Kan glikoz seviyesinin belirlenmesi için geliştirilen sandviç tipi glikoz oksidaz elektrodu

ÖZET Bu araştırmanın amacı, kandaki glikoz derişiminin ölçümünde kullanılacak sandviç türü bir glikoz oksidaz elektrot geliştirilmesidir. Pt-Ag/AgCİ amperometrik esaslı bir elektrod kullanılmıştır. Tanıyıcı tabaka, sandviç benzeri bir yapıda, yangeçirgen iki membran araşma yerleştirilmiş bir enzim tabakasından oluşturulmuştur. Araştırmanın ilk bölümünde çözücü döküm yöntemiyle değişik gözenek yapısında, poliüretan, polietersülfon, selüloz asetat membranlar üretilmiştir. Selüloz asetat membranlar, KOH ile deasetillenerek modifiye edilmiştir. Satin alınma yoluyla değişik gözenek yapısında polikarbonat membranlar temin edilmiştir. Bu membranlar, plazma polimerizasyonuyla HMDS ile veya PVAL adsorpsiyonu ve çapraz bağlanması ile kaplanarak modifiye edilmiştir. PVAL kaplı membranlara, CNBr aktivasyonuyla heparin immobilize edilmiştir. Tüm bu membranlar, SEM, FTIR-ATR ve temas açısı ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Farklı miktarlarda enzim (GOD), seyreltici protein (BSA) ve çapraz bağlayıcı (glutaraldehit) kullanılarak hazırlanan enzim tabakaları, bu membranlar araşma değişik kombinasyonlarda yerleştirilerek, seçicilik, doğrusallık, cevap süresi, duyarlılık ve kanla uyuşabilirlik yönünden en uygun sandviç yapısı araştırılmıştır. Bulunan önemli sonuçlar şu şekilde özetlenebilir: (i) Elektrod seçiciliği, iç membran olarak kullanılan membranın hem yapısı (gözenek boyutları ve yükü) hemde elektroaktif maddelerin boyut ve yükü ile ilgilidir. Araştırma kapsamında denenen membranlardan seçicilik yönünden en uygun membran, çözücü döküm yöntemiyle hazırlanan PES membrandır; (ii) enzim elektrodun substrat derişimi yönünden kullanılabileceği derişim aralığını gösteren doğrusallık sınırı, sandviç türü elektrodda dış membran kütle transfer özellikleri değiştirilerek kontrol edilebilir. Hasta kanında ulaşılan en yüksek glikoz derişimi 30 mM civarındadır. Bu doğrusallık sınırına, polikarbonat membranın modifiye formlarıyla ulaşılabilmektedir. HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranlarda doğrusallık üst sınırı 60 mM'dır; (iii) elektrod cevap süresi, kullanılan sandviçin hem kütle transfer hemde tepkime hızlarıyla ilgilidir. Sunulan araştırma kapsamında test edilen sandviçlerde cevap süresi 46 ile 225 s arasında değişmektedir. Doğrusallık sının da göz önüne alınırsa, cevap süresi 48 s olan HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranın en uygun dış membran olduğu söylenebilir; (iii) araştırmada incelenen sandviçlerle oluşturulan elektrodların, doğrusallık sınırlan ile duyarlılıklan ters yönde değişmektedir. PC membran dış membran olarak kullanıldığında doğrusallık sının ve duyarlılık 10 mM ve 54.05 nA/mM iken, HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC memoranda aynı değerler sırasıyla 60 mM ve 8.96 nA/mM'dır. Modifiye PC'm11 doğrusallık sının ve cevap süresi de göz önüne alındığında, duyarlıklık yönünden de yeterli, dolayısıyla dış membran olarak en uygun olduğu söylenebilir; (iv) enzim tabakası, hem kütle transfer hemde tepkime hızlan dolayısıyla elektrod performansım etkilemektedir. Elektrod cevap süresi ve doğrusallık sının yönünden en uygun büeşimin (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml tampon olduğu söylenebilir; (v) kanla uyuşabilirlik, dış membran yüzey özellikleri ile ilgilidir. Kullanılan membran yüzey alam düşük olduğundan, membranlann hiçbiri önemli bir kan hücresel eleman kaybına yol açmamıştır. En yüksek protein adsorpsiyonu, HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membranda gözlenmiştir. Ancak albumin ön adsorpsiyonu, bu membrandaki protein adsorpsiyonunu önemli miktarda azaltmıştır. Tüm membranlar kanın pıhtılaşmasına yol açmaktadır, dolayısıyla antikoagülant kullanımına ihtiyaç vardır. Heparin immobilizasyonu yeterli etkinlikte yapılamadığı için, pıhtılaşma süresi uzatılmasına rağmen tamamen önlenememiştir; (vi) geliştirilen elektrodlar ile kandan doğrudan glikoz ölçümü yapmak mümkündür. Diğer yöntemlerle korelasyon en iyi HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile modifiye edilmiş PC membramn dış membran olarak kullanıldığı durumda elde edilmiştir. Seçicilik, doğrusallık, cevap süresi, duyarlılık ve kanla uyuşabilirlik yönünden en uygun sandviç yapısı şöyledir: (i) iç membran: PES, (ii) enzim tabakası: (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml tampon derişiminde protein karışımı ve (iii) dış membran: HMDS kullanılarak plazma polimerizasyonu ile yüzeyi modifiye edilmiş PC membran. Ill ABSTRACT The aim of this study is to develop a sandwich type glucose oxidase electrode to measure the blood glucose level. The amperometric electrode utilizes Pt anode and Ag/AgCl as reference. The recognition system is in the form of sandwich made up of two semipermeable membrane with an enzyme layer placed in between them. In the first part of the study, polyurethane, polyethersulphone and cellulose acetate membranes with different pore structure were prepared by solvent casting method. Cellulose acetate membranes were modified by deacetylation with KOH. Polycarbonate membranes with different pore sizes were purchased from the manufacturer. The surfaces of those membranes were modified either by HMDS utilizing plasma polymerization technique, or by PVAL adsorption and cross-linking. PVAL coated surfaces were further modified by heparin immobilization via CNBr activation. All membranes were characterized by SEM, FITR-ATR and Contact Angle measurements. The enzyme layers were prepared by using different amount of enzyme (GOD), inactive protein (BSA) and crosslinking agent (gluteraldehyde). Those enzyme layers were placed in between different combinations of membrane layers to investigate the performance of electrode on the basis of; selectivity, linearity, response time, sensitivity and blood compatibility. The results may be summarized as follows; (i) The selectivity of the electrode is directly proportional with the physical and physicochemical structure (pore size, charge density, etc.) of the inner membrane and chemical properties and sizes of electroactive compounds. Only the PES membrane is totally satisfies the requirements of the selectivity, (ii) The linearity of the electrode can be described as the upper limit of the linear response of electrode through the substrate concentration, which can be controlled by changing the mass transfer properties of the outer membrane. The upper limit of the glucose concentration of the blood in diabetic patients is approximately 30 mM. The sanwich type enzyme electrode can reach to that limit by utilizing modified polycarbonate membranes. The linearity of the electrode was extended to 60 mM by employing the HMDS modified PC membranes, (iii) The response time of the electrode is related to the mass transfer and reaction rates in the sandwich. In this study, the response time of the sandwiches varies between 46-225 s. Including the linear range of the membrane, the HMDS modified PC membranes with 48 s of response time can be considered as the most convenient outer membrane, (iv) TheIV sensitivity and the linearity of the sandwiches are generally inversely proportional to each other. In the case of utilizing PC membrane as outer layer in the sandwich, the linearity and sensitivity becomes 10 mM and 54.05 nA/mM, however, in the case of HMDS-PC membrane, those values becomes 60 mM and 8.96 nA/mM. Considering the linearity, response time, and acceptable sensitivity, Plasma polymerization modification of PC membranes with HMDS, can be evaluated as the most suitable membrane as an outer layer, (v) The enzyme layer affects the electrode performance by mass transfer and reaction rate. The best combination of enzyme and inactive protein was found to be (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml buffer, for better linearity and response time, (vi) Blood compatibility is directly related to the surface characteristics of the outer membrane which faces the biologic environment including substrate, and blood components. Due to the very small contact area utilization in the electrode sandwich, not a significant change in blood cells were observed. The highest protein adsorption was observed on HMDS-PC surfaces. The treatment with the albumin pre- adsorption to that surface significantly decreased the plasma proteins adsorption. All membranes were coagulated the blood, so the requirement for the usage of anticoagulation reagent is arised. The immobilisation of heparin to the surfaces has extended the coagulation time, but could not eliminate completely, (vii) The direct measuring of glucose concentration from blood showed a good agreement with the `conventional hospital laboratory findings`. The best correlation was achieved by employing HMDS-PC membrane. The best sandwich structure on the basis of selectivity, linearity, response time, sensitivity and blood compatibility is: (i) inner membrane: PES (ii) enzyme layer: the mixture of (30 mg GOD+200 mg BSA)/ml buffer (iii) outer membrane: Plasma polymerization modification of PC membranes with HMDS. 159