Structure-function interplay in the mode of action of the Penicillium chrysogenum antifungal protein PAF

Pilze sind eine häufige Ursache für menschliche Gesundheitsprobleme. Aufgrund der stetig steigenden Zahl von Pilzinfektionen und der abnehmenden Wirksamkeit etablierter antimykotischer Medikamente muss die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung dieser Infektionen gefördert werden. Antimikrobielle Proteine und Peptide (AMPs) sind eine potenzielle Quelle für die Erforschung neuer Therapeutika. In den vorliegenden Studien wurden der antifungale Wirkmechanismus und die Struktur-Funktions-Beziehung des Penicillium chrysogenum antifungalen Proteins (PAF) detailliert untersucht. Dieses Wissen stellt eine Grundvoraussetzung für weitere Entwicklungen dar. Mit Hilfe eines neu entwickelten Expressionssystems auf der Basis von Penicillium chrysogenum wurden modifizierte PAF-Proteinvarianten hergestellt. Unterschiedliche Proteinmotive von PAF (hydrophile, hydrophobe und aromatische Bereiche; positiv und negativ geladene Proteindomänen; das evolutionär konservierte γ-core Motiv) konnten untersucht werden, indem spezifische Aminosäuren innerhalb dieser Motive durch ortsspezifische Mutagenese ausgetauscht wurden. Die Aminosäuren wurden anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften ausgewählt, um die Eigenschaften der jeweiligen Proteinmotive zu modifizieren und die Auswirkungen des Austausches auf die Proteinstruktur und -funktion zu untersuchen. Dabei wurde eine breite Palette von PAF-Varianten generiert: PAF(Y48Q) und PAF(F31N) für hydrophobe/aromatische Domänen; PAF(D19S) und PAFD53S/D55S für negative Domänen; PAF(T8Y/S10K) und PAF(T8K/K9T/S10K/E13K) für das γ-core Motiv. Basierend auf dem γ-core Motiv wurden die synthetischen, 14-Aminosäure langen Peptide Pγ, Pγvar und Pγopt generiert. Im ersten Schritt wurde die antifungale Aktivität dieser AMPs auf pilzliche Modellorganismen wie Aspergillus niger, Neurospora crassa und auf die humanpathogene Hefe Candida albicans in verschiedenen experimentellen Ansätzen bestimmt. Durch Fluoreszenzmarkierung konnte dabei erstmals die Aufn
Fungi are a major cause of human health problems. Due to the steadily increasing number of fungal infections and the decreasing effectiveness of established antifungal drugs, the development of novel strategies to counteract the fungal burden has to be promoted. Antimicrobial proteins and peptides (AMPs) offer a potential source for new therapeutics. In these studies, the antifungal mode of action and the structure-function relation of the Penicillium chrysogenum antifungal protein (PAF) were investigated in detail, which is a prerequisite for further developments. With a newly introduced Penicillium chrysogenum expression system, the efficient production of modified PAF protein variants was carried out. Distinct protein motifs of PAF (hydrophilic, hydrophobic and aromatic patches; positively and negatively charged protein domains; the evolutionary conserved γ-core motif) were investigated by exchanging specific amino acids within these motifs by site-directed mutagenesis. The amino acids were selected to modify the physicochemical properties of the respective protein motifs and to examine the effects of the exchanges on the protein structure and function. In the course of this, a broad set of PAF variants was generated: PAF(Y48Q) and PAF(F31N) for hydrophobic/aromatic domains; PAF(D19S) and PAF(D53S/D55S) for negative domains; PAF(T8Y/S10K) and PAF(T8K/K9T/S10K/E13K) for the γ-core motif. Based on the γ-core motif, the synthetic 14-amino acid peptides Pγ, Pγvar and Pγopt were created. The antifungal activity of these AMPs was determined on fungal model organisms such as Aspergillus niger, Neurospora crassa and the human-pathogenic yeast Candida albicans in various ways. By fluorescence labelling, it was for the first time possible to directly investigate the uptake of PAF into sensitive fungi. The AMP structures were determined by (nuclear magnetic resonance) NMR and (electronic circular dichroism) ECD spectroscopy. In general, none of the protein variants showed r
Christoph Sonderegger, MSc
Kumulative Dissertation aus vier Artikeln
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Dissertation Medical University of Innsbruck 2018