Mycobacterium marinum biofilm: a tool to study and target persistent tuberculosis

Tuberculosis remains a widespread and deadly infectious disease, especially in the developing world. Despite the availability of effective antibiotics, treatment of the infection is challenging due to the extreme persistence of the causative pathogen Mycobacterium tuberculosis. Recent studies have shown that M. tuberculosis can form multicellular colonies, referred to as biofilms. A biofilm-like lifestyle provides bacteria with increased tolerance to external stress factors, such as physical forces and chemicals, and creates persistence-favoring environments. One of the hallmark features of biofilms is reduced susceptibility to antibiotics. M. tuberculosis is primarily an intracellular pathogen, habituating maturation-stalled phagosomes of macrophages. Biofilm-like communities of mycobacteria are suggested to reside in the extracellular environment of the host, such as surfaces of alveolar cavities and necrotic granulomas. One of the key components of bacterial communities is the extracellular matrix. Through the lessons learned from other biofilm-forming species, it is known that the matrix generally consists of polysaccharides, proteins, extracellular DNA and lipids. Components of the mycobacterial biofilm matrix have not been explicitly studied, although several studies have indicated the presence of mycolic acids and cellulose. This thesis investigates the role of cellulase and mycobacterial pilin in biofilm formation by over-expressing celA1 (MMAR_0107) and mtp (MMAR_3485) genes in Mycobacterium marinum. Both over-expression strains retained capability for planktonic growth, but their biofilm-like growth was disrupted as observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). Formation of rope-like ‘cording’ structures was disrupted in mtp over-expressing strain, and increased aggregation of bacteria was observed. Biofilm formation of celA1 over-expression strain was severely disrupted, implying that a substrate of CelA1-cellulase is an important structural component of the biofilm of M. marinum. Amyloids are being increasingly discovered from biofilms of various species. Being highly resistant proteinaceous fibers, amyloids exhibit cytotoxicity in multiple human diseases. In contrast to pathological amyloids, functional amyloids, known for both mammals and bacteria, are utilized for cellular functions. Due to the analogy of M. tuberculosis pili (MTP) with known functional amyloids curli pili of E. coli, MTP were considered as candidates for biofilm-constituting amyloid in mycobacteria. Our experiments and recent investigation by other researchers could not confirm the amyloidogenicity of MTP and therefore we applied ab initio amyloid identification approach We identified a novel mycobacterial amyloid candidate as a putative protein with a SIR2-like domain (MMRN_51880). Based on in silico analysis, the protein had aggregative sequences. The protein was produced in both biofilm and planktonic culture. The function of the protein has not been annotated yet, but the presence of SIR2-domain suggests that the protein belongs to protein deacetylases. Further studies are required for the verification of a new candidate as a novel mycobacterial functional amyloid. Overall, this study contributes to our scarce understanding of mycobacterial biofilm matrix components which could be further investigated for antibiofilm drug development purposes. The antibiofilm therapy could allow us to enhance the effect of existing antibiotics and drastically shorten the duration of antimycobacterial treatment, contributing to the eradication of the tuberculosis pandemic. Tuberkuloosi on yhä laajasti esiintyvä ja tappava infektiotauti eteenkin kehittyvissä maissa. Vaikka toimiva hoito on saatavilla, taudin parantaminen on edelleen haastavaa. Aiheuttajapatogeeni Mycobacterium tuberculosis on kehittynyt äärimäisen vastustuskykyiseksi ihmisen immuunisuojaa ja antibiootteja vastaan. Hiljattain M. tuberculosis -bakteerin on osoitettu muodostavan monisoluisia yhteisöjä eli biofilmejä. Biofilminmuodostus on tunnettu ilmiö bakteereilla, ja sen tiedetään edesauttavan bakteerien selviytymistä vaikeissa ympäristöolosuhteissa. Biofilminkaltainen elintapa on tunnettu eteenkin korkeasta antibiootinsietokyvystään. M. tuberculosis -bakteeri on ensisijaisesti solunsisäinen patogeeni, joka on erikoistunut selviytymään makrofageissa. Biofilminkaltaista elämänmuotoa ajatellaan puolestaan esiintyvän isäntäsolujen ulkopuolella. Biofilmien keskeinen tekijä on soluväliaine. Bakteerien biofilmin soluväliaine koostuu yleisimmin polysakkarideista, solunulkopuolisesta DNA:sta, proteiineista ja lipideistä. Mykobakteerien biofilmien soluväliaineen komponentteja ei tunneta täysin, mutta muutamat aiheesta tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet mm. mykolihappojen ja selluloosan osallisuuden. Tässä tutkielmassa olen tarkastellut sellulaasin ja mykobakteerien piliinin vaikutusta biofilminmuodostukseen. Tähän tarkoitukseen valmistin celA1 (MMAR_0107) ja mtp (MMAR_3485) geenejä ilmentäviä kantoja käyttäen Mycobacterium marinum -lajia. Molemmat yliekspressiokannat säilyttivät kyvyn planktoniseen kasvuun. Yliekspressiokantojen biofilminkaltainen kasvu oli kuitenkin huomattavasti villityypistä poikkeavaa konfokaalimikroskopialla tarkasteltuna. Mykobakteereille tyypilliset nauhamaiset rakenteet ilmentyivät mtp-yliekspressiokannassa aggregoituneena solumassana. Biofilmimuodostus celA1-yliekspressiokannassa oli huomattavasti heikentynyt viittaen sellulaasin substraatin olevan tärkeä rakenteellinen osa M. marinum:n -biofilmiä. Amyloideja tunnistetaan erilaisten biofilmien soluväliaineesta enenevässä määrin. Amyloidit ovat erittäin kestäviä proteiinikuituja, joiden sytotoksisia ominaisuuksia on tunnistettu ihmisen tautien yhteydessä. Funktionaaliset amyloidit, toisin kuin tauteja aiheuttavat, ovat tarpeellisia solujen toiminnoissa. M. tuberculosis -pilukset (MTP) ovat osoittautuneet aiemmissa tutkimuksissa samankaltaisiksi kuin tunnetut funktionaaliset amyloidit – E. coli:n curli pilukset. Tämän vuoksi ajatellaan, että MTP saattaa muodostaa amyloideja mykobakteereissa, mutta ilmiötä ei ole vielä osoitettu. Tämän vuoksi sovelsimme suoraa amyloidien tunnistusmenetelmää. Tunnistettu monomeeri osoittautui ennustetuksi proteiiniksi (MMRN_51880), jossa on SIR2-kaltainen domeeni. Sekvenssianalyysin perusteella tunnistetulla proteiinilla on amyloidin muodostusta mahdollistavia sekvenssejä. Proteiinia tuotetaan todennäköisesti sekä biofilmisen että planktonisen kasvun aikana. Proteiinin merkitystä ei tunneta, mutta sen sisältämä SIR2-kaltainen domeeni viittaa proteiinien deasetylaatioon. Jatkotutkimuksien avulla olisi mahdollista selvittää, muodostaako tunnistettu proteiini mykobakteerien amyloideja. Yleisesti ottaen uusi tieto mykobakteerien biofilmeistä on tärkeää, koska se mahdollistaa biofilminvastaisten lääkkeiden kehityksen. Yhdistettynä olemassa oleviin antibiootteihin hoitostrategia voisi tehostaa merkittävästi käytössä olevien antibioottien tehoa ja lyhentää antibioottikuurien kestoa helpottaen näin tuberkuloosiepidemian hävittämistä.