Amiloglikosidaz enziminin sıcaklığa duyarlı NIPAAm/AAm kopolimer matriste tutuklanması ve maltodeksrinden glikoz şurubu üretimi

Özet iv ÖZET Bu çalışmada sıcaklığa duyarlı NIPAAm/AAm (n-izopropil akrilamid/akrilamid) kopolimer matrisinde fiziksel olarak tutuklanmış amiloglikosidaz enzimi kullamlarak maltodekstrinden sürekli glikoz şurubu üretimi araştırılmıştır. Çalışma kapsamında öncelikle serbest amiloglikosidaz enziminin en yüksek aktivite verdiği sıcaklık ve pH aralığı tespit edilmiş ve bu optimum koşullarda başlangıç enzim yükünün ve substrat derişiminin D-glikoz ilk üretim hızına (aktiviteye) olan etkisi incelenmiştir. Sonuçta 0.01 mL başlangıç enzim yükü (aktivite bazında, 45.37 g/L/sa) kullamlarak yapılan deneylerde serbest enzimin T = 60 °C 'ta ve pH 4.5 asetat tamponunda en iyi çalıştığı ve bu koşullarda 100 g/L başlangıç substrat derişiminin en yüksek D-glikoz dönüşüm hızım sağladığı tespit edilmiştir. Substratlı ve substratsız ortamda serbest enzimin deaktivasyon hız sabitleri tespit edilmiş ve substrat ortamında deaktivasyon incelendiğinde daha önce literatürde karşılaşılmadığı üzere substrat derişimi ile değişen deaktivasyon hız sabitleri elde edilmiştir. Serbest enzim kinetiğini tespit için bilgisayar ortamında nonlineer regrasyon ile literatürdeki inhibisyonlu/inhibisyonsuz tüm enzimatik hız ifadeleri taranmış ve çalışılan bütün sıcaklıklarda (30-60 °C) en uygun ifadenin substrat inhibisyonu durumunda geçerli olan Haldane kinetiği formunda olduğu bulunmuştur. Bulunan model partikül içi `difüzyon+reaksiyon` çözümünde reaksiyon hız ifadesi olarak kullanılmıştır. Çalışmanın ikinci kısmında farklı NIPAAm/AAm bileşimlerinde partiküller hazırlanarak kopolimer matrisin şişme-kasılma kinetiği incelenmiş ve dinamik şişme ve kasılma için suyun partikül içindeki etkin difüzyon katsayıları 10`5 cm2/s mertebesinde hesaplanmıştır. Enzimin endüstriyel uygulamada kullanılan çalışma sıcaklığı olan 60 °C 'ta faz geçişi gösteren matrisin % NIPAAm değeri 80 (w/w) olarak tespit edilmiştir. Amiloglikosidaz enziminin NIPAAm/AAm kopolimer matrisine immobilizasyonu çalışmaları gerçekleştirilmiş, en yüksek ve kararlı enzim aktivitesini veren partikül hazırlama koşullan tespit edilmiştir. Sonuçta; 40 mL dağıtma fazında kullanılan başlatıcı (KPS) ve CaCİ2 miktarı sırasıyla 0.4 g ve 1.2 g olduğunda ve 3.6 mL monomer fazında kullanılan çapraz bağlayıcı (MBAAm); 0.033 g/mL, hızlandırıcı (TEMED); 0.3 mL, sodyum aljinat; 0.03 g, NIPAAm monomeri; 0.394 g, AAm monomeri 0.094 g, enzim yükü; 0.8 mL olduğunda elde edilen 2.7 mm çapındaki (+ 4 °C 'ta) partiküller gerek yüksek görünür aktivite ve gerekse kararlılık açısından en uygun bulunmuştur. Bu koşullarda hazırlanan partiküllerin gözlenir aktivitesinin gerçek immobilize enzim aktivitesinin % 14 'ü olduğu tespit edilmiştir. SEM ve FTIR analizinden elde edilen sonuçlar NIPAAm/AAm kopolimer matrisinin oldukça gözenekli bir iç yapıya sahip olduğu ve immobilize edilen amiloglikosidaz enziminin fiziksel bir tutuklama yönteminden beklenildiği üzere kimyasal olarak matrisle etkileşmediğini göstermiştir. Bu çalışmada serbest ve immobilize enzimin aktivasyon enerjileri sırasıyla 13.24 ve 7.36 kcal/gmol olarak tespit edilmiştir. BuÖzet sonuç immobilize enzimin sıcaklık değişimine serbest enzim kadar duyar olmadığım göstermiştir. Ayrıca immobilize enzim partiküllerinin sürekli beslemeli karıştırmalı reaktörde (SBKR) farklı alıkonma zamanlarında (0.51-12 sa) ve işletim sıcaklıklarında (30-60 °C) D-glikoz üretim performansı incelenmiş ve maltodekstrinin farklı sıcaklıklarda partikül içi etkin difüzyon katsayıları 10`6 cm2/s mertebesinde hesaplanmıştır. SBKR 'de enzim immobilize partiküllerin D-glikoz üretim kararlılığı incelenmiş ve sıcaklık döngüsü uygulanan sistemde kasılma-şişme hareketinin sistem performansı üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Sonuçta sıcaklık döngüsü uygulamasının amaçlanan performans artışım hiçbir koşulda veremediği görülmüştür. Bu amaca yönelik olarak hesaplanan görünür Thiele modülü değerleri (0.9-3) çalışılan bütün sıcaklıklarda prosesin kimyasal reaksiyon kontrollü olmadığını ancak baskın bir difüzyon kontrolünün de olmadığım göstermiştir. Farklı bir reaktörde immobilize partiküllerin performansının izlenmesi amacıyla dolgulu kolonda farklı alıkonma zamanlarında çalışılmış ve ayrıca kolonda D-glikoz üretim kararlılığı incelenmiştir. Enzim immobilize partiküllerin kararlılığının (~300 saat) incelendiği SBKR ve dolgulu kolon deneylerinden elde edilen sonuçlar immobilizasyonun enzim deaktivasyonunu önemli derecede yavaşlattığım ve aynı koşullarda serbest enzimin çok kısa sürede deaktive olduğunu göstermiştir. Literatürde NIPAAm/AAm kopolimer matrisinde tutuklu amiloglikosidaz enzimi kullanarak SBKR ve dolgulu kolonda maltodekstrinden sürekli glikoz şurubu üretimini araştıran ve sıcaklık döngüsü uygulamasının reaktör performansına etkisini inceleyen başka bir çalışma yoktur. Bu çalışmada sıcaklık döngüsünün uygulaması, enzim kararlılığının ve performansının artırılmasına yönelik deneysel optimizasyon, serbest enzim ve desteğe ait kinetik ve kütle aktarım katsayılarının bulunması, substrat ve deaktive olan enzimin kullanım zorluğuna rağmen ticari proseste kullanılanla aynı seçilmesi çalışmayı literatürde orjinal hale getirmekte ve endüstriyel uygulama olanağım artırmaktadır. Anahtar kelimeler: Amiloglikosidaz, maltodekstrin, sıcaklık duyarlı polimer, n-izopropil akrilamid, difüzyon ve reaksiyon modeli, etkin difüzyon katsayısı, sürekli glikoz üretimi. Abstract vi ABSTRACT In this study, the production of glucose syrup from maltodextrin using amyloglucosidase enzyme entrapped in a thermo-responsive NIPAAm/AAm (n-isopropylacrylamide/acrylamide) copolymer matrix was investigated. Firstly, optimum temperature and pH range for free enzyme activity were determined and then effects of initial enzyme load and substrate concentration on the initial D-glucose production rate (activity) were examined at these optimum conditions. As a result, experiments conducted with 0.01 mL initial free enzyme load (45.37 g/L/h, in terms of activity) indicated that free enzyme gave the optimum activity at T=60 °C and pH 4.5 acetate buffer, and 100 g/L initial substrate concentration provided the highest D-glucose conversion rate at these optimum conditions. Deactivation rate constants for the free enzyme used in substrate-free and substrate- containing medium were determined and for the latter one deactivation rate constants as a function of substrate concentration -not reported in literature before- were obtained. For the determination of free enzyme kinetics, all enzymatic rate expressions in literature with or without inhibition were searched with nonlinear regression analysis through Systat® canned program and Haldane kinetics for substrate inhibition gave the best fit for the experimental data at all temperatures studied (30-60 °C). This model was used in the `diffusion+reaction` solution within the particle as the reaction rate expression. In the second part of the study, particles having different NIPAAm/AAm compositions were prepared and swelling-shrinking kinetics of copolymer matrix were investigated. Effective diffusion coefficients of water in the particle for the dynamic swelling and shrinking cases were determined with the order of magnitude 10` cm /s. NIPAAm % value of copolymer matrix having the LCST (lower critical solution temperature) of 60 °C, corresponding to the industrial operating temperature of amyloglucosidase, was found as 80 % (w/w). Entrapment of amyloglucosidase in the NIPAAm/AAm copolymer matrix was realized and then particle preparation conditions for the highest and most stable enzyme activity were determined. As a result, particles (2.7 mm in diameter, at 4 °C) prepared by using 40 mL continuous phase having 0.4 g initiator (KPS) and 1.2 g CaCb, and 3.6 mL monomer phase having 0.3 mL accelerator (TEMED), 0.9 mL cross-linker (from the solution of 0.033 g MBAAm /mL), 0.03 g sodium alginate, 0.394 g NIPAAm, 0.096 g (AAm) and 0.8 mL enzyme provided the optimum observable enzyme activity. Observable activity of the immobilized enzyme was determined as 14 % of the real enzyme activity immobilized. FTIR and SEM analysis of enzyme-free and enzyme immobilized particles indicated that NIPAAm/AAm copolymer matrix has very macroporous internal structure and enzyme molecules were entrapped only physically within the macroporous matrix and there was no chemical interaction between enzyme and matrix.Abstract vii In this study activation energies of free and immobilized enzyme were determined as 13.24 and 7.36 kcal/gmol, respectively. This result indicated that temperature sensibility of immobilized enzyme was not as much as free enzyme. Finally, D-glucose production performance of enzyme immobilized particles in a continuously fed stirred tank reactor (CFSTR) for different retention times (0.51-12 h) and operating temperatures (30-60 °C) were investigated and effective diffusion coefficients of maltodextrin at these operating temperatures were determined with the order of magnitude 10`6 cm2/s. D-glucose production stability of enzyme immobilized particles was examined and the effect of shrinking-swelling behaviour on the system performance was investigated in a periodically changing temperature cycle. As a result, application of temperature cycling did not provide expected performance enhancement for all cases studied. Calculated observable Thiele modulus values (0.9-3) indicated that the process was neither chemical reaction controlled nor dominantly diffusion controlled. Performance (at different retention times) and stability of enzyme immobilized particles were investigated also in a packed bed reactor. Experiments conducted as long as ~300 h using CFSTR and packed bed for the investigation of stability of enzyme immobilized particles indicated that immobilization slowed down the deactivation of enzyme significantly and free enzyme under the same conditions deactivated in a very short period of time. In literature there is no publication reporting the investigation of continuous glucose production from maltodextrin by using amyloglucosidase enzyme entrapped in a thermo-responsive copolymer matrix and effect of temperature cycling on the reactor performance. Application of periodic temperature cycling, experimental optimization for the enhancement of performance and stability, determination of kinetic and mass transfer coefficients of free enzyme and immobilized enzyme matrix, selection of commercial substrate and enzyme in spite of difficult handling make this study original in literature and give opportunity for the industrial use. Keywords: Amyloglucosidase, maltodextrin, thermo-responsive polymer, n-isopropyl acrylamide, diffusion and reaction model, effective diffusion coefficient, continuous glucose production. 230