Study of cis and trans signals in the determination of alternative splicing patterns

El splicing se encuentra presente a lo largo de las distintas especies de organismos eucariotas, representando una pieza clave en la inmensa mayoría de los procesos de regulación. Para que el mismo pueda llevarse a cabo, debe darse el reconocimiento de una serie de señales. En particular, los sitios donores y aceptores de splicing definen los límites del intrón y su reconocimiento constituye uno de los primeros pasos dentro del ciclo de splicing. A lo largo del genoma, estos sitios presentan una cierta variabilidad en su secuencia, la cual se encuentra relacionada con la posibilidad de regular su reconocimiento y establecer diversos patrones de splicing alternativo. Por otro lado, este reconocimiento se encuentra influido por la acción de una gran variedad de factores en trans que son reclutados al lugar donde se está llevando a cabo el splicing. En la primera parte de esta tesis, buscamos analizar la variabilidad de secuencia que presentan los sitios donores a lo largo de diversas especies eucariotas. Para esto construimos un modelo estadístico de máxima entropía para determinar patrones de correlación no triviales entre los distintos pares de posiciones que constituyen los sitios donores de splicing, en busca de determinar cuáles de éstos son comunes entre las 30 especies analizadas, y cuáles son característicos de solo algunos grupos. Si bien el proceso de splicing conserva un gran número de elementos en común en los organismos eucariotas, en los últimos años múltiples estudios han destacado la posible relevancia funcional de pequeñas diferencias entre las especies. Así logramos establecer patrones de correlación característicos en los sitios donores de splicing que distinguen a las especies vegetales de los metazoos y los hongos. En la segunda parte, nos abocamos al estudio del efecto sobre el splicing de PRMT5, un factor que, mediante la metilación de proteínas, participa de la regulación de múltiples procesos moleculares. Se ha propuesto que la acción de PRMT5 podría favorecer el reconocimiento de sitios donores débiles. Con el objetivo de determinar en qué medida el efecto que tiene PRMT5 sobre los patrones de splicing se encuentra influído por señales en cis, se realizaron experimentos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) en plantas de Arabidopsis thaliana mutantes de PRMT5, pertenecientes a dos ecotipos distintos: Columbia (Col-0) y Landsberg erecta (Ler). De esta manera se buscó analizar el efecto que tiene la mutación ante la variabilidad genética que presentan estos ecotipos. Para poder discriminar los cambios relacionados con variaciones de las secuencias en cis, se analizó también híbridos F1 Col-0 X Ler y Ler X Col-0. Mediante estos análisis se llegó a la conclusión de que una parte importante de los patrones de splicing afectados por la mutación de PRMT5 dependen de señales en cis, teniendo una particular relevancia la fortaleza del sitio donor. Splicing is present throughout eukaryotic organisms, representing a key part in a large number of regulatory processes. To be carried out, there must be recognition of a series of signals present both within and around the intron. In particular, the splicing donor and acceptor sites define the boundaries of the intron and are critical for its proper recognition. Throughout the genome, these sites present a certain variability in their sequence, which is related to the possibility of regulating their recognition and establishing different patterns of alternative splicing. On the other hand, this recognition is influenced by the action of a wide variety of factors in trans that are recruited. In the first part of this work, we analyzed the sequence variability of donor sites across various eukaryotic species. We built a maximum entropy statistical model to determine non-trivial correlation patterns between the different pairs of positions that constitute the splicing donor sites, seeking to determine which of these are common among the 30 species analyzed, and which are characteristic of just some groups. Although the splicing process preserves a large number of elements in common between the different species, in recent years multiple studies have highlighted the possible functional relevance of small interspecific differences. Using this approach, we were able to establish characteristic correlation patterns in splice donor sites that distinguish plant species from metazoans and fungi. In the second part of this thesis, we study the effect of PRMT5 on splicing. PRMT5 is a Protein arginine methyltransferase that participates in the regulation of multiple molecular processes, such as chromatin modification and alternative splicing. It has been proposed that the action of PRMT5 could favor the recognition of weak donor sites. In order to deter mine to what extent the effect PRMT5 has on splicing patterns is influenced by cis signals, sequencing experiments were performed (RNA-Seq) in PRMT5 wildtype and mutant Arabi-dopsis thaliana plants belonging to two different ecotypes: Columbia (Col-0) and Landsberg erecta (Ler). In this way, we sought to analyze the effect that the mutation has on the genetic variability that these ecotypes have. In order to discriminate the changes related to variations in the cis sequences, F1 Col-0 X Ler and Ler X Col-0 hybrids were also analyzed. Through these analyses, it was concluded that an important part of the splicing patterns affected by the PRMT5 mutation depend on cis signals, having a particular relevance the strength of the donor site. Fil: Beckel, Maximiliano Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.