Estudo in vitro de células mesenquimais isoladas da polpa de dentes permanentes com e sem inflamação : caracterização e indução de diferenciação

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2012. Introdução: As células-tronco da polpa dental (DPSC) têm se mostrado multipotentes e têm sido muito estudadas para engenharia de tecidos. Estudos recentes sugeriram a presença de células mesenquimais viáveis na polpa dental humana inflamada. Objetivo: a) Comparar células de polpas dentais normais e inflamadas quanto à presença de células-tronco, proliferação e potencial de diferenciação; b) Investigar se a irradiação com laser de baixa potência aumentaria o potencial de proliferação e diferenciação de DPSC isoladas a partir de polpas dentais normais (DPSC-N) e inflamadas (DPSC-I); c) Construir bibliotecas subtrativas de cDNA com células de polpas dentais normais e inflamadas para identificar possíveis transcritos diferencialmente expressos. Métodos: a) Células de polpas dentais humanas normais e inflamadas foram comparadas quanto à proliferação (MTT), morfologia, e expressão de STRO-1. Células STRO-1-positivas foram submetidas a ensaios de proliferação (MTT e contagem de UFC), a análises morfológicas e do perfil imunofenotípico e às diferenciações odonto-osteogênica, adipogênica e condrogênica. As células diferenciadas foram avaliadas quanto à morfologia e à expressão dos genes BSP, LPL e SOX-9 por qRT-PCR. A quantidade de matriz mineralizada produzida após a diferenciação odonto-osteogênica também foi comparada. b) DPSC-N e DPSC-I foram irradiadas com um laser de baixa potência vermelho (660 nm) em quatro diferentes fluências de energia (0,05; 0,30; 7 e 42 J/cm2 ). As duas fluências menores foram produzidas por irradiação das duas fluências mais elevadas através de um disco de dentina, usado para simular uma condição clínica. A proliferação e a competência na diferenciação odonto- osteogênica foram comparadas. c) O cDNA de células de polpas dentais normais e inflamadas foi utilizado, após hibridações subtrativas, para a construção de duas bibliotecas enriquecidas com transcritos diferencialmente expressos em cada população. Amostras de cDNA das bibliotecas foram sequenciadas, comparadas às depositadas no banco de dados Swiss-Prot e funcionalmente classificadas, usando a ferramenta KEGG Orthology. Resultados: Não se observaram diferenças na morfologia e na proliferação de DPSC-N e DPSC-I antes ou depois da separação das STRO-1-positivas. Elas tiveram expressões semelhantes de STRO-1 e seus perfis imunofenotípicos foram compatíveis com o de células-tronco mesenquimais. Tanto DPSC-N quanto DPSC-I foram capazes de se diferenciarem sob as três condições analisadas e apresentaram padrões semelhantes de expressão de BSP, LPL e SOX-9. A produção de matriz mineralizada também foi compatível. Em todos os experimentos quantitativos, houve diferenças entre as células de cada paciente, tanto de polpa normal como de inflamada, mas não houve diferença estatística entre os dois grupos. Após a irradiação com laser, não houve diferença significativa entre as taxas de proliferação e as produções relativas de nódulos mineralizados em comparação com os respectivos controles, tanto para DPSC-N quanto para DPSC-I. A análise das bibliotecas subtrativas de cDNA não revelou diferenças estatisticamente significativas quanto à expressão gênica nas categorias funcionais. Conclusão: Não foram identificadas diferenças significativas entre as propriedades das células da polpa dental normal e inflamada quanto à presença de células-tronco e seu potencial de proliferação e diferenciação, assim como em relação ao padrão de expressão gênica global. Além disso, o laser não intensificou as propriedades dessas células. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Introduction: Human dental pulp stem cells (DPSC) have shown multipotency and have been widely studied for tissue engineering. Recent studies have sugested the presence of viable mesenchymal cells in the inflamed human dental pulp. Aim: a) To compare cells from normal and inflamed human dental pulps regarding the presence of stem cells, their proliferation and differentiation potential; b) To investigate if low-level laser therapy could increase the proliferation and differentiation potential of DPSC isolated from normal dental pulps (DPSC-N) and from inflamed pulps (DPSC- I); and c) To construct subtractive cDNA libraries with cells from normal and inflamed dental pulps to identify potential differentially expressed transcripts. Methodology: a) Cells from human normal and inflamed pulps were compared in respect to proliferation (MTT assay), morphology and STRO-1 expression. STRO-1-positive cells were subject to proliferation assays (MTT and CFU counting), to morphological and immunophenotypic analyses and then submitted to odonto-osteogenic, adipogenic and condrogenic differentiation. Differentiated cells were evaluated concerning the morphology and the expression, by qRT-PCR, of BSP, LPL and SOX-9 genes. The amount of mineralized matrix produced after odonto-osteogenic differentiation was also compared. B) DPSC-N and DPSC-I were irradiated with a red low-level laser (660 nm) in four different energy fluences (0.05, 0.30, 7 and 42 J/cm2 ). The two lower fluences were produced by irradiating the two higher fluences through a dentin disc, which was used to simulate a clinical condition. The proliferation and the cell odonto-osteogenic differentiation competence were compared. c) cDNA of cells from normal and inflamed dental pulps were used, after subtractive hybridizations, to construct two libraries, enriched with differently expressed transcripts in each cell population. The cDNA samples were sequenced and compared to sequences which were deposited in the database Swiss-Prot. Then, they were functionally classified, using the tool KEGG Orthology. Results: No difference was observed in the morphology and in the proliferation rate of DPSC-N and DPSC-I either before or after separation of STRO-1-positive cells. They had similar expressions of STRO-1 and had mesenchymal immunophenotype. Both DPSC-N and DPSC-I were capable of differentiating under the three assayed conditions and presented similar patterns for BSP, LPL and SOX-9 expression. Mineralized matrix production was also compatible. In all the quantitative experiments, differences were found between cells from each patient, either from normal or inflamed pulps. Nonetheless, there was no statistical difference between these two groups. After laser irradiation, there was no statistically significant difference between the proliferation rates and the relative productions of mineralized nodules compared to the respective controls, either for DPSC-N or DPSC-I. The analysis of the subtractive cDNA libraries revealed no statistically significant difference in gene expression in the functional categories. Conclusion: No significant differences were found between the properties of cells from normal and inflamed dental pulps for the presence of stem cells and their proliferation and differentiation potentials, as well as in relation to global gene expression pattern. Furthermore, the laser did not increase the properties of these cells.