Avaliação da nitração de proteínas na deficiência mitocondrial

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O óxido nítrico apresenta um importante papel na regulação de processos mitocondriais, porém quando combinado com os radicais livres produzidos em excesso, pode levar à formação de peroxinitrito, um dos compostos químicos mais prejudiciais derivados da reação entre radicais livres. A formação de peroxinitrito pode provocar a nitração de proteínas e contribuir para um estresse nitrativo que, por sua vez, pode alterar a função e a estrutura de proteínas. Em estudos anteriores, foi observado que fibras musculares de pacientes com doenças mitocondriais apresentavam aumento da atividade da óxido nítrico sintase e que células com mutações no DNA mitocondrial (mtDNA), apresentavam níveis elevados de óxido nítrico intra e extracelular. Com a presença aumentada do óxido nítrico, ponderamos que existe a possibilidade de que ocorra o estresse nitrativo e possível nitração de proteínas em células que apresentam alteração no mtDNA. O presente projeto tem por objetivo avaliar qual a relação da nitração de proteínas com a deficiência mitocondrial. Os objetivos específicos são: (a) avaliar se a presença da nitração de proteínas nas fibras musculares de pacientes com doença mitocondrial está correlacionada com características genéticas, clínicas e laboratoriais; (b) avaliar se a utilização de antioxidante é capaz de reduzir a nitração de proteínas em células com deficiências mitocondriais; (c) avaliar se a redução de nitração de proteínas em células com deficiência mitocondrial levaria a uma melhora na respiração celular. Foram utilizadas amostras de músculo de pacientes com doença mitocondrial e células cíbridas derivadas de osteosarcoma com as mutações m.3243A>G, m.8344A>G e contendo deleção do mtDNA (~7,2kb), em homoplasmia. As amostras de músculo foram analisadas após histoquímica para enzimas mitocondriais e imuno-histoquímica para proteínas nitradas. As análises em células cíbridas consistiram em: (a) quantificação do óxido nítrico intracelular; (b) imuno-citoquímica para nitrotirosina; e (c) avaliação do efeito do tratamento com o antioxidante N-acetilcisteína (NAC) sobre a nitração de proteínas e respiração celular. Nosso estudo demonstrou que proteínas nitradas foram mais frequentes nas amostras de pacientes com alterações em genes que codificam o tRNA. A nitração no sarcolema ocorreu predominantemente nos pacientes com maior proporção de fibras com proliferação mitocondrial. Demonstramos também que as células com alterações mitocondriais apresentavam níveis elevados de nitração de proteína quando comparadas ao controle 143B (linhagem sem alteração mitocondrial). O antioxidante NAC foi eficaz em reduzir a presença de nitração de proteínas nas três linhagens avaliadas. Esta redução ocorreu com decremento da produção de radicais superóxido e do NO intracelular nas linhagens m.3243 A>G e m>8344 A>G), porém, não observamos alterações da respiração celular após o tratamento com NAC. A partir da análise dos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que, a nitração de proteínas foi mais frequente nos pacientes com mutações no gene do tRNA e, o tratamento com o antioxidante NAC foi capaz de reduzir a nitração de proteínas nas células com as mutações m.3243 A>G, m.8344 A>G e deleção, porém sem melhora na respiração celular.