Search

Zusammenfassung Mikroorganismen haben im Laufe ihrer Evolution zur Anpassung an ihren Lebensraum eine Vielfalt an strukturell diversen und zum Teil sehr komplexen Metaboliten entwickelt. Diese verschaffen ihnen Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt. Die Nutzung dieser Substanzen führte zur Entwicklung von Antibiotika, Immunsuppressiva und Zytostatika. Hierbei zeigen sich besonders die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), NRPS/PKS-Hybride und NRPS-ähnliche Enzyme für die Synthese der Grundgerüste der Sekundärmetabolite verantwortlich. Die so entstandenen Substanzen können durch andere Enzyme (tailoring enzymes) wie beispielsweise Methyltransferasen oder Prenyltransferasen weiter modifiziert werden, wodurch oftmals die biologische Aktivität gesteigert wird. Zur fermentativen, semisynthetischen oder chemoenyzmatischen Herstellung dieser Naturstoffe und deren Derivate ist ein detailliertes Wissen der Biosynthese der beteiligten Enzyme Voraussetzung. Obwohl die individuellen Domänen von NRPS und PKS inzwischen biochemisch und strukturell sehr gut untersucht sind, ist das Verständnis für die Interaktion der Domäne und die ablaufenden Mechanismen noch sehr gering. Da sich einfache Systeme wie die NRPS-ähnlichen Enzyme leichter untersuchen lassen, sollten in der vorliegenden Arbeit alle NRPS-ähnlichen Enzyme mit einer A-T-TE Enzymstruktur aus Aspergillus terreus (A. terreus) und ein weiteres aus Chaetomium globosum (C. globosum) charakterisiert werden. Zunächst sollten die NRPS-ähnlichen Gene apvA, melA, atrAAt, pgnA aus A. terreus mit der eigenen Promoter- und Terminatorsequenz heterolog in Aspergillus nidulans exprimiert werden. Obwohl eine Integration für melA und atrAAt ins Genom beobachtet wurde, konnte in den Ethylacetatextrakten der Kulturüberstände kein Produkt nachgewiesen werden. Für die Expression der NRPS-ähnlichen Gene in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) sollten die Gene von cDNA bzw. gDNA amplifiziert werden. Hierdurch konnte die Exon-Intron Struktur für apvA, melA, btyA und atrAAt korrigiert werden. Des Weiteren konnte die Domänen Architektur für das putative NRPS-ähnlich Gen atrAAt, das laut der NCBI-Datenbank nur aus einer A- und einer T-Domänen bestand, durch die Amplifikation von cDNA zu einer A-T-TE-Struktur korrigiert werden. Die NRPS-ähnlichen Gene haben etwa eine Größe von 2763-2874 bp und kodieren entsprechend für 920-958 AS lange Proteine. Eine Expression der sieben NRPS-ähnlichen Gene in S. cerevisiae führte zu den fünf Produkten Aspuvinon E, Butyrolacton IIa, Atromentin, Phenguignarsäure und Didemethylasterrichinon D. Die Produkte wurden extrahiert und die Strukturen mittels Massenspektrometrie und NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Auf einem Liter Kultur konnten für Aspulvinon E und Phenguignarsäure eine Produktion von 13 bzw. 15 mg und für Butyrolacton IIa sogar bis zu 35 mg berechnet werden. In anschließenden Versuchen zur Isolierung der NRPS-ähnlichen Proteine stellte sich heraus, dass Affinitäts-Tags am C-Terminus die Enzymaktivität stark hemmt. Ein N terminaler His6-Tag hatte hingegen keinen negativen Einfluss auf die Aktivität. Anhand des Proteinnachweises mit Hilfe eines Western Blotes wurde der optimale Zeitpunkt für die Isolierung auf etwa 16 Stunden nach der Induktion der Proteinexpression durch Galaktose festgestellt. Die rekombinanten Proteine konnten mit einer Konzentration von etwa 1 ml/l Kultur aufgereinigt werden. Allerdings konnte keine katalytische Aktivität nachgewiesen werden. Für ein alternatives Expressionsystem in Escherichia coli wurden die NRPS-ähnlichen Gene sowie das Phosphpantethenyltransferase Gen npgA in die Vektoren pQE60 und pET28a(+) kloniert. Die Expression konnte aus Zeitgründen nicht mehr durchgeführt werden. Die A-T-TE Domänen der NRPS-ähnlichen Enzyme bilden theoretisch autonome Einheiten, die zwischen den Enyzmen ausgetauscht werden können. Um diese Theorie zu überprüfen und um zusätlich für die NRPS-ähnlichen unnatürliche Produkte zu generieren, sollten die das Substrat aktivierenden A-Domänen mit den TE-Domänen, die für Dimerisierung verantwortlich sind, kombiniert werden. Dafür wurden die A-Domänen von Pgna, ApvA, AstA und AtqA, die Phenyl-; 4-Hydroxy-bzw. Indolpyruvat aktivieren, mit der TE-Domäne von AvpA, BtyA, PgnA, AtrAAt bzw. AstA rekombiniert. Die T-Domäne wurde jeweils von einem der ursprünglichen Enzyme übernommen. Insgesamt wurden 34 Konstrukte hergestellt, die zur Expression in S. cerevisiae verwendet wurden. Für 22 konnten die erwarteten Produkte nachgewiesen und anhand der [M+H-] - Ionen und deren Fragmentierungen sowie NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. So konnten Indolbutyrolacton und Indolguignarsäure synthetisiert werden, welche zuvor noch nie in der Literatur beschrieben worden waren. Weiterhin ist bekannt, dass die durch die NRPS-ähnlichen Enyzme hergestellten Produkte oft nur das Grundgerüst für Sekundärmetabolite bilden. Daher wurde die nähere genetische Umgebung der NRPS-ähnlichen Gene untersucht. Es wurden 4 Prenyltransferasegene identifiziert, die zur Ko-Expression mit den NRPS-ähnlichen ausgewählt wurden. Leider konnte das prenylierte Produkt in den Transformaten der Bäckerhefe nicht detektiert werden., Summary In the course of their evolution, microorganisms have developed a variety of structurally diverse and sometimes very complex metabolites to adapt to their habitat. These give them advantages over other inhabitants of their environment. The use of these substances led to the development of antibiotics, immunosuppressants and antitumor agents. The backbone structures of these substances are often synthesized by the enzyme classes of polyketide synthases (PKSs), nonribosomal peptide synthetases (NRPSs), NRPS / PKS hybrids and NRPS-like enzymes. The resulting structures can be further modified by other tailoring enzymes such as methyltransferases or prenyltransferases, which often increases the biological activity. A detailed knowledge of the biosynthesis and of the involved enzymes is a prerequisite for the fermentative, semisynthetic or chemoenzymatic production of these natural substances and their derivatives. Although the individual domains of NRPS and PKS have biochemically and structurally been investigated, understanding of the interaction of the domain and the mechanisms involved is still very poor. Since simple systems like the NRPS-like enzymes can be investigated more easily, the NRPS-like enzymes with an A-T-TE architecture from Aspergillus terreus (A. terreus) and another from Chaetomium globosum (C. globosum) will be characterized in the present work. First, the NRPS-like genes apvA, melA, atrAAt, pgnA from A. terreus with their own promoter- and terminator-sequence should be analysed by heterologous expression in Aspergillus nidulans. Although an integration for melA and atrAAt into the genome was observed, no product could be detected in the ethyl acetate extracts of the culture. For the expression of the NRPS-like genes in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), cDNA or gDNA was used for the amplification of the genes. This made it possible to revise the exon-intron structures for apvA, melA, btyA and atrAAt. Furthermore, the domain architecture of the putative NRPS-like gene atrAAt, which according to the NCBI database only consisted of one A and one T domains, could be corrected by amplifying cDNA to an A-T-TE structure. The NRPS-like genes have a size of 2763-2874 bp and accordingly code for proteins of 920-958 aa. Expression of the seven NRPS-like genes in S. cerevisiae led to the five products aspuvinone E, butyrolactone IIa, atromentine, phenguignardic acid and didemethylasterrichinone D. The products were extracted and the structures were determined by means of mass spectrometry and NRM spectroscopy. For aspulvinone E and phenguignardic acid, a production of 13 and 15 mg/l and for butyrolactone IIa even up to 35 mg/l could be calculated on one liter of culture. In subsequent attempts to isolate the NRPS-like proteins, it turned out that affinity tags at the C-terminus strongly inhibit enzyme activity. In contrast, an N-terminal His6 tag had no negative influence on the activity. On the basis of the protein detection by Western blot, the optimal point in time for isolation was determined to be around 16 hours after the induction of protein expression by galactose. The recombinant proteins could be purified with a concentration of about 1 ml/l culture. However, no catalytic activity could be detected. To test an alternative expression system, the NRPS-like genes and the phosphpantethenyltransferase gene npgA were cloned into the vectors pQE60 and pET28a (+) for the expression in Escherichia. Due to time limits the gene expression and protein isolation could no longer be carried out. The A-T-TE domains of the NRPS-like enzymes theoretically form autonomous units that can be exchanged between the enzymes. In order to test this theory and in addition to generate unnatural products, the substrate-activating A domains were combined with the TE domains, which are responsible for the dimerisation. For this purpose, the A domains of Pgna, ApvA, AstA and AtqA for activation of phenyl-, 4-hydroxy or indole pyruvate, were recombined with the TE domain of AvpA, BtyA, PgnA, AtrAAt and AstA, respectively. The T domain was taken over from one of the original enzymes. A total of 34 constructs were prepared in this way which were used for expression in S. cerevisiae. 22 of the expected products could be detected. The structure was elucidated on the basis of the molecular ions and their fragmentation as well as NMR spectroscopy. In this way, indole butyrolactone and indole guignaric acid could be obtained, which had never before been described in the literature. It is also known that the products of the NRPS-like enzymes often only form the basic structure for secondary metabolites. Therefore, the genetic environment of the NRPS-like genes was investigated. 4 prenyltransferase genes were identified which were selected for co-expression with the NRPS-like ones in S. cerevisiae. Unfortunately, the prenylated product could not be detected in the baker's yeast transformants.

Naturstoffe, die aus dem Sekundärmetabolismus stammen werden von Organismen nicht unbedingt zum Überleben, der Reproduktion oder der Differenzierung benötigt, bieten aber dennoch einen signifikanten Selektionsvorteil in der Konkurrenz mit anderen Lebewesen. Daraus resultiert, dass viele dieser Naturstoffe in Organismen bestimmte biologische Aktivitäten aufweisen. Durch die biologische Aktivität vieler dieser Substanzen ist beispielsweise der pilzliche Sekundärmetabolismus eine attraktive Quelle für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneimittel. Bisher wurde nur ein Bruchteil aller existierenden Pilze identifiziert, was bedeutet, dass noch immer ein enormes ungenutztes Potenzial für die Herstellung pharmazeutisch nutzbarer Naturstoffe vorhanden ist. Dieses Potenzial kann durch verschiedene bioinformatische, molekularbiologische und biochemische Ansätze zugänglich gemacht werden. Die Entdeckung biosynthetischer Gene für Sekundärmetabolite in Pilzen wird dadurch erleichtert, dass relevante Gene für die Herstellung einer Verbindung nebeneinander an einem bestimmten Lokus auf dem Chromosom vorliegen, d.h. sie sind geclustert. Diese biosynthetischen Gencluster (BGCs) enthalten ein oder mehrere Gene, deren Proteinprodukte für die Bildung des Kohlenstoffrückgrats des jeweiligen Stoffs verantwortlich ist. Dieses Rückgrat wird durch weitere, im Cluster kodierte, modifizierende Enzyme strukturell diversifiziert. In dieser Arbeit wurden die BGCs für zwei unterschiedliche Naturstoffe und ihre Analoga in dem Ascomyceten Aspergillus ruber identifiziert und bestätigt. Außerdem wurden einzelne Schritte in diesen Stoffwechselwegen näher untersucht. Das Salicylaldehydderivat Flavoglaucin und seine Analoga unterscheiden sich nur in der Anzahl und Position der Doppelbindungen in der Heptyl-Seitenkette. In vorangegangenen Studien wurde gezeigt, dass einige dieser Substanzen biologisch aktiv sind, indem sie beispielsweise als Antioxidantien wirken, antiinflammatorische Effekte vorweisen oder auch an humane Opioid- und Cannabinoidrezeptoren binden. Obwohl Flavoglaucin und seine Analoga schon 1934 zum ersten Mal beschrieben wurden, war bis zur Veröffentlichung der in dieser Arbeit beschriebenen Daten nicht viel mehr über ihre Biosynthese bekannt, als dass sie Produkte des Polyketidstoffwechsels sind. Durch Genome Mining konnte in dieser Arbeit ein Gencluster (fog-Cluster) im Genom von A. ruber identifiziert werden, der alle nötigen Gene für die Biosynthese dieser Stoffe enthält. Die heterologe Expression dieses BGC im Modellorganismus Aspergillus nidulans bestätigte, dass der fog-Cluster für die Bildung von Flavoglaucin und seinen Analoga verantwortlich ist. Gendeletionen in dem heterologen Expressionsstamm, die Überexpression des Gens für die hoch-reduzierende Polyketidsynthase (HR-PKS) fogA in A. nidulans, in vitro-Enzymassays mit der Prenyltransferase FogH und Fütterungsexperimente zur Untersuchung der FAD-abhängigen Oxidoreduktase FogF zeigten einen ungewöhnlichen Weg hin zum finalen Aldehydprodukt. Das Polyketidgrundgerüst wird von FogA in Kooperation mit dem Cupin FogC und den kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen FogB und FogD reduktiv als Salicylalkohol entlassen, nur um nach der C3-Hydroxylierung durch das Cytochrom P450 (CYP) FogE und die C5-Prenylierung durch FogH von FogF wieder zu einem Aldehyd oxidiert zu werden. Diese Reoxidation ist bemerkenswert, da die Freisetzung des Produkts von einer HR-PKS für gewöhnlich hydrolytisch als Carbonsäure oder reduktiv allerhöchstens als Aldehyd erfolgt. Die Modifikation der Intermediate vor der Reoxidation erfordert scheinbar die Hydroxymethylgruppe des Salicylalkohols, denn eine Prenylierung des synthetisierten Aldehyd-Substratanalogs durch FogH findet nicht statt. Diese Arbeit wurde in Kooperation mit Frau Dr. Huomiao Ran durchgeführt. Die Biosynthese von Flavoglaucin weist einige Parallelen zu denen von Sordarial in Neurospora crassa und Trichoxid in Trichoderma virens auf, unterscheidet sich aber neben der Prenylierung signifikant durch die finale Reoxidation und die Variabilität des Sättigungsmusters in der Heptyl-Seitenkette. In dieser Arbeit wurde auch die Biosynthese von Indolalkaloiden der Echinulin-Familie näher untersucht. Aus einer vorigen Studie war bekannt, dass zwei Prenyltransferasen EchPT1 und EchPT2 jeweils die reverse C2-Prenylierung und mehrere konsekutive reguläre Prenylierungen des Indolrings des zyklischen Dipeptids aus L-Tryptophan und L-Alanin katalysieren. Die Einführung einer oder zwei exo-Doppelbindungen an den Substituenten um den 2,5-Diketopiperazinring durch eine CYP aus dem identifizierten BGC wurde jedoch nur vermutet. Durch heterologe Expression des postulierten ech-BGCs in A. nidulans konnte diesem Cluster die Bildung von Substanzen der Echinulin-Familie eindeutig zugewiesen werden. Dabei wurden allerdings nur Substanzen ohne Doppelbindung (Echinulin-Serie) und mit einer (∆10) Doppelbindung am Tryptophansubstituenten (Neoechinulin A-Serie) gebildet. Das Enzym für die Einführung der zweiten (∆14) Doppelbindung am Alaninsubstituenten (Neoechinulin B-Serie) scheint nicht durch die Gene des Clusters kodiert zu werden. Auch die Erweiterung des exprimierten BGCs um drei weitere potenzielle Oxidoreduktasen stromabwärts des ech-Clusters resultierte nicht in der Produktion von Substanzen mit beiden Doppelbindungen. Fütterungsexperimente bestätigten die Einführung der ∆10-Doppelbindung durch die im ech-Cluster kodierte CYP EchP450, aber widerlegten die Hypothese, dass EchP450 auch die Bildung der ∆14-Doppelbindung katalysiert. Weitere in vitro-Enzymassays mit der Prenyltransferase EchPT2 zeigten deutlich ihre Präferenz gegenüber Substraten ohne exo-Doppelbindung, was in gewissem Maße zur Erklärung der Verhältnisse zwischen den verschiedenen Substanzen der Echinulin-Familie in A. ruber beiträgt., Natural products which arise from an organism’s secondary metabolism are not necessarily re-quired for survival, reproduction and differentiation but offer a significant selective advantage in their respective environment. As a result, many of these natural products display significant biolog-ical activities in organisms. Due to the biological activity of many of these substances, the fungal secondary metabolism for example is an attractive source for the discovery and development of new drugs. So far, only a limited number of all existing fungi has been identified, which means that there is still an enormous unused potential for the production of pharmaceutically relevant natural products. This potential can be accessed through various bioinformatic, molecular biological and biochemical approaches. The discovery of biosynthetic genes for secondary metabolites in fungi is facilitated by the fact that relevant genes for the production of a given compound are located in close proximity to each other on the chromosome, i.e., they are clustered. These biosynthetic gene clusters (BGCs) contain one or more genes whose protein products are responsible for the formation of the carbon backbone of the respective substance. This backbone is structurally diversified by tailoring enzymes encoded by other genes in the cluster. In this thesis, BGCs for two different natural products and their conge-ners from the ascomycete Aspergillus ruber were identified and confirmed. In addition, individual steps in these metabolic pathways were examined in more detail. The prenylated salicylaldehyde derivative flavoglaucin and its congeners differ from each other only in the number and position of the double bonds of the heptyl side chain. Previous studies have shown that some of these substances are biologically active, for example by acting as antioxi-dants, showing anti-inflammatory effects, or binding to human opioid and cannabinoid receptors. Although flavoglaucin and its congeners have been known since 1934, not much was known about their biosynthesis other than that they are products of polyketide metabolism. This thesis describes the discovery of a gene cluster (fog cluster) in the genome of A. ruber through genome mining, which contains all the genes necessary for the biosynthesis of these substances. Heterologous ex-pression of this BGC in the model ascomycete Aspergillus nidulans confirmed that the fog cluster is responsible for the formation of flavoglaucin and its congeners. Gene deletions in the heterologous expression strain, the overexpression of the gene for the highly reducing polyketide synthase (HR-PKS) FogA in A. nidulans, in vitro enzyme assays with the prenyltransferase FogH and feeding exper-iments to investigate the FAD-dependent oxidoreductase FogF showed an unusual route to the final aldehyde product. The polyketide skeleton is reductively released as a salicyl alcohol by FogA in cooperation with the cupin protein FogC and the short-chain dehydrogenases/reductases FogB and FogD, only to be reoxidized to the salicylaldehyde by FogF after C3-hydroxylation by the cyto-chrome P450 (CYP) FogE and C5-prenylation by FogH. This reoxidation is remarkable, as product release from an HR-PKS usually occurs hydrolytically as a carboxylic acid or reductively as an alde-hyde. Modification of the intermediates apparently requires the hydroxymethyl group of the salicyl alcohol, because prenylation of a synthesized aldehyde substrate analog by FogH does not occur. This work was carried out in cooperation with Dr. Huomiao Ran. The biosynthesis of flavoglaucin shows some parallels to that of sordarial in Neurospora crassa and trichoxide in Trichoderma virens, but differs significantly in terms of prenylation, the final reoxidation of an alcoholic intermediate to an aldehyde and the variability of the saturation pattern in the heptyl side chain. Furthermore, the biosynthesis of indole alkaloids of the echinulin family was investigated in more detail. A previous study showed that two prenyltransferases EchPT1 and EchPT2 catalyze the re-verse C2 prenylation and several consecutive prenylations at different positions of the indole ring of the cyclic dipeptide cyclo-L-tryptophan-L-alanine. It was speculated that a CYP encoded in the identified BGC introduces two exo double bonds on the substituents of the 2,5-diketopiperazine ring. By heterologous expression of the postulated ech BGC in A. nidulans, the formation of echinulin family indole alkaloids could be clearly assigned to this cluster. However, only substances without a double bond (echinulin series) and with a (∆10) double bond on the tryptophan substitu-ent (neoechinulin A series) were formed. The enzyme for the introduction of the second (∆14) dou-ble bond on the alanine substituent (neoechinulin B series) does not seem to be encoded by the genes of the ech cluster. The expansion of the expressed BGC by three additional potential candi-date genes downstream of the ech cluster did not yield the products with both double bonds. Feeding experiments confirmed the introduction of the ∆10 double bond by the CYP EchP450 en-coded in the ech cluster but refuted the hypothesis that EchP450 also catalyzes the formation of the ∆14 double bond. Further in vitro enzyme assays with the prenyltransferase EchPT2 showed its clear preference for substrates without an exo double bond, which contributes to some extent to the explanation of the different product ratios between the various echinulin family alkaloids in A. ruber.

Mutterkornalkaloide sind basische Naturstoffe, die zu der Gruppe der Indolalkaloide gehören. Sie zeigen ein breites Spektrum an pharmakologischen und zuweilen auch toxischen Wirkungen aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit zu den Neurotransmittern Dopamin, Serotonin und Adrenalin. Die Hauptproduzenten sind filamentöse Pilze aus den Familien Clavicipitaceae und Aspergillaceae wie z.B. Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus oder Penicillium commune. Die ersten Schritte der Biosynthese von Mutterkornalkaloiden, ausgehend von L-Tryptophan, verlaufen bis zur Stufe von Chanoclavin-I Aldehyd in allen bekannten Produzenten gleich. Später verzweigen sich die Biosynthesewege und es entstehen unterschiedliche Endprodukte. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der letzte, noch nicht aufgeklärte, gemeinsame Schritt der Biosynthese untersucht werden: die Umwandlung von 4-DMA-L-Abrin zu Chanoclavin-I. Diese Reaktion untergliedert sich in mindestens zwei Oxidations- und einen Decarboxylierungsschritt. Deletions-Experimente haben gezeigt, dass die FAD-abhängige Oxidoreduktase FgaOx1 und die Katalase FgaCat für die Bildung von Chanoclavin-I essenziell sind. Um den Reaktionsmechanismus aufzuklären, sollten beide Enzyme in E. coli oder S. cerevisiae überproduziert und biochemisch charakterisiert werden. Im Falle von fgaCat war die heterologe Expression in E. coli erfolgreich, es konnte jedoch für dieses Enzym alleine keine katalytische Aktivität festgestellt werden. Die Sequenz von FgaOx1 aus der NCBI-Datenbank wurde durch eine Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert, eine Überproduktion des Proteins in E. coli oder S. cerevisiae konnte jedoch nicht erreicht werden. Durch einen bioinformatischen Vergleich der Mutterkornalkaloid-Gene aus Aspergillus fumigatus, Claviceps purpurea und Arthroderma benhamiae mit den verfügbaren Genomsequenzen der Ascomyceten aus der NCBI-Datenbank konnten 15 weitere Spezies identifiziert werden, die die genetische Ausstattung für die Produktion von Mutterkornalkaloiden besitzen. Dazu zählen auch die beiden Pilze Penicillium roqueforti und Penicillium camemberti, die aufgrund ihrer industriellen Verwendung in der Käseherstellung bekannt sind. Im Rahmen der bioinformatischen Analysen wurden neben der Sequenz von FgaOx1 aus Aspergillus fumigatus auch die Proteinsequenzen von 27 weiteren Proteinen aus der NCBI-Datenbank durch Analyse der Intron-Exon-Struktur korrigiert. Durch die Identifizierung der Gencluster und die Korrektur der Sequenzen leistet diese Arbeit einen wertvollen Beitrag für die zukünftige Aufklärung der Biosynthesewege und die Analyse der strukturellen Vielfalt der Mutterkornalkaloide in den verschiedenen Produzenten. In der Vergangenheit wurde bereits über die Produktion von Isofumigaclavin A in Penicillium roqueforti berichtet, allerdings gab es zu Beginn dieser Arbeit keine Publikationen, die Aufschluss über die Biosynthese dieser Substanz geben. Durch die Identifizierung von zwei Mutternkornalkaloid-Genclustern und zwei weiteren, nicht geclusterten Genen in unterschiedlichen Bereichen des Genoms wurde der Grundstein für die Aufklärung des Biosyntheseweges gelegt. In dieser Arbeit wurden acht Gene, die möglicherweise für die späteren Schritte der Biosynthese von Isofumigaclavin A verantwortlich sind, ausgewählt und für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert. Drei der Gene konnten erfolgreich in E. coli exprimiert werden und die entsprechenden Proteine (FgaDHPr, FgaOx3Pr3 und FgaATPr) wurden mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Für FgaATPr konnte in den durchgeführten in vitro-Assays keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPr wurde als kurzkettige Dehydrogenase/Reduktase charakterisiert, welche die Umwandlung von Chanoclavin-I zu Chanoclavin-I Aldehyd in Anwesenheit von NAD+ katalysieren kann. In der aktiven Form liegt das Enzym vermutlich als Pentamer vor. Der KM-Wert für Chanoclavin-I lag bei 573 μM und für NAD+ bei 82 μM. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 326 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,15 s-1. FgaOx3Pr3 gehört zur Gruppe der „Old Yellow Enzymes“ und fungiert als FMN-enthaltende und NAD(P)H-abhängige Oxidoreduktase. Im Rahmen der durchgeführten Enzym-Assays wurde FgaOx3Pr3 als Chanoclavin-I Aldehyd-Reduktase charakterisiert, die zusammen mit FgaFS aus Aspergillus fumigatus oder EasG aus Claviceps purpurea die Bildung von Festuclavin katalysieren kann. Des Weiteren wird in Anwesenheit von FgaOx3Pr3 die Aktivität der untersuchten Chanoclavin-I Dehydrogenasen (FgaDH, ChaDH, FgaDHPr und FgaDHPca) signifikant gesteigert. Es konnte mit Hilfe der durchgeführten Experimente nachgewiesen werden, dass die Aktivitätssteigerung auf eine Aufhebung der Produkthemmung der FgaDH-Reaktion durch FgaOx3Pr3 zurückzuführen ist. Da diese Fähigkeit noch für kein anderes Enzym dieser Klasse beschrieben wurde, handelt es sich bei FgaOx3Pr3 um ein einzigartiges, bifunktionales Enzym, das ein exzellenter Kandidat für die chemoenzymatische Synthese von Mutterkornalkaloiden des Clavin-Typs ist. Über die Produktion von Mutterkornalkaloiden in Penicillium camemberti wurde bisher nicht in der Literatur berichtet. Auch in dieser Arbeit konnten in den Kulturextrakten der untersuchten Stämme keine Mutterkornalkaloide nachgewiesen werden, obwohl ein potenzielles Gencluster für deren Biosynthese identifiziert wurde. Die beiden Gene fgaDHPca und easHPca wurden für die heterologe Expression in E. coli und S. cerevisiae kloniert und konnten in beiden Organismen erfolgreich überproduziert werden. Für EasHPca konnte keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden. FgaDHPca wurde jedoch wie FgaDHPr ebenfalls als Chanoclavin-I Dehydrogenase charakterisiert, welche in ihrer aktiven Form als Tetramer vorliegt. Die ermittelten KM-Werte lagen bei 536 μM für Chanoclavin-I und 528 μM für NAD+. Die mittlere maximale Reaktionsgeschwindigkeit vmax betrug 383 nmol mg-1 min-1 und die Wechselzahl kcat 0,18 s-1. In dieser Arbeit wurde somit erstmals bewiesen, dass P. camemberti die genetische Ausstattung für die Biosynthese von Mutterkornalkaloiden besitzt., Ergot alkaloids are alkaline natural products that belong to the group of indole alkaloids. They have a broad spectrum of pharmacological, but often toxic effects because of their structural similarity with the neurotransmitters dopamine, serotonin and adrenaline. The main producers are filamentous fungi of the families Clavicipitaceae and Aspergillaceae like Claviceps purpurea, Aspergillus fumigatus or Penicillium commune. Starting with L-tryptophan, the first steps of the biosynthesis of ergot alkaloids are similar in all known producing species. After reaching the branch point of the biosynthetic pathways, different end products are formed. This study aims to investigate the remaining common step of the biosynthesis of ergot alkaloids: the conversion of 4-DMA-L-abrine to chanoclavine-I. This step includes at least two oxidation and one decarboxylation reactions. Deletion studies showed that the FAD dependent oxidoreductase FgaOx1 and the catalase FgaCat are essential for the formation of chanoclavine-I. To elucidate the reaction mechanism, both enzymes should be overproduced in E. coli or S. cerevisiae and characterized biochemically. In the case of fgaCat, the heterologous expression in E. coli was successful, but no catalytic activity could be detected for this enzyme alone. The sequence of FgaOx1 from the NCBI database was corrected after an analysis of the intron-exon-structure, but the overproduction of the protein in E. coli or S. cerevisiae was not successful. A bioinformatic comparison of the ergot alkaloid genes from Aspergillus fumigatus, Claviceps purpurea and Arthroderma benhamiae with available genome sequences of Ascomycetes from the NCBI database revealed the presence of ergot alkaloid genes in 15 species that had not been described before. Two of those species are Penicillium roqueforti and Penicillium camemberti which are known for their usage in the industrial production of cheese. In addition to FgaOx1, another 27 protein sequences from the NCBI database were corrected after analysis of their intron-exon-structures in the course of the bioinformatic studies. By identifying the gene clusters and correcting the sequences, this work is a valuable contribution to the future elucidation of the biosynthetic pathways and the analysis of the structural diversity of ergot alkaloids in various producing species. The production of isofumigaclavine A in Penicillium roqueforti has been reported previously, but there were no publications about its biosynthesis at the beginning of this study. The identification of two ergot alkaloid gene clusters and two additional non-clustered genes in different genomic regions laid the foundation for the elucidation of the biosynthetic pathway. Eight genes are very likely involved in the later steps of the isofumigaclavine A biosynthesis and were chosen for cloning and heterologous expression in E. coli and S. cerevisiae. Three of these genes were successfully expressed in E. coli and the recombinant proteins (FgaDHPr, FgaOx3Pr3 and FgaATPr) were purified via affinity chromatography. The in vitro assays showed no enzymatic activity for FgaATPr. FgaDHPr was characterized as a short-chain dehydrogenase/reductase which catalyzes the conversion of chanoclavine-I to chanoclavine-I aldehyde in the presence of NAD+. The native form of the enzyme is likely a pentamer. The KM value for chanoclavine-I was 573 μM and for NAD+ 82 μM. The mean maximum reaction velocity vmax was 326 nmol mg-1 min-1, corresponding to a turnover number kcat 0.15 s-1. FgaOx3Pr3 belongs to the “Old Yellow Enzymes“ and acts as a FMN containing and NAD(P)H dependent oxidoreductase. FgaOx3Pr3 was characterized as a chanoclavine-I aldehyde reductase which catalyzes the formation of festuclavine in the presence of FgaFS from Aspergillus fumigatus or EasG from Claviceps purpurea in vitro. In addition, the enzyme activities of all investigated chanoclavine-I dehydrogenases (FgaDH, ChaDH, FgaDHPr and FgaDHPca) were enhanced significantly by FgaOx3Pr3. These experiments proved that FgaOx3Pr3 overcomes the product inhibition for the FgaDH reaction, resulting in an enhanced product yield. This feature has not been described for other enzymes of the same class, therefore FgaOx3Pr3 is a unique bifunctional enzyme and an excellent candidate for the chemoenzymatic synthesis of clavine-type ergot alkaloids. The production of ergot alkaloids in Penicillium camemberti has not been reported in the literature so far. Although a potential gene cluster for the biosynthesis of ergot alkaloids has been identified in this study, no ergot alkaloids were detected in the culture extracts of the investigated strains. Nevertheless, the two genes fgaDHPca and easHPca were cloned and successfully expressed in E. coli and S. cerevisiae. EasHPca showed no enzymatic activities in the in vitro assays, while FgaDHPca was characterized as a chanoclavine-I dehydrogenase. The native Form of FgaDHPca is likely a tetramer and the KM values were 536 μM for chanoclavine-I and 528 μM for NAD+. The mean maximum reaction velocity vmax was 383 nmol mg-1 min-1 and the turnover number kcat 0.18 s-1.Thus, it was shown for the first time in this work, that P. camemberti has the genetic potential for the biosynthesis of ergot alkaloids.

2,5-Diketopiperazines are the basic structures of some already approved drugs with different indications and therefore represent important skeletons for new potential biological active structures. This basic structure can be formed by cycliodipeptide synthases (CDPSs). It has been postulated that special motifs in the active center allow a prediction of possibly formed cyclic dipeptides. In this work, a cyclodipeptide synthase from Nocardiopsis prasina named CDPS-Np was analyzed. According to the motives in the active center, this CDPS is proposed to produce phenylalanine-containing cyclic dipeptides. After experimental proof, CDPS-Np was shown to produce tyrosine-containing cyclic dipeptides with cyclo(L-Tyr-L-Phe) as the main and cyclo(L-Tyr-L-Tyr), cyclo(L-Tyr-L-Met) and cyclo(L-Tyr-L-Leu) or cyclo(L-Tyr-L-Ile) as minor products. These results provided evidence that this kind of prediction allows to become a hint of possible product formation, but an experimental proof is necessary. Due to the deviation of the actual from the expected product formation, motifs in the active center were analyzed. The substrate specificity should be changed by site-directed mutagenesis in the two binding pockets P1 and P2. For this purpose, various mutations were first introduced in position Thr82 and Tyr196 in binding pocket P1 of CDPS-Np. The original intention to change the substrate specificity could not be achieved by these experiments. However, an 8-fold increase in product formation of cyclo(L-Tyr-L-Phe) and 10-fold of cyclo(L-Tyr-L-Tyr) were detected in the case of the mutant CDPS-Np_T82V_Y196 compared to that of the wild type. Site-directed mutagenesis in the binding pocket P2 also did not change the product spectrum. While the CDPSs are able to form the basic structure of potential active agents, different enzymes are able to modify these structures. Methyltransferases are able to attach a methyl-residue to either C- or O-atoms. Cytochrome P450 enzymes are for example able to bild C-C-bonds and to introduce hydroxy groups or double bonds. In this work, cyclodipeptide oxidases (CDOs) were analyzed, which introduce double bonds at positions 3 and 6 of 2,5-diketopiperazine skeleton. CDOs consist of two subunits, which are only together active for introduction of double bonds. Until now only two CDOs has been analyzed in details. AlbA and AlbB from Streptomyces noursei and Ndas_1146 and Ndas_1147 from Nocardiopsis dassonvillei. The third CDO named CDOA-Np and CDOB-Np from Nocardiopsis prasina has been analyzed in this work. For this purpose, the overlapping nucleotide sequence was cloned into a vector for overproduction of CDOA-Np and CDOB-Np in E. coli. By identifying the enzymatic products of a biotransformation of the natural substrate cyclo(L-Tyr-L-Phe) in E. coli, the functionality of CDOA-Np and CDOB-Np could be confirmed. Furthermore, the activity of His6-CDOA-Np and CDOB-Np-His6 was also shown. For futher investigations, the separated genes of the cyclodipeptide oxidases from Nocardiopsis prasina and Nocardiopsis dassonvillei were already cloned into different expression vectors for overproduction in E. coli. This requires the optimization of overproduction and purification of CDOA-Np-His6, CDOB-Np-His6, Ndas-1146-His6 and Ndas-1147-His6. Furthermore, the cyclodipeptide oxidase from Nocardiopsis prasina was compared with the alrady known cyclodipeptide oxidases from Nocardiopsis dassonvillei and Streptomyces noursei. For this purpose, the overlapping nucleotide sequence from Streptomyces noursei was cloned into an expression vector for overproduction of AlbA and AlbB in E. coli. Subsequently, the biotransformation of various cyclic dipeptides by CDOA-Np/ CDOB-Np, Ndas_1146/Ndas_1147 as well as AlbA/AlbB was investigated. After identification of the enzymatic products by LC-MS, these results were compared. In this context it was the first time that these three cyclodipeptide oxidases has been compared with each other. These enzymes share similar, but not identical behaviors. The mechanism of the CDO reaction is unknown. A direct dehydration, α-hydroxylation followed by loss of water or imine formation and a following isomerization are possible scenarios. The mechanism was analyzed by biotransformation of deuterated cyclo(L-Tyr-L-Phe) using CDOA-Np/CDOB-Np from Nocardiopsis prasina, Ndas_1146/Ndas_1147 from Nocardiopsis dassonvillei and AlbA/AlbB from Streptomyces noursei in E. coli. After analysis of the products by LC-MS, no product indicating an imine-intermediate were detected. These results suggest a direct dehydration as plausible mechanism of the reaction., 2,5-Diketopiperazine sind die Grundgerüste von einigen bereits zugelassenen Arzneistoffen mit unterschiedlichen Indikationen und stellen ebenso wichtige Grundstrukturen für weitere potentielle Wirkstoffe dar. Das Grundgerüst der 2,5-Diketopiperazine kann unter anderem von Cyclodipeptid-synthasen (CDPSs) synthetisiert werden. Es wurde bereits berichtet, dass die Motive im aktiven Zentrum dieser Enzyme eine Vorhersage über die potentiell gebildeten cyclischen Dipeptide zulassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine putative Cyclodipeptidsynthase namens CDPS-Np aus Nocardiopsis prasina analysiert. Nach der Betrachtung der Motive im aktiven Zentrum zufolge waren hierbei phenylalanin-haltige cyclische Dipeptide zu erwarten. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CDPS-Np mit cyclo(L-Tyr-L-Phe) als Hauptprodukt und cyclo(L-Tyr-L-Tyr), cyclo(L-Tyr-L-Met) und cyclo(L-Tyr-L-Leu) oder cyclo(L-Tyr-L-Ile) als Nebenprodukte tyrosin-haltige cyclische Dipeptide synthetisiert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass diese Vorhersagen zwar einen Hinweis auf die Synthese cyclischer Dipeptide ermöglichen, der experimentelle Nachweis der tatsächlichen Produkte jedoch unverzichtbar ist. Aufgrund der Abweichung der tatsächlichen von der erwarteten Produktbildung von CDPS-Np wurden die Motive im aktiven Zentrum genauer betrachtet. Durch zielgerichtete Mutagenese innerhalb der zwei Bindetaschen P1 und P2 des aktiven Zentrums von CDPS-Np solllte deren Substratspezifität verändert werden. Hierfür wurden zunächst verschiedene zielgerichtete Mutationen innerhalb der Bindetasche P1 in den Positionen Thr82 und Tyr196 eingeführt. Die ursprüngliche Absicht die Substratspezitität von CDPS-Np zu verändern konnte durch diese Experimente jedoch nicht erzielt werden. Allerdings konnte bei CDPS-Np_T82V_Y196F im Vergleich zum Wildtypen die 8- bzw. 10-fache Produktion von cyclo(L-Tyr-L-Phe) bzw. cyclo(L-Tyr-L-Tyr) festgestellt werden. Gezielt eingeführte Mutationen innerhalb der Bindetasch P2 von CDPS-Np führten ebenso nicht zur Änderung des Produktspektrums. Während die Cyclodipeptidsynthasen die Grundstruktur für potentielle Wirkstoffe bilden, können diese durch unterschiedliche Enzyme derivatisiert werden. Hierbei können zum einen Methyltransferasen Methyl-Reste auf C- oder O-Atomen anfügen. Zum anderen können Cytochrom P450 Enzyme C-C-Bindungen, Hydroxygruppen oder Doppelbindungen einfügen. In dieser Arbeit wurden Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), welche Doppelbindungen an Positionen 3 und 6 in 2,5-Diketopiperazin-Grundgerüste einfügen können, analysiert. Cyclodipeptidoxidasen bestehen aus zwei Untereinheiten, welche nur zusammen zu der enzymatischen Bildung einer Doppelbindung führen. Bisher wurden zwei Cyclodipeptidoxidasen genauer analysiert. Zum einen AlbA und AlbB aus Streptomyces noursei und zum anderen Ndas_1146 und Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei. In dieser Arbeit wurde eine weitere putative Cyclodipeptidoxidase, CDOA-Np und CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, genauer betrachtet. Hierfür wurde die überlappende Gensequenz in einen Vektor zur Überproduktion von CDOA-Np und CDOB-Np in E. coli kloniert. Durch die Identifizierung der enzymatischen Produkte einer Biotransformation des naturlichen Substrats cyclo(L-Tyr-L-Phe) in E. coli konnte die Aktivität von CDOA-Np und CDOB-Np bestätigt werden. Des Weiteren konnte ebenso die Aktivität von His6-CDOA-Np und CDOB-Np-His6 gezeigt werden. Für weitere Untersuchungen wurden die einzelnen Gensequenzen der Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis prasina und Nocardiopsis dassonvillei in verschiedene Expressionsvektoren für E. coli kloniert. Hierbei bedarf es der Optimierung der Überproduktion und Reinigung von CDOA-Np-His6, CDOB-Np-His6, Ndas-1146-His6 und Ndas-1147-His6. Des Weiteren sollte die Cyclodipeptidoxidase aus Nocardiopsis prasina mit den bereits bekannten Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis dassonvillei und Streptomyces noursei verglichen werden. Hierfür wurde zunächst die überlappende Gensequenz aus Streptomyces noursei zur Überproduktion von AlbA und AlbB in E. coli kloniert. Anschließend wurde die Biotransformation verschiedener cyclischer Dipeptide durch CDOA-Np/CDOB-Np, Ndas_1146/Ndas_1147 sowie AlbA/AlbB untersucht. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produktbildung durch die drei Cyclodipeptidoxidasen mittels LC-MS wurden diese miteinander verglichen, was bisher noch nicht betrachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass diese sich sehr ähnlich, jedoch nicht gleich verhalten. Der Reaktionsmechanismus der CDOs ist weitgehend unbekannt. Es kommt hierbei eine direkte Dehydrierung, eine α-Hydroxylierung mit anschließender Dehydratation oder eine Imin-Bildung in Verbindung mit einer anschließenden Isomerisierung in Frage. In dieser Arbeit wurde der Reaktionsmechanismus anhand einer Biotransformation von deuteriertem cyclo(L-Tyr-L-Phe) durch CDOA-Np/CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, Ndas_1146/Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei und AlbA/AlbB aus Streptomyces noursei in E. coli analysiert. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produkte mittels LC-MS konnten keine Produkte, welche auf Bildung einer Imin-Zwischenstufe hindeuten, festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten somit auf eine direkte Dehydrierung.

Pilze, Bakterien und Pflanzen stellen zahlreiche Sekundärmetabolite her. Ihr Nutzen in dem Produzenten selbst ist oft noch nicht geklärt, dennoch haben viele Sekundärmetabolite eine außerordentliche Bedeutung für die Menschheit. Penicillin hat die Medizin bis heute geprägt, aber auch Lovastatin ist ein Bespiel dafür, welches Potenzial in den Sekundärmetaboliten von Pilzen steckt. Eine interessante Gruppe der Sekundärmetaboliten sind die prenylierten Indolalkaloide. Im Vergleich zur jeweils unprenylierten Substanz kann die Einführung einer Prenylgruppe und die damit verbundene Erhöhung der Lipophilie die biologische Aktivität verbessern. Indolalkaloide können aus tryptophanhaltigen cyclischen Dipeptiden aufgebaut sein. Das Diketopiperazin-Grundgerüst der cyclischen Dipeptide liefert durch die Heteroatome und der Vielseitigkeit in den Seitenketten der Aminosäuren eine ideale Voraussetzung für weitere Modifikationen wie z. B. Acetylierungen, Methylierungen, Cyclisierungen oder Oxidationen. Die hierdurch eingeführten Modifikationen und funktionellen Gruppen führen zu einer Vielfalt an einfachen sowie komplexen Naturstoffen mit interessanten biologischen Aktivitäten. Der Naturstoffgruppe der Ardeemine aus Aspergillus fischeri liegt eine Fumiquinazoline (FQ) Tripeptidgrundstruktur aus Antranilsäure, D-Ala und L-Trp zugrunde. Ein sehr effizienter Biosyntheseweg bestehend aus der NRPS ArdA und der Prenyltransferase ArdB führt zu einem hexacyclischem System (Ardeemin) und die Acetyltransferase ArdC bildet anschließend 5 N Acetylardeemin. Beide Strukturen, Ardeemin und 5 N Acetylardeemin, weisen eine biologische Aktivität als Multi-Drug-Resistance Exportpumpeninhibitor auf. Aufgrund der pharmazeutisch relevanten und vielversprechenden Aktivitäten als Chemotherapeutika sind Fumiquinazoline sowie verwandte Strukturen seit Jahren Teil der Forschung. Durch den Einsatz der Prenyltransferasen für cyclische Dipeptide FtmPT1, BrePT, CdpNPT, CdpC3PT und AnaPT gelang es im Rahmen der vorliegenden Arbeit 14 verschiedene Ardeemin FQ und ent Ardeemin FQ Derivate zu identifizieren und diese mittels LC-MS sowie NMR-Analyse zu charakterisieren. Die Enzyme katalysierten den Transfer der Prenyleinheit an insgesamt sechs unterschiedlichen Positionen N1, C2, C3, C5, C6 und C7. Ardeemin FQ wurde mit Umsätzen von bis zu 77% sehr viel besser akzeptiert als das Enantiomer ent-Ardeemin FQ mit Gesamtumsätzen von maximal 22%, die sich meist auch auf mehreren Produkten verteilen. In einem weiteren Projekt wurde durch die zielgerichtete Mutagenese 5-DMATS und FgaPT2 Mutanten hergestellt, die zur Substratherstellung von C5-prenyliertem cyclo-L-Trp-L-Pro eingesetzt werden sollten. Trotz der erfolgreich hergestellten Mutanten 5-DMATS_R243L, 5 DMATS_R243L_L327G sowie FgaPT2_R244L_Y398F konnte entweder kaum Aktivität oder nur wenig von dem gewünschten Produkt detektiert werden. Parallel zu diesen Mutanten wurde das mehrfachprenylierende Enzym EchPT2 mutiert mit dem Ziel die Mehrfachprenylierungen zu steuern und die Akzeptanz gegenüber dem Donor GPP zu erweitern. Die erfolgreich hergestellten Mutanten EchPT2_A404W, EchPT2_A404F, EchPT2_A404Y und EchPT2_A404L zeigten keinerlei Aktivität gegenüber revers C2 prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro, revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Ala oder Tryprostatin B, allerdings konnte bei EchPT2_A404Y mit dem unprenyliertem Substrat cyclo-L-Trp-L-Pro zwei Produktpeaks detektiert werden. Die Mutante EchPT2_L334G katalysiert den Transfer von GPP auf revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro mit moderatem Gesamtumsatz von 14% verteilt auf mindestens drei Produkten. Für das Projekt der heterologen Expression der Cytochrom P450 (CYP) Gene ftmP450-1 bzw. ftmP450-2 aus Neosartorya fischeri in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) zur Untersuchung der Substratspezifität der CYP Enzyme, wurden u. a. prenylierte cyclo-L-Trp-L-Pro Derivate für die Zufütterung benötigt. Die prenylierten Substanzen wurden entweder als Co-Expression der Prenyltransferase zusammen mit den jeweiligen CYP Gene in S. cerevisiae oder chemo-enzymatisch mit rekombiniertem Protein produziert und anschließend zugefüttert. Es wurden die folgenden heterologen Expressionssysteme erfolgreich in S. cerevisiae KO3 etabliert: die Monoexpression von ftmP450-1, ftmP450-2, ftmPT1 und brePT sowie die Co-Expression von ftmPT1 mit ftmP450-1, brePT mit ftmP450-1und ftmPT1 mit ftmP450-2. Für die heterologen Expressionssysteme mit einer Prenyltransferase in S. cerevisiae wurden unprenylierte cyclische Dipeptide zugefüttert, die insgesamt gut umgesetzt wurden. Für die Systeme mit ftmP450-1 bzw. ftmP450-2, allerdings ohne Prenyltransferase, wurden die regulär C2-prenylierten cyclischen Dipeptide wie cyclo-L-Trp-L-Pro (Tryprostatin B), cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-L-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro, cyclo-L-Trp-L-Leu und cyclo-L-Trp-L-Ala getestet. Dabei zeigte sich ftmP450-2 toleranter gegenüber diesen Substraten als ftmP450-1. Mit ftmP450-1 konnten zusätzlich Substrate getestet werden, die Modifikationen in der Prenyleinheit enthielten, da diese nicht unmittelbar an der Oxidationsreaktion beteiligt ist. Aus diesem Grund war es möglich cyclo-L-Trp-L-Pro Substrate zu testen, die an C4 – C7, C2 revers prenyliert oder an C2 regulär geranyliert waren. Die Verschiebung der Prenylgruppe zu den Positionen C4 – C7 führten zu keiner Umsetzung durch ftmP450-1, allerdings wurden die Substrate, die an C2 eine modifizierte Prenyleinheit trugen, gut umgesetzt und zeigt die Wichtigkeit einer Prenylierung an C2. Diese Produkte von ftmP450-1 wurden mittels LC-MS und NMR-Analyse charakterisiert.

In the course of evolution, microorganisms have developed the ability for production of a multiplicity of structural diverse and complex compounds. Under given environmental conditions, biosynthetic pathways are induced to synthesize complex metabolites that are often toxic toward their competing organisms. Especially production of secondary metabolites of filamentous fungi is one of the most important source of biological active substances, which can be used for the benefit of human health. Notably, the enzyme classes of polyketide synthases (PKS), nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and NRPS/PKS-hybrids are responsible for the production of novel natural products that exhibit considerable therapeutic potential, e.g. antibiotics, antifungal and immunospuppressive drugs. These natural products can be further modified by other enzymes e.g. prenyltransferases, consequently leading to a huge structural diversity. For discovery and development of new drugs, understanding of reaction mechanism of enzymes in nature is mandatory and especially biochemical investigations become more important. In this thesis, functions of two unknown prenyltransferases (FtmPT3, CdpC2PT) of Neosartorya fischeri (N. fischeri) were biochemically identified and characterised. The gene ftmPT3, encodes a prenyltransferase, which catalyses in the presence of DMAPP the prenylation of verruculogen at OH-13 and therefore acts as the long-time missing O-prenyltransferase in the fumitremorgin A biosynthesis. Intensive sequence analyses of ftmPT3 and its adjacent neighbour genes revealed, in comparison to Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), an additional locus with a size of 9.6 kb and seven putative genes. The protein CdpC2PT, shows sequence identities of 40 % with the C2-prenyltransferase BrePT from Aspergillus versicolor and 42 % with NotF from Aspergillus sp. on the amino acid level. Investigations of reaction mixtures of CdpC2PT with DMAPP, showed a broad substrate specifity towards cyclic dipetides with preference for (S)-benzodiazepindione and cyclo-L-Trp-L-Trp. NMR and MS analyses of the enzymatic products revealed unequivocally that CdpC2PT acts as a reverse C2-prenyltransferase and catalyses the mono- and diprenylation of cyclo-L-Trp-L-Trp. Literature search showed the existence of mono- and diprenylated derivatives of cyclo-L-Trp-L-Trp in Penicillium fellutanum (P. fellutanum), socalled fellutanines. Therefore, it can be speculated that CdpC2PT could be involved in the biosynthesis of fellutanines in N. fischeri. Sequence analyses of the neighbour genes revealed the existence of a putative amino oxidase EAW25547, which could be contribute to the biosynthesis of fellutanines. The coding gene NFIA_043660 was successfully amplified from genomic DNA (gDNA) of N. fischeri and subsequently cloned into both expression vectors pQE60 and pHIS8. After incubation under different expression conditions no protein overproduction could be shown. Furthermore, the gene NFIA_062330, encoding for the last unkonwon putative prenyltransferase of N. fischeri, was biochemically investigated. Sequence analyses revealed an orthologous gene ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus), with a sequence identity of 62 % on the amino acid level. Both genes NFIA_062330 and ACLA_042210 were amplified from gDNA and cloned into the expression vector pQE60. Expression of the genes was carried out successfully in the optimized overexpression E. coli strain M15 [pREP4]. Unfortunately no activity could be detected after testing a number of different substrates. Another project focused on the function of two homologous NRPS genes Pc21g15480 of Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) and NFIA_074300 of N. fischeri. Both genes were amplified from gDNA and successfully cloned into the expression vector pJW24. After protoplastation and transformation of the wildtype Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 with the expression constructs, integration of genes was proven by PCR screening. After extraction of Pc21g15480 transformants, cyclo-L-Trp-L-His was detected by HPLC and NMR analyses. Analysis of the NFIA_074300 transformants revealed, that one transformant produced an additional product peak in comparison to the wildtype. Surprisingly this substance was identified by NMR and MS analyses as pseurotin A, a product of a NRPS/PKS-hybrid and was not the expected substance. In addition, production of secondary metabolites by targeted co-expression of prenyltransferases genes with a NRPS gene was carried out in the dissertation. The genes NFIA_043650 and NFIA_074280, encoding for the prenyltransferases CdpC2PT and CdpC3PT, respectively, were primarily amplified from gDNA and afterwards cloned into the expression construct pCaW34. The expression constructs were transferred into transformant A. nidulans CaW03 (ftmPS). PCR screening of the transformants confirmed the ectopic integration of the prenyltransferase genes into the genome. HPLC analysis revealed clearly product accumulation in the resulted transformants and showed the successful strategy for production of biologically active substances by synthetic biology. Structure elucidation of the isolated products was carried out by NMR and MS analyses., Im Laufe der Evolution, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden. Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine toxische Wirkung gegenüber den konkurrierenden Organismen zeigen. Vor Allem die Sekundärmetabolit-Produktion von filamentösen Pilzen stellt dabei eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar, welche zum Nutzen der menschlichen Gesundheit eingesetzt werden können. Insbesondere die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS), nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) und NRPS/PKS-Hybride sind für die Synthese von neuen Naturstoffen verantwortlich, welche großes therapeutisches Potential (Antimykotika, Antibiotika, Immunsuppressiva) besitzen. Die metabolisierten Naturstoffe, können weiterführend durch z.B. Prenyltransferasen modifiziert und somit die Strukturvielfalt enorm gesteigert werden. Für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneistoffe ist das Verstehen von Reaktionsmechanismen einzelner Enzyme in der Natur zwingend notwendig und dafür sind vor allem biochemische Untersuchungen von großer Bedeutung. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die Funktionen von zwei unbekannten Prenyltransferasen (FtmPT3, CdpC2PT) aus Neosartorya fischeri (N. fischeri) aufgeklärt. Das Gen ftmPT3, codiert für eine Prenyltransferase, welche in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die Prenylierung von Verruculogen an OH-13 katalysiert und somit die lang gesuchte O-Prenyltransferase innerhalb der Fumitremorgin A-Biosynthese darstellt. Intensive Sequenzuntersuchungen zu ftmPT3 und der angrenzenden Nachbargene, wiesen im Vergleich zu Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) einen zusätzlichen Genbereich mit einer Größe von 9,6 kb und sieben Genen auf. Das Protein CdpC2PT, wies Sequenzidentitäten von 40 % mit der C2-Prenyltransferase BrePT aus Aspergillus versicolor und 42 % mit NotF aus Aspergillus sp. auf. Die Analyse der Reaktionsgemische von CdpC2PT mit DMAPP, zeigte die Akzeptanz zyklischer Dipeptide mit Substratpräferenz zu (S)-Benzodiazepindion und cyclo-L-Trp-L-Trp auf. Durch die Analyse der enzymatischen Produkte mittels NMR und MS, konnte CdpC2PT eindeutig als eine reverse C2-Prenyltransferase nachgewiesen werden, welche außerdem die Mono- und Di-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Trp katalysiert. Literaturrecherche nach bekannten Naturstoffen wies die Existenz von mono- und diprenylierten cyclo-L-Trp-L-Trp Derivaten (Fellutaninen) in Penicillium fellutanum (P. fellutanum) nach und lässt folglich die Beteiligung von CdpC2PT in der Fellutanin-Biosynthese in N. fischeri vermuten. Die Sequenzanalyse der Nachbargene zeigte das Vorhandensein einer putativen Aminooxidase EAW25547 auf, welche in der Fellutanin-Biosynthese mitwirken könnte. Dieses Gen NFIA_043660 wurde aus der genomischen DNA (gDNA) von N. fischeri amplifiziert und in die beiden Expressionsvektoren pQE60 und pHIS8 kloniert. Nach der Untersuchung verschiedener Expressionsbedingungen konnte jedoch keine Proteinüberproduktion festgestellt werden. Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit, die letzte putative Prenyltransferase aus N. fischeri codierend durch NFIA_062330 untersucht. Sequenzanalysen ergaben ein orthologes Gen ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus) mit einer 62 %igen Übereinstimmung auf Aminosäureebene. Die Gene ACLA_042210 und NFIA_062330 konnten jeweils aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. Die Überexpression der Gene wurde erfolgreich in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Stamm E. coli M15 [pREP4] durchgeführt. Für beide Enzyme wurde eine Vielzahl an diversen Substraten getestet, doch leider konnte bisher keine Aktivität nachgewiesen werden. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die homologen NRPS-Gene Pc21g15480 aus Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) und NFIA_074300 aus N. fischeri in vivo funktionell untersucht. Beide Gene wurden erfolgreich aus gDNA amplifiziert und in den Expressionsvektor pJW24 überführt. Nach Protoplastierung und Transformation des Wildtyps Aspergillus nidulans (A. nidulans) TN02A7 mit den Expressionskonstrukten wurde die Integration der Gene für einige Transformanten mittels PCR-Screening nachgewiesen. Nach Extraktion der Kulturen der Pc21g15480-Transformanten konnte die deutliche Akkumulation zweier neuer Substanzen im Vergleich zum Wildtyp A. nidulans TN02A7 beobachtet werden. Nach Isolierung des ersten Produktes konnte mittels NMR- und MS-Analysen cyclo-L-Trp-L-His nachgewiesen werden. Die Untersuchung der NFIA_074300-Transformanten zeigte hingegen nur einen Transformanten mit einer zusätzlichen Produktbildung im Vergleich zu A. nidulans TN02A7 auf. Diese Substanz wurde mittels NMR und MS überraschenderweise als das PKS/NRPS-Produkt Pseurotin A identifiziert werden und stellte nicht die erwartete Substanz dar. Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der gezielten Koexpression der Prenyltransferasegene cdpC2PT oder cdpC3PT mit dem NRPS-Gen ftmPS aus N. fischeri. Die codierenden Gene NFIA_043650 und NFIA_074280 wurden nach der entsprechenden Amplifikation in das Expressionskonstrukt pCaW34 eingebracht. Nach der in vivo Synthese von cyclo-L-Trp-L-Pro (Brevianamid F) durch die NRPS FtmPS, wurden die Expressionskonstrukte in den Transformanten A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Die ektopische Integration der Gene wurde durch PCR-Screening der erhaltenen Transformanten bestätigt. Die Analyse der Sekundärstoffproduktion mittels HPLC zeigte, eine deutliche Produktbildung in den einzelnen Transformanten auf.

To understand the biological diversity of natural products produced by different microorganism, it is very important to elucidate the biosynthesis of these products. In most cases, the biosynthetic genes are located as a cluster on the genome and can be identified by bioinformatic approaches. Based on the structure feature of natural products, it is possible to find the biosynthetic gene cluster in the genome sequence. After successful identification of a cluster in the genome sequence, it is possible to modify the original biosynthesis by chemoenzymatic synthesis or by genetic manipulations. For that purpose, FtmPT1 in the biosynthesis of verruculogen was overproduced in E. coli M15 cells and purified with Ni-NTA-Agarose. In addition, the four stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala were synthesised by chemical synthesis. These and further six cyclic dipeptides were subsequently incubated with the overproduced prenyltransferase FtmPT1, resulting in the formation of regularly C2-prenylated derivatives. These chemoenzymatically produced diketopierazines were tested in cooperation with Prof. Kassack from Düsseldorf for their biological activities with their non-prenylated precursors as controls. The results showed that the cytotoxic effects of the prenylated diketopierazines were significant higher than those of the non-prenylated precursors. This seems that the prenyl moiety, rather than the prolin moiety is essential for the biological activity. In addition, all tested stereoisomers of cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala showed comparable cytotoxic activities towards the tested cell lines. So the stereochemistry at C-11 and C-14 and the corresponding substituents have no significant influence on the cytotoxicity. During the isolation of the C2-prenylated diketopiperazines, detailed analysis of the incubation mixtures of FtmPT1 revealed the presence of additional product peaks in the HPLC chromatograms. Seven regularly C3-prenylated hexahydropyrrolo[2,3-β] indoles and two regularly N1-prenylated diketopiperazines were isolated and identified by HR-ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. L-tryptophan-containing cyclic dipeptides were converted to C3β-prenylated diketopiperazines and D-tryptophan containing cyclic dipeptides to C3α-prenylated diketopiperazines, so that in both cases a syn-cis configuration was generated. Based on the given crystal structure of FtmPT1, a putative reaction mechanism was proposed. The independent product formation was confirmed by time dependency assays and elucidation of KM-values. In addition to the chemoenzymatic production of tryprostatin B analoga the natural compound fumigaclavin A was isolated from Penicillium commune NRRL2033. The structure and stereochemistry of (8R,9S)-fumigaclavin A was confirmed by ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY experiments. Isolation of fumitremorgin A from N. fischeri NRRL181 provided the evidence for its role as end product of the biosynthesis of fumitremorgins in this fungus. Furthermore nine natural products could be isolated from N. fischeri NRRL181 and identified via HR-ESI-MS and NMR analysis. First of all, the known products aszonalenin, acetylaszonalenin and the precursors of fumitremorgin A: 12,13-dihydroxyfumitremrogin C, fumitremorgin B and verruculogen. Four additional substances of the fumitremorgin-type with unknown biosynthetic pathways could be isolated from N. fischeri NRRL181. Via HR-ES-MS and NMR analysis, these compounds could be identified as verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B and compound 15. Spirotryprostatin A and 6-methoxyspirotryprostain B were first isolated from N. fischeri NRRL181 in this study and compound 15 has not been reported previously. The prenyltransferase gene ftmPT3 is not located in the known verruculogen-cluster at chromosome 8, but at a different chromosome. It was therefore speculated that the genes around ftmPT3 could be responsible for the biosynthesis of verruculogen TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B or compound 15. Three genes were therefore amplified by PCR from gDNA or cDNA and were cloned into expression vectors (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C). After heterologous gene expression in E. coli or S. cerevisiae and purification of the recombinant proteins, enzyme assays with different substrates and cofactors were carried out; unfortunately, no additional product peak could be detected in the HPLC chromatograms of the enzyme assays. Transformation of the prenyltransferase gene brePT into A. nidulans TN02A7 containing the NRPS gene ftmPS, was used as a strategy for in vivo production of deoxybrevianamid E. Unfortunately, no expected product could be detected with HPLC., Zum besseren Verständnis der biologischen Diversität von Naturstoffen aus verschiedenen Mikroorganismen ist es wichtig, deren Biosynthese aufzuklären. Durch bioinformatische Analysen weiß man, dass in den meisten Fällen die Biosynthesegene aus Mikroorganismen in einem Cluster im Genom liegen. Aufgrund der Strukturen der Naturstoffe ist es demnach möglich, deren Biosynthesegene aufzudecken und zu identifizieren. Nach gelungener Identifikation der Cluster ist es nun möglich die Biosynthese gezielt zu modifizieren und somit neue Substanzen mit vorher festgelegter Struktur mittels chemoenzymatischer Synthese mit rekombinanten Enzymen oder aber auch durch genetische Manipulation in Modelorgansimen zu erhalten. Im Zuge dieser Arbeit wurde hierfür zunächst das rekombinante Protein FtmPT1 aus der bekannten Biosynthese von Verruculogen in E. coli-M15-Zelle überproduziert und mittels Ni-NTA-Agarose aufgereinigt. Zusätzlich wurden die vier Stereoisomere von cyclo Trp-Pro und cyclo Trp Ala synthetisiert, um sie später zusammen mit sechs weiteren zyklischen Dipeptiden mittels chemoenzymatischer Synthese mit FtmPT1 und DMAPP an Position C-2 zu prenylieren. In Kooperation mit Prof. Kassack aus Düsseldorf wurden die 14 chemoenzymatisch hergestellten Tryprostatin B-Analoga auf ihre Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Zelllinien untersucht. Dabei ließ sich feststellen, dass die prenylierten Substanzen, bis auf ein paar Ausnahmen, eine ähnliche zytotoxische Aktivität gegenüber einer Zelllinie aufwiesen, wobei alle prenylierten Diketopiperazine eine deutlich höhere zytotoxische Aktivität als ihre unprenylierten Substrate aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Prenyl-Einheit essentiell für die biologische Aktivität ist, die Prolin-Einheit in Tryprostatin B dagegen nicht. Des Weiteren wiesen in den von Prof. Kassack durchgeführten Assays alle vier getesteten Stereoisomere von cyclo-Trp-Pro und cyclo-Trp-Ala ähnliche IC50-Werte gegenüber den getesteten Zelllinien auf. Dies spricht nun dafür, dass die Stereochemie an C-11 und C-14 der Diketopiperazine sowie deren Substituenten ebenfalls keinen großen Einfluss auf die Zytotoxizität nehmen. Im Zuge der Isolierung der C2-prenylierten Diketopiperazine wurden in den HPLC-Chromatogrammen zusätzliche Produktpeaks entdeckt, welche ebenfalls mittels semipräperativer HPLC isoliert wurden. Die Strukturen wurden anschließend mittels ESI-MS- und NMR-Spektroskopie als reguläre C3- und reguläre N1-prenylierte Produkte identifiziert, wobei L tryptophanhaltige zyklische Dipeptide mit FtmPT1 zu C3β-prenylierten Diketopiperazinen umgesetzt wurden und D-tryptophanhaltige zyklische Dipeptide zu C3α-prenylierten Diketopiperazinen, so dass in beiden Fällen eine syn-cis Konfiguration vorlag. Basierend auf der bekannten FtmPT1 Struktur wurden daraufhin Reaktionsmechanismen postuliert und mittels Zeitabhängigkeitsassays sowie durch Bestimmung von KM-Werten eine voneinander unabhängige Produktbildung bestätigt. Neben der chemoenzymatischen Produktion der Tryprostatin B-Analoga wurde, ebenfalls mittels semipräperativer HPLC, Fumigaclavin A aus P. commune NRRL2033 isoliert. Durch Aufklärung der Stereochemie mittels NOESY-Spektroskopie als (8R,9S)-Fumigaclavin A konnte Pyroclavin, ebenfalls mit 8R-Konfiguration, als Vorstufe der Biosynthese von Fumigaclavin A identifiziert werden. Durch die Isolierung von Fumitremorgin A aus N. fischeri NRRL181 konnte der letzte Schritt in der Biosynthese von Fumitremorgin A in N. fischeri NRRL181 identifiziert werden. Zusätzlich zu Fumitremorgin A konnten neun weitere Naturstoffe aus N. fischeri NRRL181 isoliert und deren Struktur mittels ESI-MS-und NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Hierbei handelt es sich unter anderem um Aszonalenin und Acetylaszonalenin, welche von einem bekannten Cluster aus N. fischeri NRRL181 synthetisiert werden. Die Vorstufen 12,13 Dihydroxyfumitremogin C, Fumitremorgin B und Verruculogen in der Biosynthese von Fumitremorgin A wurden ebenfalls isoliert. Neben diesen sechs Indolalkaloiden mit bekannter Biosynthese wurden vier weitere Alkaloide des Fumitremorgin-Typs aus N. fischeri NRRL181 isoliert, deren Biosynthese zu Beginn dieser Arbeit noch nicht aufgeklärt werden konnte. Hierbei handelt es sich um Verruculogen TR-2, Spirotryprostatin A, 6 Methoxyspirotryprostain B und Substanz 15, wobei Spirotryprostatin A und 6 Methoxyspirotryprostain B zum ersten Mal aus N. fischeri NRRL181 isoliert werden konnten und es sich bei Substanz 15 um einen neuen Naturstoff handelt. Da die Prenyltransferase FtmPT3, anders als erwartet, nicht im Biosynthesecluster von Verruculogen identifiziert wurde, sondern auf einem anderen Chromosom, wurde vermutet, dass die benachbarten Gene von FtmPT3 für die Biosynthese der im Rahmen dieser Arbeit isolierten Verbindungen aus N. fischeri NRRL181 verantwortlich sein könnten. Deswegen wurden drei Gene ausgesucht, welche mittels PCR aus gDNA bzw. cDNA amplifiziert und anschließend in verschiedene Expressionsvektoren (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C) kloniert wurden. Durch heterologe Genexpression in E. coli- bzw. S. cerevisiae-Zellen und Aufreinigung der überproduzierten Proteine konnten verschiedene Enzymassays mit unterschiedlichen Cofaktoren und Substraten durchgeführt werden. Jedoch konnte in keinem der getesteten Assays ein Produktpeak mittels analytischer HPLC detektiert werden. Zusätzlich sollte durch Transformation des Prenyltransferasegenes brePT in den Modelorganismus A. nidulans CaW03, in welchen bereits die NRPS FtmPS ektopisch integriert wurde, eine in vivo Produktion von Deoxybrevianamid E mittels HPLC detektiert werden. Dieser letzte Schritt der biologischen in vivo Synthese von Deoxybrevianamid E konnte jedoch nicht erfolgreich durchgeführt werden.

In der vorliegenden Dissertation wurden Arbeiten zur biochemischen Charakterisierung der SAM-abhängigen N-Methyltransferase FgaMT aus A. fumigatus sowie verschiedener putativer Prenyltransferasen unterschiedlicher Aspergillen durchgeführt. Das putative Gen fgaMT, bestehend aus zwei Exons von 272 bp und 748 bp, getrennt durch ein Intron von 72 bp, wurde in dem Biosynthese-Gencluster von Fumigaclavin C in A. fumigatus identifiziert. Das abgeleitete Protein FgaMT besteht aus insgesamt 339 Aminosäuren und weist eine molekulare Masse von 38.1 kDa auf. Der codierende Abschnitt dieses Gens konnte per PCR erfolgreich aus cDNA amplifiziert werden. Nach Klonierung in den Expressionsvektor pQE60 wurde das entstandene Expressionskonstrukt pOR15 mit dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ transformiert. Die Überexpression des fgaMT-Gens erfolgte bei 37 oC, 200 rpm und 1 mM IPTG Endkonzentration im Medium. Das lösliche FgaMT-His6 wurde bis zur Homogenität aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Mit Hilfe von Enzymassays wurde bewiesen, dass FgaMT in Anwesenheit von S-Adenosylmethionin (SAM) als Co-Substrat die Methylierung von 4-Dimethylallyltryptophan (4-DMAT) an der NH2-Gruppe katalysiert. Das Produkt dieser Reaktion wurde durch Analyse per NMR und Massenspektroskopie eindeutig als 4-Dimethylallylabrin nachgewiesen. Da FgaMT 4-DMAT, nicht aber L-Tryptophan als Substrat akzeptierte, konnte nachgewiesen werden, dass FgaMT den zweiten Schritt in der Biosynthese von Ergotalkaloiden katalysiert. Das Enzym benötigt keine Metall-ionen für seine enzymatische Aktivität und weist eine relativ hohe Substratspezifität gegenüber einem Prenylrest an Position C-4 des Indolringes auf. Derivate von 4-DMAT mit Modifikationen am Indolring wurden ebenfalls von FgaMT als Substrate akzeptiert. Sogar 4-Methyl-L-tryptophan wurde von FgaMT umgesetzt. Die KM-Werte wurden mit 0,12 mM für 4-DMAT und 2,4 mM für SAM bestimmt. Die Umsatzrate betrug 2,0 s-1. Durch eine Analyse über FPLC konnte gezeigt werden, dass FgaMT als Homodimer wirkt. Das putative Prenyltransferasegen NFIA_112230 konnte von dem von mir betreuten Bachelor-Studenten Andreas Schweitzer aus genomischer DNA von N. fischeri NRRL181 amplifiziert und mit dem Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. In Fortführung dieses Projektes wurde das Gen von mir in dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ erfolgreich überexprimiert und das abgeleitete, rekombinante Enzym EAW20699-His6 isoliert. Das Protein konnte mit einer molekularen Masse von ca. 50 kDa fast bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Um das natürliche Substrat von EAW20699 zu identifizieren, wurde eine Vielzahl von Enzymassays mit unterschiedlichen Substraten durchgeführt und über HPLC analysiert. Bisher konnte jedoch noch keine Prenylierungsaktivität nachgewiesen werden. Die beiden putativen Prenyltransferasegene AN9229-PT1 und AN9229-PT2 aus A. nidulans sowie das Gen ATEG_03092.1 aus A. terreus, ebenfalls für eine Prenyltransferase kodierend, wurden erfolgreich durch Fusions-PCR aus Fosmiden bzw. gDNA der entsprechenden Aspergillus-Stämme amplifiziert und in die beiden E. coli Expressionsvektoren pQE60 und pHis8, sowie im Falle von AN9229-PT2, auch in den Hefevektor pYES2/NT C kloniert und mit den entsprechenden Wirtsstämmen transformiert. Die erfolgreiche Klonierung konnte durch die Sequenzierung der Expressionskonstrukte bei allen drei Prenyltransferasegenen verifiziert werden. Die Überexpression der Gene war in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Wirtsstamm E. coli M15 [pREP4] ebenfalls erfolgreich, wobei die überproduzierten Proteine jedoch anscheinend zu “inclusion bodies“ aggregierten, ausfielen und nicht mehr ohne Weiteres isoliert und gereinigt werden konnten. Im Falle der Überexpression von AN9229-PT2 konnte aber durch Kultivierung unter sehr milden Bedingungen (niedrige Kultivierungstemperatur und Dauer, Induktion durch geringe IPTG-Konzentration) bzw. durch Aufreinigung mit Laurylsarcosin, das Protein in geringer Menge isoliert werden. Die Enzymassays mit den so gewonnenen Proteinen, wie auch durchgeführte Assays mit dem Rohextrakt, zeigten bisher aber noch keine Prenyltransferaseaktivität. Auch Enzymassays mit Rohextrakten der beiden anderen Prenyltransferasen AN9229-PT1 und EAU36366 wiesen auf keine enzymatische Aktivität hin.

Ergotalkaloide (EA) sind eine komplexe Familie von Indolderivaten mit einem tetrazyklischen Ergolinringsystem, die von Pilzen aus zwei unterschiedlichen Familien produziert werden. Dies sind z.B. Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) aus der Familie Trichocomaceae oder Claviceps purpurea (C. purpurea) aus der Familie Clavicipitaceae. EA besitzen unterschiedliche Strukturen und dadurch auch unterschiedliche biologische Aktivitäten. Aufgrund ihrer Strukturen können EA in drei Gruppen eingeteilt werden: Alkaloide vom Clavin-Typ, Ergoamide und Ergopeptine. Ergoamide sind Amid-Derivate der D-Lysergsäure, während Ergopeptine Peptid-Derivate der D-Lysergsäure darstellen. Alkaloide vom Clavin-Typ enthalten zwar das tetrazyklische Ergolinringsystem, sind jedoch keine Derivate der D-Lysergsäure. Ein Beispiel für diese Gruppe ist Fumigaclavin C, das Endprodukt der Ergotalkaloidbiosynthese in A. fumigatus. Die Pilze der Familie Trichocomaceae produzieren nur Alkaloide vom Clavin-Typ, während Pilze der Familie Clavicipitaceae hauptsächlich Ergoamide und Ergopeptine bilden. Durch den Vergleich der Gencluster für die Biosynthese von EA verschiedener Produzenten konnten sieben homologe Gene identifiziert werden. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass diese Gene in die Bildung des tetrazyklischen Ergolinringsystems involviert sein müssen. In früheren Studien konnten zwei der sieben homologen Gene, fgaPT2 und fgaMT aus A. fumigatus, den entsprechenden Schritten in der Biosynthese des Ergolinrings zugeordnet werden. Die Prenyltransferase FgaPT2 katalysiert den ersten Schritt, die Prenylierung von L-Tryptophan. Das Produkt 4-Dimethylallyltryptophan wird im nächsten Schritt durch die N-Methyltransferase FgaMT zu N-Methyl-4-Dimethylallyltryptophan umgesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten die Funktionen von drei weiteren der sieben homologen Gene aus A. fumigatus, fgaDH, fgaOx3 und fgaFS, in der Biosynthese von Fumigaclavin C aufgeklärt werden. FgaDH besitzt die konservierten Motive von klassischen Short-Chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs), weist aber ansonsten keine Sequenzähnlichkeiten zu SDRs oder anderen bekannten Proteinen auf. Es konnte gezeigt werden, dass FgaDH die Oxidation von Chanoclavin-I zu Chanoclavin-I-Aldehyd katalysiert, wobei NAD+ als Kofaktor benötigt wird. Die Struktur von Chanoclavin-I-Aldehyd konnte eindeutig durch NMR- und MS-Analysen nachgewiesen werden. Die KM-Werte für Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,27 bzw. 1,1 mM. Eine Wechselzahl von 0,38 s-1 wurde aus den kinetischen Parametern berechnet. Das Protein FgaOx3 enthält eine old yellow enzyme-like FMN binding domain, während FgaFS keine konservierten Bereiche oder sonstige Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinen aufweist. Die beiden Proteine FgaOx3 und FgaFS sind zusammen für die Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin verantwortlich. In Abwesenheit von FgaFS kommt es durch FgaOx3 unter Einbau von Sauerstoff zur Bildung eines Produktgemischs, das aus zwei Stereoisomeren besteht und durch FgaFS nicht weiter umgesetzt wird. Die Strukturen von Festuclavin und den zwei Stereoisomeren konnten durch detailierte NMR- und MS-Analysen aufgeklärt werden. Anhand der gesammelten Daten wurde ein Reaktionsmechanismus ausgehend von Chanoclavin-I-Aldehyd postuliert. Desweiteren konnte in dieser Dissertation durch eine Analyse der Genomsequenzen verschiedener Pilze ein putatives Ergotalkaloidgencluster in den Pilzen der Familie Arthrodermataceae identifiziert werden. Das Cluster besteht aus fünf Genen, deren Homologe in A. fumigatus und C. purpurea in die Bildung von Chanoclavin-I-Aldehyd aus L-Tryptophan involviert sind. Es konnten keine homologen Gene zu denen gefunden werden, die für die weitere Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin bzw. Agroclavin oder für die späteren Schritte im Biosyntheseweg von A. fumigatus bzw. C. purpurea verantwortlich sind. Aus dem putativen Gencluster von Arthroderma benhamiae (A. benhamiae) wurde das Gen ARB_04646, welches das Homolog zu fgaDH ist, mit korrigierter Intron/Exon-Struktur amplifiziert, kloniert und erfolgreich exprimiert. Das Enzym bekam die Bezeichnung ChaDH. ChaDH katalysiert wie sein Homolog FgaDH in Anwesenheit von NAD+ die Oxidation von Chanoclavin-I. Das enzymatische Produkt konnte durch NMR- und MS-Analysen eindeutig als Chanoclavin-I-Aldehyd identifiziert werden. Die KM-Werte für Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,09 bzw. 0,36 mM. Aus den kinetischen Parametern wurde eine Wechselzahl von 0,76 s-1 berechnet. In den Kulturüberständen von A. benhamiae konnten keine EA nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse der Gene zeigte, dass unter den gewählten Laborbedingungen keine detektierbare Expression stattfand. In dieser Arbeit konnte somit eine dritte pilzliche Familie identifiziert werden, die zumindest die genetischen Informationen für die Biosynthese von EA bzw. Chanoclavin-I-Aldehyd enthält.

Die Sekundärmetabolit-Produktion der Pilze stellt eine wichtige Quelle von biologisch aktiven Stoffen dar. Innerhalb der Sekundärmetabolite besitzen die Ergotalkaloide sowohl pharmazeutisch-nützliche als auch toxische Eigenschaften. Die Ergotalkaloide gehören zu den Indolalkaloiden. Momentan ist Claviceps purpurea (C. purpurea) einer der wichtigsten Stämme für die industrielle Ergotalkaloidproduktion. C. purpurea produziert hauptsächlich die Ergotalkaloide Ergotamin, Ergocryptin und verwandte Ergopeptine. Im Gegensatz dazu wurden aus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) und Penicillium commune (P. commune) die Clavinalkaloide, darunter Festuclavin, Pyroclavin und die Fumigaclavine A, B und C, isoliert. Ein gemeinsames strukturelles Merkmal dieser Substanzen ist das tetrazyklische Ergolinringsystem. Im Verlauf der Ergotalkaloidbiosynthese stellt Chanoclavin-I-Aldehyd einen Verzweigungspunkt dar. In C. purpurea wird Ergotamin und in A. fumigatus bzw. P. commune Fumigaclavin C bzw. A gebildet. Das Ergotamin enthält einen Tripeptidrest, während die Fumigaclavine andere Substituenten enthalten, z.B. eine Acetoxy-Gruppe an C-9. Zusätzlich unterscheiden sich Fumigaclavin C aus A. fumigatus bzw. Fumigaclavin A aus P. commune stereochemisch an der Position C-8 des Ergolinrings. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen von Ergotalkaloidgenclustern innerhalb der Ascomyceten untersucht. Dabei wurden aus 53 verschiedenen Pilzfamilien 138 in der NCBI-Datenbank verfügbare Pilzgenome auf Sequenzhomologien zu den sieben orthologen Genen von A. fumigatus und C. purpurea analysiert. Es wurden insgesamt 23 Pilze identifiziert, die putative Ergotalkaloidgencluster enthielten. Diese 23 Pilze verteilen sich innerhalb der Ascomyceten auf die drei Familien Clavicipitaceae, Trichocomaceae und Arthrodermataceae. Zum funktionellen Nachweis wurde das Gen fgaOx1 aus A. fumigatus und sein Homolog easE aus C. purpurea untersucht. Beide Gene wurden in Expressionsvektoren kloniert und Expressionsbedingungen in Escherichia coli (E. coli) bzw. in Saccharomyces cerevisiae getestet. Leider blieben die Expressionsversuche der beiden Gene erfolglos. Weitere Proteinsequenzanalysen von FgaOx1 ergaben, dass wahrscheinlich zwei Membrandomänen vorhanden sind. Im Falle des Gens easE ergaben sich während der Untersuchungen der Pilzgenome der Ascomyceten neue Ergebnisse. Wahrscheinlich ist die Intron-Exon-Struktur innerhalb der NCBI-Datenbank fehlerhaft. Die Verzweigungspunkte der Ergotalkaloidbiosynthesen in C. purpurea, A. fumigatus und P. commune wurde durch diese Arbeit weiter aufgeklärt. Durch die Expression der Gene easA und easG aus C. purpurea und deren Aufreinigung sowie der biochemischen Charakterisierung der kodierten Proteine konnte gezeigt werden, dass Chanoclavin-I-Aldehyd in Gegenwart von reduziertem Glutathion durch EasG allein zu Agroclavin umgesetzt wird. Für diesen Schritt war keine Beteiligung von EasA nötig, vielmehr scheint das Protein EasA seine Funktion evolutionär verloren zu haben. In dem postulierten Reaktionsmechanismus von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Agroclavin werden ein Isomerisierungs- und ein Reduktionsschritt benötigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung durch ein nicht-enzymatisches Intermediat von Chanoclavin-I-Aldehyd mit Glutathion (GSH) vollzogen wird. Die Reduktion hingegen erfolgt enzymatisch durch das Protein EasG, das als Iminreduktase fungiert. Für die Katalyse benötigt EasG den Kofaktor NADPH. Die Struktur des Agroclavins wurde eindeutig durch NMR- und MS-Analysen identifiziert. Durch die Kombination von FgaOx3 aus A. fumigatus mit EasG aus C. purpurea konnte gezeigt werden, dass beide Proteine zusammen die Reaktion von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und seinem Stereoisomer Pyroclavin katalysieren. Zuvor war nur bekannt, dass FgaOx3 und FgaFS aus A. fumigatus zusammen Festuclavin bilden. Im Zusammenhang mit diesen Ergebnissen erfolgte die Amplifikation und anschließende Expression der orthologen Gene fgaOx3pc und fgaFSpc aus P. commune NRRL2033 und die Aufreinigung beider Proteine. Die Kombination aller Orthologen lieferte neue Erkenntnisse über den Reaktionsmechanismus und damit auch über den Verzweigungspunkt der Ergotalkaloidbiosynthese in A. fumigatus und P. commune. Im Unterschied zum Reaktionsmechanismus in C. purpurea werden in A. fumigatus und P. commune zwei Reduktionsschritte für die Umsetzung von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und Pyroclavin benötigt. Dabei katalysieren FgaOx3 bzw. FgaOx3pc den ersten und die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc den zweiten Reduktionsschritt. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Hypothesen einer anderen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc die Stereochemie der Gesamtreaktion festlegen und nicht die auch als old yellow enzymes bekannten Reduktasen FgaOx3 bzw. FgaOx3pc. Zudem wird durch die jeweilige Iminreduktase das Produktverhältnis zwischen Festuclavin und Pyroclavin festgelegt.

Prenylated compounds are widely distributed in all living organisms and often posses biological activities differing from their non-prenylated precursors. Transfer reactions of an isoprene moiety from a prenyl donor onto an acceptor molecule, e. g. a terpenoid, a serine residue of a protein or an aromatic molecule, are catalyzed by prenyltransferases. Aromatic prenyltransferases are responsible for prenylation of aromatic compounds and found as membrane-bound or soluble enzymes in bacteria, fungi and plants. They contribute to the diversity of primary and secondary metabolites. During the last decades, many prenylated natural products were isolated from different microorganisms. These natural products include aurachins, a group of quinoline alkaloids from myxobacteria. In this thesis the gene auaA from the putative biosynthetic gene cluster of aurachins in the myxobacterium Stigmatella aurantiaca Sg a15 was heterologously expressed in E. coli and the gene product was subsequently characterized biochemically. AuaA was unequivocally demonstrated to function as a farnesyltransferase catalyzing the prenylation of 2-methyl-4-hydroxyquinoline at position C3 of the quinoline ring. The enzymatic reaction of AuaA followed apparently Michaelis-Menten-kinetics and was strictly dependent on the presence of divalent metal ions. KM-values were determined for 2-methyl-4-hydroxyquinoline and FPP at 0.27 mM and 0.043 mM, respectively. The maximum reaction velocity Vmax was determined at 2.21 nmol/min*mg. Like other aromatic prenyltransferases AuaA showed also flexibility towards aromatic substrates. In addition to its natural substrate 2-methyl-4 hydroxyquinoline, this membrane-bound enzyme accepted also six other 4-hydroxyquinolines and low conversion was even observed for two of six tested flavonoids. In contrast to the promiscuity towards aromatic substrates, AuaA was found to be relatively specific for FPP. GPP was accepted only with a relative activity of 3.3 % in comparison to FPP. Selected amino acid residues in the aspartate-rich motifs, which are characteristic for membrane-bound aromatic prenyltransferases, were investigated in AuaA by site-directed mutagenesis. By mutation of the conserved aspartate residues, the importance of these residues was confirmed. Mutation of the arginine residue in the first aspartate-rich motif (NRxxDxxxD) revealed that the amino acid at this position is not directly involved in the AuaA reaction, which is in contrast to the results obtained for LePGT1, another prenyltransferase from this group. The enzymes FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS from Aspergillus fumigatus belong to aromatic prenyltransferases of the DMATS-family and catalyze the transfer of a prenyl moiety onto an indole ring. In contrast to membrane-bound aromatic prenyltransferases, they do not contain aspartate-rich motifs for binding of prenyl diphosphate via divalent metal ions and their activities are independent of the presence of metal ions. Therefore it was speculated that basic amino acid residues in prenyltransferases of the DMATS-family coordinate the prenyl diphosphate residue. To investigate the importance of three conserved basic amino acid residues for the catalytic activites, site-directed mutagenesis experiments were carried out with FgaPT2, FtmPT1 and 7-DMATS. The results indicated that two lysine residues are involved in the prenyl transfer catalyzed by these enzymes. Mutation of arginine, the third chosen amino acid residue, led only in FgaPT2 to a strong decrease of enzyme activity, indicating that the corresponding arginine residues in FtmPT1 and 7-DMATS are not directly involved in the prenylation reactions. After solution of the crystal structure of FgaPT2 and analyzes of the enzyme complex with L-tryptophan and DMASPP, a substrate analogue to dimethylallyl diphosphate (DMAPP), a reaction mechanism was postulated. In this mechanism the amino acid residues E89, R100 and K174 should play essential roles. In order to verify this hypothesis, mutagenesis experiments of the suggested residues were carried out and the effects of the mutations on the enzyme activity were determined. Mutation of E89 and R100 confirmed the essential roles of these residues for the catalysis of FgaPT2. In contrast, substitution of K174 by glutamine did not support the importance of this residue for the postulated reaction mechanism., Prenylierte Naturstoffe sind in allen lebenden Organismen weit verbreitet und weisen häufig biologische Aktivitäten auf, die sich oft von ihren nicht prenylierten Vorstufen unterscheiden. Transferreaktionen von Isopreneinheiten von einem Prenyldonor auf ein Akzeptormolekül, wie z.B. ein Terpenoid, ein Serinrest oder einen Aromaten, werden von Prenyltransferasen katalysiert. Für die letzte Reaktion sind die sogenannten aromatischen Prenyltransferasen verantwortlich, die als membrangebundene oder lösliche Enzyme in Pflanzen, Pilzen und Bakterien auftreten und zu einer großen Vielfalt an Primär- und Sekundärmetaboliten beitragen. Im Laufe der letzten Jahrzehnte sind viele prenylierte Substanzen mit interessanten biologischen Aktivitäten aus Mikroorganismen isoliert worden, deren Biosynthese großteils noch unbekannt war. Zu diesen Naturstoffen gehörten unter anderem die Aurachine, eine Gruppe von Chinolinalkaloiden aus Myxobakterien. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte das Gen auaA aus dem putativen Gencluster für Aurachinbiosynthese in dem Myxobakterium Stigmatella aurantiaca Sg a15 heterolog in E. coli exprimiert und das Genprodukt anschließend biochemisch charakterisiert werden. Dabei wurde eindeutig gezeigt, dass AuaA als eine Farnesyltransferase fungiert und die Bildung von Aurachin D durch Prenylierung von 2-Methyl-4-Hydroxychinolin an Position C3 des Chinolinrings katalysiert. Die enzymatische Reaktion folgte der Michaelis-Menten-Kinetik und war strikt abhängig von divalenten Metallionen. Die KM-Werte für 2-Methyl-4-Hydroxychinolin und FPP betrugen 0.27 mM und 0.043 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit 2.21 nmol/min*mg. AuaA zeigte Flexibilität gegenüber aromatischen Substraten, da es neben dem natürlichen Substrat auch sechs weitere 4 Hydroxychinoline akzeptierte und sogar zwei von sechs getesteten Flavonoiden in geringem Maße umsetzte. Im Gegensatz dazu war das Enzym relativ spezifisch in Bezug auf den Prenyldonor. Neben FPP akzeptierte AuaA zwar GPP, jedoch nur mit einer relativen Aktivität von 3.3 %. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden ausgewählte Aminosäurereste in den für membrangebundene aromatische Prenyltransferasen charakteristischen aspartatreichen Motiven in AuaA untersucht. Durch die Mutationen konnte die essentielle Bedeutung der konservierten Asparaginsäurereste bestätigt werden. Die Mutation des Arginins im ersten aspartatreichen Motiv (NRxxDxxxD) zeigte, dass die Aminosäure an zweiter Position in dem Motiv nicht direkt in die von AuaA katalysierte Reaktion involviert ist, was einen Unterschied zu LePGT1, einer weiteren Prenyltransferase dieser Enzymgruppe, darstellt. Die Enzyme FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS aus Aspergillus fumigatus gehören zu aromatischen Prenyltransferasen der DMATS-Familie und katalysieren den Transfer eines Prenylrests auf einen Indolkörper. Anders als membrangebundene aromatische Prenyltransferasen enthalten sie keine konservierten aspartatreichen Motive zur Bindung des Prenyldiphosphates durch divalente Metallionen und ihre Aktivität ist ionenunabhängig. Diese Tatsache führte zu der Vermutung, dass in den Prenyltransferasen der DMATS-Familie basische Aminosäuren die Rolle der Metallionen bei der Koordination von Prenyldiphosphat übernehmen könnten. Mit Hilfe von zielgerichteter Mutagenese wurde die Bedeutung von drei konservierten basischen Aminosäureresten für die katalytische Aktivität der Prenyltransferasen FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS untersucht. Die Experimente zeigten, dass zwei Lysinreste in die von allen drei Enzymen katalysierten Prenylierungsreaktionen involviert sind, während die Mutation des ausgewählten Argininrests nur in FgaPT2 zu einem deutlichen Aktivitätsverlust führte. Dies deutete darauf hin, dass dieser Argininrest in FtmPT1 und 7-DMATS nicht direkt an der Prenylierung beteiligt ist. Durch Aufklärung der Struktur von FgaPT2 und Analysen des Enzymkomplexes mit L-Tryptophan und DMASPP, dem Substratanalogon von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), konnte ein Prenylierungsmechanismus postuliert werden, bei dem die Aminosäurereste E89, R100 und K174 eine essentielle Rolle spielen sollten. Zur Überprüfung der Hypothese wurden diese Aminosäurereste mutiert und anschließend die Auswirkung der Mutationen auf die Aktivität von FgaPT2 untersucht. Der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Austausch von E89 und R100 bestätigte die essentielle Rolle dieser Reste für die Katalyse von FgaPT2. Dagegen konnte die Substitution von K174 durch Glutamin die Notwendigkeit dieser Aminosäure für den Reaktionsmechanismus nicht unterstützen.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistisch pathogener Schimmelpilz und einer der Hauptauslöser invasiver Aspergillose. Zusätzlich stellt er ein wichtiges Allergen dar. Obwohl die Pathogenität dieses Pilzes von großer Bedeutung ist, ist bis jetzt noch relativ wenig über die Grundlagen dieser Pathogenität bekannt. A. fumigatus produziert eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten, die möglicherweise für die Pathogenität mitverantwortlich sind. U. a. bildet dieser Pilz das Epipolythiodioxopiperazin Gliotoxin, das auf Zellkulturen toxisch wirkt. Aus diesem Grund wurde spekuliert, dass Gliotoxin an der Pathogenität beteiligt sein könnte. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass noch weiterer Sekundärmetbolite einen Einfluss auf die Pathogenität von A. fumigatus haben. Es ist somit von großem Interesse, mehr über die genetischen Informationen und die Biosynthese von Sekundärmetaboliten, die eventuell als Virulenzfaktoren fungieren könnten, zu erfahren. Das Gencluster der Gliotoxinbiosynthese aus A. fumigatus ist bekannt und besteht aus insgesamt acht Genen. Aus der Genomsequenz von A. fumigatus Af293 konnte ein weiteres Cluster, das drei Gene mit signifikanten Sequenzähnlichkeiten sowohl zu gliC, gliP und gliM aus dem Gliotoxin- als auch zu sirC, sirP und sirM aus dem Sirodesminbiosynthesecluster enthält, identifiziert werden. Sirodesmin ist ein weiteres Epipolythiodioxopiperazin und wird von Leptosphaeria maculans gebildet. Sirodesmin spielt in der Phytopathogenität dieses Pilzes eine entscheidene Rolle. Das putative Gencluster aus A. fumigatus enthält insgesamt acht open reading frames, das Endprodukt des Clusters ist noch unbekannt. Neben den drei schon erwähnten Genen enthält dieses Cluster ein Gen, Afu3g12930, das für eine putative Prenyltransferase kodiert. Die kodierende Sequenz dieses Gens wurde kloniert und in Escherichia coli überexprimiert. Das Protein (7-DMATS) wurde anschließend als His6-Fusionsprotein aufgereinigt. Untersuchungen zur Substratspezifität zeigten, dass 7-DMATS eine breite Akzeptanz besaß und verschiedene aromatische Substrate prenylierte. L-Tryptophan wurde bei diesen Versuchen als Substrat mit der höchsten Umsetzungsrate akzeptiert. Dies war ein Indiz dafür, dass es sich bei dieser Prenyltransferase um eine Dimethylallyltryptophansynthase handelt. Durch Strukturaufklärung des enzymatischen Produktes konnte die Position C-7 des Indolrings eindeutig als Ort der Prenylierung nachgewiesen werden. Wie bereits erwähnt akzeptierte 7-DMATS unterschiedliche aromatische Substrate. Von den getesteten 24 Indolderivaten wurden, bis auf eine Ausnahme im Falle des 7-Methyltryptophans, alle Indolderivate von 7-DMATS akzeptiert und in ihre prenylierten Produkte umgewandelt. Strukturanalysen dieser prenylierten Indolderivate zeigte die Regiospezifität der Prenylierung. In allen Fällen katalysierte 7-DMATS die Anhängung des Prenylrestes an Position C-7 des Indolrings. Durch Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte mit acht unterschiedlichen Indolderivaten Umsetzungsraten von 56 bis nahezu 100 % erreicht werden. Basierend auf der breiten Substratspezifität und auf den hohen Umsetzungsraten kann 7-DMATS als ein sehr gutes Werkzeug für eine chemoenzymatische Synthese von prenylierten Indolderivaten angesehen werden., Aspergillus fumigatus, an opportunistic pathogenic fungus, is the major reason for invasive aspergillosis and constitute also as an allergenic origin. Despite of the importance of the pathogenity of this fungus, only little is known about the background of its pathogenity. A. fumigatus produces a series of secondary metabolites which can be alone or together responsible for the pathogenity. For example, this fungus produces gliotoxin, an epipolythiodixopiperazine, which is in vitro characterised as a potent agent for cell death. For this reason it was speculated, that this mycotoxin might be involved in the pathogenesis of A. fumigatus. It is still necessary to know more about the genetic information and biosynthesis of further secondary metabolites, which might function as virulence factors. The biosynthetic gene cluster of gliotoxin has been identified in A. fumigatus. In the genome sequence of A. fumigatus Af293, an additional putative biosynthetic gene cluster containing three genes with significant sequence similarity to gliC, gliP und gliM of the gliotoxin cluster, as well as to sirC, sirP and sirM of the sirodesmin cluster could be identified. Sirodesmin is also an epipolythiodixopiperazine derivative, which is produced by Leptosphaeria maculans. Sirodesmin is implicated in the phytopathogenity of this fungus. The putative gene cluster from A. fumigatus contains in total eigth open reading frames. The end product of this cluster is still unknown. One gene in this cluster, Afu3g12930 (termed hereafter 7-dmats), which encodes for a putative prenyltransferase, could be identified. The coding region of this gene was cloned, overexpressed in Escherichia coli and afterwards the His6-fusion protein was purified. The enzyme was found to catalyse the prenylation of various aromatic substances whith the highest conversation rate for L-tryptophan. This indicated that 7-DMATS functions as a dimethylallyltryptophansynthase. Structural elucidation of the enzymatic product revealed that the prenyl moiety was attached at position C-7 of the indole moiety. As mentioned above, 7-DMATS accepted various aromatic substrates, including different tryptophan-containing cyclic dipeptides and different indole derivatives. 24 simple indole derivatives were tested and all of the substances, with an exception of 7-methyltryptophan, were accepted and converted to their prenylated products. Structural elucidation of these prenylated products proved the prenylation at position C-7 and demonstrated that 7-DMATS catalyses regiospecifically the prenylation at position C-7 of the indole moiety. Eight different indole derivatives could be prenylated with conversion rates between 56 and 100 % under optimised conditions. Based on the broad substrate specificity and the high conversation rate, 7-DMATS can be used as an effective tool for chemoenzymatic synthesis of prenylated indole derivatives. 7-DMATS is an interesting enzyme not only due its potential as a tool for chemoenzymatic synthesis, but also its catalytic promiscuity.

Fumigaclavin A, B und C sind Ergotalkaloide des Clavin-Typs und werden von Aspergillus- und Penicillium-Arten produziert. Neueste Untersuchungen zeigen, dass Fumigaclavin C experimentell induzierte Leberschäden und Kolitis bei Mäusen bessern kann und gefäßrelaxierend wirkt. Fumigaclavine haben dieselbe Grundstruktur wie Lysergsäure und Dihydrolysergsäure, die Säurekomponenten der pharmazeutisch wichtigen Ergotalkaloide aus Claviceps purpurea bzw. derer semisynthetischen Derivate. Aufgrund der ähnlichen Strukturen und der gleichen biogenetischen Herkunft sind die Untersuchungen zur Biosynthese von Fumigaclavinen auch für das Verständnis der Biosynthese von Ergotalkaloiden aus C. purpurea von Bedeutung. Ein putatives Biosynthesegencluster von Fumigaclavin C wurde in der Genomsequenz von Aspergillus fumigatus AF 293 identifiziert. Das putative Gencluster ist 22 kb groß und enthält 11 ORFs. Sequenzanalyse und Vergleich mit Datenbankeinträgen der Gene aus dem Cluster ermöglichte die Aufstellung eines hypothetischen Biosyntheseweges für Fumigaclavin C. Der experimentelle Beweis für die Identität des Clusters von Fumigaclavin C aus A. fumigatus wurde durch heterologe Überexpression der beiden Prenyltransferasegene fgaPT1 (=Afu2g17990) und fgaPT2 (=Afu2g18040) in E. coli bzw. in Saccharomyces cerevisiae und anschließende biochemische Charakterisierung der Genprodukte erbracht. FgaPT2 katalysiert die Prenylierung von L-Tryptophan zu Dimethylallyltryptophan und somit den ersten Schritt in der Ergotalkaloid-Biosynthese. FgaPT1 katalysiert den letzten Schritt der Fumigaclavin C-Biosynthese, die reverse Prenylierung von Fumigaclavin A an Position 2 des Indolrings. Sowohl FgaPT1 als auch FgaPT2 verwenden Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) als Prenyldonor. Die Enzyme wurden als His-tag Proteine überproduziert und mit Hilfe einer NTA-Nickel-Affinitätssäule zur Homogenität gereinigt. Die enzymatischen Produkte wurden über HPLC isoliert und deren Strukturen mittels spektroskopischer Methoden (NMR und MS) aufgeklärt. Die biochemischen Eigenschaften der beiden Enzyme, die kinetischen Parameter und die Ionenabhängigkeit wurden untersucht. FgaPT2 und FgaPT1 sind 52,5 kDa bzw. 50,2 kDa Proteine und liegen in ihrer aktiven Form als Dimere vor. Für FgaPT2 wurden Km -Werte von 8 µM für L-Tryptophan und von 4 µM für DMAPP bestimmt. Die Km-Werte von FgaPT1 wurden für Fumigaclavin A mit 6 µM und für DMAPP mit 13 µM bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden Enzyme wie auch Dimethylallyltryptophansynthasen aus anderen Pilzen und FtmPT1 aus dem Biosynthesegencluster von Fumitremorginen aus A. fumigatus zu einer neuen Gruppe von Prenyltransferasen gehören, die als lösliche Enzyme vorliegen, keine divalenten Metallionen für ihre Aktivität benötigen und aromatische Substrate prenylieren. Die Dimethylallyltransferase FgaPT2 aus A. fumigatus wurde mit und ohne die beiden Substrate L-Tryptophan und DMAPP kristallisiert. Aus den Kristallen konnten Röntgenbeugungsmuster erhalten werden, die in der Zukunft die Aufklärung der Kristallstruktur erlauben könnten und somit einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der Struktur und Funktion der pilzlichen Prenyltransferasen bedeuten würden. Bisher liegen keine Kristalldaten von pilzlichen Prenyltransferasen vor. Die Identifizierung des Biosynthesegenclusters von Fumigaclavin C aus dem pathogenen Pilz Aspergillus fumigatus stellt eine Alternative zum Cluster aus C. purpurea für die Untersuchungen der Biosynthese von Ergotalkaloiden zur Verfügung, denn Fumigaclavin C hat nicht nur die gleiche Grundstruktur wie Lysergsäure, beide Substanzen haben dieselbe biogenetische Herkunft und teilen mehrere der ersten Reaktionsschritte in der Biosynthese. Ein weiteres putatives Fumigaclavin-Biosynthesegencluster wurde aus Penicillium commune NRRL 2033 kloniert. Das Cluster wurde durch Screening einer Cosmidbank mit homologen PCR-Primern für ein DMATS-Genfragment identifiziert. Die homologen Primer konnten nach Sequenzierung eines mit Hilfe von degenerierten Primern für DMATS-Gene amplifizierten Fragmentes synthetisiert werden. Ein Vergleich des Clusters aus P. commune mit dem von C. purpurea und A. fumigatus zeigte, dass sich die strukturellen Unterschiede der von den drei Stämmen produzierten Ergotalkaloide erstaunlich genau in der Organisation der Cluster wiederfinden. Mit P. commune steht somit ein nichtpathogener Fumigaclavin-Produzent für die weitere Untersuchung der Ergotalkaloide zur Verfügung. Durch den Vergleich der drei Cluster konnten neue Hypothesen über die Ergotalkaloidbiosynthese und die beteiligten Enzyme und Gene für alle drei Pilze aufgestellt werden. Fumigaclavines A, B and C are ergot alkaloids of the clavine type and are produced by species of the genera Aspergillus and Penicillium. Recent studies have shown that fumigaclavine C can improve experimentally induced liver injury and colitis in mice and has vasorelaxant properties. Fumigaclavines have structural features similar to lysergic and dihydro-lysergic acid, the acidic components of the pharmaceutically important ergot alkaloids from Claviceps purpurea and their semisynthetic derivatives. In addition to their similar structures both substances share a common biogenetic origin, therefore the molecular and biochemical investigations on the biosynthesis of the fumigaclavines are also important for the understanding of the biosynthesis of ergot alkaloids from C. purpurea. A putative biosynthetic gene cluster of fumigaclavine C has been identified in the genomic sequence of Aspergillus fumigatus AF 293. The putative gene cluster spans 22 kb and comprises 11 ORFs. Sequence analysis and comparison of the genes from the cluster with data base entries permitted the postulation of a hypothetical biosynthetic pathway for fumigaclavine C. Experimental evidence for the identity of the fumigaclavine C cluster from A. fumigatus was provided by heterologous overexpression of the two prenyltransferase genes fgaPT1 (=Afu2g17990) and fgaPT2 (=Afu2g18040) in E. coli and Saccharomyces cerevisiae, respectively, and biochemical characterisation of the gene products. FgaPT2 catalyzes the prenylation of L-tryptophan to give dimethylallyltryptophan and thereby the first step of ergot alkaloid biosynthesis. FgaPT1 catalyzes the last step of fumigaclavine C biosynthesis, the reverse prenylation of fumigaclavin A at position 2 of the indole ring. Both FgaPT1 and FgaPT2 use dimethylallyl diphosphate (DMAPP) as prenyl donor. The enzymes were overproduced as His-tag proteins and purified to near homogeneity with Ni-NTA-affinity chromatography. The enzymatic products were isolated by HPLC and their structures were confirmed by spectroscopic methods (NMR and MS). The biochemical properties, the kinetic parameters and the dependence of the activity on metal ions of both enzymes were investigated. FgaPT2 and FgaPT1 are 52.5 kDa and 50.2 kDa proteins, respectively, and are active as homodimers. For FgaPT2 Km-values were determined with 8 µM for L-tryptophan and 4 µM for DMAPP. Km-values for FgaPT1 were determined as 6 µM for fumigaclavine A and 13 µM for DMAPP. Both enzymes, together with dimethylallyltryptophan synthases from other fungi and FtmPT1 from the biosynthetic gene cluster of fumitremorgins from A. fumigatus, have been shown to belong to a new group of prenyltransferases, which exist as soluble enzymes, are independent in their activity from divalent metal ions, and prenylate aromatic substrates. The dimethylallyltransferase FgaPT2 from A. fumigatus was crystallized with and without its substrates L-tryptophan and DMAPP. X-ray diffraction patterns could be obtained from the crystals, from which the structure of FgaPT2 might be deduced in the future, thereby providing an important contribution to the understanding of the structure and function of fungal prenyltransferases, for which no crystal structure has been reported yet. A putative biosynthetic gene cluster of fumigaclavine A was also cloned from Penicillium commune. The cluster was identified through the screening of a cosmid library with homologous PCR-primers for a DMATS gene fragment. The homologous primers were designed after the sequencing of a fragment amplified with degenerate primers for DMATS-genes. A comparison of the cluster from P. commune with those of C. purpurea and A. fumigatus showed, that the structural differences of the ergot alkaloids produced by the three species are reflected in the organisation of their clusters. P. commune represents a non-pathogenic fumigaclavine producer for further investigation of ergot alkaloids. By comparison of the three clusters, new hypotheses about the ergot alkaloid biosynthesis and the roles of the responsible enzymes could be deduced for all three fungi.