Estudo dos mecanismos de sinalização e reparo do dano de DNA durante o estresse replicativo em Trypanosoma cruzi

Lesões não reparadas no DNA, quantidades limitadas de dNTPs ou estresse topológico causado pela transcrição do DNA podem diminuir ou parar a progressão da forquilha de replicação, o que é conhecido como estresse replicativo. A DNA topoisomerase 3α atua na dissolução das junções de Holliday durante a recombinação homóloga e a DNA topoisomerase 3β suprime o acúmulo dos R-loops formados durante a transcrição. Logo, estas enzimas podem prevenir o estresse replicativo. Uma vez que as forquilhas de replicação tenham parado o seu movimento, as células eucarióticas contam com as cinases ATM e ATR para coordenar as transições do ciclo celular, recrutar proteínas de reparo e regular a apoptose. Tanto os genes das topoisomerases 3α e 3β quanto das cinases ATM e ATR estão presentes no genoma dos tripanossomatídeos, contudo, as funções destas proteínas não estão claras no Trypanosoma cruzi, o parasito causador da doença de Chagas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel destas enzimas durante o estresse replicativo em T. cruzi. Para analisar o envolvimento da topoisomerase 3α no reparo por recombinação homóloga, parasitos selvagens (WT) e nocautes (Topo3α KO e Topo3β KO) foram expostos à radiação gama. Apenas as células Topo3α KO não foram capazes de retomar o crescimento após o tratatamento, indicando a importância desta enzima durante essa via de reparo. Estas células também foram tratadas com drogas capazes de parar a forquilha de replicação. Em comparação aos parasitos WT e Topo3β KO, os parasitos Topo3α KO foram mais sensíveis ao tratamento com cisplatina, hidroxiureia e metil metano sulfonato (MMS). Entretanto, foi observado uma variação na sensibilidade das células Topo3α KO durante os tratamentos testados, o que indica o envolvimento de mais de uma via de reparo na resolução do estresse replicativo mediada pela topoisomerase 3α. Uma diferença similar também foi observada na célula deficiente em Rad51, a recombinase que atua na recombinação homóloga, o que corrobora a participação da topoisomerase 3α nesta via de reparo. Para estudar a função das cinases ATM e ATR, epimastigotas selvagens da cepa CL Brener foram transfectados com um cassete de deleção, o que permite a geração de parasitos heminocautes para os genes alvos. Após a transfecção foram corretamente selecionados parasitos com níveis reduzidos de ATM. O estudo destas células permitirá uma maior compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta à quebra de fita dupla em T. cruzi. Unrepaired DNA damage, limited concentration of free dNTPs, or topological stress caused by DNA transcription may slow or stall the replication fork progression, which is known as replicative stress. DNA topoisomerase 3α dissolutes the Holliday junctions during homologous recombination and DNA topoisomerase 3β suppresses the accumulation of R-loops formed during transcription. Therefore, these enzymes can prevent replicative stress. Once replication forks have stopped their movement, eukaryotic cells rely on ATM and ATR kinases to coordinate cell cycle transitions, recruit repair proteins, and regulate apoptosis. Both topoisomerase 3α and 3β genes as well as ATM and ATR kinases are present in the trypanosomatid genome, but the functions of these proteins are unclear in Trypanosoma cruzi, the parasite that causes Chagas disease. Thus, the present work aimed to evaluate the role of these enzymes during the replicative stress in T. cruzi. To analyze the involvement of topoisomerase 3α in the homologous recombination repair, wild type parasite (WT) and knockout parasites (Topo3α KO and Topo3β KO) were exposed to gamma radiation. Only Topo3α KO cells were unable to resume growth after treatment, indicating the importance of this enzyme during this repair pathway. These cells were also treated with drugs that halt the replication fork. Topo3α KO parasites were more sensitive to treatment with cisplatin, hydroxyurea and methyl methane sulfonate (MMS) than WT and Topo3β KO parasites. However, it was observed a variation in the sensitivity of Topo3α KO cells during the treatments tested, which indicates the involvement of more than one repair pathway in topoisomerase 3α-mediated replicative stress resolution. A similar difference was also observed in the Rad51 deficient cells, the recombinase that acts on homologous recombination, which corroborates the participation of topoisomerase 3α in this repair pathway. To study the function of ATM and ATR kinases, wild type epimastigotes of CL Brener strain were transfected with a deletion cassette, which allows the generation of single knockout parasites for the target genes. After transfection, parasites with reduced ATM levels were correctly selected. The study of these cells will allow a better understanding of the mechanisms involved in the DNA double strand break response in T. cruzi.