Search

SLAC/SLAH Anionenkanäle, die zur Familie der langsamen Anionenkanäle gehören, repräsentieren Schlüsselproteine in der pflanzlichen Stressantwort. Neben ihrer Aufgabe in Stresssituationen, ist eine Untergruppe der Kanäle für die Beladung der Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid in der Stele der Pflanzenwurzeln verantwortlich. Biophysikalische und pflanzenphysiologische Studien stellten heraus, dass vor Allem der Anionenkanal SLAH3 für die Beladung der Xylem Leitgefäße mit Nitrat und Chlorid verantwortlich ist. Ihm zur Seite gestellt werden noch die elektrisch inaktiven Homologe SLAH1 und SLAH4 in der Wurzel exprimiert. Sie steuern die Aktivität von SLAH3 durch die Assemblierung zu SLAH1/SLAH3 oder SLAH3/SLAH4 Heteromeren. Neben der Kontrolle durch Heteromerisierungsereignisse, werden SLAH3 Homomere sehr spezifisch und schnell durch zytosolische Ansäuerung aktiviert. Obwohl bereits die Kristallstruktur des bakteriellen Homologs HiTehA zu pflanzlichen SLAC/SLAH Anionenkanälen bekannt ist, welche HiTehA als Trimer charakterisiert, sind die Stöchiometrie und der Polymerisierungsgrad der pflanzlichen SLAC/SLAHs bisher noch unbekannt. Die Fluoreszenzmikroskopie umfasst viele etablierte Anwendungsmethoden, wie die konfokale Laserrastermikroskopie (CLSM), Techniken mit verbesserter Auflösung, wie die Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung (SIM) und hochauflösende Methoden, welche durch die Lokalisationsmikroskopie (z.B. dSTORM und PALM) oder die Expansionsmikroskopie (ExM) vertreten werden. Diese unterschiedlichen Mikroskopie-methoden ermöglichen neue Einblicke in die Organisation von Proteinen in biologischen Systemen, die bis auf die molekulare Ebene hinunterreichen. Insbesondere im Bereich der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie sind im Gegensatz zu tierischen Frage-stellungen bisher jedoch nur wenige Untersuchungen in pflanzlichen Geweben durchgeführt worden. Die Lokalisationsmikroskopie ermöglicht die Quantifizierung einzelner Moleküle in nativen Systemen und lässt überdies Rückschlüsse auf den Polymerisierungsgrad von Proteinen zu. Da Poly- und Heteromerisierung von Proteinen oftmals mit der Funktionalität eines entsprechenden Proteins einhergeht, wie es bei den SLAC/SLAH Anionenkanälen der Fall ist, wurden in dieser Arbeit PALM Messungen zur Untersuchung des Polymerisierungsgrades und Interaktionsmuster der Anionenkanäle angewendet. Ferner wurden Expressionsmuster der SLAC/SLAHs untersucht und zudem Mikroskopieanwendungen im Pflanzengewebe etabliert und verbessert. In Bezug auf die Mikroskopieanwendungen konnten wir in Arabidopsis thaliana (At) Wurzeln die polare Verteilung von PIN Proteinen mittels SIM bestätigen und die gruppierte Verteilung in der Plasmamembran am Zellpol auflösen. In Wurzel-querschnitten war es möglich, Zellwände zu vermessen, den Aufbau der Pflanzenwurzel mit den verschiedenen Zelltypen zu rekonstruieren und diesen in Zusammenhang mit Zellwanddicken zu bringen. Anhand dieser Aufnahmen ließ sich die Auflösungsgrenze eines SIM-Mikroskops bestimmen, weshalb diese Probe als Modellstruktur für Auflösungsanalysen, zur Kontrolle für die korrekte Bildverarbeitung bei hochauflösender Bildgebung und andere Fragestellungen empfohlen werden kann. Für die Expansionsmikroskopie in pflanzlichen Proben konnten ein enzym- und ein denaturierungsbasiertes Präparationsprotokoll etabliert werden. Dabei wurden ganze At Setzlinge, Wurzelabschnitte und Blattstücke gefärbt, expandiert und mit zwei bis drei Mal verbesserter Auflösung bildlich dargestellt. In diesem Zusammenhang waren Aufnahmen ganzer Wurzel- und Blattproben mit beeindruckender Eindringtiefe und extrem geringem Hintergrundsignal möglich. Zudem wurden die Daten kritisch betrachtet, Probleme aufgezeigt, gewebespezifische Veränderungen dargestellt und limitierende Faktoren für die ExM in Pflanzenproben thematisiert. Im Fokus dieser Arbeit stand die Untersuchung der SLAC/SLAH Proteine. SLAH2 wird in den Wurzeln vornehmlich in Endodermis- und Perizykelzellen exprimiert, was anhand verschiedener At SLAH2 YFP Mutanten untersucht werden konnte. Dies unterstützt die Annahme, dass SLAH2 bei der Beladung der Leitgefäße mit Nitrat maßgeblich beteiligt ist. Es ist denkbar, dass SLAH2 ebenfalls eine wachstumsbeeinflussende Funktion über die Regulation von Nitratkonzentrationen zugeschrieben werden kann. Darauf deuten vor allem die verstärkte Expression von SLAH2 im Bereich der Seitenwurzeln und die heterogene Expression in der Elongations-, Differenzierungs- und meristematischen Zone hin. Die Membranständigkeit von SLAH4 konnte nachgewiesen werden und FRET FLIM Untersuchungen zeigten eine hohe Affinität von SLAH4 zu SLAH3, was die beiden Homologe als Interaktionspartner identifiziert. Für die Bestimmung des Oligomerisierungsgrades mittels PALM wurden die pflanzlichen Anionenkanäle in tierischen COS7-Zellen exprimiert. Die elektrophysiologische Funktionalität der mEOS2-SLAC/SLAH-Konstrukte wurde mit Hilfe von Patch-Clamp-Versuchen in COS7-Zellen überprüft. Um Expressionslevel, Membranständigkeit und die Verteilung über die Membran der SLAC/SLAHs zu verifizieren, wurden dSTORM-Aufnahmen herangezogen Schließlich ermöglichten PALM-Aufnahmen die Bestimmung des Polymerisierungs-grades der SLAC/SLAH Anionenkanäle, die stöchiometrischen Veränderungen bei Heteromerisierung von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 und auch der Einfluss einer zytosolischer Ansäuerung auf den Polymerisierungsgrad von SLAH3 Homomeren. Zudem weisen die Oligomerisierungsanalysen von SLAH3 Mutanten darauf hin, dass die Aminosäuren Histidin His330 und His454 entscheidend an der pH sensitiven Regulierung von SLAH3 beteiligt sind. Durch die erhobenen Daten konnten also entscheidende, neue Erkenntnisse über die Regulationsmechanismen von pflanzlichen Anionenkanälen auf molekularer Ebene gewonnen werden: Unter Standardbedingungen liegen SLAC1, SLAH2 und SLAH3 hauptsächlich als Dimer vor. Auf eine zytosolische Ansäuerung reagiert ausschließlich SLAH3 mit einer signifikanten stöchiometrischen Veränderung und liegt im aktiven Zustand vor Allem als Monomer vor. Der Oligomerisierungsgrad von SLAC1 und SLAH2 bleibt hingegen bei einer zytosolischen Ansäuerung unverändert. Ferner kommt es bei der Interaktion von SLAH3 mit SLAH1 oder SLAH4 zur Formierung eines Heterodimers, welches unbeeinflusst durch den zytosolischen pH bleibt. Im Gegensatz dazu bleiben die elektrisch inaktiven Untereinheiten SLAH1 und SLAH4 monomerisch und assemblieren ganz spezifisch nur mit SLAH3. Die hochauflösende Fluoreszenz-mikroskopie, insbesondere PALM erlaubt es also Heteromerisierungsereignisse und Änderungen im Poylmerisierungsgrad von Membranproteinen wie den SLAC/SLAHs auf molekularer Ebene zu untersuchen und lässt so Rückschlüsse auf physiologische Ereignisse zu., Anion channels of the slow anion channel family (SLAC/SLAH) are general master switches of plant stress responses. In addition a subgroup of channels load the vascular tissue in roots with nitrate and chloride. The activity of the main nitrate and chloride loading anion channel, SLAH3, is controlled by heteromerization with the electro-physiologically silent subunits SLAH1 and SLAH4 or alternatively by cytosolic acidification. Although the crystal structure of a bacterial homologue (HiTehA) of plant SLAC/SLAH anion channels is already known and suggests a trimeric structure, the stoichiometry and the multimerization level of the plant anion channel counterparts are still undiscovered. Fluorescence microscopy encompasses numerous well-established application methods like confocal laser scanning microscopy (CLSM), high resolution techniques like structured illumination microscopy (SIM) and super resolution microscopy represented by single molecule localization microscopy (e.g. dSTORM and PALM) or recently upcoming methods like expansion microscopy (ExM). These different application methods open new fields of insight into the biological organization of proteins, even down to the molecular level. In comparison to faunal studies, very little floral enquiries have been conducted, especially in the super resolution-sector. Single-molecule localization microscopy enables individual molecules to be quantified in the native environment and therefore allows conclusions regarding protein stoichiometry. As protein stoichiometry often involves cellular function of the corresponding protein, we used PALM applications and single molecule counting strategies to analyze the stoichiometric distribution of anion channel complexes. Moreover, in this study, expression patterns of the SLAC/SLAH proteins were investigated and different microscopic applications on plant specific issues could be improved and established. Referring to microscopic applications, we confirmed the polar orientation of PIN proteins via SIM and succeeded in resolving the clustered distribution in the plasma membrane at the cellular pole. Besides we were also able to measure cellwall dimensions of root cross sections from Arabidopsis thaliana seedlings and therefore succeeded in concluding the root architecture, designating the various cell types within the root, comparing them with cellwall thickness and evaluating resolution limits of the SIM microscope. Due to these reasons, this specimen can be recommended as a model structure for resolution analyses, control measurements regarding tissue-intactness after image processing for super-resolution images, or further questions. We turned out to establish two different protocols for ExM-studies in plants. One is based on enzymatic digestion and the other one on denaturation. We were able to label, expand and image whole At-seedlings, root- and leaf segments and thereby improved the resolution 2 3 fold. In this regard we managed to comprehensively depict the intact structure of leaves and roots with impressive penetration depth and extremely low background. We also examined our data and identified tissue-specific changes, discuss problems and possible limits of ExM in plants. The major part of this work was the investigation of SLAC/SLAH proteins. The expression of SLAH2 in roots is mainly located in endodermal and pericycle cells which was observed in various At-SLAH2-YFP mutants. Thus, strengthening the hypothesis, that SLAH2 has a major role in loading the vascular tissue with nitrate. The heterogeneous expression levels of SLAH2 in the meristematic-, elongation- and differentiation zone and moreover the upregulation in areas of lateral root formation also suggests that SLAH2 has an effect on plant growth by regulating nitrate levels. SLAH4 is located in the plasma membrane and FRET FLIM measurements showed a high affinity to SLAH3, validating the two homologues as interaction partners. For PALM-stoichiometry analyses, the plant anion channels were expressed in mammalian COS7-cells, in order to avoid endogenous falsification of the stoichiometries, as well as impractical reasons of PALM imaging in plant tissue. Hence, checking the electrophysiological functionality of mEOS2-SLAC/SLAH constructs via patch-clamp measurements. dSTORM-measurements were used to verify expression levels, correct membrane-association and the distribution of the SLAC/SLAHs in COS7 cells. We determined the multimerization level of SLAC/SLAHs upon cytosolic acidification and monitor stoichiometric changes upon heteromerization of SLAH3 with SLAH1 and SLAH4. On the basis of our data the following valuable new insights into the regulation mechanisms of plant anion channels were revealed: under control conditions, SLAC1, SLAH2 and SLAH3 are mainly depicted as dimers. Upon cytosolic acidification with NaOAc the stoichiometries of SLAC1 and SLAH2 remained unchanged, whereas the amount of dimeric SLAH3 is significantly reduced and shifts to a mainly monomeric distribution. It could also be assessed that SLAH3 interacts with SLAH1 or SLAH4, thereby forming a heterodimer, which is barely separable by acidification. In contrast, for SLAH1 and SLAH4 no affinity was observed. Moreover, the stoichiometries of different SLAH3-mutants indicated a crucial role of the amino acids histidin His330 and His454 in the pH-sensitive regulation of SLAH3. Hence, super-resolution micrsocopy, especially PALM allows the quantification of polymerization- and heteromerization-levels of proteins like the SLAC/SLAH anion-channels on the molecular level and therefore enabling physiological conclusions.

Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, über eine neue Syntheseroute neuartige Aminopyridinato-(Ap), Imidazolidin-2-iminato- (Ii) sowie ApIi-Titan-Komplexe zu entwickeln. Neben der Synthese der verwendeten Liganden und Komplexe wie auch deren vollständigen Charakterisierung waren die detaillierte Analyse der erhaltenen Produkte aus der Polymerisation, Copolymerisation, Dimerisierung und Heterotrimerisierung von Ethylen und im Besonderen die Klärung mechanistischer Fragen bezüglich der Dimerisierung und Heterotrimerisierung wichtiger Bestandteil. Die damit einhergehenden hohen Selektivitäten und Aktivitäten der Katalysatoren konnten sowohl durch die Variation der Reste an den Liganden als auch durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen fein abgestimmt werden. Bei Ap- und Ii-Liganden handelt es sich um stabilisierende und dirigierende Liganden für Polymerisationskatalysatoren von α-Olefinen. Aus der Kombination dieser Liganden bestehende Komplexe zeigten mit Zirconium und Hafnium als Zentralatom bereits gute Aktivitäten in der Oligomerisation von Ethylen. Jedoch war es noch nicht möglich, Titan-Komplexe mit beiden Liganden herzustellen. Das Einbringen des Ii-Liganden in die ApTi-Vorstufe über herkömmliche Synthesewege, wie Amin- oder Alkaneliminierung, verursachte eine Abspaltung des Ap-Liganden. In der vorliegenden Arbeit gelang dies durch die Entwicklung einer neuen Syntheseroute ausgehend von Tribenzylmonochloridotitan(IV) als Vorstufe. Über eine Alkaneliminierung wurde zunächst der Ap- und anschließend über eine Salzmetathese der Ii-Liganden in hohen Ausbeuten koordiniert. Durch die Aktivierung eines Dialkylkomplexes mit BF15 konnte ein entsprechendes Kation generiert, isoliert und charakterisiert werden. Neben diesen neuen Gemischtligandkomplexen (ApIiTiBn2) wurden außerdem verschiedene Vorstufen, unter anderem Mono(aminopyridinato)titan(IV)-Komplexe, unter optimierten Bedingungen synthetisiert. Die vollständige Charakterisierung der Verbindungen erfolgte über NMR-Spektroskopie, Elementaranalyse und Röntgeneinkristallstrukturanalyse. Die Auswertung der Röntgeneinkristallstrukturanalyse des ApIiTiBn2-Systems lieferte Hinweise über die zuvor genannte Verdrängungsreaktion der Ap-Liganden. Im nächsten Schritt wurden die Präkatalysatoren mit Ammoniumborat in der Ethylenoligomerisation bzw. -polymerisation eingesetzt. Die Kombination der beiden Steuerliganden mit Titan als Zentralatom bewirkte nicht nur einen Wechsel von der Polymerisation (ApTiBn3) zur Oligomerisation (ApIiTiBn2 z.B. mit 1-Cyclohexyl-3-(2,6-diisopropylphenyl)imidazolidin-2-imin), sondern ermöglichte eine selektive Dimerisierung von Ethylen zu 1-Buten. Im Vergleich zu den Einligandsystemen konnten die Aktivitäten enorm gesteigert werden. Bei optimierten Bedingungen erwies sich 4AF als der interessanteste Präkatalysator mit der höchsten Selektivität (94 % 1-Buten) und TOF (76 10^6 h^-1). Diese Aktivitäten sind vergleichbar mit denen von Enzymen und übertreffen, nach unserem Wissen, die bislang publizierten Aktivitäten für die Dimerisierung von Ethylen. Durch Temperatur- und Druckstudien war es möglich, Informationen zu mechanistischen Aspekten zu erhalten, wie zum Beispiel eine Schulz Flory Verteilung mit einem unerwarteten Anstieg des α-Wertes bei steigender Temperatur oder einer Druckabhängigkeit erster Ordnung. Eine Abhängigkeit der Kettenlänge der Produkte vom sterischen Anspruch am Pyridinrest des Ap-Liganden führte weiterhin zur schrittweisen Erniedrigung des Molekulargewichtes. Folglich wird eine Verringerung des mittleren Molekulargewichtes sowohl durch die Variation des Ap- (fein) und Ii-Liganden (grob) als auch durch eine Erniedrigung der Temperatur oder des Drucks erreicht. Die Reaktionszeit und die eingesetzte Stoffmenge des Präkatalysators oder des Scavengers spielen dabei keine ersichtliche Rolle. Ein Langzeitexperiment demonstrierte die Stabilität des aktivierten ApIiTiBn2-Systems über mehrere Stunden mit einer Katalysatorbeladung von mindestens 0,03 ppm. Des Weiteren konnte die „Selbstheilung“ eines CH-aktivierten Kations untersucht werden. Diese hochaktiven, selektiven und langzeitstabilen Systeme erlaubten im nächsten Schritt die Nutzung von höheren Olefinen als Comonomere. Mit dem Einsatz von 4AF gelang es, das Produktspektrum durch eine selektive Heterotrimerisierung zu spezifizieren. Neben der Einführung einer Ethylverzweigung wurden die Olefine hierbei regioselektiv um ein Ethylen verlängert. Dabei wirkte sich eine Erhöhung der Kettenlänge des eingesetzten Monomers mit einer Erniedrigung auf die Aktivität, jedoch nicht auf die Selektivität aus. Die Isolierung und anschließende Charakterisierung von 4-Ethylenoct-1-en, dem Heterotrimerisierungsprodukt von 1-Hexen, ließen Rückschlüsse auf den vorliegenden Mechanismus zu. Über eine Temperatur-, Zeit- und Druckstudie konnte ein analoges Verhalten zur Ethylendimerisierung bezüglich des Molekulargewichtes beobachtet werden. Sehr geringe Abweichungen bei dreimaliger Wiederholung dieser Experimente bewiesen eine sehr gute Reproduzierbarkeit. Die Herstellung verschiedener Produkte im Multigrammmaßstab ermöglichte es, ein bereits verlängertes Produkt nochmals selektiv zu verlängern. Unter sehr milden Bedingungen (1 bar, 15 °C) wurden somit neben linearen auch verzweigte, cyclische und aromatische Olefine selektiv verlängert. Auf diesem Weg gelang es, 4-Ethyloctadec-1-en und 4,6-Diethyldodec-1-en, nach unserem Wissen bis dato nicht literaturbekannte Produkte, zu synthetisieren und anschließend zu charakterisieren. Diese Ergebnisse gewähren den Zugang zu einer signifikant großen Anzahl neuer Verbindungen, die, wie am Beispiel von (4-Ethyldecyl)diisobutylaluminium gezeigt, funktionalisiert werden können.

Das Nukleoprotein der Arenaviren erfüllt zentrale Aufgaben im viralen Replikationszyklus. Dazu gehört die Enkapsidierung des viralen Genoms und die Regulation von Transkription und Replikation sowie die Interaktion mit dem Matrixprotein und die Inhibition der Typ I Interferon-Antwort. Über die Homo-Oligomerisierung des Nukleoproteins, ihre Bedeutung für diese vier Aufgaben sowie die hierfür notwendigen Domänen innerhalb des Nukleoproteins war bisher nichts bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich das Nukleoprotein in Abwesenheit viraler RNA zu symmetrischen, ringförmigen Trimeren zusammenlagert. Die Bildung dieser Trimere ist unabhängig von posttranslationalen Modifikationen und ist innerhalb der Arenaviren konserviert. Mutationsanalysen ergaben, dass Bereiche innerhalb der N- und der C-terminalen Domäne kritisch für die Trimerisierung des Nukleoproteins sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Oligomerisierung des Nukleoproteins eine Grundvorraussetzung für seine Funktion bei der Replikation und Transkription des viralen Genoms ist. Im Gegensatz dazu spielt sie bei der Interaktion des Nukleoproteins mit dem Matrixprotein und für die Fähigkeit des Nukleoproteins zur Inhibition der Typ I Interferon-Antwort keine Rolle. Vermutlich wird das Nukleoprotein der Arenaviren durch Wirtszell-spezifische Proteasen verkürzt. Die dabei entstehenden, großen Spaltfragmente liegen als Monomere vor und könnten in der infizierten Zelle die Funktion als Interferon-Antagonist übernehmen, während ungespaltenes Nukleoprotein für die Replikation, Transkription und Enkapsidierung des viralen Genoms verwendet wird. Das Nukleoprotein sorgt durch seine Interaktion mit dem Matrixprotein für den Einbau des viralen Genoms in neu entstehende Virionen. In dieser Arbeit wurden die dafür verantwortlichen Aminosäurebereiche auf kurze Bereiche innerhalb der C-terminalen Proteindomäne des Nukleoproteins eingegrenzt. Anhand dieser Untersuchungen wurde ein Modell für die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein an der Virusmembran aufgestellt. Vergleichende Studien zwischen den Nukleoproteinen und Matrixproteinen verschiedener Arenaviren ergaben zudem, dass heterotypische Interaktionen nur zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein nahe verwandeter Arenaviren möglich sind. Die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein wurde somit als Faktor identifiziert, der die die Bildung von Arenavirus-Reassortanten stark einschränkt. Insgesamt konnte in dieser Arbeit der Zusammenhang zwischen der Homo-Oligomerisierung und den biologischen Funktionen des Nukleoproteins aufgezeigt werden. Darüber hinaus wurden funktionelle Domänen für die NP-NP-Interaktion und die Interaktion zwischen dem Nukleoprotein und dem Matrixprotein innerhalb des Nukleoproteins identifiziert.

Das HIV-1-Protein p6 ist im C-terminalen Bereich von Gag lokalisiert und besitzt trotz seiner geringen Größe von nur 52 Aminosäuren eine komplexe strukturelle und funktionelle Organisation. Es bindet mindestens zwei zelluläre Buddingfaktoren (Tsg101 und ALIX) sowie zwei virale Proteine (Vpr und Env) und übt eine Vielzahl biologischer Funktionen aus. Außerdem besitzt p6 sowohl C- als auch N-terminal jeweils eine L-Domäne, welche unter anderem den letzten Schritt in der Abschnürung des naszierenden Virions von der Zellmembran, in einem bis heute noch nicht vollständig geklärten Mechanismus, regulieren. Neben den Modifikationen der Ubiquitinylierung und Sumoylierung fungiert p6 außerdem als Substrat für verschiedene Kinasen: Im Jahr 2002 wurde p6 als Hauptphosphoprotein in HIV-1-Partikeln identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass p6 durch die MAP-Kinase ERK-2 an der Position Thr-23 phosphoryliert wird. Weiter gibt es Hinweise, dass die genannte Kinase durch die Phosphorylierung an Thr-23 von p6 den Viruszusammenbau sowie die Virusfreisetzung reguliert. Zur Identifikation weiterer potentieller Kinasen wurde zu Beginn dieser Arbeit eine in silico Analyse durchgeführt und schließlich mittels in vitro Experimenten mit synthetischem und viralem p6-Peptid die Proteinkinase C, welche spezifisch Ser-Reste an Position 14, 25 und 40 in p6 phosphoryliert, identifiziert. Vergleicht man die Konsensussequenzen verschiedener HIV-1-Isolate der M-Hauptgruppe, so ist eine absolute Konservierung von Ser-40 festzustellen, was auf eine mögliche biologische Funktion dieser Stelle hindeutet. Zur Untersuchung der biologischen Funktion der Phosphorylierungsstellen in p6 wurden Konstrukte kloniert, die an den identifizierten Ser-Resten mutiert wurden. Die Substitution aller Ser-Reste einzeln zeigte in Infektionsstudien, dass nur die Mutation von Ser-40 zu einer verminderten Replikationskapazität in T-Zellen sowie in primären humanen Zellen führte. Die Mutation von Ser-14 und Ser-25 zeigte keinen Effekt auf die Replikation von HIV-1. Die Mutation aller drei PKC-Stellen zusammen führte hingegen zu einem kompletten Verlust der Replikationsfähigkeit. Obwohl die Mutation der Phosphoakzeptorstellen die Freisetzung der Viruspartikel nicht beeinflusste, sind die produzierten Virionen der Ser-40-Mutante weniger infektiös und die Dreifachmutation führte sogar zu einem kompletten Verlust der Infektiösität. Als molekularer Mechanismus hinter diesem Phänomen konnte in Pulse-Chase Experimenten beobachtet werden, dass die CA-Prozessierung von p25 zu p24 im Fall der Ser-40-Mutante gestört ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass der Defekt in der CA-Prozessierung zu einer irregulären Core-Morphologie und zur Bildung einer elektronendichten Struktur außerhalb des Cores führt. Die erhaltenen Ergebnisse belegen eine neue, bis heute unbekannte Funktion von p6, die nicht die Virusfreisetzung, sondern die Gag-Prozessierung betrifft. Das konservierte Ser-40 reguliert auf noch unbekannte Weise, womöglich durch PKC-Phosphorylierung, die CA-Reifung und somit die Infektiösität von HIV-1. Neben den verschiedenen Bindungsstellen für virale und zelluläre Proteine sowie den Modifikationsstellen besitzt p6 die inhärente Fähigkeit zur Ausbildung oligomerer Formen. Diese wurden durch die Behandlung von sp6 und vp6 mit chemischen Crosslinkern und anschließender Western Blot Analyse untersucht. Es zeigte sich, dass das C-terminale Fragment von p6 oligomere Strukturen ausbildet. Somit konnte der in silico Befund, dass p6 eine im C-terminalen Bereich lokalisierte Oligomerisierungsdomäne besitzt, bestätigt werden. Ob diese Oligomerisierungsdomäne in p6 zur Gag-Gag-Multimerisierung, welcher eine wichtige Rolle in der Gag-Assemblierung und der Produktion von Viruspartikeln zukommt, beiträgt, sie eine ganz andere funktionelle Relevanz hat oder gar funktionslos ist, ist bislang nicht bekannt. The HIV-1 protein is located at the C-terminus of Gag and despite its small size of 52 amino acids it comprises a quite complex structural and functional organization: it binds at least two cellular budding factors (Tsg101 and ALIX) as well as two viral proteins (Vpr and Env) and it exerts a variety of biological functions. Among others, it regulates the final abscission step of the nascent virion from the cell membrane by the action of two different l domains, one located at the C- and one located at the N-terminus of the peptide, in a yet not completely elucidated mechanism. Besides the ubiquitinylation and sumoylation p6 acts as a substrate for distinct kinases: 2002 p6 was identified as the major phosphoprotein found in HIV-1 particles and it could be shown that phosphorylation of p6 by MAP-kinase ERK-2 at position Thr-23 regulates the assembly and release of progeny virions. To identify further potential kinases an in silico analysis was performed and finally in vitro experiments with synthetic and viral p6 identified PKC to specifically phosphorylate Ser residues in position 14, 25 and 40 in p6. When the consensus sequences derived from various HIV-1 group M isolates were compared, one can see that Ser-40 is absolutely conserved. Therefore, the biological function of this site has to be identified. To analyze the biological function of the identified phosphorylation sites, different constructs carrying mutations of the identified Ser residues were generated. Individual substitutions of the Ser residues revealed that only mutation of Ser-40 reduced virus replication in T-cell lines and in primary human cells, while mutation of Ser-14 and Ser-25 had no effect on the replication. In contrast, mutation of all three PKC-sites completely abrogated replication. Although mutation of PKC sites had no influence on virus release, the infectivity was reduced for the Ser-40 mutant and completely lost for the triple mutant. As molecular mechanism behind this phenomenon pulse-chase experiments illustrated that the efficiency in final processing of CA from p25 to p24 was dependent on the integrity of Ser-40. Electron micrographs showed that the defect in CA processing led to an irregular morphology of the virus core and the formation of an electron dense extra core structure. Thus, the obtained results support a novel, till this day unknown function of p6, that does not affect virus release but concerns Gag processing. The conserved Ser-40 regulates in a yet unknown manner CA maturation and thereby infectivity of HIV-1 in a process that might involve PKC phosphorylation. In addition to the different binding sites for viral and cellular proteins and the modification sites p6 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This observation was analyzed by incubating sp6 and vp6 with chemical crosslinkers and western blotting. It turned out that the C-terminal fragment of p6 has the propensity to form oligomeric structures. This is consistent with in silico analysis, which predicts an oligomerization domain in the C-terminus of p6. Whether this oligomerization domain in p6 contributes to the Gag-Gag multimerization, which has an important role in Gag assembly and virus particle production, or whether it has a complete different functional relevance or it is totally out of any function is previously not known.

The classical NF-kappaB-signaling is not only one uniform pathway but consists of several distinct signaling pathways which differ regarding their inducing agents, the intracellular proteins involved in signal transmission, the kind of activated NF-kappaB dimers and the set of induced target genes. However, the precise molecular mechanisms by which these differential NF-kappaB activation patterns are determined still remain largely unknown. The key regulator within the classical NF-kappaB-signaling cascades is the IKK-complex. Since structural alterations in the IKK-complex are thought to participate in the regulation of its kinase activity, protein-protein-interactions within the IKK-complex were characterized. The IBD in NEMO has been shown to mediate the interaction with the IKKs. However, our studies reveal that the IBD additionally constitutes an independent oligomerization interface. Interestingly, the IBD possesses several phosphorylation sites. Yet, the physiological functions are still largely unknown. IKKß-mediated phosphorylation of Ser68 in the IBD caused a reduced NEMO-IKKß interaction and NEMO oligomerization. The negative effect of the Ser68-phosphorylation on the classical NF-kappaB-signaling pathways underline the importance of phosphatases and specific dephosphorylation events for the classical NF-kappaB activation. Therefore the yet poorly defined role of the protein phosphatase calcineurin in the TCR-induced NF-kappaB activation was analyzed. Our results point out that calcineurin acts as a BCL10 phosphatase that removes inhibitory phosphate groups from BCL10 in the early activation state. Therefore a molecular basis of how calcium influences the TCR-induced NF-kiappaB-signaling pathway is the calcineurin-mediated regulation of the CBM-complex. In summary these data underscore the importance of negatively regulating phosphorylations, which are necessary to avoid an unwanted chronic NF-kappaB activation and highlight the relevance of phosphatases in the process of IKK activation.

Diese Arbeit befasste sich mit der Fragestellung, wie durch gezielte Modifikation der Proteinfaltung die virale Replikation beeinflusst werden kann. Durch Jahrmillionen der Koevolution entwickelten Viren eine Abhängigkeit von Mechanismen der Wirtszellen. Zelluläre Proteine stellen auf Grund ihrer geringen Mutationsrate interessante Ansatzpunkte zur antiviralen Therapie dar. So wurde für die Assemblierung, Knospung und Reifung diverser Retroviren eine Abhängigkeit gegenüber einem funktionalen Ubiquitin-Proteasom-System in den Zielzellen beschrieben. Diese Effekte wurden bisher allein auf die Proteasom-Inhibitor (PI)-bedingte Depletion des freien zellulären Ubiquitins zurückgeführt. Im ersten Schwerpunkt dieser Arbeit wurde gezeigt, dass ein auf dem chemischen Chaperon Glycerol basierendes Medium, welches Zellen optimierte Bedingungen zur Proteinfaltung bietet, die Prozesse der viralen Freisetzung positiv beeinflusst. Weiterhin war es möglich, den PI-bedingten Freisetzungsdefekt durch die Applikation des Glycerolmediums abzuschwächen. Dies liegt an der Verminderung der durch die Hemmung der Proteasom-Aktivität bedingten Akkumulation fehlgefalteter, polyubiquitinierter Gag-Moleküle, den sogenannten Gag-DRiPs, welche in einer mechanistisch den Prionen ähnlichen Art und Weise die Freisetzung viraler Partikel beeinflussen. Diese in den Replikationsstudien beobachteten Effekte traten in einer derart kurzen Zeitspanne auf, dass sie in starkem Kontrast zu der erst deutlich später detektierbaren Abnahme des freien Ubiquitins stehen. Aus diesen Daten geht hervor, dass die PI-bedingte Hemmung der viralen Freisetzung nicht allein auf einer verringerten zellulären Ubiquitinmenge beruhen kann, sondern vielmehr auch durch Gag-DRiPs bedingt wird. Ein weiterer Schwerpunkt lag in der spezifischen Hemmung des zentralen zellulären Hitzeschockproteins Hsp90 und deren Auswirkung auf die Replikation von HIV-1. Die selektive Hemmung von Faltungsprozessen führt zur Akkumulation polyubiquitinierter Proteine, welche wiederum mit der geordneten Assemblierung von Gag-Molekülen interferieren können. Sowohl in ex vivo kultivierten tonsillärem Gewebe als auch in PBMCs konnte eine deutlich dosisabhängige Hemmung der HIV-1 Replikation durch den Hsp90-Inhibitor 17-AAG nachgewiesen werden. Die hierbei verwendeten Substanzmengen lagen weit unter der maximal tolerierbaren Konzentration. Weiterhin zeigte die Kombination von 17-AAG mit einem PI (PS-341) im niedrigen nanomolaren Bereich synergistische Effekte auf die Hemmung der Replikation von HIV-1, was für einen günstigen therapeutischen Index in vivo spricht. Diese Ergebnisse charakterisieren die selektive Hemmung von Hsp90 durch 17-AAG in Kombination mit Proteasom-Inhibitoren als vielversprechenden therapeutischen Ansatz zur Einflussnahme auf die Replikation von HIV-1. Ein alternativer Mechanismus, wie ein korrekt gefaltetes virales Protein auf die Virusfreisetzung einwirkt, wurde in einem dritten Schwerpunkt aufgezeigt. Das elfte IAV-Protein PB1-F2 wurde auf dessen inhärente Fähigkeit zur Oligomerisierung untersucht. Durch Studien synthetischer Peptide zeigte sich, dass PB1-F2 Oligomere ausbildet, die durch chemische cross linker stabilisiert und nachgewiesen werden konnten. In Übereinstimmung mit in silico generierten Vorhersagen konnten der N- und C-terminale Bereich des Proteins als Oligomerisierungsdomänen charakterisiert werden. Unterstützt durch die Ausprägung von Disulfidbindungen über das Cystein in Position 42, befindet sich die Hauptoligomerisierungsdomäne im C-Terminus von PB1-F2. In Kombination mit dem Vorhandensein einer mitochondrialen Lokalisationssequenz wird deutlich, dass die PB1-F2 vermittelte Apoptose auf der Ausbildung von PB1-F2-Ionenkanälen beruht, was durch eine spätere Publikation unseres Labors bestätigt werden konnte. Folglich könnte PB1-F2, ähnlich wie das M2-Protein der Orthomyxoviridae und das Vpu-Protein der Retroviridae zu den Viroporinen gezählt werden und über Multimerisierung zur Ausbildung von Ionenkanälen in der mitochondrialen Membran zur Pathogenität des IAV beitragen. This study dealt with the influence on viral replication by a systematic modification of protein folding. During millions of years of co-evolution viruses generated a dependency on host cells mechanism. Cellular proteins are interesting starting points for antiviral therapy due to their marginal mutation rate. Therefore a dependency of retroviral assembly, budding, and maturation to a functional ubiquitin-proteasome system of target cells was described. These effects were led back to proteasome inhibitor (PI) caused depletion of free cellular ubiquitin so far. The first emphasis of this work was to demonstrate that a medium based on the chemical chaperone glycerol provides optimized conditions for protein folding, as well as affects the release of viral particles positively. Furthermore the PI-caused defect of virus release was attenuated by application of glycerol substituted medium. This is caused by the decrease of accumulated, misfolded, polyubiquitinated Gag-molecules followed by inhibition of proteasomal activity, so called Gag-DRiPs, which act in a prion-like manner to influence the release of viral particles. In replication studies these effects were detected in such a short period of time that they were in strong contrast to the decrease of free ubiquitin detectable broadly later. These data demonstrate that a PI-caused decrease of virus release is not only caused by a diminished quantity of cellular ubiquitin but through the influence of Gag-DRiPs. A further emphasis was the specific inhibition of the central cellular heat shock protein Hsp90 and the consequences on HIV-1 replication. The selective inhibition of folding processes results in the accumulation of polyubiquitinated proteins which may interfere with the well-regulated assembly of Gag-molecules. As well as in ex vivo cultivated tonsillary tissues as in PBMCs a clear concentration dependency of inhibition of HIV-1 replication was detectable by Hsp90 inhibitor 17-AAG. The applied amounts of the inhibitor were far below maximum tolerated concentration. In addition a combination of 17-AAG with a PI (PS-341) in low nanomolar concentrations demonstrated synergistic effects on inhibition of HIV-1 replication which indicates a beneficial therapeutic index in vivo. These results characterize the selective inhibition of Hsp90 by 17-AAG in combination with proteasome inhibitors as a promising therapeutic approach to influence HIV-1 replication. A third emphasis based on an alternative mechanism which pointed out how a correct folded viral protein is able to influence virus release. The 11th IAV-protein PB1-F2 was characterized concerning its inherent capability to oligomerize. By using synthetic proteins it was shown that PB1-F2 forms detectable oligomers which can be stabilized via a chemical cross linker. In accordance to in silico generated predictions the N- and C-terminus of PB1-F2 were characterized as domains of oligomerization. The main oligomerization domain of PB1-F2 is located in its C-terminus supported by the occurrence of disulfide bonds via the cysteine in position 42. This in combination with the existence of a mitochondrial localization sequence corroborates that the PB1-F2 mediated apoptosis is based on the formation of PB1-F2 ion channels. This fact was published by our laboratory recently. Accordingly to this PB1-F2 may be dedicated to the viroporins, as well as the M2-protein of orthomyxoviridae and the vpu-protein of retroviridae, and support pathogenicity of IAV by its multimerization and formation of ion channels into the mitochondrial membrane.

In dieser Arbeit wurde die Komplexbildung von hGBP1 bei der Hydrolyse von GTP mit Dynamischer Lichtstreuung und Deuteriumaustausch untersucht. Dabei wurden berechnete hydrodynamische Radien aus modellierten Kristallstrukturen mit denen aus den Messungen verglichen, um so die Struktur des Komplexes zu ermitteln. Mit GppNHP (ein nicht hydrolysierbares GTP-Analogon) ergab sich ein über die G-Domänen assoziierender Dimer-Komplex und mit \(GDP/AlF_{x}\) (ein nicht hydrolysierbares GTP-Übergangszustands-Analogon) ein über die Subdomäne \(\alpha\)12/13 gebildeter Tetramer-Komplex. Im zweiten Teil wurden hGBP1 und seine Komplexe an der Oberfläche deuteriert und dann deren Peptide mit Maldi-TOF untersucht. Durch veränderte Deuterierungsgerade, die durch Berechnungen ergänzt wurden, konnten Strukturänderungen nachgewiesen werden. Unter anderem wurde gezeigt, dass bei der Hydrolyse die Subdomäne \(\alpha\)12/13 herausklappt und so das Teramer gebildet wird.

In this thesis it was succeeded to establish an expression system for BDV-glycoprotein. This system yielded a BDV-glycoprotein, which correlates with the wild type glycoprotein in all characteristics. It is cloven at Amino acid position 246-249 by Furin. The transport to the cell surface and the therewith associated glycosylation conform to the natural glycoprotein. Therefore, it was possible to make the further analysis with the help of a vectorialy expressed glycoprotein, which complies with the glycoprotein of infected cells. As it is fact, that many proteins which are involved in cell fusion are dimmers or trimers, so this was investigated for the BDV-glycoprotein, too. Superior, oligomeric forms of the BDV glycoprotein could be demonstrated, in all probability, dimers and trimers of this protein. By means of this new expression system it was possible to show, that the BDV glycoprotein is able to arrange the cell-cell-fusion on its own after the subsidence of the pH-value. For this reaction it is essential that the BDV-glycoprotein has been cloven before. Compared to the amount in infected cells, the increased fusion activity of BDV-glycoprotein stable cell line could be explained by the higher expression level and the more efficient transport to the cell surface. An inhibition of the fusion of about 50% could be attained by the treatment of the cells with Heparin before lowering the pH-value. Through substitution in the amino acid region 296-305 in the c-terminal subunit of BDV-glycoprotein it could be shown that this region plays an important role during the fusion process. As a conclusion it can be stated, that the fusion peptide is located in this domain. In order to precisely characterise the fusion peptide, further investigations have to be carried out., In dieser Arbeit ist es gelungen, ein Expressionssystem für das BDV-Glykoprotein zu etablieren, welches ein solitäres BDV-Glykoprotein hervorbringt, das vollständig funktionell ist und in allen seinen Eigenschaften denen des Wildtyp-Glykoproteins entspricht. Es wird ebenso wie das Wildtyp-Glykoprotein an Aminosäure-Position 246-249 durch Furin gespalten. Der Transport zur Oberfläche und die damit verbundene Glykosylierung entsprechen der des natürlichen Glykoproteins. Somit konnten nun alle weiteren Untersuchungen an einem vektoriell exprimierten Glykoprotein durchgeführt werden, welches dem aus infizierten Zellen entspricht. Da bekannt ist, dass viele Proteine, die an der Zellfusion beteiligt sind, meist als Dimere oder Trimere vorliegen, wurde hier dieses auch für BDV untersucht. Dargestellt werden konnten höher oligomere Formen des BDV-Glykoproteins, wobei es sich wahrscheinlich um dimere und trimere Formen des BDV-Glykoproteins handelt. Mit Hilfe des Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass das BDV- Glykoprotein alleine in der Lage ist, nach einer Erniedrigung des pH-Werts eine Zell-Zell-Fusion zu vermitteln. Essentiell für die Fusion ist, dass das BDV-Glykoprotein gespalten vorliegt. Die erhöhte Fusionsaktivität der stabil Glykoprotein exprimierenden Zelllinie gegenüber infizierten Zellen liegt wahrscheinlich an der erhöhten Expressionsrate und dem effizienteren Transport an die Oberflächen. Eine Inhibition der Fusion um 50% konnte durch eine Behandlung der Zellen mit gelöstem Heparin erreicht werden, bevor der pH-Wert herabgesetzt wurde. Durch Substitutions-Mutationen konnte gezeigt werden, dass der Aminosäurebereich 296-305 in der C-terminalen Untereinheit des BDV-Glykoprotein eine wichtige Rolle bei der Fusion spielt. Es kann daher gesagt werden, dass ein Fusionspeptid in diesem Bereich des BDV-Glykoprotein liegt. Für eine genauere Charakterisierung sind weitere Untersuchungen nötig.

graph. Darst.

Butadiene as a bulk chemical achieves through its polymers a high industrial importance. This work describes the upscaling of an oligomerisation of 1,3-butadiene to mid size oligobutadienes from lab scale to pilot scale. A pilot plant is planned, constructed and operated based on data recieved by thermodynamic calculations and reaction calorimetrie. The influence of different reaction parameters and the workup procedure on product quality is examined after applying different product workups. Wihtin an addiational reaction step it is shown how to functionalize the previously synthesized oligobiatdienes in carbon dioxide as reaction media by hydroformylation to the corresponding oligoaldehydes. Afterwards the homogeneous catalyst system is extracted by carbon dioxide from the product. In the third part of the work a system is introduced which allows the selective hydroformylation of certain olefines out of olefin mixtures with different chain lenghts. The problem is solved by using a two phase system, where the catalyst is immobilized in a carbon dioxide phase and the liquid product are converted into the aldehydes dependent on the pressure of carbon dioxide.

Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilität und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. Für die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchführung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig für deren Aktitvität sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molekül eine hohe Aktivität, die durch sekundäre Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivität konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdomäne nur geringfügig gesteigert werden. CD27L war als lösliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antikörper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivität der TNC-stabilisierten Form signifikant stärker ausgeprägt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivität konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie gehört, für die eine Stabilisierung des trimeren Moleküls und dessen Oligomerisierung nötig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabhängig eine hohe Aktivität. GITRL benötigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Moleküls durch die TNC-Domäne, um gute Aktivität zu zeigen. Im Weiteren wurden Antikörperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberflächenantigen binden. Eine starke Zelloberflächenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte für scFv-41BBL und für scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antikörperfragments eine extrazelluläre Proteinbindedomäne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erhält man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendomäne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle ermöglichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranständigen Liganden dessen Aktitvät neutralisieren können. Für CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabhängige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberflächenmolekül-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose geschützt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranständigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gestört und gleichzeitig Apoptose verstärkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabhängigen Aktivierung von TNF-Liganden könnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden können., Trimer stability and oligomerization status of TRAIL, FasL and APRIL, three members of the TNF ligand family, critically determine their receptor activating potential. However, detailed information for the immunostimmulatory ligands CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL and GITRL regarding the importance of trimer formation, stabilization and oligomerization for ligand activity was lacking. These aspects were investigated systematically in this work. CD40L was highly active as a trimeric molecule. Secondary oligomerization and/or stabilization via the tenascin-C (TNC) trimerization domain slightly enhanced its specific activity. As soluble Flag-tagged and as hexameric Fc protein CD27L failed to bind and activate its cognate receptor CD27, even after crosslinking. However, the TNC stabilized form of CD27L induced a strong signal after oligomerization with anti-Flag antibody. Receptor signaling was only activated by oligomerized molecules of trimeric OX40L and 41BBL whereas the respective TNC fusion protein showed significant stronger activity. Stabilized GITRL trimers and hexamers already activated their receptor whereas oligomerization of GITRL just slightly enhanced the specific activity. Taken together, CD27L, OX40L and 41BBL belong to a TNF ligand family subgroup which requires oligomerization and stabilization of the trimeric molecule to ensure strong receptor activation. In contrast, CD40L and GITRL already display high oligomerization-independent activity, though the latter needs stabilization by the TNC domain. Furthermore, antibody fragment (scFv)-ligand fusion proteins targeting specific cell surface antigens were designed and analyzed. Strong cell surface antigen-selective TNF receptor activation was achieved for scFv-41BBL and scFv-OX40L whereas scFv-CD40L and scFv-GITRL already induced signaling in the absence of antigen-positive cells. scFv-CD27L lacked activity even on antigen-positive cells. Using an extracellular protein binding domain for example the ligand binding domain of a TNF receptor instead of an antibody fragment resulted in fusion proteins that on the one hand activate the TNF ligand domain and thus the corresponding receptor on target cells and on the other hand neutralize membrane ligand activity by binding. The effect of cell surface immobilization-mediated activation of these fusion proteins on cells expressing the corresponding target molecule was shown here for CD40-, RANK- and B7-2-FasL. The CD40-FasL fusion protein simultaneously blocked CD40L-CD40 interaction and induced strong apoptosis in T47D cells displaying an antiapoptotic autocrine CD40L-CD40 signaling loop. The principle of antigen-dependent activation of TNF ligands could be of use in tumor treatment due to the fact that tumor specific marker targeting leads to locally restricted receptor activation on antigen positive cells, promising a reduction in potential off target effects.

Das humane Guanylat-bindende Protein 1 (hGBP1) ist zur Selbstaktivierung durch Bildung von Homodimeren über die LG-Domänen fähig. Darüber hinaus ist die Assemblierung zu Homotetrameren möglich. Dieser Schritt erfolgt über die helikale Subdomäne \(\alpha\)12/13 nach Konformationsänderungen innerhalb der LG-Domäne, welche während der Hydrolyse von GTP zu GDP auftreten. Ziel dieser Arbeit war es, unter biophysikalischen und biochemischen Gesichtspunkten, die Selbstassemblierung von hGBP1 zu untersuchen und die Rolle der helikalen Subdomäne \(\alpha\)12/13 innerhalb dieses Vorgangs zu klären. Durch gezielten Entwurf von Punktmutanten konnte der strukturelle Mechanismus der Hydrolyse-abhängigen Tetramerisierung untersucht werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit der Einfluss der Tetramerisierung auf die GTPase-Aktivität untersucht. Diese Arbeit beschäftigte sich ebenfalls mit der biochemischen Charakterisierung von hGBP2 und gibt die ersten Hinweise auf eine Interaktion zwischen hGBP1 und hGBP2.

Der Glycinrezeptor (GlyR) ist ein inhibitorischer Chloridkanal, der u.a. im Rückenmark, im Hirnstamm und in der Retina exprimiert wird und dort maßgeblich an der Prozessierung von motorischen und/oder sensorischen Signalen beteiligt ist. Als Mitglied der Superfamilie der nikotinischen Acetylcholinrezeptoren ist der GlyR ein Pentamer, dessen Untereinheiten jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, vier Transmembranregionen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Bislang wurden vier ligandenbindende alpha-Untereinheiten (alpha 1-4) und eine für die synaptische Verankerung verantwortliche beta-Untereinheit identifiziert. Die beta-Untereinheit bildet im Gegensatz zu den alpha-Untereinheiten keine Homooligomere; sie ist nur in heterooligomeren GlyRs mit einer bisher angenommenen Stöchiometrie von 3alpha:2beta zu finden. Wie bei allen Mitgliedern der Superfamilie erfolgt die Ligandenbindung innerhalb der extrazellulären Domänen an der Kontaktstelle zwischen zwei benachbarten Untereinheiten. Um den Mechanismus der Ligandenbindung am homo- und heterooligomeren GlyR in dieser Arbeit aufzuklären, wurden Modelle der N-terminalen Domänen der alpha1- und beta-Untereinheiten basierend auf der Kristallstruktur des Acetylcholin-Bindeproteins generiert. Zur Verifizierung der Rolle aller im Modell in der Bindungstasche lokalisierten Aminosäureseitenketten wurden diese durch zielgerichtete PCR-Mutagenese substituiert, anschließend die mutierten Untereinheiten in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch charakterisiert. So konnten die wichtigsten Seitenketten der alpha1-Ligandenbindungstasche identifiziert werden, die an der Bindung der Agonisten Glycin und Taurin, des Antagonisten Strychnin und des Modulators 3alpha-(3’-Methoxybenzoyloxy)nortropan beteiligt sind. Die anschließende Untersuchung des heterooligomeren alpha1beta-GlyRs konnte zum ersten Mal eine direkte Beteiligung der beta-Untereinheit an der Ligandenbindung aufzeigen, wobei die Stabilisierung der Liganden in der Bindungstasche mit den zur alpha1-Untereinheit homologen Resten erfolgt. Zusätzlich ergab ein Vergleich der Affinitätsveränderungen nach Substitution homologer Reste in der alpha1- und der beta-Untereinheit Hinweise auf eine neue Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Nur die Koexpression einer alpah1beta-Tandemuntereinheit mit der beta-Untereinheit resultierte in einem Rezeptor mit den gleichen pharmakologischen Eigenschaften wie der heterooligomere Wildtyp-GlyR. Dieses Ergebnis bestätigte die neue 2alpha:3beta Stöchiometrie heterooligomerer GlyRs. Damit wurde in dieser Arbeit eine dominante Rolle der beta-Untereinheit in heterooligomeren GlyRs aufgezeigt, welche für das Verständnis der synaptischen Verankerung und insbesondere der Pharmakologie des Rezeptors wichtig ist. Mit der neuen Stöchiometrie wurde gleichzeitig eine neue betabeta-Kontaktstelle in heterooligomeren GlyRs identifiziert, die als Wirkungsort neuer Therapeutika genutzt werden könnte.

Oligomers of higher olefins like 1-decene, known as polyalphaolefins (PAO), are used as base oils for lubricants and stand out due to a high stability combined with extraordinary greasing properties. Ionic liquids have properties that are variable in a wide range (polarity, acidity) and are employed both as solvents and catalysts. They are very well suited for biphasic catalysis and are preferentially used to recycle a catalyst. In this thesis there are various possibilities shown to oligomerise 1-decene with ionic liquids. In order to use the polyalphaolefins as base oils for engine oils, a product distribution comprised of trimers as the principal component was desired. This distribution was reached using systems consisting of boron trifluoride and tetrafluoroborates. In this work there is shown that boron trifluoride can be immobilised and recycled in ionic liquids. Further on there is explained how to control the product distribution from geometric to Poisson-like by solubility properties of the ionic liquid. The use of tensid-like tetrafluoroborates here very likely results in polyalphaolefins of higher quality.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der kationisch initiierten Oligomerisation von N-Vinylformamid mit Iod, Brom, Trifluormethansulfonsäure und Trifluormethansulfonsäure-trimethylsilylester. Quantenchemische Berechnungen zur Konformation und zur Elektronendichteverteilung von N-Vinylformamid, sowie zu seiner Reaktion mit Elektrophilen werden vorgestellt. Die Struktur der erhaltenen Oligomere wird mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie, MALDI-TOF-MS, GPC, IR-Spektroskopie, Thermogravimetrie und quantitativer Elementaranalyse untersucht. Die Abhängigkeit von Ausbeute, mittleren Polymerisationsgrad und Kopfgruppenfunktionalität der erhaltenen Oligo(N-vinylformamide) vom Initiator, sowie von der Polarität des Lösemittels, dem eingesetzten Monomer/Initiator-Verhältnis und der Reaktionstemperatur wird vorgestellt. Im Vergleich zum N-Vinylformamid werden N-Vinylacetamid, N-Methyl-N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid und N-Vinylpyrrolidon auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Initiatoren der kationischen Polymerisation Oligomere zu bilden. Mit N-Deutero-N-vinylformamid als Monomer und der 2H-NMR-Analyse der erhaltenen Oligomere wird der Einfluß der NH-Eliminierung während der Oligomerisation von N-Vinylformamid untersucht. Ausgehend von den experimentellen Ergebnissen wird ein für die Vinylpolymerisation neuer Mechanismus für die Oligomerisation von N-Vinylformamid vorgeschlagen und diskutiert. The topic of the dissertation is the survey of the cationically initiated oligomerization of N-vinylformamide with iodine, bromine, trifluoromethanesulfonic acid, and trifluoromethanesulfonic acid trimethylsilylester as initiators. Quantum chemical calculations on the conformation and the electron density of N-vinylformamide, as well as on its reaction with electrophiles are presented. The structure of the obtained oligomers is investigated with 1H- and 13C NMR spectroscopy, MALDI-TOF-MS, GPC, IR spectroscopy, thermal decomposition, and quantitative combustion analysis. The influence of the polarity of the solvent, of the initiator, of the reaction temperature, and of the monomer/initiator ratio on yield, degree of polymerization, head group functionality, and chain structures of the obtained oligo(N-vinylformamide) is investigated. In comparison with N-vinylformamide, the ability of N-vinylacetamide, N-methyl-N-vinylformamide, N-methyl-N-vinylacetamide, and N-vinylpyrrolidone in undergoing a cationically induced polymerization to oligomeric products is investigated. The influence of the NH-elimination on the oligomerization process is investigated with N-deutero-N-vinylformamide as monomer and the 2H NMR analysis of the obtained oligomers. From the results, a new mechanism for the oligomerization of N-vinylformamide is proposed and discussed.