Search

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine prospektive Untersuchung mit zusätzlicher retrospektiver Datenerhebung zum Krankheitsverlauf vor Studieneintritt zur Auswertung der TNF-alpha-naiven Patienten der BioCrohn-Studie im Hinblick auf die klinische Effektivität und mögliche prädiktive Marker für ein Ansprechen auf die anti-TNF-Therapie. Dazu wurden 336 Biologika-naive Morbus Crohn-Patienten unter einer neuen anti-TNF-Therapie auf das klinische Therapieansprechen und im Hinblick auf den prognostischen Wert von Patienten- und Krankheitscharakteristika sowohl zum Zeitpunkt des Studienbeginns als auch zum Zeitpunkt der Diagnosestellung und des frühen Krankheitsverlaufs untersucht. Es zeigten sich deutlich höhere steroidfreie Remissionsraten der Biologika-naiven Morbus Crohn-Patienten unter einer neuen anti-TNF-Therapie in diesem Real-World Setting als in vorhergegangenen klinischen Zulassungsstudien. Zwei Drittel dieser Patienten erreichte innerhalb der ersten 6 Monate mit anti-TNF-Therapie eine steroidfreie Remission. Als signifikant in unserer zusätzlichen retrospektiven Erhebung der Patientendaten bei Erstdiagnose in den Studienzentren vor Ort für das prognostische Gewicht der Vorhersage der Remission einer späteren anti-TNF-Therapie zeigten sich folgende klinisch auswertbaren Parameter im Hinblick auf ein Ansprechen der Therapie: ein jüngeres Alter, eine geringere Stuhlfrequenz sowie häufigere mittelgradige abdominelle Schmerzen bei Erstdiagnose. Nach Analyse der Krankheits- und Patientencharakteristika finden sich unterschiedliche prognostische Faktoren, die das Erreichen einer steroidfreien Remission unter anti-TNF voraussagen können. Während ein jüngeres Alter und eine kürzere Krankheitsdauer als positiv prädiktiv für ein Ansprechen auf TNF-alpha-Therapie zu werten sind, sprechen das frühere Vorliegen von Fisteln und ein höheres Alter bereits bei Krankheitsbeginn für ein schlechteres Ansprechen. Da höheres Alter zudem das Risiko für unerwünschte Nebenwirkungen zu erhöhen scheint, sollte die Indikationsstellung einer TNF-alpha-Therapie bei älteren Patienten dementsprechend streng überprüft werden.

Next Generation Sequencing (NGS) ist eine Methode, die mittlerweile einen hohen Stellenwert bei der Suche tumorspezifischer SNPs erlangt hat. In dieser Studie werden NGS-gestützte, tumorspezifische Mutationsfunde beim Magenkarzinom mittels konventioneller Sequenziertechnik validiert. Darüber hinaus findet eine Validierung auf posttranslationeller und posttranskriptioneller Ebene statt. Next generation sequencing (NGS) is a method which has reached great importance at identifying tumor-specific SNPs. In this study, NGS-detected mutations in gastric cancer are validated using conventional sequencing techniques. Further, posttranslational und posttranscriotional Aspects are being validated.

Meprin α und Meprin β sind Zink abhängige Metalloendoproteasen, die zur Astacin Peptidasenfamilie zählen. Meprine sind in humanen Pathologien wie Fibrose und der Generierung von Amyloid β Peptiden relevant. Um Meprine in Erkrankungen als therapeutische Moleküle einzusetzen, ist das Verständnis der Regulation ihrer proteolytischen Aktivität bedeutsam. Erstmals wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass membrangebundenes Promeprin β nicht durch lösliche Proteasen aktiviert werden kann. Trypsin, der potenteste bekannte Meprin Aktivator, konnte membrangebundenes Promeprin β nicht maturieren. Somit bestätigte sich die initial aus der Meprin β Kristallstruktur entwickelte Hypothese, dass lösliche Aktivatoren keinen Zugang zur nahe der Zellmembran gelegenen Propeptid Spaltstelle erhalten und eine membrangebundene Protease zur Aktivierung notwendig ist. Es wurde Matriptase 2 als erster membrangebundener Aktivator von Promeprin β identifiziert. Dies wurde in Meprin β und Matriptase 2 Ko-Transfektionsansätzen mittels Immunoblots sowie Bestimmung der spezifischen proteolytischen Meprin β Aktivität an der Zelloberfläche validiert. Massenspektrometrische Untersuchungen identifizierten die Spaltstelle im Meprin β Propeptid an Position Arg 61/ Asn 62. In Überexpressionsstudien wurde die Kolokalisation von Meprin β und Matriptase 2 auf der Membran detektiert. Promeprin α wird nicht durch Matriptase 2 aktiviert. Zudem konnte von humanen Fibroblasten exprimiertes Prokollagen I als Meprin Substrat validiert werden. Deshalb wurde die proteolytische Meprin Aktivität mit selektierten Inhibitoren in humanen dermalen Fibroblasten reguliert. Dies resultierte in einer reduzierten Prokollagen I Maturierung im Zelllysat. Die Ergebnisse eröffnen interessante Perspektiven für zukünftige Forschungsprojekte. Es könnte die Beteiligung der Matriptase 2 bei Meprin β induzierten Pathologien und die Applikation selektiver Meprin Inhibitoren in geeigneten in vivo Fibrose Modellen analysiert werden.

To summarize, the results shown here confirms that the host-microbiota interaction is a critical check pint for intestinal inflammation and development. Though, it is still a debate whether the interaction is a cause or consequence of the disease, the results indicate a potential role of epigenetic modification in disease manifestation of UC or postnatal development. The finding might be helpful to support the combinational epigenetic and microbiota based therapies of intestine inflammation.

Durch die Invasion von Bakterien in die Lamina propria des Darmes wird das Immunsystem aktiviert. Diese Aktivierung erfolgt unter anderem durch Zytokine, die durch den JAK/STAT-Signalweg eine Entzündung hervorrufen können, weshalb die JAK Inhibition für chronisch entzündliche Darmerkrankungen eine attraktive Therapiemöglichkeit darstellt. Dabei wurde die bedeutende Rolle der JAK-Proteine in entzündlichen Erkrankungen, wie der rheumatoiden Arthritis gezeigt. Zur Familie der JAK-Proteine zählen JAK1, JAK2, JAK3 und Tyk2. Die Bedeutung von JAK1, JAK2 und Tyk2 in CED wurde bereits beschrieben. Dagegen ist die Funktion von JAK3 in CED bisher nicht hinreichend geklärt. Tofacitinib wurde 2012 als einer der ersten oral verfügbaren JAK-Inhibitoren zur Therapie der rheumatoiden Arthritis in den USA zugelassen. Eine Zulassung in Europa wurde aufgrund der schweren Nebenwirkungen nach Behandlung mit Tofacitinib abgelehnt. Die Nebenwirkungen von Tofacitinib entstehen vermutlich durch die unselektive Inhibition der vier JAK-Proteine. Durch eine gezielte rektale Applikation und durch die Anwendung modifizierter JAK Inhibitoren sollte die systemische Verteilung von Tofacitinib verhindert werden. Hierfür wurden zwei JAK-Inhibitoren zur Anwendung im Kolon synthetisiert. Die Verbindungen unterscheiden sich zusätzlich aufgrund der Selektivität gegenüber den JAK-Proteinen. Die Verbindungen und Tofacitinib als Referenzsubstanz wurden zuerst in vitro in einem intestinalen Karzinomzellsystem charakterisiert. Aufgrund der überzeugenden in vitro Daten wurden die Verbindungen in einem akuten DSS-induzierten Kolitis Modell in der Maus auf ihre Wirkung getestet. Dabei führte weder die Behandlung mit Tofacitinib noch mit den neuen Verbindungen zur Verbesserung der Wundheilung und der klinischen Parameter. Trotz der fehlenden protektiven Wirkung in dem getesteten System könnten die neuen Substanzen Therapiemöglichkeiten bei anderen Erkrankungen, wie Darmkrebs, darstellen.

Die Metalloprotease ADAM17 spielt eine äußerst wichtige Rolle in physiologischen wie pathologischen Prozessen. In dieser Arbeit sollte insbesondere die Rolle der CANDIS (Conserved ADAM Seventeen Dynamic Interaction Sequence) bezüglich ihrer Substratbindeeigenschaften näher charakterisiert werden.

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen, wie M. Crohn und Colitis ulcerosa, deren Ätiologie nicht letztendlich geklärt ist, sind charakterisiert durch chronisch-rezidivierende Entzündungen des Gastrointestinaltrakts. In der Pathogenese spielt eine Barrierestörung der Darmwand vor dem Hintergrund einer polygenetischen Suszeptibilität eine wichtige Rolle. Verschiedene krankheitsrelevante Gene konnten bislang identifiziert werden, darunter auch DLG5, mit dessen Funktion sich die vorliegende Arbeit befasst. Hierfür wurde ein konditionales Dlg5 Knockout-Modell verwendet, bei dem das Gen in den intestinalen Epithelzellen selektiv deletiert wird. Nach chemisch-induzierte Darmentzündung zeigten sich dann in den Befunden teilweise deutliche Unterschiede zwischen den Dlg5ΔIEC und Wildtyp Mäusen: Die Dlg5ΔIEC Mäuse zeigten eine erhöhte Letalitätsrate, einen stärkeren Gewichtsverlust, einen erhöhten histologischen Score und eine erhöhte Apoptoserate der Epithelzellen. Hieraus ist zu schließen, dass der Verlust von Dlg5 in den Knockout Mäusen ein stärkeres Entzündungsgeschehen auslöst, das mit einem schwereren Krankheitsverlauf und einer erhöhten Letalität einhergeht. Ursachen hierfür könnten in einer Störung der Darmwandbarriere, insbesondere in der Funktion des Epithels liegen. Die wichtige Funktion von DLG5 in diesem Zusammenhang konnte in anderen Studien bereits demonstriert werden, u.a. in seiner Funktion für die Zell-Zell-Kontakte. Anhand der erhobenen Befunde scheinen Veränderungen der Epithelzellproliferation und –regeneration des Darmepithels ebenfalls von großer Bedeutung für die Epithelzellintegrität zu sein. Auf molekularer Ebene konnte durch Experimente in HeLa Zellen eine Verbindung zwischen dem Knockout von Dlg5 und einer erhöhten Aktivierung von ERK, das als Bestandteil des MAP-Kinase Signalweges ebenfalls eine wichtige Rolle in der Proliferation der Zellen spielt, detektiert werden. Die genaueren Mechanismen sind hier aber noch unklar.

Die Ätiologie der Periimplantitis ist insbesondere auf dem genetischen Level weitgehend unbekannt. Diese Arbeit untersuchte immundefiziente Tiere um die Fachkenntnisse zur Entstehung und zum Verlauf der Periimplantitis mit ihren Wirtsfaktoren zu verbessern und um ferner Therapieoptionen zu evaluieren. Für diesen tierexperimentellen Versuch wurden in 40 Mäusen Titannägel (FRIOS®) median am Gaumen direkt hinter den oberen Schneidezähnen inseriert. Es erfolgte eine Einteilung in 4 Gruppen. 20 Mäuse gehörten dem Inzuchtstamm der Art C57BL/6N (Normal) an. Weitere 20 Mäuse waren Knockoutmäuse (NOD2-defizient). Bei 20 Versuchstieren, jeweils bei 10 Mäusen der Art C57BL/6N und bei 10 Knockoutmäusen der Art NOD2, wurden die Membran-Nägel zusätzlich mit einer Ligatur versehen. Die restlichen 10 Tiere der beiden Gruppen dienten jeweils als Kontrollgruppe. Nach 6 Wochen erfolgten Histologie und Radiologie. Es konnte eine reproduzierbare Implantatinseration mit dem Hervorrufen einer Periimplantitis im Knockoutmausmodell erreicht werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Implantate mit Ligaturen klinisch, radiologisch sowie histologisch eine signifikant höhere periimplantäre Destruktion mit Implantatverlust induzieren, als die jeweiligen Kontrollgruppen. Ein Rückschluss der gewählten Immundefizienz NOD2 der Knockoutmäuse auf die Periimplantitis konnte nicht gezogen werden. Development, progression and therapy are the mainly unsolved uprising problems in the periimplantitis. Periodontal disease models are established in knock-out mice. The aim of this study was to examine the basics and the development of the periimplantitis, based on a prior study „A knock-out model for Periimplantitis“. This work considered immune deficient knockout animals to improve the knowledge for the origin and the process of Periimplantitis with their host factors. In 40 mice, 20 normal (C57BL/6N) and 20 advertises knockout mice (NOD2-defizient), titanium implants (FRIOS®) in the area of the upper jaw directly behind the front teeth were inserated. With 10 mice of each of the two tribes the implants were provided in addition with ligatures so that altogether 4 groups could be formed (C57BL/6N implant as a control group, C57BL/6N implant and ligature, knockout implant as a control group, knockout implant and ligature). The 40 mice were fed with a special diet enriched with sugar and flavor under a steady weight check over a period of 6 weeks, then killed by means of a cervical dislocation. The specimens were processed histologically and microradiographies were prepared. The results show that implants with ligatures induce a significantly higher periimplantitis bone defect than the respective control groups. The micro radiological examinations confirm this results. At the end of the observation period, the portion of implants lost was higher in the ligature group. Indeed in the normal mouse groups as well as in the knockout mouse tribes as many implants were lost, what implies that the chosen immune-deficiency of the knockout mice does not have influence on the periimplantitis. Nevertheless this test confirms that an induce of a periimplantitis also is possible in the knockout mice model.

Peroxiredoxin-4 (Prdx4) ist ein Vertreter hochgradig konservierter Oxidoredukasen, welcher mit verschiedenen entzündichen Erkrankungen assoziiert werden konnte, unter anderem zeigten höhere Serumspiegel bei Sepsis-Patienten ein schlechteres Outcome. In dieser Arbeit wurden Prdx4 Knockout-Mäuse im Rahmen von Lipopolysaccharid-induzierten Endotoxinämie-Modellen bezüglich des klinischen Verlaufes und der Bildung von Entzündungsmediatoren charakterisiert. Darüber hinaus wurden Makrophagen aus Prdx4-defizienten Mäusen isoliert und charakterisiert. Prdx4-defiziente Mäuse zeigten eine erheblich stärkere klinische Beeinträchtigung und eine gesteigerte Zytokin-Freisetzung. Dies konnte durch Behandlung mit dem IL1-Rezeptorantagonist Anakinra gebessert werden. Isolierte Makrophagen zeigten ebenfalls eine stark gesteigerte Zytokin-Produktion. Darüber hinaus zeigten Wildtyp-Makrophagen nach Stimulation eine Sekretion von Prdx4. Das sezernierte Protein wies eine starke antientzündliche Wirkung auf, welche sich nicht durch seine antioxidative Wirkung erklären ließ. Es konnte gezeigt werden, dass Prdx4 nach erfolgter Endozytose die endosomale Membran überwindet und sich im Zellinneren anreichert. Diese Arbeit zeigt, dass Prdx4 eine starke antientzündliche Wirkung besitzt. Ein bisher nicht beschriebener Mechanismus aus Sekretion und Phagozytose, scheint hierfür ursächlich zu sein.

Die lange nicht kodierende RNA ANRIL ist die am besten replizierte Risikoregion der Atherosklerose und Parodontitis. Darüber hinaus weist dieser Genort unabhängige Assoziationen sowohl zu weiteren immunvermittelten und metabolischen Krankheiten, als auch zu verschiedenen Krebsformen auf. ANRIL zeigt einen cis-regulatorischen Einfluss auf die Tumorsuppressorgene “Cyclin abhängige Kinase“ 2A (CDKN2A) und 2B (CDKN2B). Wie genau verschiedene Varianten dieser gewebsspezifisch, alternativ gespleißten lncRNA zu unterschiedlichen Krankheitsausprägungen führen war jedoch bisher kaum verstanden. Verschiedene Studien konnten eine verminderte Konzentration der kurzen ANRIL Transkripte in homozygoten Trägern des mit Atherosklerose und Parodontitis assoziierten RisikoHaplotyps nachweisen. Um die Funktion dieser Transkripte in der Manifestation beider Krankheiten zu untersuchen wurde ein induzierbares, stabiles shRNA Zellsystem verwendet. Durch die genomweite Expressionsprofilierung konnte eine zeitabhängige, mit der verminderten ANRIL Expression korrelierende Transkriptionsänderung von ADIPOR1, VAMP3 und C11ORF10 nachgewiesen werden. Die Untersuchung der identifizierten Gene auf das Vorhandensein von krankheitsassoziierten Varianten zeigte eine Assoziation mit einem erhöhten Risiko für Atherosklerose [rs10864294 P = 0.015, Odds Ratio (OR) = 1.30, 95% Konfidenzintervall (CI) = 1.1-1.6, 1471 Fälle, 2737 Kontrollen] und aggressive Parodontitis (AgP; P = 0.008, OR = 1.31, 95% CI = 1.1-1.6, 864 Fälle, 3664 Kontrollen) in dem stromaufwärts von VAMP3 gelegenen CAMTA1 Gen. Diese Assoziation konnte durch den mit rs10864294 im gleichen Haplotyp liegenden rs2301462 in einer Metaanalyse, bestehend aus 14 genomweiten Assoziationsstudien der Atherosklerose (CARDIoGRAM), in silico repliziert werden (P = 0.001). Zusätzlich zeigte ein Haplotyp-Block über C11ORF10 und den FADS Gen-Cluster, welcher genomweit mit verschiedenen metabolischen- und Entzündungskrankheiten assoziiert ist, eine Assoziation mit aggressiver Parodontitis (p-allelisch = 0.016, Odds Ratio [OR] = 0.84, 95% C.I. = 0.72-0.98), jedoch nicht mit Atherosklerose. Die Ergebnisse der Arbeit lassen eine Rolle spezifischer ANRIL Varianten bei der Regulation von Schlüsselgenen des Glukose- und Fettsäure-Metabolismus vermuten.

Ischämie und Reperfusion (I/R) im Gastrointestinaltrakt können eine Dysfunktion der endothelialen und epithelialen Barriere verursachen und dadurch zur Translokation von Bakterien und schließlich zum Multiorganversagen führen. In mehreren Studien wurde demonstriert, dass Anästhetika I/R-Schäden vermindern können, allerdings sind die zellulären und molekularen Mechanismen noch weitgehend ungeklärt. Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Wirkungen des intravenösen Anästhetikums Propofol auf Hypoxie induzierte Prozesse am Darmepithel zu untersuchen, wurden unter Verwendung eines Enzym basierten in-vitro Hypoxiesystems die Effekte von Propofol im CaCo-2 Zellkulturmodell (humane epitheliale kolorektale Adenokarzinomzellen) evaluiert. Hierzu wurden die Zellen einer einstündigen Hypoxie ausgesetzt und gleichzeitig mit Propofol in klinisch relevanten Konzentrationen von 30 µM sowie 100 µM inkubiert. Im Vordergrund der Untersuchungen standen die Regulation der ROS-Spiegel mittels fluorometrischer Quantifizierungen, der Wasserstoffperoxidspiegel durch kolorimetrische Quantifizierungen und der Expression der Katalase durch Western Blots und RT-PCRs. Unter Verwendung des Enzym basierten Hypoxiemodells sank der Sauerstoffpartialdruck innerhalb von 15 Minuten unter 5 mmHg und blieb für mindestens vier Stunden konstant. Hypoxie induzierte in den CaCo-2 Zellen morphologische Veränderungen, die auf eine Zellschädigung hindeuten. Die fluorometrischen Quantifizierungen der ROS-Spiegel ergaben 2, 24 und 48 Stunden nach Hypoxie eine signifikante Zunahme der Menge an ROS in der Hypoxiegruppe im Vergleich zur Normoxiegruppe (2 h, 24 h und 48 h: P0,05). Western Blot Experimente demonstrierten, dass die Menge der exprimierten Katalase 4 Stunden nach Hypoxie im Vergleich zur Normoxiekontrolle signifikant erhöht war (P

Zusammenfassung Single-domain Antikörper oder Nanobodies besitzen aufgrund ihrer geringen Größe eine Reihe herausragender Eigenschaften, die sie in die Lage versetzen, Limitationen (z.B. Kosten, Stabilität, versteckte Epitope, Gewebegängigkeit) klassischer IgG-Antikörpertherapien zu überwinden. Zur Erweiterung ihrer Einsatzmöglichkeiten werden Antikörper häufig modifiziert und z.B. an Radionuklide oder Polyethylenglykol gekoppelt. Als neuartiger Ansatz zur gezielten Modifizierung von Nanobodies haben wir die Mikrobielle Transglutaminase (MTG) untersucht. Als Modellsystem der Modifizierung wurde die Dimerisierung mittels Ribonuklease A S-tag gewählt und am Beispiel eines Nanobodies gegen humanen Tumor Nekrose Faktor (hTNF) eine Methode zur MTG-induzierten Dimerisierung etabliert. Die dimeren Nanobodies wiesen gegenüber den monomeren Nanobodies eine um den Faktor 5 gesteigerte Aktivität auf. Auf Pflanzen basierende Expressionssysteme besitzen gegenüber klassischen Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine Vorteile wie Kostenersparnis, Erweiterbarkeit der Anbaufläche und etablierte Anbau- und Ernteverfahren. Die zentralen Einschränkungen wie geringe Proteinakkumulation und ineffiziente Aufreinigungsverfahren können durch Anfügen eines Elastin-ähnlichen Polypepitds (elastin-like polypeptide, ELP) überwunden werden. Die Anreicherung der rekombinanten Proteine in Pflanzen wird deutlich gesteigert und gleichzeitig ermöglicht der ELP-Anhang eine simple und effiziente Reinigungsmethode – das inverse transition cycling (ITC). Sie beruht auf reversibler Aggregation in Abhängigkeit von Temperatur und Salzkonzentration. Hier zeigen wir, dass das Anfügen eines ELP-Anhangs an den verwendeten Nanobody zu einer deutlichen Steigerung der Akkumulation auf über 2% des gesamten löslichen Proteins führt. Aktivitätstests des anhand ITC gereinigten anti-hTNFNanobody- ELP Fusionsproteins wiesen eine dem aus E. coli stammenden Nanobody vergleichbare Aktivität auf. In auf dieser Dissertation aufbauenden Experimenten verhinderten die anti-hTNF-Nanobody-ELP Fusionsproteine die Sterblichkeit im LPS/D-Gal Sepsis-modell der Maus komplett. Zudem war die Halbwertszeit des anti-hTNF-Nanobody- ELP Fusionsproteins gegenüber dem ursprünglichen Nanobody um den Faktor 20 verlängert. Die Modifizierung / Dimerisierung von Nanobodies mittels Mikrobieller Transglutaminase sowie die Expression und Aufreinigung von Nanobody-ELP Fusionsproteinen aus Pflanzen stellen interessante Weiterentwicklungen in der Nanobody-Technologie dar.

In dieser Studie wurden die Auswirkungen einer achtwöchigen oralen Vitamin A Gabe auf den Insulin/Glukose- und Fettstoffwechsel von 40 männlichen Probanden mit verschieden FABP2 Promoter Haplotypen (AA und BB) untersucht.

Die Schleimhaut des Darmtraktes ist charakterisiert durch komplexe metabolische und immunologische Prozesse und wird gesteuert durch hochdynamische Genexpressions-Programme. Mit der Verfügbarkeit von next generation sequencing und ihrer Nutzbarkeit für die Analyse von RNA-Sequenzen wurde die Genauigkeit über die globale Architektur des Transkriptoms gegenüber anderen Methoden wie microarrays auf eine neue Ebene befördert. Basierend auf dem 3‘ Oligo-dT priming von polyadenylierten Boten-RNA gefolgt von reverser Transkription und einem sogenannten template switch wurde eine Methode für RNA-Seq auf der Life Technologies SOLiD Plattform etabliert. Dieser Ansatz zeigte zuverlässige Informationen über das untersuchte Gewebe, z. B. in Bezug auf Genexpression und der Beobachtung von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen im Genom. In dieser Arbeit wird über die Tiefencharakterisierung des polyadenylierten Transkriptoms in zwei nah verwandten, dennoch unterschiedlichen Geweben des murinen Intestinaltrakts (Dünn- und Dickdarm) berichtet. Eine gewebespezifische Architektur des Transkriptoms und die Präsenz von zuvor nicht bekannten Bereichen transkriptioneller Aktivität wurden gefunden. Im ersten Schritt wurden Signaturen von 20.541 NCBI-RefSeq-Transkripten im Darm identifiziert (74,1 % der annotierten Gene), davon fanden sich 16.742 in beiden untersuchten Geweben. Obwohl die Mehrheit der Sequenzen annotierten Genen zugeordnet werden konnten, fanden sich 27.543 nicht-annotierte, transkriptionell aktive Regionen im Genom im Widerspruch zur aktuellen Genannotationen von RefSeq oder Ensembl. Unter Nutzung eines zweiten, unabhängigen, strangspezifischen Protokolls konnten 20.966 dieser Befunde bestätigt werden, die Mehrheit davon in direkter Nähe zu bekannten Genen. In der Folge wurden die Befunde bezüglich ihrer Nähe zu beschriebenen Exon-Elementen kategorisiert. Regionale Unterschiede zwischen Dünn- und Dickdarm dieser transkriptionell-aktiven, aber nicht annotierten Elemente wurden untersucht. Die vorliegende Arbeit demonstriert die Komplexität eines typischen intestinalen mRNA-Transkriptoms von Säugetieren anhand einer strangspezifischen Auflösung bis hin zur Einzelbase. Die Analysen zeigten zum ersten Mal ein strangspezifisches Bild von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen in zwei Geweben und repräsentieren eine Ressource für weitere Untersuchungen transkriptioneller Prozesse, welche zur molekularen Gewebeidentität beitragen. Die mittels RNA-Seq in dieser Arbeit erhobenen Daten waren von hoher, zuvor nicht zugänglicher Qualität, so dass RNA-Seq in der Zukunft vermutlich die neue Standardmethode für die genomweite Untersuchung des Transkriptoms darstellen wird. The intestinal mucosa is characterized by complex metabolic and immunological processes driven highly dynamic gene expression programs. With the advent of next generation sequencing and its utilization for the analysis of the RNA sequence space, the level of detail on the global architecture of the transcriptome reached a new order of magnitude compared to other methods like microarrays. A method for RNA-Seq based on 3’ oligo-dT priming of polyadenylated messenger RNA followed by reverse transcription and a template switch was established on the Life Technologies SOLiD platform. This approach showed robust information about the characterized tissue, for example in terms of gene expression and the observation of non-annotated transcriptionally active regions of the genome. This thesis reports the ultra-deep characterization of the polyadenylated transcriptome in two closely related, yet distinct regions of the mouse intestinal tract (small intestine and colon). The tissue-specific transcriptomal architecture and the presence of novel transcriptionally active regions were assessed. In the first step, signatures of 20,541 NCBI RefSeq transcripts could be identified in the intestine (74.1% of annotated genes), thereof 16,742 are common in both tissues. Although the majority of reads could be linked to annotated genes, 27,543 non-annotated transcriptionally active regions not consistent with current gene annotations in RefSeq or Ensembl were identified. By use of a second independent strand-specific RNA-Seq protocol, 20,966 of these nTARs were confirmed, most of them in vicinity of known genes. This thesis further categorized the findings by their relative adjacency to described exonic elements and investigated regional differences of novel transcribed elements in small intestine and colon. The current study demonstrates the complexity of an archetypal mammalian intestinal mRNA transcriptome in high resolution and identifies novel transcriptionally active regions at strand-specific, single base resolution. The analysis for the first time shows a strand-specific comparative picture of non-annotated transcriptionally active regions in two tissues and represents a resource for further investigation of the transcriptional processes that contribute to molecular tissue identity. RNA-Seq generated data showed high, to date unseen quality. This suggests that RNA-Seq will be the new standard method for genome-wide analysis of the transcriptome.

Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind die wichtigsten Entitäten der chronisch entzündlichen Darmkrankheiten (CED), deren Ursachen und Therapie derzeitig Gegenstand der Forschung sind. Eine Kombination aus genetischer Prädisposition und Umweltfaktoren wird aktuell diskutiert. Diese resultiert in einer Barrierefunktionsstörung der Darmmukosa, die Grundlage eines chronisch entzündlichen Geschehens ist. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor (GPR) 43 wird in entzündeten Arealen auf neutrophilen Granulozyten (PMN) verstärkt exprimiert. Er detektiert kurzkettige Fettsäuren (SCFA), die von anaeroben Bakterien der Darmflora produziert werden, und aktiviert Migrationsprozesse. Für die vorliegende Arbeit wurden Gpr43-Knockout-Mäuse gezüchtet, um ihr Verhalten im Rahmen einer experimentellen Colitis mit Wildtypmäusen zu vergleichen. Die chemisch induzierte Natriumdextransulfat (DSS)-Colitis stellt ein etabliertes Mausmodell der Darmentzündung dar. Mittels klinischer Parameter, Histologie, Mini-Endoskopie und ELISA wurde das Ausmaß der Entzündung in einem chronischen und einem akuten Ansatz bestimmt. Zusätzlich wurde mit isolierten PMN Migrations-Untersuchungen in einer Transmigrationskammer (Boyden-Kammer) durchgeführt um die funktionellen und molekularen Auswirkungen der Gpr43-Defizienz zu untersuchen. In der akuten DSS-Colitis wurde für die Gpr43-/--Mäuse eine stärkere Entzündung, gestützt durch den klinischen Verlauf und die erhöhten Zytokin-Parameter, festgestellt. Der Gesamteindruck deutete auf eine systemische Infektion hin, die einherging mit dem Tod aller Versuchstiere während der Experimentalphase. Histologische und endoskopische Untersuchungen zeigten jedoch weniger entzündliche Merkmale als bei den Vergleichstieren. In der chronischen DSS-Colitis wirkte die Gpr43-Defizienz protektiv auf den Verlauf der Erkrankung. Die erhobenen Parameter und Untersuchungen zeigten geringere Entzündungsparameter als bei den Wildtypmäusen. In beiden Modellen war gleichermaßen auffällig, dass sich in den submukosalen Blutgefäßen Granulozytenkonglomerate ansammelten, während in der Submukosa selbst kaum PMNs zu finden waren. Ob eine geminderte Evasionsfähigkeit mit der Rezeptordefizienz in einen kausalen Zusammenhang gebracht werden kann, wurde anschließend in Chemotaxisexperimenten untersucht: Die Migration per se war nicht beeinträchtigt, lediglich mit SCFA stimulierte Zellen zeigten ein reduziertes Migrationsvermögen. Des Weiteren wurde die Proteinkinase p38 als Gpr43-abhängiger Mediator der Aktivierungskaskade identifiziert und erstmals zeigt diese Arbeit, dass L-Selektin-shedding GPR43- und p38-abhängig induziert wird. Damit erscheint das Ausbleiben dieses Vorgangs ursächlich für die verminderten Evasion von PMN und stellt damit ein mögliches therapeutisches Ziel zur Durchbrechung der chronischen Entzündung dar.

NOD-like Rezeptoren (NLR) repräsentieren eine Gruppe von intrazellulären Sensor-Proteinen des angeborenen Immunsystems, die pathogen-assoziierte Moleküle (PAMPs) oder andere zytosolische Gefahrensignale (DAMPs) erkennen. Ihre essentielle Rolle für die Verteidigung gegen Pathogene wird dadurch unterstrichen, dass Mutationen in den NLR-Genen mit einer großen Bandbreite von entzündlichen Krankheiten assoziiert wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde die genomische Organisation, die Regulation und Funktionsweise des NLR-Familienmitglieds NLRC5 untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass NLRC5 an antiviralen Signalprozessen beteiligt ist. Nach einer viralen Infektion kommt es zu einer erhöhten Expression von IFN-, was durch autokrine Mechanismen zu einer erhöhten Expression von NLRC5 führt. An dieser transkriptionellen Kontrolle sind Komponenten der gamma-interferon activation sequence (GAS) Signalkaskaden beteiligt. Künstlich aktiviertes NLRC5 bewirkt die Aktivierung von zwei bisher nicht mit NLR-Proteinen assoziierten Signalwegen. Die Aktivierung von interferon-specific response element (ISRE)- und GAS- Promotorelementen führt zu einer gesteigerten Expression von antiviralen Zielgenen (IFN-, OAS1, PRKRIR). Zusätzlich führte Überexpression oder künstliche Oligomerisierung von NLRC5 zu einer verstärkten und über einen längeren Zeitraum andauernden Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors STAT1, der an der Vermittlung von antiviralen Prozessen beteiligt ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass NLRC5 einen wichtigen molekularen Schalter des GAS/ISRE-Signalwegs repräsentiert, der dazu beiträgt, antivirale Verteidigungsmechnismen zu aktivieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zusätzlich eine bisher nicht beschriebene Interaktion zwischen zwei NLR-Mitgliedern. Durch homophile NACHT-NACHT – Interaktion zwischen NLRC5 und NOD2 kommt es zu einer verstärkten NOD2-abhängigen NF-B- und NLRC5-vermittelten ISRE-Aktivierung. Koexpression beider Proteine vermittelt außerdem einen erhöhten Schutz gegen bakterielle Zytoinvasion im Listeria monocytogenes – Infektionsmodell. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die protektiven Eigenschaften von NLR-Proteinen innerhalb des angeborenen Immunsystem und die damit verbundenen aktivierten Signalkaskaden weit vielfältiger sind als bisher angenommen. Die Interaktion zwischen den verschiedenen NLR-Familienmitgliedern scheint dabei ein nicht zu unterschätzender Faktor zu sein, der in Zukunft stärker beachtet werden sollte. NOD-like receptors (NLRs) represent a group of intracellular proteins of the innate immune system which recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or other cytosolic danger signals (DAMPs). Mutations in NLR genes have been linked to a variety of inflammatory diseases underscoring their pivotal role in host defense and immunity. This work describes the genomic organisation and regulation of the human NLR-family member NLRC5. The results show that NLRC5 is involved in antiviral signal processes. Viral infection induced an increased expression of IFN-, and led through an autocrine mechanism, to an enhanced expression of NLRC5. The transcription is regulated by components of the gamma-interferon activation sequence (GAS) cascade. Artificial oligomerisation of NLRC5 lead to an activation of two new signal transduction pathways, which were until now not associated with NLR proteins. The activation of interferon-specific response element (ISRE)- and GAS-promotor elements resulted in an enhanced expression of antiviral target genes (IFN-, OAS1, PRKRIR). Additionally, overexpression or enforced oligomerisation of NLRC5 led to an increase in phosphorylation of the transcription factor STAT1, which is involved in antiviral processes. The results indicate that NLRC5 represents an important molecular regulator for the GAS/ISRE-pathway and helps to activate antiviral defense programms. Furthermore, the results show a new interaction between two members of the NLR-family. The homophilia NACHT-NACHT – interaction between NLRC5 and NOD2 induce an increased NOD2-dependent NF-B- and NLRC5-mediated ISRE-activation. Co-expression of both proteins mediated an increased protection against the cytoinvasive bacteria Listeria monocytogenes. The results suggest that the protective properties of NLR-proteins for the innate immunity with the associated signal cascades are multifaceted. They also underpin the importance of understanding the interactions between different NLR-family members in immune response to infections and highlight the need in future investigations.

Diese Arbeit zeigt, dass ROS als Mediatoren der NOD2-Signalgebung agieren. Die Mitglieder der NADPH-Oxidasen-Familie DUOX2 und NOX1 wurden als subzelluläre ROS Quellen in intestinalen Epithelzellen identifiziert. NOX1 und DUOX2 sind zusammen mit NOD2 an der Zellmembran lokalisiert, darüber hinaus ist DUOX2 an den bakteriziden Effekten von NOD2 beteiligt. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der NOD2-vermittelten Immunantwort in intestinalen Epithelzellen: NOD2 aktiviert mehrere Ebenen der Immunabwehr, die neben dem NF−κB-Signalweg, der Sekretion von Zytokinen und antimikrobiellen Peptiden auch die kontrollierte Produktion von ROS einschließen. In this dissertation, controlled ROS generation is demonstrated for the first time as an integral component of NOD2-induced signalling. The NADPH oxidase family members DUOX2 and NOX1 are both involved in a ROS-dependent NF-κB amplification loop downstream of NOD2 in intestinal epithelial cells. NOX1 and DUOX2 co-localize with NOD2 at the plasma membrane. Moreover, the presence of DUOX2 is required for the direct bactericidal properties of NOD2. It is hypothesized that the mechanism suggested here opens new avenues for the understanding of immune responses initiated by the colonic epithelium: NOD2 activates multiple layers of host defense, including ROS generation, NF-κB activation and cytokine/antimicrobial peptide secretion.