Evaluation of T Cell Responses In The Co-Cultures Establıshed Wıth Neutrophıls, Monocytes, and Lung Adenocarcınoma Cells

CD4+ and CD8+ T cells are critical mediators in anti-tumor immunity. Together with neutrophils, they have been shown to dominate the immune landscape of the non-small cell lung cancer (NSCLC). A number of studies have estimated the prognostic significance of neutrophil-to-lymphocyte ratio in NSCLC. However, immune regulatory role of neutrophils has not yet been fully elucidated. Hence, this study aims to evaluate T cell responses in the presence of neutrophils, monocytes and lung adenocarcinoma cell lines, in vitro. Peripheral blood neutrophils, CD14+ monocytes, and CD8+ or CD4+ T cells were purified from the healthy volunteers. In order to optimize the co-cultures, different combinations of these cell types were employed under various stimuli. Neutrophils were stimulated with different combinations of IFN-γ, G-CSF, N-acetylcysteine (NAC), and N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP). At different ratios, pre-stimulated or freshly isolated neutrophils were co-cultured with NSCLC cell lines media (A549, NCI-H1299, or NCI-H441) or their conditioned with or without monocytes. Soluble anti-human CD3 mAb was added in order to test the antigen-independent influences on T cells. Proliferation, viability, activation, ROS production capacity, cytokine secretion, and expression of co-stimulatory molecules were tested on specific cell types. Based on TIM-3 expression, CD8+ T cells were recovered from the co-cultures and re-stimulated to test whether the TIM-3mod/high subpopulation is exhausted. G-CSF and NAC stimulation promoted the PMN longevity, diminished the ROS production, and enhanced the stimulatory capacity of PMNs on T cell proliferation. The presence of lung cancer cells and monocytes prolonged the survival of neutrophils. In co-cultures, neutrophils swiftly acquired an activated state with decreased CD62L. Besides, ROS production by neutrophils was decreased in the co-cultures. The presence of monocytes, neutrophils, and lung cancer cells enhanced CD8+ T proliferation and the expression of inhibitory receptors. Under certain conditions lacking monocytes as major supporters of T-cell proliferation, the presence of neutrophils together with lung adenocarcinoma cells, barely supported CD8+ T cell responses. TIM-3mod/high CD8+ T cells recovered from NSCLC co-cultures were not exhausted and displayed high proliferation and IFN-γ secretion. NAC stimulation did not modulate the CD8+ T cell proliferation or TIM-3/LAG3 expression in co-cultures. Expression of 4-1BBL, OX40L and B7-2 costimulatory genes were increased in the PMNs co-cultured with lung cancer cells, monocytes and CD8+ T cells. Consequently, in a co-culture setup employing neutrophils, monocytes, CD8+ T cells and lung cancer cells, which was established to partially model the tumor microenvironment, our findings indicate the importance of neutrophils as a critical modulator for CD8+ T cell responses. CONTENTS APPROVAL PAGE iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETHICAL DECLARATION v ACKNOWLEDGEMENTS vi ABSTRACT vii ÖZET viii CONTENTS ix LIST OF ABBREVIATIONS xii FIGURES xv TABLES xviii 1. INTRODUCTION 1 2. LITERATURE OVERVIEW 4 2.1. Polymorphonuclear Leukocytes (PMNs) 4 2.1.1. Origin and Maturation of PMNs 4 2.1.2. Migration of PMNs 11 2.1.3. Functions of PMNs 15 2.1.4. Subsets of PMNs 17 2.1.5. Influence of PMNs on T cell responses 20 2.2. Lung Cancer 22 2.2.1. Classification of Lung Cancer 23 2.3. Immune Response in NSCLC 24 2.3.1. PMNs in NSCLC 27 2.3.2. T Cell Responses in NSCLC 28 2.3.3. Tumor-associated Macrophages in NSCLC 31 2.3.4. Other immune cells in NSCLC 31 3. MATERIALS AND METHODS 35 3.1. Materials Used in This Study 35 3.2. Buffers and Solutions 36 3.3. Cell Culture and Purification 37 3.3.1. Cell Culture 37 3.3.2. Freezing and Thawing of Cell Lines 38 3.3.3. Cell Counting 39 3.3.4. Isolation of the cells and Cell Sorting 40 3.3.5. Establishment of Co-cultures: 45 3.3.6. 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) cell viability assay: 46 3.4. Immunological Techniques 47 3.4.1. Flow Cytometry Analysis 47 3.5. Molecular Techniques 51 3.5.1. Total RNA isolation and spectrophotometric analysis 51 3.5.2. cDNA synthesis 51 3.5.3. Polymerase chain reaction (PCR) 52 3.5.4. Real-time PCR (RT-PCR) 54 3.5.5. Agarose gel electrophoresis 56 3.6. Statistical analysis 57 4. RESULTS 58 4.1. Preliminary analyses on PMN for the establishment of co-culture conditions 58 4.1.1. Assessment of the PMN viability 58 4.1.2. Assessment of PMN activation 66 4.1.3. The influence of PMNs on T cell proliferation 71 4.2. Assessment of CD8+ T cell responses in the co-cultures of PMNs, monocytes and NSCLC cells 77 4.2.1. CD8+ T cell proliferation in the co-cultures 77 4.2.2. CD8+ T cell activation in the co-cultures 78 4.2.3. CD8+ T cell-related cytokine production in the co-cultures 83 4.2.4. CD8+ T cell exhaustion in the co-cultures 85 4.3. Potential influence of PMN in the co-cultures 88 4.3.1. ROS production and CD8+ T cell responses 88 4.3.2. The costimulatory gene expression in PMNs 91 5. DISCUSSION 93 6. RESULTS AND RECOMMENDATION 106 7. REFERENCES 108 8.APPENDICES APPENDIX 1: Ethics Committee Approval APPENDIX 2: Scientific meetings where the data of this thesis were presented. APPENDIX 3: Thesis Orijinality Report. APPENDIX 4: Digital Receipt 9. CURRICULUM VITAE CD4+ ve CD8+ T hücreleri, anti-tümör immün yanıtlarında kritik aracılardır. Nötrofillerle beraber, küçük hücreli dışı akciğer kanserinin (KHDAK) tümör mikroçevresinde fazla miktarlarda bulundukları gösterilmiştir. Ayrıca, bir dizi çalışma, akciğer kanserinde nötrofil/lenfosit oranının prognostik önemini göstermiştir. Bununla birlikte, nötrofillerin immün düzenleyici rolü henüz tam olarak açıklanamamıştır. Bu nedenle, bu çalışma, nötrofiller, monositler ve akciğer adenokarsinom hücrelerinin varlığında T hücre yanıtlarını değerlendirmeyi amaçlamaktadır. Periferik kan nötrofilleri, CD14+ monositler ve CD8+ ve CD4+ T hücreleri sağlıklı bireylerden toplanan kanlardan izole edilmiştir. Ko-kültürleri optimize etmek için, bu hücre tiplerinin farklı kombinasyonları ile ve çeşitli uyaranlar varlığında ko-kültürler oluşturulmuştur. Nötrofiller IFN-γ, G-CSF, NAC ve fMLP ile uyarılmıştır. Farklı oranlarda, önceden uyarılmış veya yeni izole edilmiş nötrofiller, KHDAK hücre hatları (A549, NCI-H1299 veya NCI-H441 ve/veya monositler) ile birlikte ko-kültür edilmiştir. T hücreleri üzerindeki antijenden bağımsız etkileri test etmek için çözünür anti-human CD3 monoklonal antikoru eklenmiştir. İmmün hücrelerin proliferasyonu, canlılığı, aktivasyonu, ROS üretim kapasitesi, sitokin üretimi, ve kostimülatör gen ekspresyonu belirli hücre tiplerinde test edilmiştir. TIM-3mod/high alt popülasyonun yorulmuş olup olmadığını anlamak için, TIM-3 ekspresyonuna göre, CD8+ T hücreleri ko-kültürlerden toplanarak yeniden uyarılmıştır. G-CSF ve NAC ile uyarılan nötrofillerde, ROS üretimi düşerek canlılık süresi artmıştır ve bu nötrofillerin T hücre proliferasyonunu da desteklediği görülmüştür. Kanser hücrelerinin ve monositlerin varlığı, nötrofillerin yaşam sürelerini uzatmış, üzerlerindeki CD62L ekspresyonunu düşürmüş ve ROS üretim kapasitelilerini azaltmıştır. Monositlerin, nötrofillerin ve akciğer kanseri hücrelerinin varlığı, CD8+ T hücre çoğalmasını ve üzerlerindeki inhibitör reseptörlerinin ekspresyonunu arttırmıştır. T hücre proliferasyonunun ana destekçileri olarak monositlerden yoksun olan belirli koşullar altında, akciğer kanseri hücreleri ile birlikte nötrofillerin varlığında CD8+ T hücre proliferasyonu ve aktivasyonu engellenmemiştir. KHDAK ko-kültürlerinden toplanan TIM-3mod/high CD8+ T hücreleri yüksek proliferasyon ve IFN-γ üretimi kapasitesine sahip olup yorulmamış hücre oldukları gösterilmiştir. NAC eklenen ko-kültürlerde CD8+ T hücre proliferasyonu veya TIM-3/LAG3 ekspresyonu değişmemiştir. Akciğer kanseri hücreleri, monositler ve CD8+ T hücreler ile birlikte kültürlenen nötrofillerde 4-1BBL, OX40L ve B7-2 kostimülatör genlerinin ekspresyonu artmıştır. Nötrofiller, monositler, CD8+ T hücreleri ve akciğer kanseri hücrelerini kullanarak tümör mikroçevresini kısmen modellemek için kurulan bir ko-kültür düzeninde, bulgularımız nötrofillerin CD8+ T hücre yanıtları için kritik bir modülatör olarak önemini göstermektedir.