Polyhydroxybutyrate microspheres as potential embolization and chemoembolization agent

ııı ABSTRACT Embolization and chemoembolization has been accepted forms of endovascular therapy for many years. Several materials, both natural or synthetic origin have been used for embolization including particles, sponges or oil emulsions but no single agent has been completely satisfactory in all cases yet. In this study, we attempted to prepare microspheres from microbial biodegradable polyesters i.e. polyhydroxy- alkonoates for potential embolization and chemoembolization agent. Polyhydroxy- butyrate (PHB) was produced from Hyphomicrobium Zavarzinii. The PHB microspheres in the size range of 5-120um were prepared by a solvent evaporation technique, in which methylene chloride, distilled water and polyvinyl alcohol were utilized as the solvent, dispersion medium and emulsifier, respectively. Effects of the initial polymer/solvent ratio, the emulsifier concentration, and the stirring rate on the size and size distribution of the PHB microspheres were investigated. It was found that the size and size distribution of the PHB microspheres were increased by an increase in the polymer/solvent ratio and by a decrease in the emulsifier concentration. The size of the microspheres was decreased by increasing of the stirring rate, while the size distribution became narrower. It was possible to obtain PHB with very narrow size distributions by applying gravity field-flow fractionation technique. In the second part of this study, drug loading and in-vitro drug release from these matrices were also investigated. A tuberculostatic agent, Rifampicin was selected as a model drug for this purpose. The effects of polymer/solvent ratio, emulsifier concentration, stirring rate and initial drug concentration were evaluated for drug loading and microsphere size and drug concentration were evaluated for drug release mechanism. In the third part of this study polyhydroxybutyrate (PHB) produced by a methanol-utilizing bacteria was used to prepare microspheres by in the size range of 120-200 um for in in- vivo embolization using the same technique mentioned previously i.e. solvent evaporation technique. In in- vivo evaluations a post-renal embolizations were performed in the test animals, i.e. Mongal dogs. Renal angiograms were obtained before and after embolization by following the standard catheterization procedures. The embolizations were technically successful in all animals. It did not show any problems associated with solid materialapplication such as tedious preparation, unequal suspension, high friction, difficulty in injecting through the chatheter and temporary occlusion. The histpathological evaluation of PHB microspheres as an embolic agent were also investigated 24 h and 7 days after the embolization. All the embolized kidneys were shown a pathological changes associated with kidney's infraction due to renal artery obstruction and blockage a blood supply to kidneys. However there was neither any inflammatory reaction nor any evidence of tissue toxicity due to PHB microspheres. Based on our results obtained in this study, PHB microspheres could be considered an potential embolic and chemoembolic agent. ÖZET Embolizasyon ve kemoembolizasyon önemli endovasküler tedavi yöntemleridir. Embolizasyonda partikül, süngerimsi ve yağ emülsiyonları şeklinde doğal ve sentetik kökenli materyallerden hazırlanan değişik yapılar kullanılmış, ancak henüz her türlü uygulamada kullanılabilecek tek bir ajan geliştirilememiştir. Bu çalışmada, potansiyel bir embolizasyon ve kemoembolizasyon ajanı olarak mikrobiyal, biyoparçalanabilir olabilen bir poliester olan polihidroksibütirat (PHB) kallanılarak mikroküre formunda ajanlar hazırlanmıştır. PHB, Hyphomicrobium Zavarzinii' den üretilmiştir. PHB mikroküreler çözücü buharlaştırma tekniği kullanılarak 5-120 um aralığında hazırlanmıştır. Bu işlemde çözücü olarak metilen klorür, dağıtma ortamı ve emülsifier olarak sırasıyla damıtık su ve polivinil alkol kullanılmıştır. Başlangıç polimer/çözücü oram, emülsifier derişimi ve karıştırma hızının PHB mikroküre boy ve boy dağılımına etkileri araştırılmıştır. PHB mikroküre boy ve boy dağılımının başlangıç polimer/çözücü oranının artması ve emülsifier derişiminin azalması ile arttığı tespit edilmiştir. Karıştırma hızındaki azalma ile mikrokürelerin çapı artmış ancak boy dağılımı azalmıştır. Hazırlanan PHB mikroküreler geniş boy dağılımına sahip olduğu için akış halinde yerçekimi etkisiyle fraksiyonlama tekniği kullanılarak çok dar boy dağılımına sahip mikrokürelerin elde edilmesi mümkün olmuştur. Çalışmanın ikinci bölümünde, PHB mikrokürelere ilaç yüklenmiş ve ilaç salımı incelenmiştir. Bir tüberküloz ajanı olan Rifampicin ilaç yükleme ve salım çalışmaları için model ilaç olarak seçilmiştir. Bu bölümde polimer/çözücü oranının, emülsifier derişiminin, karıştırma hızının ve başlangıç ilaç derişiminin ilaç yükleme oranına, mikroküre çapının ve mikroküre ilaç içeriğinin ilaç salım mekanizmalarına etkileri araştırılmıştır. Çalışmanın üçüncü bölümünde embolizasyon uygulamalarında kullanılmak üzere PHB mikroküreler, metanolün yer aldığı ortamdaki bakterilerden üretilen PHB kullanılarak çözücü buharlaştırılması tekniği ile 120-200 um aralığında üretilmiştir. In-vivo çalışmalar deney hayvanı olarak seçilen Mongrel cinsi köpeklerde yapılan post-renal embolizasyon işlemleriyle gerçekleştirilmiştir. Renal anjiyogramlarembolizasyon öncesi ve sonrası Standard kateterizasyon teknikleri kullanılarak ayrı ayrı elde edilmiştir. Hayvanlarda yapılan embolizasyon çalışmaları teknik olarak başarılı olmuştur. Mikroküreler ile yapılan uygulamalarda, örneğin hazırlanma zorluklan, yetersiz süspansiyon homojenitesi, yüksek sürtünme, kateter içerisine enjeksiyon güçlükleri ve geçici tıkama gibi problemler gözlenmemiştir. Embolik ajan olarak kullanılan PHB mikroküreler, embolizasyondan sonraki 24 saatte ve 7 günde histopatolojik olarak değerlendirilmiştir. Embolize edilen böbreklerin tamamında, böbreklere kan besleyen renal arterlerdeki tıkanmadan dolayı böbreğin yapısında bozunmalar şeklinde patolojik değişiklikler gözlenmiştir. Bununla birlikte, PHB mikrokürelerden dolayı herhangi bir yangı reaksiyonu veya doku toksisitesi meydana gelmemiştir. Sunulan bu çalışmaya göre hazırlanan PHB mikroküreler potansiyel bir embolik ve kemoembolik ajan olarak değerlendirilebilir. 100