Back to Search Start Over

DEVELOPMENT OF BORON DOPED TISSUE SCAFFOLDS WHICH HAVE SYNERGISTIC EFFECTS WITH BETA-LACTAME ANTIBIOTICS

Authors :
Çakır, Demet
Gümüşderelioğlu, Menemşe
Kimya Mühendisliği
Publication Year :
2018
Publisher :
Fen Bilimleri Enstitüsü, 2018.

Abstract

In the presented study, it was aimed to develop boron-doped hydroxyapatite (B-HAp)/chitosan tissue scaffolds which have synergistic effect with beta-lactame antibiotics as systems to prevent infection and speed up the treatment of any bone damage. For this purpose, cell proliferation was investigated by cell culture studies with MC3T3-E1 mouse precursor bone cell line. In addition, the synergistic effect between amoxicillin (AMX), a beta-lactam antibiotic, and B-HAp, produced by the biomimetic method, was studied with selected bacterial strains. AMX loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles were produced using the double-emulsion preparation-solvent evaporation (w/o/w) method. Encapsulation yield of AMX to PLGA nanoparticles was found to be 36%. The diameters of empty and AMX loaded PLGA nanoparticles were determined to be 187 nm and 182 nm, respectively. It has been proven through the 85-day release study with PLGA nanoparticles that 20% of AMX is released by a burst effect in the first hour and the AMX release is carried out in a long-term and controlled manner, proving that the release is achieved by the diffusion mechanism according to the "Higuchi model". In the on-going study B-HAp/chitosan nanocomposite tissue scaffolds were prepared by freeze-drying method in the presence of AMX loaded PLGA nanoparticles and their characteristics were determined. It has been observed that the AMX release is achieved by a slower and more controlled diffusion mechanism than that of the particles. In-vitro cell culture studies were performed with the MC3T3-E1 cell line for 7-day to examine the effect of AMX loaded PLGA nanoparticle containing B-HAp/chitosan tissue scaffolds on cell proliferation. There was no statistically significant effect of low AMX doses used with B-HAp on cell proliferation. Four different bacterial strains (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1144 and Klebsiella pneumoniae ATCC 700603), which produce the beta-lactamase enzyme, and three different methods (double disk synergy method, agar diffusion method and gradient test) were used to examine the synergistic effect between the beta-lactame antibiotic, AMX, and B-HAp. Test results proved the synergistic effect between AMX and B-HAp. The results obtained within the scope of the study indicated that beta-lactam antibiotic releasing and boron containing tissue scaffolds could be used effectively with their cellular and antibacterial properties in bone tissue regeneration. İÇİNDEKİLER ÖZET ABSTRACT TEŞEKKÜR İÇİNDEKİLER ÇİZELGELER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR 1. GİRİŞ 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Doku Mühendisliği 2.2. Kemik Doku Mühendisliği 2.2.1. Kemiğin Yapısı ve Özellikleri 2.2.2. Kemik Doku Mühendisliği Yaklaşımı 2.2.3. Kemik Doku Mühendisliğinde Kullanılan Biyomalzemeler ve Doku İskeleleri 2.2.4. Kemik Doku Mühendisliğinde Kullanılan Hücreler ve Biyosinyal Moleküller 2.3. Antibiyotikler 2.3.1. Kullanım Alanları 2.3.2. Etki Mekanizmaları 2.3.3. Sınıflandırılmaları 2.4. Beta-Laktam Antibiyotikleri 2.4.1. Penisilin Grubu Beta-Laktamlar 2.4.1.1. Amoksisilin (AMX) 2.5. Beta-Laktam Antibiyotiklere Karşı Gelişen Direnç Mekanizmaları 2.6. Beta-Laktamazlar 2.6.1. Genişlemiş Spektrumlu Beta-Laktamazlar (GSBL) 2.7. Beta-Laktamaz Enzimi Üreten Bakteriler 2.7.1. Gram-Pozitif Bakteriler 2.7.1.1. Staphylococcus aureus Suşları 2.7.2. Gram-Negatif Bakteriler 2.7.2.1. Escherichia coli Suşları 2.7.2.2. Klebsiella pneumoniae Suşları 2.8. Beta-Laktamaz İnhibitörleri 2.9. Hidroksiapatit 2.10. Bor ve Bor Katkılı Hidroksiapatit 2.11. Kontrollü Salım Sistemleri 2.11.1. Partiküler Formdaki İlaç Salım Sistemleri 2.11.2. Partikül Üretim Yöntemleri 2.11.2.1. İkili-Emülsiyon Hazırlama-Çözücü Buharlaştırma Yöntemi 2.11.3. Partikül Üretiminde Kullanılan Biyomalzemeler 2.11.4. Kontrollü İlaç Salım Sistemlerinde Kullanılan Matematiksek Modeller 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 3.1. Kullanılan Malzemeler 3.2. Biyomimetik Yöntemle HAp ve B-HAp Üretimi ve Karakterizasyonu 3.2.1. HAp ve B-HAp Üretimi 3.2.2. Hidroksiapatitin ve Bor Katkılı Hidroksiapatitin Karakterizasyonu 3.3. AMX Yüklü PLGA Nanopartiküllerin Hazırlanması 3.3.1. PLGA Nanopartiküllerin Sentezi 3.3.2. PLGA Nanopartiküllere AMX Yüklenmesi 3.4. PLGA Nanopartiküllerin Karakterizasyon Çalışmaları 3.4.1. AMX Yüklü PLGA Nanopartiküllerin Enkapsülasyon Veriminin Belirlenmesi 3.4.2. Partikül Boyutunun Belirlenmesi 3.4.3. Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) Analizi 3.4.4. Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) Analizi 3.5. Doku İskelelerinin Üretimi 3.6. Nanokompozit Doku İskelelerinin Karakterizasyonu 3.6.1.1. FTIR Analizi 3.6.1.2. SEM Analizi 3.7. Salım Sistemlerinin Hazırlanması ve Salım Kinetiklerinin İncelenmesi 3.7.1. PLGA Nanopartiküllerden AMX Salımı 3.7.2. Kitosan Nanokompozit Doku İskelelerinden AMX Salımı 3.8. Bakteriyel Çalışmalar 54 3.8.1. Çift Disk Sinerji Yöntemi 3.8.2. Agar Difüzyon Yöntemi 3.8.3. Gradiyent Testi 3.9. Hücre Kültür Çalışmaları 3.9.1. MC3T3-E1 Hücre Kültürü 3.9.2. Toksisite Çalışmaları 4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 4.1. Biyomimetik Yöntemle HAp ve B-HAp Üretimi ve Karakterizasyonu 4.2. PLGA Nanopartiküllerin Hazırlanması 4.3. PLGA Nanopartiküllerin Karakterizasyonu 4.3.1. AMX Yüklü PLGA Nanopartiküllerin Enkapsülasyon Veriminin Belirlenmesi 4.3.2. Boş ve AMX Yüklü PLGA Partiküllerin Boy ve Boy Dağılımı 4.3.3. FTIR Analizi 4.3.4. SEM Analizi 4.4. Doku İskelelerinin Üretimi 4.5. Nanokompozit Doku İskelelerinin Karakterizasyonu 4.5.1. FTIR Analizi 4.5.2. SEM Analizi 4.6. Salım Çalışmaları ve Salım Kinetiklerinin İncelenmesi 4.6.1. PLGA Nanopartiküllerden AMX Salımı 4.6.2. Kitosan Nanokompozit Doku İskelelerinden AMX Salımı 4.7. Bakteriyel Çalışmalar 4.8. Hücre Kültür Çalışmaları 4.8.1. MC3T3-E1 Hücre Kültürü 4.8.2. Toksisite Çalışmaları 5. GENEL SONUÇLAR 6. KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ Sunulan tez çalışmasında herhangi bir kemik hasarında enfeksiyonu önleyici ve tedavi sürecini hızlandırıcı sistemler olarak, beta-laktam antibiyotikleri ile sinerjik etkiye sahip bor katkılı hidroksiapatit (B-HAp)/kitosan doku iskelelerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, MC3T3-E1 fare öncül kemik hücre hattı ile hücre kültür çalışmaları yapılarak hücre proliferasyonu incelenmiştir. Ayrıca, seçilen çeşitli bakteri suşları ile çalışılarak bir beta-laktam antibiyotiği olan amoksisilin (AMX) ve biyomimetik yöntem ile üretilen B-HAp arasındaki sinerjik etki incelenmiştir. İkili-emülsiyon hazırlama-çözücü buharlaştırma (w/o/w) yöntemi kullanılarak AMX yüklü poli(laktik-ko-gikolik asit) (PLGA) nanopartiküller üretilmiştir. AMX’in, PLGA nanopartiküllere enkapsülasyon verimi %36 olarak bulunmuştur. Boş ve AMX yüklü PLGA nanopartiküllerin çapları sırasıyla, 187 nm ve 182 nm olarak belirlenmiştir. PLGA nanopartiküller ile gerçekleştirilen 85 günlük salım çalışması sonucunda, ilk saatte ani patlama etkisi ile AMX’in %20’sinin salındığı ve AMX salımının uzun dönemli olarak kontrollü bir şekilde gerçekleştiği belirlenerek salım mekanizmasının “Higuchi modeli”ne uygun olarak difüzyon mekanizması ile gerçekleştiği kanıtlanmıştır. Tez çalışmasının devamında AMX yüklü PLGA nanopartiküllerin varlığında dondurarak-kurutma yöntemiyle B-HAp/kitosan nanokompozit doku iskeleleri hazırlanmış ve karakteristik özellikleri belirlenmiştir. AMX salımının partiküllerden salıma nazaran daha yavaş ve daha kontrollu biçimde difüzyon mekanizmasıyla gerçekleştiği görülmüştür. AMX yüklü PLGA nanopartikül içeren B-HAp/kitosan doku iskelelerinin hücre proliferasyonuna etkisini incelemek için MC3T3-E1 hücre hattı ile 7 gün süren in-vitro hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. B-HAp ile birlikte kullanılan düşük AMX miktarlarının hücre proliferasyonu üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisinin olmadığı gözlenmiştir. Beta-laktam antibiyotiği AMX ile B-HAp arasındaki sinerjik etkinin incelenebilmesi için beta-laktamaz enzimi üreten 4 farklı bakteri suşu (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1144 ve Klebsiella pneumoniae ATCC 700603) ve 3 faklı yöntem ile (çift disk sinerji yöntemi, agar difüzyon yöntemi ve gradiyent testi) bakteriyel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Test sonuçları AMX ile B-HAp arasındaki sinerjik etkinin varlığını kanıtlamıştır. Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlar ışığında, beta-laktam antibiyotiği salan ve bor içeren doku iskelelerinin kemik dokusunun yenilenmesinde hücresel ve antibakteriyel özellikleri ile etkin bir biçimde kullanılabilecekleri gösterilmiştir.

Details

Language :
Turkish
Database :
OpenAIRE
Accession number :
edsair.od......4268..3c775c227429caacc0e2d043d4b8ffbb