Desenvolvimento de um método imunoenzimático para detecção de IgG anti-RBD de SARS-CoV-2

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia (Mestrado Profissional), Florianópolis, 2022. Em 2019, surgiram os primeiros casos de pacientes acometidos pela COVID-19 na China e logo a doença se alastrou pelo mundo culminando em uma pandemia. Em janeiro de 2022 a pandemia causada pelo novo coronavírus supera marcas impressionantes de número de casos e mortes, sendo o Brasil o país com 3º maior número de casos acumulados. O novo coronavírus possui uma proteína estrutural importante chamada Spike que é amplamente expressa e sabidamente imunogênica. Em decorrência disso, já estão em uso no mundo 15 vacinas que utilizam a Spike ou suas subunidades nas formulações vacinais, com destaque para o seu domínio de ligação ao receptor. Entretanto, apesar da disponibilidade de algumas vacinas, ainda há uma grande parcela da população suscetível às formas graves da COVID-19 e a altos níveis de contágio. Somado a isso, a disseminação de variantes de preocupação alerta para o fato de que mesmo indivíduos vacinados, ou com infecção prévia por SARS-CoV-2, desencadeiam uma resposta humoral menos eficiente à essas cepas, remetendo à necessidade de que a população mundial tenha acesso rapidamente ao esquema vacinal completo, a fim de minimizar os impactos causados pela doença. Por isso, o Laboratório de Imunobiologia junto a um grupo multicêntrico, propõe o desenvolvimento de uma vacina brasileira hipotetizando que uma vacina de BCG recombinante expressando determinantes antigênicos das proteínas Spike (RBD) e do Nucleocapsídeo induz uma resposta humoral protetora contra o SARS-CoV-2. Para testar esta hipótese é preciso que estejam disponíveis métodos para detecção de imunoglobulinas, sendo assim é de grande valia o desenvolvimento desta ferramenta no laboratório de Imunobiologia. Baseado nesse cenário, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um teste capaz de detectar imunoglobulinas anti-Spike e anti-RBD através da metodologia de ELISA indireto. Os ensaios foram padronizados e otimizados através da variação individual de parâmetros como a solução de bloqueio; a diluição do anticorpo secundário; a diluição das amostras e o tempo de desenvolvimento da reação enzima-substrato. Afinal, obteve-se quatro métodos imunoenzimáticos capazes de detectar IgG anti-SARS-CoV-2 em soro murino ou humano. Especificamente o ensaio para detecção de IgG anti-RBD murina, possibilita a titulação das amostras de soro e possui boas características de repetibilidade. Por fim, o custo estimado por amostra desse ensaio é por volta de 62x menor que o custo de kits comercializados no mercado, o que permite o uso escalável em laboratórios. Abstract: In 2019, the first cases of patients affected by COVID-19 were reported in China and this disease spread around the world, culminating in a pandemic. In January 2022, the pandemic caused by the new coronavirus overcomes impressive marks in number of cases and deaths, Brazil being the 3rd highest country in number of accumulated cases. The new coronavirus has an important structural protein called Spike that is widely expressed and known to be immunogenic. Hence, 15 vaccines developed targeting Spike protein or its subunits, with emphasis on its receptor-binding domain, are already in use worldwide. However, despite the availability of some vaccines, there is still a large portion of the world's population susceptible to severe forms of COVID-19 and high levels of transmission. In addition, the dissemination of variants of concern alerts to the fact that vaccinated individuals, or even those with previous SARS-CoV-2 infection, trigger a less efficient humoral response to these strains, leading to the need of quick access to the complete vaccination schedule for global population, to minimize impacts caused by the disease. Therefore, the Laboratory of Immunobiology, together with a multicenter group, proposed the development of a Brazilian vaccine, hypothesizing that a recombinant BCG vaccine expressing antigenic determinants of Spike protein (RBD) and Nucleocapsid protein induces a protective humoral response against SARS-CoV-2. In order to test this hypothesis, a method for detection of immunoglobulins must be available, and thus the development of this tool is of great value. Based on this scenario, the objective of this work was to develop a test capable of detecting anti-Spike and anti-RBD immunoglobulins through an indirect ELISA method. The assays were standardized and optimized through the individual variation of parameters such as the blocking solution; the dilution of the secondary antibody; the dilution of the samples and the time of the enzyme-substrate reaction. The result were four enzyme-linked immunosorbent methods capable of detecting anti-SARS-CoV-2 IgG in murine or human serum were obtained. Specifically, the assay for detecting murine anti-RBD IgG, allows titration of serum samples and has good repeatability. Finally, the estimated cost per sample of this assay is around 62x lower than the cost of commercially available kits, which allows scalable use in laboratories.