Participação do sistema endocanabinóide na modulação da função imunológica de células-tronco da polpa dentária humana

O sistema de sinalização de canabinoides endógeno (eCBS) é composto por moléculas endocanabinóides que interagem com os receptores CB1 e CB2 acoplados à proteína G, estando presente em diversos tecidos e tipos celulares, entre eles em células do sistema nervoso central (SNC), sistema imune e células-tronco mesenquimais (MSC). A presença desses receptores, em específico, tanto em células do sistema imune como em células-tronco pode ser indício do caminho de sinalização celular pelo qual os dois sistemas se comunicam. Ultimamente houve crescimento de tratamentos de diversas doenças relacionadas ao SNC utilizando derivados de canábis, como o canabidiol, demonstrando resultados positivos. No entanto, não sabemos os reflexos dos tratamentos que envolvem o eCBS em outros tipos celulares. Existe assim a necessidade do entendimento dessa comunicação, bem como dos efeitos sistêmicos e prováveis efeitos colaterais relacionados à estimulação desses receptores, uma vez que o estímulo dos mesmos pode influenciar a ativação e resposta de células-tronco de polpa dentária humana (DPSC). Tais conhecimentos formam ainda a base para uma melhor compreensão do efeito medicinal da canábis, contribuindo no esclarecimento de sua ação por exemplo em doenças neurodegenerativas e no desenvolvimento de novos medicamentos. O presente trabalho objetivou então avaliar os efeitos de agentes estimulatórios e inibitórios dos receptores canabinóides sobre a resposta imunológica e proliferativa das DPSC. Para tal, DPSC humanas foram isoladas da polpa dentária e caracterizadas para confirmação de sua identidade como células-tronco (CT). As DPSC foram então cultivadas na presença ou ausência de um agonista (anandamida) e de antagonistas (AM251 e SR144528) dos receptores CB1 e CB2 do eCBS, sob estímulo ou não de TNF-α. Para análise da imunomodulação, moléculas de superfície ligadas à imunossupressão (HLA-DR, PD-L1, PD-L2) foram mensuradas por citometria de fluxo. Paralelamente, a expressão de mRNA relacionado às moléculas do eCBS foi verificada por Real time RT-PCR, bem como a expressão para as citocinas TGF-β e IL-6. Ainda, a taxa de proliferação das DPSCs em estudo também foi avaliada. A caracterização das células isoladas confirmou sua identidade como CT. A citometria para os marcadores HLA-DR, PD-L1 e PD-L2 indicou que as DPSCs expressam esses marcadores em sua superfície celular e que sua expressão responde diferencialmente ao estímulo do eCBS, bem como à presença de TNF-α, o que comprova o papel desse sistema na influência do perfil imunomodulador atribuído às DPSCs. A análise da expressão gênica para os componentes do eCBS forneceu uma compreensão detalhada do funcionamento do sistema em DPSCs em termos de sua autorregulação, e em termos de sua resposta à presença de TNF-α. Isso permitiu confirmar que o eCBS é um sistema presente e funcionalmente ativo em DPSCs, envolvido diretamente com a imunomodulação. A análise da expressão gênica para as citocinas TGF-β e IL-6 mostrou que as DPSCs expressam os genes para estas citocinas mesmo quando cultivadas sem estímulo específico. Mostrou também que essa expressão é profundamente alterada como resposta aos estímulos do eCBS e ao estímulo por TNF-α, indicando mais uma vez o papel desse sistema na coordenação da resposta celular de DPSCs, em especial relativa à imunomodulação. A análise da taxa de proliferação das DPSCs frente aos estímulos do eCBS e ao estímulo por TNF-α mostrou que o eCBS não é capaz de afetar significativamente a proliferação das DPSCs, mas o TNF-α sim. A análise conjunta desses dados indica que o eCBS presente nas DPSCs não só responde ao estímulo imunológico, como também altera moléculas chave da resposta imune, fornecendo os estímulos necessários para que as DPSCs atuem na coordenação do ambiente inflamatório. The endogenous cannabinoid signaling system (eCBS) is composed of endocannabinoid molecules that interact with G-protein coupled receptors CB1 and CB2, and it is present in many tissues and cell types, including central nervous system (CNS) cells, the immune system cells and mesenchymal stem cells (MSC). The presence of such receptors in both immune and stem cells may be indicative of the cellular signaling pathway through which the two systems communicate. Lately there has been shown a growth in treatments of various CNS-related diseases using cannabis derivatives such as cannabidiol, showing positive results. However, we still do not know the consequences of treatments involving eCBS in other cell types.Thus, there is a need to understand such communication, as well as the systemic and related side effects upon receptors stimulation, since it may influence the activation and response of human dental pulp stem cells (DPSC). Such knowledge also form the basis for a better understanding of cannabis medicinal effects, contributing to clarify its action for example in neurodegenerative diseases and also i the development of new medicines. Thus, the present study aims at evaluating the effects of cannabinoid receptor stimulatory and inhibitory agents uppon DPSC immune and proliferative responses. So, human DPSC were isolated from dental pulp and characterized to confirm their identity as stem cells. DPSC were then cultured in the presence or absence of an agonist (anandamide) and antagonists (AM251 and SR144528) for eCBS receptors, whether or not stimulated by TNF-α. For immunomodulation analysis, immunosuppressionrelated surface molecules (HLA-DR, PD-L1, PD-L2) were measured by flow cytometry. eCBS components mRNA expression was verified by Real time RTPCR as well as the expression for TGF-β and IL-6 cytokines. The proliferation rate of DPSCs under study was also evaluated. The characterization of the isolated cells confirmed their identity as stem cells. Cytometry for HLA-DR, PDL1 and PD-L2 markers indicated that DPSCs express these markers on their cell surface and that their expression responds differentially to eCBS stimulus as well as to the presence of TNF-α, which proves the role of such system in influencing the DPSCs immunomodulatory profile. Gene expression analysis for eCBS-related enzymes and receptors provided a deep and detailed understanding of the system's functioning in DPSCs, both in terms of its selfregulation and its response to the presence of TNF-α. Such results confirmed that eCBS is a present and functionally active system in DPSCs, directly involved with immunomodulation. Gene expression analysis for TGF-β and IL-6 cytokines showed that DPSCs express genes for these cytokines even when cultured without specific stimulation. It also showed that this expression is profoundly altered as a response to eCBS stimuli and TNF-α stimulation, again indicating the role of this system in coordinating the cellular response of DPSCs, especially concerning immunomodulation. Analysis of DPSC proliferation rate under eCBS and TNF-α stimulation showed that eCBS is not able to significantly affect DPSC proliferation, but TNF-α does. The combined analysis of these data indicates that eCBS present in DPSCs not only responds to immune stimulation, but also alters key immune response molecules, providing the necessary stimuli for DPSCs to act in the coordination of such environment.