Insights on the spatiotemporal organization of integrins and their ligands using quantitative biophysical tools

Cotutela Universitat Politècnica de Catalunya i Università degli Studi di Firenze
The migration of leukocytes from the blood stream to sites of injury and infection in the extravascular tissues is fundamental for the immune response. Two of the main receptors mediating this process are the integrins aLß2 and a4ß1, both expressed on the leukocyte cell membrane, which bind to their respective ligands ICAM-1 and VCAM-1, expressed on endothelial cell (EC) membrane. The dynamic and lateral organization of integrins on the cell membrane has been shown to be crucial in the regulation of cell adhesion. Likewise, organization of ligands in small domains (clusters) would probably reinforce the bonds formed with the integrins, thus increasing leukocyte adhesion. However, how the spatiotemporal behavior of integrins and their ligands is affected by the influence of external factors, such as mechanical and/or biochemical stimuli, has not been extensively studied. In addition, the impact of such spatiotemporal changes in the process of leukocyte adhesion and migration has not been addressed yet. The main aim of this thesis has been to address these questions using a combination of state-of-art biophysical tools, including advanced cell imaging, single molecule dynamic approaches, cell mechanical stimulation, and custom-designed algorithms for data quantification. From the technical side, our general approach involved the use of single particle tracking (SPT) approaches to monitor the dynamics of individual molecules implicated in the process of the cell adhesion, in combination with different super-resolution microscopy techniques, such as STED and STORM, to visualize changes in their nanoscale organization upon the influence of biochemical and/or mechanical stimuli. To mechanically stimulate cells we developed two different approaches; namely, a mechanical stretching device and a parallel-plate flow chamber (PPFC). We integrated these devices into our single molecule set-up and succeeded in recording the diffusion of integrins on cells plated on the mechanica
La migración de leucocitos desde el torrente sanguíneo a sitios de lesión e infección es fundamental en la respuesta inmune. Dos de los principales receptores que median este proceso son las integrinas aLß2 y a4ß1, que se expresan en la membrana celular de los leucocitos y se unen a sus respectivos ligandos ICAM-1 y VCAM-1, ambos localizados sobre la membrana de células endoteliales (CE). Se ha demostrado que la dinámica y la organización lateral de las integrinas sobre la membrana celular son cruciales en la regulación de la adhesión celular. Asimismo, es muy probable que la organización de los ligandos en pequeños dominios refuerce los enlaces formados con las integrinas, fortaleciendo así la adhesión celular. Sin embargo, cómo el comportamiento espacio-temporal de las integrinas y sus ligandos es afectado por factores externos, tales como estímulos mecánicos y/o bioquímicos, no ha sido ampliamente estudiado. Además, el impacto de estos cambios espacio-temporales en el proceso de adhesión y migración leucocitaria aún no ha sido abordado. El objetivo principal de esta tesis ha sido abordar estas interrogantes usando una combinación de herramientas biofísicas de última generación que incluyen avanzadas técnicas de visualización, dinámica de moléculas individuales, estimulación mecánica de células y desarrollo de algoritmos para la cuantificación de datos. Con este fin hemos utilizado métodos de seguimiento de partículas individuales para monitorizar la dinámica de moléculas individuales, en combinación con técnicas de microscopía de super-resolución, como STED y STORM, para visualizar cambios en su organización a nano-escala tras la estimulación bioquímica y/o mecánica. Para estimular las células mecánicamente hemos desarrollado dos métodos: un dispositivo de estiramiento y una cámara de flujo de placa paralela. Ambos dispositivos fueron integrados a nuestro montaje experimental de detección de moléculas individuales y el primero fue exitosamente utilizado en la car
Postprint (published version)