Evaluation of the effect of vismodegib administration on the unfolded protein mechanism of glioblastoma cells and glioblastoma stem cells

Beyin tümörlerinin oluşumuna sinyal yolaklarının düzenlenmesindeki işlevsel bozukluklar ya da nöronal kök hücrelerden farklanabilme potansiyeli katkı sağlamaktadır. Malign gliomlar en yaygın primer beyin tümörleridir. Glioblastoma (GBM) evre IV olarak sınıflandırılan en agresif formdur. Gliomların heterojen yapıda tümörler olmaları tedavilerini zorlaştırmaktadır. Kanser kök hücreleri, proliferasyona neden olabilen ve yeni tümörler oluşturabilen kanser fenotipi ile ilişkili hücrelerdir. Glioblastom kök hücrelerinin de tedavi sonrasında bu tümörlerin oluşumundan sorumlu oldukları düşünülmektedir. Son dönemlerde GBM tedavisinde Hh sinyal yolağının hedeflenmesi önem kazanmaya başlamıştır. Vismodegib (VIS), FDA tarafından onaylanmış "Hedgehog" (Hh) yolak inhibitörüdür. Bazal hücreli karsinom tedavisinde kullanılmakta olan ilaç, Hh sinyalini pozitif yönde düzenleyen "Smoothened" molekülünü inaktif hale getirir. Hh sinyali evrimsel süreçte pek çok organizmada korunmuş bir mekanizmadır. UPR (Katlanmamış Protein Cevabı) sinyal yolağı, hatalı katlanmış proteinleri tespit eder, ER'de homeostazı düzenler ve profonksiyonel salgı hücrelerinde, büyüme ve gelişimde görev almasının yanı sıra hastalıklarda da kritik rolü bulunur. GBM'lerdeki UPR, UPR'nin bu hücrelerde aktive edilmesi gerektiğini düşündüren göstergelere rağmen kapsamlı bir şekilde çalışılmamıştır: GBM'ler, yapıları ve davranışları sebebiyle tüm kemoterapötiklere genel dirençlidirler ve dahili ve harici saldırılara karşı yüksek stres tepkileri sergileyen yüksek harici radyoterapileri de tolere edebilirler. GBM'lerin bu özellikleri, hem salgı yolu işlevini sürdüren hem de değiştirilmiş metabolizma yoluyla stres direncini artıran UPR tarafından etkinleştirilmektedir. Bu çalışmada; insan glioblastom kök hücre hatlarına, VIS'in 72. saatteki IC50 dozları uygulandı. UPR'de görevli genlerden 96 tanesinin ifade düzeylerindeki değişimler gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi yapılarak belirlendi. VIS uygulamasının U87MG GBM hücrelerinde CREB3L3, SREBF1 ve INHBE genlerinde azalma; HSPA1B geninde ise artışa yol açtığı görüldü. BKKH'lerde ise en yüksek artış OS9 geninde; en yüksek azalış EIF2A geninde saptandı. INHBE geni ifadesindeki artışın ER stresi ile ilişkili olduğu bilinmekte olup U87MG hücrelerindeki kontrole göre yüksek olması GBM patogenezinde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Çalışmamızda ilk defa VIS'in GBM hücrelerinde INHBE geninin ekspresyon seviyesini regüle edebileceği gösterilmiştir. CREB3L3 geni katlanmamış protein yanıtında transkripsiyon faktörü olarak işlev gösteren proteini kodlar ve CREB3L3 genini daha önce GBM ya da farklı tipteki herhangi bir beyin kanserlerinde araştıran bir çalışma bulunmamaktadır, VIS uygulaması sonucunda bu genin ekspresyon düzeyinde azalma görülmüştür. SREBF1 geni de transkripsiyon faktörleri arasında olup protein disülfit izomerizasyonunda ve kolesterol metabolizmasının kontrolünde görev almaktadır. Literatürde GBM için bir tedavi hedefi olarak önerilen ve daha önce VIS ile ilişkilendirilmemiş olan bu genin ekspresyonundaki azalış çalışmamız için dikkat çekici bir sonuçtur. Bu çalışmada VIS uygulamasının beyin kanseri tedavisindeki potansiyel oyun değiştirici rolü UPR mekanizmasındaki etkileri üzerinden araştırılarak literatüre katkı sağlanmıştır. VIS özellikle BKKH'lerinde ısı şoku proteinleri üzerinde etkili olarak GBM patogenezinde önemli bir ajan olarak kullanım potansiyeli göstermektedir. İlk kez araştırılan VIS-UPR ilişkisi ileri çalışmalarla desteklendiği takdirde GBM ve diğer kanser araştırmaları için yol gösterici olabilme potansiyeline sahiptir.
Functional disorders in the regulation of signaling pathways or the potential to differentiate from neuronal stem cells contribute to the formation of brain tumors. Malignant gliomas are the most common primary brain tumors. Glioblastoma (GBM) is the most aggressive form classified as stage IV. The heterogeneous nature of gliomas makes their treatment difficult. Cancer stem cells are cells associated with the cancer phenotype that can cause proliferation and form new tumors. Glioblastoma stem cells are also thought to be responsible for the formation of these tumors after treatment. Recently, targeting the Hh signaling pathway has gained importance in GBM treatment. Vismodegib (VIS) is a "Hedgehog" (Hh) pathway inhibitor approved by the FDA. The drug, which is used in the treatment of basal cell carcinoma, inactivates the "Smoothened" molecule, which positively regulates the Hh signal. Hh signaling is a conserved mechanism in many organisms in the evolutionary process. The UPR (Unfolded Protein Response) signaling pathway detects misfolded proteins, regulates homeostasis in the ER, and plays a critical role in profunctional secretory cells, growth and development, as well as in diseases. The UPR in GBMs has not been extensively studied despite indications suggesting that the UPR should be activated in these cells: GBMs are generally resistant to all chemotherapeutics due to their structure and behavior and can also tolerate high external radiotherapies, exhibiting high stress responses to internal and external attacks. These properties of GBMs are activated by the UPR, which both maintains secretory pathway function and increases stress resistance through altered metabolism. In this study; human glioblastoma stem cell lines were administered IC50 doses of VIS at 72 hours. Changes in the expression levels of 96 of the genes involved in the UPR were determined by real-time quantitative PCR analysis. It was observed that VIS application decreased CREB3L3, SREBF1 and INHBE genes in U87MG GBM cells and increased HSPA1B gene. In BKKHs, the highest increase was in the OS9 gene; the highest decrease was detected in the EIF2A gene. It is known that the increase in INHBE gene expression is associated with ER stress, and the fact that it is higher in U87MG cells compared to the control suggests that it may play a role in the pathogenesis of GBM. In our study, it was shown for the first time that VIS can regulate the expression level of the INHBE gene in GBM cells. The CREB3L3 gene encodes the protein that functions as a transcription factor in the unfolded protein response, and there has been no study investigating the CREB3L3 gene in GBM or any other type of brain cancer before. As a result of VIS application, the expression level of this gene was decreased. The SREBF1 gene is also among the transcription factors and is involved in protein disulfide isomerization and control of cholesterol metabolism. The decrease in the expression of this gene, which has been suggested as a treatment target for GBM in the literature and has not been associated with VIS before, is a remarkable result for our study. In this study, potential game-changing role of VIS application in the treatment of brain cancer has been investigated through its effects on the UPR mechanism, contributing to the literature. VIS has the potential to be used as an important agent in the pathogenesis of GBM by acting on heat shock proteins, especially in BCSCs. If the VIS-UPR relationship, which was investigated for the first time, is supported by further studies, it has the potential to be a guide for GBM and other cancer researches.