Optimizando la purificación de ornitina transcarbamilasa humana (OTC) producida recombinantemente

[ES] La ornitina transcarbamilasa (OTC) es un enzima mitocondrial que cataliza el segundo paso del ciclo de la urea, la reacción entre carbamil fosfato y ornitina para formar citrulina y fosfato. Esta ruta metabólica convierte el amonio derivado del catabolismo proteico, que es altamente tóxico, en urea, molécula inocua que se elimina en la orina. [1] Mutaciones en el gen para OTC (Xp21.1) causan la deficiencia de OTC (OTCD), el error más frecuente del ciclo de la urea. Los síntomas de OTCD se deben a la toxicidad del amonio acumulado y son variables dependiendo de la mutación presente en hemicigosis en los pacientes. Su forma más severa, neonatal temprana, generalmente afecta a varones, manifestándose con irritabilidad, falta de energía y apetito, letargia, convulsiones y coma. Aunque tratable, la OTCD puede conducir a la muerte o al retraso del desarrollo, discapacidad intelectual y daño hepático. Con menos frecuencia, la OTCD se manifiesta tardíamente, generalmente en presentaciones menos graves, tanto en hombres como en mujeres. Sus síntomas pueden incluir episodios de delirio, nivel reducido de conciencia, dolores de cabeza, vómitos, convulsiones y pérdidas prolongadas de conciencia en situaciones de estrés catabólico (parto, accidentes, cirugía, etc). [1] Para entender el funcionamiento de la OTC, establecer correlaciones genotipo-fenotipo y determinar el impacto de las mutaciones descritas (la mayoría de ellas sustituciones de aminoácido [2]) sobre la estabilidad, la actividad y los parámetros cinéticos, es clave producir OTC humana recombinante. En el laboratorio esto se consigue utilizando un sistema de expresión en E. coli [3] en el que la forma madura de OTC humana (es decir, sin secuencia señal de internalización mitocondrial) se coexpresa en presencia de chaperonas sobreexpresadas que favorecen su correcto plegamiento [3]. El procedimiento de purificación empleado (modificado de [4]) es laborioso, implica cinco etapas de purificación, incluyendo precipi
[EN] Ornithine transcarbamylase (OTC) is a mitochondrial enzyme that catalyzes the second step of the urea cycle, the reaction between carbamyl phosphate and ornithine to form citrulline and phosphate. This metabolic pathway converts ammonium derived from protein catabolism, which is highly toxic, into urea, an innocuous molecule that is eliminated in the urine. [1] Mutations in the gene for OTC (Xp21.1) cause OTC deficiency (OTCD), the most frequent error of the urea cycle. The symptoms of OTCD are due to the toxicity of the accumulated ammonium and are variable depending on the mutation present in hemizigosis in patients. It s more severe, early neonatal form usually affects males, festering with irritability, lack of energy and appetite, lethargy, seizures and coma. Although treatable, OTCD can lead to death or developmental delay, intellectual disability and liver damage. Less frequently, OTCD manifests itself late, usually in less severe presentations, in both men and women. Its symptoms may include episodes of delirium, reduced level of consciousness, headaches, vomiting, seizures and prolonged loss of consciousness in situations of catabolic stress (childbirth, accidents, surgery, etc). [1] To understand the functioning of OTC, establish genotype-phenotype correlations and determine the impact of the described mutations (most of them amino acid substitutions [2]) on stability, activity and kinetic parameters, it is key to produce recombinant human OTC . In the laboratory this is achieved using an expression system in E. coli [3] in which the mature form of human OTC (ie, without a mitochondrial internalization signal sequence) is co-expressed in the presence of overexpressed chaperones that favor its correct folding [3]. The purification procedure employed (modified from [4]) is laborious, involving five purification steps, including ammonium sulfate precipitation, dialysis and ion exchange chromatography. Affinity purification using as ligand N-5-phosphonace