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Natural Products are molecular “special equipment” that impart survival benefits on their producers in nature. Due to their evolved functions to modulate biology these privileged metabolites are substantially represented in the drug market and are continuing to contribute to the discovery of innovative medicines such as the recently approved semi-synthetic derivative of the bacterial alkaloid staurosporin in oncology indications. The innovation of low molecular weight compounds in modern drug discovery is built on rapid progress in chemical, molecular biological, pharmacological and data sciences which together provide a rich understanding of disease-driving molecular interactions and how to modulate them. NPs investigated in these pharmaceutical research areas create new perspectives on their chemical and biological features and thereby new chances to advance medical research. New methods in analytical chemistry linked with searchable NP-databases solved the issue of reisolation and enabled targeted and efficient access to novel molecules from nature. Cheminformatics delivers high resolution descriptions of NPs and explores the substructures that systematically map NP-chemical space by sp3-enriched fragments. Whole genome sequencing has revealed the existence of collocated gene clusters that form larger functional entities together with proximate resistance factors thus avoiding self-inhibition of the encoded metabolites. The analysis of bacterial and fungal genes provides tantalizing glimpses of new compound-target pairs of therapeutic value. Furthermore, a dedicated investigation of structurally unique, selectively active NPs in chemical biology demonstrates their extraordinary power as shuttles between new biological target spaces of pharmaceutical relevance.

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Die lösliche, NAD+-reduzierende Hydrogenase (SH) aus Ralstonia eutropha H16 ist eine Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenase. Das heißt, der Umsatz von H2 im Hydrogenasemodul des Enzyms ist an die Reduktion von NAD(P)+ im NAD(P)H:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul gekoppelt. Die SH ist Vertreter des Subtyps, der auch in Gegenwart von O2 katalytisch aktiv ist. Dies wird ermöglicht durch eine reduktive Entfernung von O2, die nach dem aktuellen Modell abhängig ist vom rückläufigen e--Transport vom NADH:Akzeptor-Oxidoreduktasemodul zum aktiven [NiFe]-Zentrum in der großen Hydrogenaseuntereinheit. Der Einfluss des FeS-Clusters in der kleinen Hydrogenaseuntereinheit HoxY auf diesen Prozess wurde hier untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die vier hochkonservierten Cysteine C41, C44, C113 und C179 in HoxY an der Koordination des FeS-Zentrums beteiligt sind. Außerdem wurde das nahegelegene Cystein C39 als relevant für die Sauerstofftoleranz identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Tryptophan W42 aus HoxY essentiell für die Hydrogenaseaktivität der SH ist. Damit bestätigt sich, dass die Kinetik des rückläufigen e--Transports durch die Aminosäureumgebung des FeS-Clusters in HoxY beeinflusst ist. Ferner wurden in dieser Arbeit Ansätze zum Einsatz der SH aus R. eutropha in einer H2-produzierenden cyanobakteriellen Designzelle weiterverfolgt. Dazu wurden Hybridsysteme aus SH und cyanobakteriellem Photosystem I in vitro hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur lichtgetriebenen H2-Produktion untersucht. Außerdem wurde an einem heterologen Expressionssystem der SH für Cyanobakterien gearbeitet. Weiterhin wurde die SH aus Rhodococcus opacus MR11 als komplementäres Modellsystem für O2-tolerante Pyridinnukleotid-abhängige Hydrogenasen etabliert. Dieser zur SH aus R. eutropha homologe Komplex hatte in früheren Arbeiten Vorteile für spektroskopische Studien offenbart und wurde hier erstmals im direkten Vergleich zur SH aus R. eutropha biochemisch und spektroskopisch charakterisiert. The soluble, NAD+-reducing hydrogenase (SH) from Ralstonia eutropha H16 is a pyridine nucleotide-dependent hydrogenase. In these types of enzymes the conversion of H2 in the hydrogenase module of the complex is coupled to the reduction of NAD(P)+ in the NAD(P)H:acceptor oxidoreductase module. The SH belongs to a subtype that is catalytically active also in the presence of O2. This O2 tolerance is enabled by a reductive removal of O2, which according to the current model depends on a reverse e- flow from the NADH:acceptor oxidoreductase module to the active [NiFe] site in the large hydrogenase subunit. The impact of the FeS cluster in the small hydrogenase subunit HoxY on this process was analyzed in this study. Thereby it was shown that the four highly conserved cysteines C41, C44, C113 and C179 in HoxY are involved in the coordination of the FeS center. Further the nearby cysteine C39 was identified to be relevant for the O2 tolerance of the SH. Additionally we found the tryptophan W42 to be essential for the hydrogenase activity of the SH. Thus it was confirmed that the kinetic of the reverse e- transport is affected by the amino acid environment of the FeS cluster in HoxY. In addition, approaches for using the SH from R. eutropha in H2 producing cyanobacterial design cells were pursued. On one hand hybrid systems consisting of the SH and cyanobacterial photosystem I were analyzed in vitro for their capacity to produce H2 in a light dependent manner. On the other hand work on a heterologous expression system of the SH for Cyanobacteria was continued. Furthermore the SH from Rhodococcus opacus MR11 was established as complementary model system for O2-tolerant pyridine nucleotide-dependent hydrogenases. This complex, which is homologous to the SH from R. eutropha, has revealed advantages for spectroscopic analysis in earlier studies. Here it was characterized biochemically and spectroscopically for the first time in direct comparison with the SH from R. eutropha.

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Wax synthases (WS) catalyze the esterification of fatty alcohols and activated fatty acids to synthesize wax esters (WE). Enzymes with WS activities belong to different acyltransferase families with distinct properties. Some enzymes are not only monofunctional wax synthases but possess bi- or multifunctional activities. These enzymes are not only able to esterify fatty alcohols, but utilize diacylglycerols, diols, isoprenols or sterols as acyl-acceptors. This work has identified the first WS sequences from the eukaryotic protist Tetrahymena thermophila and from the preen glands of different bird species. The respective sequences were functionally expressed and characterized in yeast. These organisms were selected because they contain unusual wax ester species and might therefore contain WS enzymes with special substrate specificities. Via sequence homologies with human wax synthases we identified 4 proteins from Tetrahymena and 5 proteins from chicken which enabled the identification of two further sequences from goose and barn owl. Phylogenetic analysis of the sequences revealed that the Tetrahymena proteins as well as the avian WS4 and WS5 proteins build up own branches of acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase 2 (DGAT2) related proteins. GgWS1 and GgWS2 from chicken are more similar to mammalian DGAT2 family members. The proteins were analyzed via expression experiments in Saccharomyces cerevisiae mutants lacking TAG synthesis and via in vitro assay with membranes of transgenic yeast cells as enzyme source. These experiments demonstrated that all Tetrahymena thermophila (Tt) proteins were functionally expressed in S. cerevisiae and possessed both in vivo and in vitro acyltransferase activities. TtWS1 conferred mainly WS activity, whereas the other three TtWS proteins were multifunctional enzymes which also catalyzed the synthesis of triacylglycerol, isoprenyl esters and partly also diesters. Four out of five chicken sequences (Gallus gallus, Gg) were functionally expressed and resulted in the formation of storage lipids. GgWS2 and GgDGAT1 expressing yeast cultures produced wax esters, while GgWS1 and GgWS4 expressing cultures resulted in the additional accumulation of different amounts of triacylglycerol. Homologs of the chicken WS4 and WS5 from goose (Anser domesticus, Ad) and barn owl (Tyto alba, Ta) were cloned. The expression of both WS4 homologs resulted in the production of WE and TAG, while none of the WS5 homologs influenced lipid synthesis. In vitro experiments revealed that GgWS1 and GgWS2 were mainly monofunctional WS while the WS4 proteins belonged to the group of bifunctional WS/DGAT enzymes. AdWS4 and TaWS4 additionally showed high activities with isoprenols as acyl-acceptors in vitro. The comparison of lipid production in transgenic yeast cultures with lipids extracted from avian preen glands revealed different lipid compositions. Further in vitro experiments with membranes isolated from preen glands as enzyme source showed activites which were quite similar to the obtained results with yeast membranes. These experiments supported the idea that WE-species not only depend on the substrate specificities of the enzymes but also on the pool of accessible substrates in the tissues.

Flavonoide sind eine wichtige Klasse sekundärer Pflanzenstoffe, die in allen höheren Pflanzen vorkommen. Bis heute sind mehr als 6400 verschiedene Verbindungen bekannt. Anthocyane, farbige Flavonoide, stellen die wichtigsten Blütenfarbstoffe dar. Sie verleihen Blüten eine rosa, rote, malvenfarbige und blaue Färbung und locken Bestäuber an. Darüber hinaus besitzen Anthocyane, wie alle anderen Flavonoide, zahlreiche wichtige Eigenschaften für Pflanzen, wie z.B. der Schutz vor UV-B-Strahlung und Pflanzenschädlingen. Die am weitesten verbreiteten Anthocyane sind durch das Hydroxylierungsmuster des B-Ringes des Flavonoidgrundgerüsts charakterisiert. Die Hydroxylierung des B-Ringes wird durch die Aktivität der zwei Cytochrom P450-Enzyme Flavonoid 3'-Hydroxylase (F3'H) und Flavonoid 3',5'-Hydroxylase (F3',5'H) kontrolliert. Ohne die Aktivität eines dieser Enzyme wird hauptsächlich das 4'-hydroxylierte Anthocyan Pelargonidin gebildet, welches für viele rosa und orange Blütenfarben verantwortlich ist. Die Aktivität der F3'H führt vorwiegend zu der Bildung von Cyanidin (3',4'-hydroxyliert) und die Aktivität der F3',5'H vorwiegend zu der Bildung von Delphinidin (3',4',5'-hydroxyliert). Cyanidin verleiht Blüten rote und malvenfarbige Farben, Delphinidin ist das vorherrschende Pigment in vielen blauen Blüten. Ziel dieser Arbeit war es die F3'H und die F3',5'H durch die Klonierung der entsprechenden cDNA-Klone aus verschiedenen Pflanzen zu isolieren und durch heterologe Expression in Hefe zu charakterisieren. Zu diesem Zweck stand sowohl chemogenetisch definiertes als auch nicht definiertes Pflanzenmaterial zur Verfügung. Aus chemogenetisch definierten Linien von Matthiola incana konnte durch differentielle PCR ein komplementärer cDNA-Klon der F3'H, die vom Genlocus B kontrolliert wird, isoliert werden. In Enzymtests setzte das als CYP75B7 klassifizierte Enzym das 4'-hydroxylierte Naringenin (NAR) zu 3',4'-hydroxyliertem Eriodictyol (ERI) und das 4'-hydroxylierte Dihydrokaempferol (DHK) zu 3',4'-hydroxyliertem Dihydroquercetin (DHQ) um. Es konnte darüber hinaus durch Northernblot-Analyse eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei den homozygot rezessiven Matthiola-Linien (bb) ohne F3'H-Aktivität um Trans-kriptions-Mutanten handelt. Zwei F3'H codierende cDNA-Sequenzen wurden aus einer cDNA-Genbank von Callistephus chinensis mit Hilfe einer F3'H cDNA-Sonde aus Arabidopsis thaliana isoliert. Bei der heterologen Expression des Klons CYPCcppHt1 zeigte das entsprechende Protein eine eindeutige F3',5'H-Aktivität, obwohl es aufgrund seiner Aminosäuresequenz nicht zu der Unterfamilie der F3',5'Hs CYP75A sondern in die Unterfamilie der F3'Hs CYP75B gehört. In den durchgeführten Enzymtests war das als CYP75B5 klassifizierte Enzym in der Lage NAR und DHK sowohl in 3'-Position als auch in 5'-Position zu hydroxylieren. Somit ist dies der erste Bericht über die Isolierung eines Enzyms mit einer F3'H spezifischen Aminosäuresequenz, das über eine F3',5'H-Aktivität verfügt. Bei der heterologen Expression des zweiten cDNA-Klons CYPCcpHt2 konnte bislang keine spezifische Enzymaktivität des codierten Enzyms, welches als CYP75B6 klassifiziert wurde, beobachtet werden. Eine weitere F3'H konnte aus Pelargonium zonale isoliert werden. Dabei wurde mit einem CYP-spezifischen Primer, der von der Hämbindungs-Region bekannter F3',5'H Sequenzen abgeleitet wurde, ein entsprechendes cDNA-Fragment durch PCR amplifiziert. Mit Hilfe des neuen RLM-RACE-Verfahrens konnte ein vollständiger cDNA-Klon generiert werden, der anschließend heterolog in Hefe exprimiert wurde. Sowohl in in vivo Enzymtests mit lebenden Hefezellen (Bioconversion) als auch in in vitro Enzymtests mit Hefemikrosomen setzte das als CYP75B8 klassifizierte Enzym NAR zu ERI und DHK zu DHQ um. Da die F3'H in Pflanzenextrakten von P. zonale aufgrund interferierender Inhaltsstoffe bisher nicht nachgewiesen werden konnte, ist dies der erste Nachweis der Existenz einer F3'H und des entsprechenden Gens in P. zonale. Durch den Einsatz des CYP-spezifischen Primers konnte außerdem ein F3',5'H-spezifisches cDNA-Fragment aus Lycianthes rantonnetii kloniert werden. Nach einem RLM-RACE wurde der offene Leserahmen des vollständigen Klons in Hefe exprimiert. Dabei zeigte das als CYP75A9 klassifizierte Enzym nur in den in vivo Enzymtests mit lebenden Hefen eine Enzymaktivität, aber nicht in Enzymtests mit Hefemikrosomen. Außerdem offenbarte das Enzym nur eine F3’H-Aktivität aber keine F3',5'H-Aktivität, so dass bislang nicht feststeht, ob es sich um eine F3'H oder um eine F3',5'H handelt . Durch die Klonierung und Charakterisierung der F3'H und der F3',5'H können viele neue und interessante Blütenfarben bei wirtschaftlich bedeutenden Zierpflanzen erzeugt werden. Darüber hinaus ermöglichen sie zusammen mit anderen Enzymen aus dem Flavonoidbiosyntheseweg die biotechnologische Produktion einer Vielzahl von verschiedenen Flavonoiden, die dadurch in ausreichender Menge und Reinheit der medizinischen Forschung und der Nahrungsmittelindustrie zur Verfügung gestellt werden können. Flavonoids are an important class of secondary metabolics present in all higher plants. Up to today more than 6400 different compounds are known. Anthocyanins, coloured flavonoids, represent the major pigments in flowers. They confer pink, red, mauve and blue to flowers and attract pollinators. Furthermore, Anthocyanins possess like all the other flavonoids various important properties for plants, such as protection against UV-B radiation and pests. The most prevalent Anthocyanins are characterized by the hydroxylation pattern of the B-ring of the basic flavonoid skeleton. The hydroxylation of the B-Ring is controlled by the activities of the two cytochrome P450 enzymes flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) and flavonoid 3',5'-hydroxylase (F3',5'H). Without the activity of one of these enzymes the 4'-hydroxylated Anthocyanin Pelargonidin is mainly generated which is responsible for many pink and orange flower colours. The activity of the F3'H predominantly leads to the production of the Cyanidin (3',4'-hydroxylated) and the activity of the F3',5'H predominantly leads to the production of delphinidin (3',4',5'-hydroxylated). Cyanidin gives flowers red and mauve colours, delphinidin is the main pigment in many blue flowers. The aim of this thesis was to isolate the F3'H and the F3',5'H by cloning of the corresponding genes from several plants and to characterize them by means of heterologous expression in yeast. For that purpose both chemogenetic defined and none defined plant material have been available. From chemogenetically defined lines of Matthiola incana a complementary cDNA clone of the F3'H that is controlled by the genetic locus B was isolated by means of differential PCR. In enzyme tests the enzyme classified as CYP75B7 converted the 4'-hydroxylated Naringenin (NAR) to 3',4'-hydroxylated Eriodictyol (ERI) and the 4'-hydroxylated Dihydrokaempferol (DHK) to 3',4'-hydroxylated Dihydroquercetin (DHQ). It could also clearly be shown through Northern blot analysis that the recessive lines of Matthiola (bb) without F3'H activity are transcription mutants. Two F3'H coding cDNA sequences were isolated from a cDNA library of Callistephus chinensis by using a F3'H cDNA labelled probe of Arabidopsis thaliana. During the heterologous expression of the clone CYPCcpHt1 the corresponding protein showed a definite F3',5'H activity even though it does not belong due to its amino acid sequence to the subfamily of the F3',5'Hs CYP75A but to the subfamily of the F3'Hs CYP75B. In the enzyme tests carried out the enzyme classified as CYP75B5 was able to hydroxylate NAR and DHK in the 3'-position as well as in the 5'-position. Thus, this is the first report on an isolation of an enzyme with a F3'H specific amino acid sequence which has a F3',5'H activity. Up to now the heterologous expression of the second clone CYPCcpHt2 has revealed no specific activity of the encoded enzyme which was classified as CYP75B6 . Another F3'H was isolated from Pelargonium zonale. For that purpose a corresponding fragment was amplified by PCR with a CYP-specific primer which derived from the heme-binding region of known F3',5'H sequences. By using the new RLM method a full-length cDNA clone could be generated and heterlogous expressed in yeast afterwards. In vivo enzyme tests (bioconversion) as well as in vitro enzyme tests showed the conversion of NAR to ERI and DHK to DHQ catalysed by the enzyme classified as CYP75B8. Since a F3'H activity could never be demonstrated in plant extracts of P. zonale due to interfering compounds this is the first evidence of the existence of a F3'H and of the corresponding gene in P. zonale. By using the same CYP-specific Primer a cDNA fragment from Lycianthes rantonnetii was also cloned by PCR. After a RLM-RACE the open reading frame of the full-length clone was expressed in yeast. The enzyme classified as CYP75A9 showed only a enzyme activity in the in vivo enzyme tests with living yeast, but not in enzyme tests with yeast microsomes. Additionally, the enzyme revealed only a F3'H activity, but no F3',5'H activity, so it is not certain at the moment whether this enzyme is a F3'H or a F3',5'H. Because of the cloning and characterization of the F3'H and the F3', 5'H many new and interesting flower colours can be created in economically important ornamental plants. Moreover, together with other enzymes of the flavonoid biosynthetic pathway they enable the biotechnological production of a multiplicity of different flavonoids, which can thereby be made available in sufficient quantity and purity for medical research and food industry.

With the worldwide use of insecticides, the number of resistant insect species increases resulting in decreased efficacy of pesticides and threat of human welfare by crop failures and disease transmission. Environmental concentrations of some insecticides are so high that even populations of non-target organisms are selected for resistance. Thus, Cyp6g1-overexpressing strains of Drosophila melanogaster Meig. were selected; they are resistant to a wide range of diverse insecticides, including DDT (dichlorodiphenyltrichloroethane) and imidacloprid. Up to now however, no evidence has been available that the cytochrome P450 monooxygenase CYP6G1 is able to metabolise insecticides. This should be studied regarding imidacloprid, DDT, and methoxychlor by heterologous expression of Cyp6g1 in cell suspension cultures of Nicotiana tabacum L. as convenient in vitro system. The required vectors with cDNA of Cyp6g1 and vectors with cDNA of Cyp71u4v2 (barley) and Cyp3a4 (human) for additional studies, were constructed, tobacco cells were transformed and studied by molecular biology. It was demonstrated, that CYP6G1 is capable of metabolising the (14C-labelled) insecticides. Cyp6g1-transgenic culture 6L converted 400 µg imidacloprid within 48 h to 60% of 4-hydroxyimidacloprid, 20% of 5-hydroxyimidacloprid, 7% of olefinic imidacloprid and minor amounts of 4,5-dihydroxyimidacloprid with an absolute metabolic rate of 86% (no detectable turnover in the non-transgenic culture LS). In supplementary studies, the metabolic pathway of imidacloprid derived from CYP6G1 was elucidated, and it was shown that the appearance of the olefinic metabolite was traced back to the influence of the acidic media. After simultaneous application of P450 inhibitor piperonyl butoxide (200 µg), the CYP6G1-dependent metabolism of imidacloprid (20 µg, 24 h) was inhibited by 82%. DDT (20 µg) was only converted under anaerobic conditions in a closed system within 48 h by reductive dechlorination to 16% DDD (dichlorodiphenyldichloroethane) (in one parallel) besides low amounts of possible further metabolites with an absolute metabolic rate of 37%. However, this result showed only a limited reproducibility. In the LS culture only 2% DDD were detected in the closed system with an absolute metabolic rate of 11%. Methoxychlor (45.8 µg) was converted to 17% of catechol methoxychlor, 16% of trishydroxymethoxychlor, 8% of bishydroxymethoxychlor, and 6% of monohydroxymethoxychlor in the 6L cell culture within 24 h (absolute metabolic rate: 96%). In contrast to studies with imidacloprid and DDT, LS culture showed a high absolute metabolic rate of 62% regarding methoxychlor. Nevertheless, 34% of the metabolic rate and especially the increased formation of trishydroxymethoxychlor and catechol methoxychlor could be traced back to the enzymatic activity of CYP6G1. Similarly, the absolute metabolic rate of methoxychlor in 6L and LS culture was inhibited by 43% and 92%, respectively, after simultaneous application of piperonyl butoxide (458 µg). Due to this treatment, the glycoside fraction decreased in favour of primary metabolites. The metabolic capacity of CYP6G1 leads to detoxification of different insecticides towards Drosophila. Thus, the gap between the supposed resistance gene Cyp6g1 and the observed resistance phenomenon was closed by the evidence that CYP6G1 is at least able to metabolise three insecticides. It should be mentioned that CYP6G1 is presumably not alone responsible for the resistance towards DDT but confers probably resistance towards methoxychlor. Using 4-n-nonylphenol, a substrate of CYP71U4v2, which was shown to be overexpressed in barley during pathogen defence, was finally identified. Cyp71u4v2-transgenic culture formed the main metabolites 4’-hydroxy-4-n-nonylphenol and 5’-hydroxy-4-n-nonylphenol with an absolute metabolic rate of 93%. In the non-transgenic culture, a high metabolic rate of 60% was also detected. However, the pattern of side chain hydroxylated metabolites with the main metabolite 8’-hydroxy-4-n-nonylphenol differed obviously from that of the transgenic culture – thus clearly proving the enzymatic activity of CYP71U4v2. The turnover of the degradation product of nonylphenol polyethoxylates formerly used in pesticide formulations by endogenous enzymes could be quite relevant for barley. The present work showed that the tobacco cell suspension culture is a convenient expression system for P450 genes of diverse origin enabling to elucidate or predict metabolism-based resistance phenomena without the need of expression of appropriate P450 reductase.

Ziel der Arbeit war die Herstellung der pharmakologisch aktiven Komponenten von Bromelain in Form von rekombinanten Proteinen. Mit den bisher angewendeten Trennmethoden ist es jedoch nicht möglich, einzelne Proteine aus dem Gemisch zu isolierten und daher die pharmakologische Wirkung einer Fraktion auf ein Protein zurückzuführen. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der rekombinanten Herstellung von Cysteinproteasen, die die Hauptbestandteile biochemisch und pharmakologisch charakterisierter Fraktionen bilden. Gene von Vertretern aus der Gruppe der Stamm- und Fruchtbromelaine, sowie Ananain wurden aus einer hergestellten cDNA-Bank des Ananasstammes isoliert, wobei eine neue Stammbromelainsequenz entdeckt wurde. Durch Modifikation des Expressionskonstruktes und Optimierung der Expressionsbedingungen konnte die Ausbeute von 1 mg/ml auf 12,5 mg/l aktives Protein gesteigert werden. Es muss weiterhin in Betracht gezogen werden, dass an der pharmakologischen Wirkung der Fraktion auch andere Proteine als die Cysteinproteasen beteiligt sein könnten, da einige pharmakologische Wirkungen eindeutig nicht auf die Cysteinproteasen zurückzuführen sind. Als Kandidat für ein solches Protein wurde der Bromelaininhibitor vorgeschlagen und exprimiert. Erstmalig besteht so die Möglichkeit, die Wechselwirkungen der Inhibitoren und der Proteasen zu untersuchen. Die rekombinant hergestellten Proteine bilden die Grundlage für pharmakologische Tests zur Aufklärung des Wirkmechanismus von Bromelain, sowie der Resorption intakter Protein vom Darm in das Blut und eventuell zum therapeutischen Nutzen der Proteine. There is significant interest in understanding the mode-of-action of bromelain, an extract of pineapple (Ananas comosum) used to treat a variety of medical conditions. On the basis of biochemical characterisation of fractionated extracts, cysteine proteases were identified as likely candidates for the active proteins. However, attempts to separate single protein components from native fruit extracts using various chromatographic methods, were not successful. Thus, the specific protease composition of bromelain remained unknown. We aimed, therefore, to produce the active components of bromelain in recombinant form, in order to try to elucidate the basis for its pharmacological activity. To this end, genes encoding for known cysteine proteases in pineapple, including stem bromelain, fruit bromelain, and ananain were isolated from a cDNA-library constructed from pineapple stem. By modification of the expression constructs and optimisation of expression conditions, yield of ananain was increased from 1 mg/l to 12.5 mg/l of active protein. In addition to the known proteases, bromelain inhibitors were also considered as candidates for the pharmacologically active agents as some of the effects do not correlate to protease activity. To investigate this proposal, the pre-protein and isoform BI-III were expressed heterologously. The successful heterologous expression of multiple components of bromelain sets the stage for future experiments to clarify the molecular details of its mode-of-action, as well as investigations into the protein-protein interactions between the proteases and their inhibitors.

Die Peptidtransporter PEPT1 und PEPT2 in Säugetieren besitzen eine wesentliche Rolle in der Aufnahme und Konservierung von Aminosäuren in verschiedenen Geweben und verfügen damit über eine nutritive Funktion. Da sie neben ihren physiologischen Substraten, Di- und Tripeptiden, auch verschiedene pharmakologisch wirksame Peptidmimetika als Substrate akzeptieren, besitzen sie darüber hinaus auch eine pharmakologische Bedeutung. Als Testsystem zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung tierischer und menschlicher Peptidtransporter konnte in dieser Arbeit die methylotrophe Hefe Pichia pastoris etabliert werden. Für den humanen intestinalen Peptidtransporter (hPEPT1) wurde gezeigt, dass eine hohe funktionelle Expressionsrate u.a. abhängig ist vom 5´-nichtranslatierten Bereich der cDNA, der Anzahl der ins Genom integrierten cDNA-Kopien und der Art des Promotors. Für das heterolog exprimierte hPEPT1-Protein mit einem Anteil von ca. 0,6% der Membranproteine in P. pastoris waren die entscheidenden funktionellen Eigenschaften wie die pH-Abhängigkeit des Transportes, die Substratspezifität und die Substrataffinität vollständig erhalten. Mittels einer Zufallsmutagenese mit nachfolgender Phänotypisierung wurden mit Ile-382 und Gly-476 zwei Aminosäurereste im hPEPT1-Protein identifiziert, deren Austausch zu einer veränderten pH-Abhängigkeit der Transportfunktion führt. Die heterologe Expression in P. pastoris erlaubte die Etablierung eines Screeningsystems für umfassende Untersuchungen zu Struktur-Affinitätsbeziehungen von Substraten für ihre Wechselwirkung mit PEPT1 und PEPT2. In Kombination mit elektrophysiologischen Untersuchungen an X. laevis Oozyten, die PEPT1 oder PEPT2 exprimieren, wurden dabei neue Einblicke in die Funktion der Carrierproteine erhalten. Unter Verwendung einer Vielzahl von Dipeptiden und Derivaten gelang es, wesentliche strukturelle Eigenschaften der Substrate festzulegen, die ihre Affinität zu den Transportern und ihre Transportfähigkeit bestimmen, wie Hydrophobizität, Ladung oder Stereoisomerie von Dipeptiden. Insbesondere konnten erstmals die minimalen strukturellen Anforderungen für die Substraterkennung und den Transport von Substraten durch PEPT2 identifiziert werden. Mit Lys[Z(NO2)]-enthaltenden Dipeptidabkömmlingen wurden die ersten spezifischen Inhibitoren der Peptidtransporter erhalten, die mit hoher Affinität (10 µM bei PEPT1 bzw. 40 nM bei PEPT2) und reversibel sowohl mit der äußeren als auch der inneren Substratbindungsstelle der Proteine interagieren. Die Hefe P. pastoris erwies sich somit hervorragend zur Expression und Charakterisierung der Peptidtransporter aus Säugern geeignet. Mit diesem System wurden wesentliche neue Erkenntnisse zur Struktur und Funktionsweise dieser sowohl nutritiv als auch pharmakologisch relevanten Transportproteine gewonnen. The mammalian peptide transporters PEPT1 and PEPT2 play an important role in the absorption and conservation of amino acids in different tissues and therefore possess a nutritive role. As the peptide carriers accept besides di- and tripeptides as their physiological substrates also a variety of pharmacologically active peptidomimetics as substrates they are relevant for drug delivery and metabolism. In this work, the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established as a new heterologous expression system for mammalian peptide transporters and their functional and structural characterisation. As shown for the human intestinal peptide transporter (hPEPT1), a high functional expression level depends mainly on the 5´-untranslated region of the cDNA, the copy number of the integrated cDNA´s in the yeast genome and the promoter used. For the heterologously expressed hPEPT1-protein comprising about 0.6% of the yeast membrane proteins, all the decisive functional characteristics such as pH-dependency of transport, substrate affinity and specificity were fully preserved. By a random-mutagenesis approach to study the structure-function relationships Ile-382 and Gly-476 were identified as two amino acid residues in the hPEPT1-protein, that, when exchanged for other residues, lead to an altered pH-dependence of transport function. Moreover, the yeast system was established as a screening platform allowing extensed studies on the structure-affinity relationships of substrates binding to the peptide transporters PEPT1 and PEPT2. In combination with electrophysiological measurements in X. laevis oocytes expressing PEPT1 or PEPT2 new insights into the function and operational mode of the carriers were obtained. By using a variety of dipeptides and derivatives it was shown that different factors as hydrophobicity, charge or stereoisomerism of amino acids in dipeptides affect affinity and transport. In addition, by applying novel amino acid and dipeptide derivatives, important functional groups within the substrates and their spatial position were identified that represent the minimal structural determinants for substrate binding and transport by PEPT2. With the Lys[Z(NO2)]-dipeptide derivatives the first specific inhibitors of the peptide transporters were obtained, that interact with high affinity (10 µM in case of PEPT1 and 40 nM in case of PEPT2) and reversible mode of action at the external as well as internal substrate binding domain. In summary, the yeast P. pastoris was shown to be suitable for expression and characterisation of mammalian peptide transporters. By using this new yeast system valuable informations on structure and function of these nutritionally as well as pharmacologically important transport proteins were obtained.

Das Sensor-Rhodopsin II des Archaeons Natronobacterium pharaonis vermittelt als Phototaxisrezeptor die photophobe Reaktion gegenüber grünem und blauem Licht. Die Anregung des Rezeptors aktiviert ein Transducermolekül, pHtrII, das in weiten Teilen große Ähnlichkeiten mit der zytoplasmatischen Domäne eubakterieller Chemorezeptoren aufweist. Nach heterologer Überexpression von pSRII sowie von Teilen des pHtrII in E. coli gelang es die Ausbildung eines stabilen Komplexes in vitro und in vivo zu verfolgen und eine 1:1-Stöchiometrie festzustellen. Um die ersten Schritte der Signaltransduktionskette aufzuklären, wurden mit Hilfe positions-spezifischer Spinmarkierung und ESR-Spektroskopie die Topographie der Helices F und G im pSRII untersucht. Die ESR-spektroskopische Bestimmung transienter Mobilitätsänderungen erlaubten es, eine Auswärtsbewegung der Helix F zu identifizieren, die sich schon in den frühen Schritten des Photozyklus vollzieht. Durch die Analyse lichtinduzierter Abstandsänderungen konnte zum ersten Mal ein ursächlicher Zusammenhang zwischen der Lichtanregung des Photorezeptors und Konformationsänderungen innerhalb des Transducersdimers detailliert beschrieben werden. Basierend auf der relativen Verlagerung der zweiten transmembranen Helices ließ sich eine Mechanismus ableiten, bei dem das konformationelle Signal im Linkerbereich amplifiziert wird und so die Wechselwirkungen innerhalb der Signaldomäne steuert.