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Dissertação de mestrado em Química Medicinal, Nos dias de hoje, um mundo mais sustentável é cada vez mais um objetivo a atingir. Face a esta necessidade, a indústria cosmética tem vindo a desenvolver novos métodos de produção para satisfazer as necessidades do mercado. Deste modo, os ingredientes cosméticos têm sido substituídos por alternativas, produzidas através de processos sintéticos mais verdes (sem solvente, menor gasto energético e/ou com recurso a biocatalisadores). Nesta dissertação foram sintetizados seis compostos emulsificantes não iónicos O/A, utilizando n-heptano e a lipase modificada da Aspergillus oryzae como biocatalisador: o éster 2-(2- etoxietoxi)etiloctanoato (6a) (η=72%), o éster 2-(2-etoxietoxi)etildecanoato (6b) (η=68%), o éster 2-(2- etoxietoxi)etilpalmitato (6c) (η=68%), o éster 2-(2-etoxietoxi)etiloleato (6d) (η=68%), o éster 2-(2- etoxietoxi)etil(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoato (6e) (η=75%) e o éster 2-etoxietiloctanoato (7a) (η=72%). As lipases nativas da Aspergillus oryzae, Candida rugosa e porcine pancreas foram também testadas, no entanto, revelaram baixa (Aspergillus oryzae) ou nenhuma atividade de esterificação (Candida rugosa e porcine pancreas). Estudos de modelação molecular foram realizados, tendo-se observado uma baixa afinidade dos substratos/produtos aos centros ativos destas enzimas. De modo a obter uma síntese mais verde, as reações com a lipase modificada foram efetuadas na ausência de solvente. Nestas foram apenas isolados os compostos 6d e 6e com um rendimento de 74% e 50%, respetivamente. Posteriormente os ésteres foram caracterizados, e foram estudadas as suas propriedades emulsificantes através da produção de nanoemulsões O/A com rácios de 2,5% e 5% de emulsificante em tampão PBS ou água. A estabilidade destas foi avaliada com recurso à técnica de DLS, que permitiu concluir que os compostos 6a e 6c não formam nanoemulsões estáveis, pelo balanço hidrofóbico-hidrofílico e pelo estado sólido do éster, respetivamente. As nanoemulsões formadas pelos restantes ésteres revelam-se estáveis durante, pelo menos, 4 meses, o que foi justificado com 60 ns de simulação de dinâmica molecular. Estas simulações revelaram que os ésteres 6b, 6e e 7a formam agregados com perfil micelar e o composto 6d forma agregados com perfil de bicamada fosfolipídica. Posteriormente foi encapsulado nestas nanoemulsões um corante hidrofóbico, o Nile Red. O corante foi eficientemente encapsulado nas nanoemulsões, o que foi confirmado através de microscopia confocal. No entanto, as nanoemulsões revelaram baixa capacidade na libertação do corante. O mesmo foi observado em estudos de permeação através de um sistema de transdermal., A more sustainable world is an emerging goal to achieve. Considering this, the cosmetic industry has been developing new production methods to meet the requirements needs of the market. In this way, cosmetic ingredients have been replaced by alternatives, produced through greener synthetic processes (solvent-free, lower energy expenditure and/or using biocatalysts). In this dissertation, six non-ionic O/W emulsifying compounds were synthesized using n-heptane and a modified lipase from Aspergillus oryzae as biocatalyst, the 2-(2- ethoxyethoxy)ethyloctanoate ester (6a) (η=72%), the 2-(2-ethoxyethoxy)ethyldecanoate ester (6b) (η=68%), the 2-(2-ethoxyethoxy)ethylpalmitate ester (6c) (η=68%), the 2-(2-ethoxyethoxy)ethyloleate ester (6d) (η=68%), the 2-(2-ethoxyethoxy)ethyl(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate ester (6e) (η=75%) and the 2-ethoxyethyloctanoate ester (7a) (η=72%). Native lipases from Aspergillus oryzae, Candida rugosa e porcine pancreas were also tested, however, revealed low (Aspergillus oryzae) or no esterification activity (Candida rugosa e porcine pancreas). Molecular modelling studies were conducted, showing a low affinity of the substracts/products to the active site of these enzymes. In order to obtain a greener synthesis, reactions with modified lipase were performed in the absence of solvent. These reactions only allowed to synthesize the compounds 6d and 6e with a yield of 74% and 50%, respectively. Subsequently the esters were characterized and their emulsifying properties were studied through the production of O/W nanoemulsions with emulsifier ratios of 2.5% and 5% in PBS buffer or water. Their stability was evaluated using the DLS technique, which allowed us to conclude that compounds 6a and 6c don’t form stable nanoemulsions due to the hydrophobic-hydrophilic balance and the solid state of the ester, respectively. The nanoemulsions formed by the remaining esters are stable for at least 4 months, which was justified with 60 ns of molecular dynamics simulation. These simulations revealed that esters 6b, 6e and 7a form aggregates with micellar profile and the compound 6d forms aggregates with phospholipid bilayer profile. Subsequently, a hydrophobic model dye, Nile Red, was encapsulated in these nanoemulsions. The dye was efficiently encapsulated in nanoemulsions, which was confirmed by confocal microscopy. However, its release was not observed, nor its permeation through a transdermal system.

Dissertação de mestrado em Química Medicinal, A procura de produtos “verdes” e sustentáveis é uma realidade cada vez mais indispensável na indústria cosmética, sendo a substituição dos silicones um dos pontos fundamentais. Neste sentido, o objetivo principal deste trabalho foi a síntese de potenciais alternativas aos silicones, implementando métodos de produção mais verdes e amigos do ambiente, e a sua posterior avaliação quando aplicadas numa formulação cosmética comercial. Para tal, foram inicialmente testadas diferentes lipases como biocatalisadores, nomeadamente Aspergillus oryzae, Candida rugosa, porcine pancreas e Thermomyces lanuginosus imobilizada em Immobead 150. Dos diferentes substratos testados, etilenoglicol, dietilenoglicol, 1,3-propanediol, 1- heptanol e 1-decanol para esterificação com três ácidos carboxílicos (heptanóico, octanóico e decanóico), foram isolados com sucesso seis compostos hidrofóbicos: heptil heptanoato 4a (ɳ=66%), heptil octanoato 4b (ɳ=71%), heptil decanoato 4c (ɳ=67%), decil heptanoato 5a (ɳ=73%), decil octanoato 5b (ɳ=72%) e decil decanoato 5c (ɳ=69%). De todas as lipases testadas, a Aspergillus oryzae nativa, Candida rugosa e porcine pancreas não revelaram qualquer atividade catalítica. A catálise enzimática com a lipase Aspergillus oryzae modificada sem solvente foi o método mais eficiente e económico, cujo pior e melhor rendimento, correspondem ao produto 4a e 5a, respetivamente, com 66% e 73%. A caracterização de cada composto foi efetuada por 1H RMN, HRMS, FTIR e termogravimetria. O potencial dos ésteres como alternativas viáveis aos silicones sintéticos foi confirmado, revelando propriedades semelhantes ao Cetiol® CC, ciclopentasiloxano (D5) e óleo de silicone 5 cSt (Sil.O5), nos diversos parâmetros avaliados. A viscosidade foi o parâmetro mais díspar, aumentando, de uma forma geral, com o aumento da cadeia carbonada. Foram produzidas nove formulações cosméticas, com a respetiva variação de silicone incorporado: C1 (Cetiol® CC), C2 (D5), C3 (Sil.O5), C4 (4a), C5 (4b), C6 (4c), C7 (5a), C8 (5b) e C9 (5c). Todos os cremes apresentaram qualidade e estabilidade dos compostos sintetizados, com alguma uniformidade na avaliação das características organoléticas e pH, superando os testes de estabilidade acelerada e em ciclos de temperatura extrema. Nos ensaios reológicos todos os produtos exibiram um comportamento pseudoplástico. O creme C1 apresentou a melhor homogeneidade e coesão, o C3 o maior valor de viscosidade, considerado o mais espesso e rígido quando em fluxo. O C6 aparentou ser o mais fluído e cremoso. Apesar de espalhável, o C4 pode ser percebido como espesso e firme devido à maior resistência ao escoamento. O C9 evidenciou o menor valor de deformação para atingir o ponto de rutura da estrutura e o C7 o maior número de microfissuras na estrutura. O aumento de temperatura para 37°C, não influenciou as formulações em estudo. As diferenças no perfil de textura foram mínimas, no entanto, os cremes C7 e C4 aparentaram ser mais espalháveis e menos espessos e pegajosos, e contrariamente, o C1 e C9 como mais firmes, coesos, pegajosos e de menor espalhamento. Entre um creme com o silicone e a alternativa produzida (C4), os voluntários deram a preferência sensorial a este último, demonstrando o potencial dos ésteres e uma preocupação com a sustentabilidade., The search for green and sustainable products is an increasingly indispensable reality in the cosmetic industry, leading to research on more "natural" products, capable of replacing synthetic ingredients. In this context, the main objective of this work was the development of silicone alternatives. For this purpose, a greener and more environmentally friendly production was adopted, followed by their incorporation and complete characterization in a commercial cosmetic formulation. In order to achieve this, different lipases including those from Aspergillus oryzae, Candida rugosa, porcine pancreas, and Thermomyces lanuginosus immobilized on Immobead 150 were initially investigated as biocatalysts. From the different substrates tested, such as ethylene glycol, diethylene glycol, 1,3-propanediol, 1-heptanol and 1-decanol for the esterification with three carboxylic acids (heptanoic, octanoic, and decanoic), six hydrophobic compounds were successfully isolated. These included heptyl heptanoate 4a (=66%), heptyl octanoate 4b (ɳ=71%), heptyl decanoate 4c (ɳ=67%), decyl heptanoate 5a (ɳ=73%), decyl octanoate 5b (ɳ=72%) and decyl decanoate 5c (ɳ=69%). Native Aspergillus oryzae, Candida rugosa and porcine pancreas did not exhibit any catalytic activity when compared to the other lipases studied. Enzymatic catalysis with the modified lipase from Aspergillus oryzae without solvent was the most efficient and economical method, whose worst and best yields correspond to products 4a and 5a, respectively, with 66% and 73%. Each compound was characterized using 1H NMR, HRMS, FTIR, and thermogravimetry. The potential of the esters as viable substitutes for synthetic silicones was confirmed, revealing similar properties to Cetiol® CC, cyclopentasiloxane (D5) and 5 cSt silicone oil (Sil.O5) in the various parameters evaluated. The most variable parameter was viscosity, which generally increased as the carbon chain lengthened. The following nine cosmetic formulations were produced, with the corresponding silicone variation included: C1 (Cetiol® CC), C2 (D5), C3 (Sil.O5), C4 (4a), C5 (4b), C6 (4c), C7 (5a), C8 (5b) e C9 (5c). All of the creams demonstrated the quality and stability of the synthesised compounds. The organoleptic properties showed similar behaviour between all formulations. In the rheological tests, all of the samples had a pseudoplastic behaviour. While C1 demonstrated the best homogeneity and cohesiveness, C3 had the highest viscosity value, and was judged to be the thickest and most firm when in flow. C6 seemed to be the creamiest and most fluid. Due to its higher flow resistance, C4 appear thicker and firmer even though it is spreadable. C7 exhibited the highest number of micro-cracks in the structure, whereas C9 displayed the lowest value of deformation required to reach the breaking point of the structure. The formulations under investigation were unaffected by the rise in temperature to 37°C. Although there were only minor differences in the textural profile, creams C7 and C4 seemed to be more spreadable and less thick and sticky, while C1 and C9 seemed harder, cohesive, sticky, and less spreadable. Between a commercial and an alternative cream (C4), the volunteers favoured the alternative cream over the one that included silicone, demonstrating the potential of esters on a sensory level and a concern for sustainability.

Made available in DSpace on 2021-06-25T10:30:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2021-03-26 Lipases are enzymes which catalyze chemical reactions, especially lipidic bonds. Enzymes may be retrieved from lipolytic fungi which produce high rates of lipases from a carbon source. Fungus previously selected from sugarcane bagasse underwent submersed fermentation with extra-virgin olive oil as the carbon source. Broth produced by the fungus was analyzed by spectrophotometry with substrate p-NPB and results were analyzed at 5% level. Current assay identified fungus which was capable of growth in a mineral medium with sole lipid carbon source and quantifies specific activities of lipases by substrate p-NPB. Best rates of specific lipid activities of the three fungi were 8.004 U mg-1, 5.897 U mg-1, 5.077 U mg-1, for fungus Paecilomyces formosus (first isolate), Paecilomyces formosus (second isolate) and Aspergillus tubingensis, which are rates cited for the first time for the three fungi. When compared to other microorganisms in the literature, they are higher and more active to be used in industrial processes. Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Goiano (IFG) Colégio Estadual Alfredo Nasser Unesp Unesp

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The enzymatic production of biodiesel is a promising alternative to the conventional production by the alkaline route in a homogeneous medium. The enzymatic process allows using raw material with any concentration of free fatty acids due to the specificity of the lipases and lower energy consumption, because the enzymes act at mild temperature conditions. The liquid formulations of lipase from Thermomyces lanuginosus, Eversa® Transform and Eversa® Transform 2.0, were launched by Novozymes A/S to be used in the biodiesel production in their free forms. After characterizing the two formulations, it was identified that both are very similar, differing in the greater thermal stability of the second formulation, which is used to give segment to this work. The immobilization of enzymes can improve theior performance in the production of biodiesel, in addition to enabling the recovery and reuse of the biocatalyst. In this work, Eversa lipase was immobilized by the technique of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs), a simple, economical and unsupported technique, capable of generating insoluble biocatalysts with high volumetric activity and improved stability. The preparation conditions were optimized in order to improve the properties of the biocatalyst. The nature of the precipitant and concentration of the crosslinking agent were evaluated. To improve the crosslinking step, bovine serum albumin (BSA), soy protein (SP) or polyethyleneimine (PEI) were co-precipitated and evaluated as co-feeders and additives. Starch (later enzymatically degraded) was used as a porogenic agent to reduce the diffusion limitations of the substrate. Magnetic silica nanoparticles functionalized with amino-octyl groups (MNPS) were also used to simplify the handling of CLEA, which are incorporated into the CLEAs by inter and/or intra crosslinks particle-enzyme with glutaraldehyde as bifunctional agent, but a great percentage of enzyme could also to be adsorbed on the nanoparticle surface before the aggregation step. The best CLEA was prepared using PEI, starch and MNPS (Eversa m-CLEA). Under these conditions, the biocatalyst showed an immobilization yield of 98.9%, recovered activity of 30.1%, a porous structure, and a thermal stability at 70°C around 40-fold higher than that of the free enzyme. In the transesterification reaction of refined soybean oil with anhydrous ethanol (molar ratio oil/ethanol 1:6), the best performance obtained was using 12 Uest/oil of Eversa m- CLEA at 40ºC. A mass yield of 89.8% of fatty acid ethyl esters (FAEE) was found after 12 h of reaction, while the soluble enzyme required 48 h of reaction to give the same yield. A caustic polishing step of the product yielded a biodiesel containing 98.9 wt.% of FAEEs and a content of free fatty acids (FFAs) below 0.25 wt.%, meeting the international standards of a biodiesel to be commercialized as biofuel. The immobilized biocatalyst could be reused for at least five cycles of 12 h, maintaining 89.6% of the first-cycle mass yield, showing the efficient recovery of the catalyst by applying an external magnetic field. From an experimental design (DCCR)23 , it was possible to define a range of optimized values to produce enzymatic biodiesel using also Eversa m-CLEA, however in the transesterification of raw materials oil, degummed soy oil, and hydrated ethanol. At a molar ratio oil/ethanol of 1:6, 4 Uest/oil at 40 ºC, a mass yield of 81.45 wt.% of FAEEs, with a FFAs content of 3.9 wt.% was obtained after 24h of reaction. After a caustic polishing, a yield of 89.88 wt.% of FAEEs with a FFAs content of 0.17 wt.% was obtained. The use of Eversa m-CLEA, a biocatalyst that is easy to recover and reuse, together with unrefined raw materials with lower added value, is a promising combination to contribute to the economic viability of the enzymatic route, aiming to make it competitive to the traditional alkaline route. A produção enzimática de biodiesel é uma alternativa promissora à produção convencional pela rota alcalina em meio homogêneo. O processo enzimático permite a utilização de matéria-prima com qualquer concentração de ácidos graxos livres devido à especificidade das lipases e ao menor consumo de energia, pelo fato das enzimas atuarem em condições suaves de temperatura. As formulações líquidas de lipase de Thermomyces lanuginosus, Eversa® Transform e Eversa® Transform 2.0 foram lançadas pela Novozymes A/S para serem usadas produção de biodiesel na sua forma livre. Após a caraterização das duas formulações, foi identificado que ambas são muito semelhantes, diferindo-se na maior estabilidade térmica da segunda formulação, sendo esta utilizada para dar segmento a este trabalho. A imobilização de enzimas pode melhorar seu desempenho na produção do biodiesel, além de viabilizar a recuperação e reuso do biocatalisador. Neste trabalho, a lipase presente na formulação de Eversa foi imobilizada pela técnica de agregados enzimáticos reticulados (CLEAs), uma técnica simples, econômica e sem suporte, capaz de gerar biocatalisadores insolúveis com alta atividade volumétrica e estabilidade aprimorada. As condições de preparo foram aprimoradas a fim de melhorar as propriedades do biocatalisador. Foram avaliados a natureza do precipitante e concentração do agente reticulante. Para melhorar a etapa de reticulação, albumina de soro bovino (BSA), proteína de soja (PS) ou polietilenoimina (PEI) foram coprecipitados e avaliados como aditivos. O amido (posteriormente degradado enzimaticamente) foi utilizado como um agente porogênico para diminuir as limitações de difusão do substrato. Nanopartículas magnéticas de sílica funcionalizadas com grupos aminos e octilas (NPMSs) também foram utilizadas para simplificar o manuseio dos CLEAs, as quais são incorporadas aos CLEAs por ligações inter e intra partícula-enzima com glutaraldeído com reagente bifuncional, mas também, uma porcentagem da enzima é adsorvida às nanopartículas antes da agregação. O melhor CLEA foi preparado com PEI, amido e NPMSs (Eversa m-CLEA). Nestas condições, obteve-se um biocatalisador com rendimento de imobilização de 98,9%, atividade recuperada de 30,1%, estrutura porosa e com uma estabilidade térmica a 70 °C 40 vezes superior à da enzima livre. Na reação de transesterificação de óleo de soja refinado com etanol anidro (razão molar óleo/etanol 1:6), o melhor desempenho obtido foi empregando 12 Uest/góleo de Eversa m-CLEA à 40ºC. Um rendimento mássico de 89,8% de ésteres etílicos de ácidos graxos (EEAGs) foi encontrado após 12 h de reação, enquanto a enzima solúvel necessitou de 48 h de reação para dar o mesmo rendimento. Uma etapa de polimento cáustico do produto rendeu um biodiesel contendo 98,9% (m/m) de EEAGs e um teor de ácidos graxos livres (AGLs) inferior a 0,25% (m/m), atendendo aos padrões internacionais para que o biodiesel possa ser comercializado como biocombustível. O biocatalisador imobilizado pode ser reutilizado por pelo menos cinco ciclos de 12 h, mantendo 89,6% do rendimento do primeiro ciclo, mostrando a recuperação eficiente do catalisador pela aplicação de um campo magnético externo. A partir de um delineamento experimental (DCCR)23, foi-se capaz de definir uma faixa de valores otimizados para a produção do biodiesel enzimático usando também o Eversa m-CLEA, porém na transesterificação de matérias-primas não refinadas, o óleo de soja degomado e etanol hidratado. A uma razão molar óleo/etanol 1:6, 4 Uest/góleo, a 40ºC, foi obtido um rendimento mássico de 81,45% de EEAGs, com um teor de AGLs de 3,9% após 24 h de reação. Após o polimento cáustico obteve-se um rendimento mássico de 89,88% de EEAGs, e um teor de AGLs de 0,17% (m/m). A utilização do Eversa m-CLEA, um biocatalisador de fácil recuperação e reuso, juntamente com matérias-primas não refinadas, de menor valor agregado, é uma combinação promissora que visa contribuir com a viabilidade econômica da rota enzimática na busca de torná-la competitiva em relação a rota alcalina tradicionalmente usada. CAPES: código de financiamento - 001 CNPQ: projetos 405889/2016-0 e 308212/2017-7 FAPESP: 2016/10636-8

Submitted by Marilene Donadel (marilene.donadel@unioeste.br) on 2020-12-02T17:19:52Z No. of bitstreams: 1 Tayrine_Pozzobon_2020.pdf: 1209204 bytes, checksum: e83317204396924afd519c14ed7e2b7f (MD5) Made available in DSpace on 2020-12-02T17:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tayrine_Pozzobon_2020.pdf: 1209204 bytes, checksum: e83317204396924afd519c14ed7e2b7f (MD5) Previous issue date: 2020-09-08 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The interest in the production of lipases is related to its technological potential as a biocatalyst in hydrolysis and synthesis reactions such as esterification, transesterification (interesterification, alcoholysis and acidolysis), as well as aminolysis (synthesis of amides) and lactonization, in aquo-restricted medium, when the amount of water in the system is low enough to shift the balance towards the synthesis. Solid State Fermantation (SSF) emerge as an alternative to reduce production costs of the biocatalyst, since it is possible to use agro-industrial waste as substrates. The objective of this work was to study the production of fungal lipase from Penicillium sumatrense by SSF using baru seed (Dipterix alata) as substrate. The microorganism used, Penicillium sumatrense, was isolated from castor leaves (Ricinus communis L.) and identified by ribosomal DNA sequencing. The enzymatic activity was determined by the titrimetric method using olive oil as a substrate. In order to optimize the production of lipases, an experimental design 2² was carried out, aiming to evaluate the effects of the variables involved in the process (substrate size and moisture). The response variable chosen was the enzymatic activity total units (U). The statistical analyzes were performed using Statistica 7.0 software. The results of the experimental design indicated that the enzymatic activity was maximum (237.0 U) when used a substrate moisture of 60% (m / m, wet basis), substrate granulometry of 15 mesh, 28 °C, after 72 h fermentation. The fermented and dry solid, produced in the best result of the experimental design (23.7 U gSS-1 or 237,0 U). It was verified, through the spectrophotometric method, that the yield into biodiesel ester (ethyl oleate) was 100%. O interesse na produção de lipases está relacionado ao seu potencial tecnológico como biocatalisador em reações de hidrólise e síntese como esterificação, transesterificação (interesterificação, alcóolises e acidólises), bem como aminólise (síntese de amidas) e lactonização, em meios aquo-restritos, quando a quantidade de água do sistema é suficientemente baixa para deslocar o equilíbrio no sentido da síntese. A Fermentação no Estado Sólido (FES) surge como uma alternativa para redução de custos de produção do biocatalisador, pois é possível utilizar resíduos agroindustriais como substratos. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção de lipase fúngica de Penicillium sumatrense por FES, utilizando como substrato a semente de baru (Dipterix alata). O microrganismo utilizado, o Penicillium sumatrense foi isolado das folhas de mamona (Ricinus communis L.) e identificado por sequenciamento de DNA ribossomal. A atividade enzimática foi determinada pelo método titulométrico utilizando-se o óleo de oliva como substrato. Para otimizar a produção de lipases foi realizado um planejamento experimental 22, visando avaliar os efeitos das variáveis envolvidas no processo (granulometria do substrato e umidade). A variável resposta escolhida foi a atividade enzimática em unidades totais (U). As análises estatísticas foram realizadas pelo software Statistica 7.0. Os resultados do planejamento experimental indicaram que a atividade enzimática foi máxima (237,0 U) quando utilizamos uma umidade do substrato de 60 % (m/m, base úmida), granulometria do substrato de 15 mesh, 28°C, após 72 h de fermentação. O sólido fermentado e seco, produzido no melhor resultado do planejamento experimental (237,0 U ou 23,7 U gSS-1) foi empregado nos estudos da síntese enzimática do biodiesel a partir do óleo da semente de baru. Verificou-se, através do método espectrofotométrico, que o rendimento em éster do biodiesel (oleato de etila) foi de 100%.

The apremilast, marketed as OTZELA®, is a oral drug, used in psoriases and psoriatic arthritis psoriatic, acting as a anti-inflammatory. Is a recent drug, which was approved for FDA (Food Drug Administration) in 2014. The drug referred have a only stereogenic center and is commercialized in enantiomerically pure form, since what the (S)-enantiomer is more active which the (R)-enantiomer. In this work we describe the preliminary results referred the chemoenzymatic synthesis of apremilast intermediates in lipases presence, being the key-step, the obtaining of amine (S-2)-1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-1-methylsulfonyl-2-ethylamine, (S)-36. That intermediate can be obtained through kinetic resolution of amine rac-36, via carbamation reaction using lipases. The amine rac-36 was prepared, as 70% yield, via two sequential steps one-pot, which consisted in 3-ethoxy-4-methoxybenzonitrile, 38, reaction with (methylsulfonyl)methanide (formed carbanion among the dimethylsulfone and n-butyl-lithium), with obtaining of the enamine 1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethenamine 39, treatment followed with NaBH4, in glacial acetic acid. The 1-(3-ethoxy-4-methoxyfenyl)-2-(mehtylsulfonyl)ethyl)alyl carbamate, rac-49, was prepared starting of amine rac-34 via carbamation reaction with allyl chloroformate, in triethylamine presence, 89% yield. Both, the amine rac-34 and the carbamate rac-49 corresponding was analyzed by CLAE, using a chiral column, and ideal conditions for the enantiomers separation. The first approach to be studied was the lipase behavior in several solvents in 40 ºC for 72 h for kinetic resolution of amine rac-36, via carbamation reaction. Highlighted the solvents which show low value of dielectric constant: THF, TBME, hexane, cyclohexane and toluene, since which the best result was obtained in hexane, in CAL-B presence, as 14% conversion and >200 enantioselectivity (E). Also of CAL-B, the Candida rugosa lipase and CAL-A are promising in kinetic resolution of rac-36. In parallel, the commercial anhydride 3- nitrophthalic anhydride 50, was effectively transforming in 3-aminophthalic, 51, qualitative yield. The latter was subjected to an acetylation reaction to obtain 3-acetylaminophthalic anhydride 37, one of apremilast's intermediates, but with a yield of only 25%. O apremilast, comercializado como OTZELA®, é um fármaco oral, utilizado no tratamento da psoríase e da artrite psoriática, atuando como um anti-inflamatório. É um fármaco recente, que foi aprovado pela FDA (Food Drug Administration) em 2014. O referido fármaco possui apenas um centro estereogênico e é comercializado na forma enantiomericamente pura, já que o (S)-enantiômero é mais ativo que o (R)-enantiômero. Neste trabalho descrevemos os resultados preliminares referentes à síntese quimioenzimática de intermediários do apremilast na presença de lipases, sendo a etapa chave, a obtenção da amina (S-2)-1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-1-metilssulfonil-2-etilamina, (S)-36. Esse intermediário pode ser obtido através da resolução cinética da amina rac-36, via reação de carbamatação, catalisada por lipases. A amina rac-36 foi preparada, com 70% de rendimento, via duas etapas sequenciais one-pot, que consistiu na reação da 3-etoxi-4-metoxibenzonitrila 38 com o (metilssulfonil)metanídeo (carbânion formado entre a dimetilssulfona e n-butil-lítio), com a obtenção da enamina 1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-(metilssulfonil)etenamina 39, seguido de tratamento com NaBH4, em ácido acético glacial. O carbamato de 1-(3-etoxi-4-metoxifenil)-2-(metilssulfonil)etil)alila rac-49 foi preparado a partir da amina rac-34 via reação de carbamatação com cloroformato de alila, na presença de trietilamina, com rendimento de 89%. Ambos, a amina rac-34 e o correspondente carbamato rac-49 foram analisados por CLAE, utilizando coluna quiral, e condições adequadas para a separação de seus correspondentes enantiômeros. A primeira abordagem a ser estudada foi o comportamento de lipases em diferentes solventes a 40 ºC por 72 h na resolução cinética da amina rac-36, via reação de carbamatação. Destacaram-se os solventes que apresentaram baixos valores de constante dielétrica: THF, TBME, hexano, cicloexano e tolueno, sendo que o melhor resultado foi obtido em hexano, na presença de CAL-B, com conversão de 14% e enantiosseletividade (E) >200. Além da CAL-B, a lipase de Candida rugosa e CAL-A mostram-se promissoras na resolução cinética de rac-36. Em paralelo, o anidrido comercial 3-nitroftálico 50 foi eficientemente transformado no anidrido-3-aminoftálico 51, em rendimento quantitativo. Este último, foi submetido a uma reação de acetilação para a obtenção do anidrido 3-acetilaminoftálico 37, um dos intermediários do apremilast, porém com rendimento de apenas 25%.

Apremilast (S)-1 is a commercially known drug under the brand name Otezla® and is used to treat patients with moderate to severe psoriasis or active psoriatic arthritis. This drug is relatively recent and was approved by the FDA only in 2014. In this project, we describe the development of a biocatalytic approach for the synthesis of apremilast and the key step was to obtain a chiral intermediate, the alcohol (R)-14, (R)-1-(3-ethoxy)4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethanol. The alcohol (R)-14 was obtained via two enzymatic approaches, one using ketoreductases and one using lipases. Bioreduction of ketone 12, 1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethanone, in the presence of KRED-P2-D12, led to alcohol (R)-14 with 48% conversion and enantiomeric excess 93%. Kinetic resolution of racemic ester rac-15, 1-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(methylsulfonyl)ethyl acetate, by hydrolytic process catalyzed by lipase from Aspergillus niger led to alcohol (R)-14 with enantiomeric excess > 99%, 50% conversion and enantioselectivity (E) > 200. Kinetic resolution of rac-15 was only effective in the presence of 20% n-butanol relative to phosphate buffer medium (pH 7). Lipase from Aspergillus niger has proven to be a robust biocatalyst because it provides the intermediate alcohol (R)-14 in enantiomerically pure form and with a maximum conversion of 50%. The best condition for resolution of rac-15 was lipase/substrate 3:1, in PO43- (pH 7) buffer with 20% n-butanol, 6 h of reaction time at 45 ° C. Subsequently, enantiomerically pure alcohol (R)-14 reacted with phthalimide 19, 4-acetylamino-isoindol-1,3-dione, via Mitsunobu reaction, yielding apremilast in 65% yield and enantiomeric excess 51%. CAPES O apremilast (S)-1 é um fármaco conhecido, comercialmente, pela marca Otezla® e é utilizado para o tratamento de pacientes com psoríase moderada a grave ou com artrite psoriática ativa. Este fármaco é relativamente recente, sendo aprovado pelo FDA somente em 2014. Neste projeto, descrevemos o desenvolvimento de uma abordagem biocatalítica para a síntese do apremilast, através uma rota sintética com 5 etapas e rendimento global de 20%. A etapa chave do processo, foi a obtenção de um intermediário quiral, o álcool (R)-1-(3-etóxi-4-metoxifenil)-2-(metilsulfonil)etanol ((R)-14). O álcool (R)-14 foi obtido via duas abordagens enzimáticas, uma utilizando cetorredutases e outra utilizando lipases. A biorredução da cetona 1-(3-etóxi-4-metoxifenil)-2-(metilsulfonil)etanona (12), na presença da enzima KRED-P2-D12, levou ao álcool (R)-14 com conversão de 48% e excesso enantiomérico de 93%. A resolução cinética do éster racêmico acetato de 1-(3-etóxi-4-metoxifenil)-2-(metilsulfonil)etila (rac-15), por processo hidrolítico, catalisada pela lipase de Aspergillus niger levou ao álcool (R)-14 com excesso enantiomérico > 99%, conversão de 50% e enantiosseletividade (E) > 200. A resolução cinética de rac-15 somente foi eficiente na presença de 20% de n-butanol em relação ao meio de tampão fosfato (pH 7) 0,1 M. A lipase de Aspergillus niger provou ser um biocatalisador robusto na obtenção do intermediário álcool (R)-14 na forma enantiomericamente pura e com a máxima conversão de 50%. A melhor condição para a resolução de rac-15 foi lipase/substrato 3:1 (massa/massa), em tampão PO43- (pH 7) 0,1 M com 20% de n-butanol, 6 h de reação a 45 ºC. Subsequentemente, o álcool (R)-14, enantiomericamente puro, reagiu com 4-acetilamino-isoindol-1,3-diona (19), via reação de Mitsunobu, produzindo o apremilast com 65% de rendimento e 51% de excesso enantiomérico.

Submitted by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-06-01T18:17:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tatiana_paula_costa.pdf: 854193 bytes, checksum: cdfd516197805e0008e0e3641cd4904c (MD5) Approved for entry into archive by Jos? Henrique Henrique (jose.neves@ufvjm.edu.br) on 2021-06-01T18:18:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tatiana_paula_costa.pdf: 854193 bytes, checksum: cdfd516197805e0008e0e3641cd4904c (MD5) Made available in DSpace on 2021-06-01T18:18:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tatiana_paula_costa.pdf: 854193 bytes, checksum: cdfd516197805e0008e0e3641cd4904c (MD5) Previous issue date: 2020 Enzimas produzidas por fungos filamentosos t?m demonstrado amplas aplica??es biotecnol?gicas nos mais diversos segmentos industriais. Para suprimento dessa demanda, h? uma crescente busca por novas linhagens de fungos produtores dessas enzimas, levando ao isolamento e sele??o a partir dos mais diferentes biomas. Esse trabalho objetivou analisar a temperatura dos fungos filamentosos, selecionar um fungo filamentoso potencialmente capaz de produzir lipase e otimizar a produ??o da enzima pelo micro-organismo selecionado. Inicialmente foi analisado a temperatura de crescimento de vinte e um fungos filamentosos do laborat?rio em meio Aveia e meio BDA, a fim de verificar a melhor temperatura de crescimento de cada micro-organismo. Os fungos em meio aveia com maiores taxas de crescimento a diferentes temperaturas foram o 3.8TA, P3, MB2.9, MB2.12, 4.2 e B8, e em meio BDA foram o 3.8TA, P3, M2.3, C421, B8, 4.2 e A4. Os vinte e um fungos foram testados quanto a sua capacidade de produ??o de lipases em meio contendo Tween? 80, sendo que destes micro-organismos dois (M1.1 e A4) apresentaram halo de atividade lipol?tica quando utilizado a solu??o reveladora, optando-se pelo fungo A4 para prosseguir com o trabalho. Em seguida, o fungo filamentoso A4 foi incubado em quatro meios submersos distintos (Vogel, Adams, Khanna, e SR), ? 30 ?C, em estufa bacteriol?gica, de forma estacion?ria, durante oito dias e retirados a cada vinte e quatro horas, sendo o meio que apresentou uma melhor atividade lipol?tica o Khanna (2,32 U.mL-1) ap?s 120 horas de cultivo. Ap?s definir o meio de cultivo submerso, variou-se sua composi??o, analisando fonte de nitrog?nio (extrato de levedura, peptona, ureia, nitrato de pot?ssio e suas combina??es). Para a fonte de nitrog?nio o melhor valor de atividade lipol?tica obtido foi 2,15 U.mL-1 (ureia + peptona + KNO3) pelo fungo filamentoso A4. Em seguida, foram analisadas diferentes fontes de sais (sais Vogel, sais CP, sais SR e suas combina??es), estabelecendo a suplementa??o do meio com sais Vogel. Analisou-se, tamb?m, o efeito da varia??o do pH inicial do meio de cultura (pH iniciais 4,0; 4,5; 5,0; 5,5 e 6,0), determinando o 4,5 como ideal para crescimento do isolado A4 e produ??o de lipases. Por fim, analisou-se a influ?ncia de diferentes ?leos (soja, milho, girassol, dend? e algod?o) como fonte de carbono, e o fungo A4 apresentou uma melhor atividade enzim?tica em meio de cultura suplementado com ?leo de algod?o (171,36 U.mL-1). Esses resultados demonstram a import?ncia da sele??o de fungos filamentosos como recurso biotecnol?gico, em especial para a produ??o de enzimas lipol?ticas. A otimiza??o resultou em um aumento na produ??o da enzima, abrindo perspectivas para a otimiza??o do processo de fermenta??o submersa utilizando processos de baixo custo. Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-gradua??o em Biocombust?veis, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2020. Enzymes produced by filamentous fungi have had extensive biotechnological applications in the most diverse industrial segments. To supply this demand, there is a growing search for new strains of fungi that produce these enzymes, leading to isolation and selection from the most varied biomes. This work sought to determine the ideal temperature for growth of the filamentous fungi, select a filamentous fungus potentially capable of producing lipase and optimize the production of the enzyme by the selected microorganism. Initially, the growth temperatures of 21 filamentous fungi from the laboratory were analyzed in Oat medium and BDA medium to verify the best growth temperature of each microorganism. The fungi in Oat medium with the highest growth rates at different temperatures were 3.8TA, P3, MB2.9, MB2.12, 4.2 and B8, and those with the highest growth rates in BDA medium were 3.8TA, P3, M2.3, C421, B8 , 4.2 and A4. The 21 fungi were tested for their ability to produce lipases in medium containing Tween? 80, two of which (M1.1 and A4) presented halos of lipolytic activity when the developing solution was applied. The fungus A4 was chosen for further work. The filamentous fungus A4 was incubated in four different submerged media (Vogel, Adams, Khanna, and SR) at 30 ?C in a bacteriological oven, stationary, for eight days. Aliquots were removed every twenty-four hours. The greatest lipolytic activity was observed with the Khanna medium (2.32 U.mL-1) after 120 hours of cultivation. After defining the submerged culture medium, its composition was varied to determing the best nitrogen source (yeast extract, peptone, urea, potassium nitrate and their combinations). For the nitrogen source, the highest lipolytic activity obtained was 2.15 U.mL-1 (urea, peptone and KNO3) with the filamentous fungus A4. Dfferent sources of salts (Vogel salts, CP salts, SR salts and their combinations) were analyzed, and the supplementation of the medium with Vogel salts was established. The effect of the variation of the initial pH of the culture medium (initial pH 4.0; 4.5; 5.0; 5.5 and 6.0) was also determined, and pH 4.5 was ideal for growth of A4 isolate and for lipase production. Finally, the influence of different oils (soy, corn, sunflower, palm and cotton) as a carbon source was determined. The greatest enzymatic activity for the fungus A4 was observed in culture medium supplemented with cotton oil (171.36 U.mL-1). These results demonstrate the importance of selecting filamentous fungi as a biotechnological resource, especially for the production of lipolytic enzymes. The optimization resulted in an increase in the production of the enzyme, which opens perspectives for the optimization of the submerged fermentation process using low cost processes.

The goal of this study was the isolation and biochemical characterization of psychotrophic microbiota, evaluating its deteriorating potential on refrigerated raw milk stored in both individual and collective expansion tanks located in farms from Agreste and Sertão regions of Alagoas State. Milk samples from 23 (individual) and 13 (collective) tanks were analyzed, and the presence of psychotropic bacteria was diagnosed in both types of refrigeration tanks, totalizing 105 bacterial isolates. There was a predominance of gram-negative psychotropic bacteria 78,09% (82/105) from genus Pseudomonas, Enterobacter, Aeromonas, Burkholderia, Acinetobacter e Shigella, whereas gram-positive bacteria represented 21,90% (23/105) of total isolates, from genus Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus, Micrococcus and Bacillus. In general, Pseudomonas was the most prevalent genus isolated 43,81% (46/82). The majority of bacterial isolates had high extracellular enzymes production – protease, lipase and/or lecithinase, which evidenced elevate deteriorating potential for milk and its derivatives. There was no significant difference on enzymatic production among isolates or between individual and collective tanks, as well as no dependency between total number of enzymatic producer bacterial isolates and tank type. Objetivou-se com o presente trabalho isolar e caracterizar bioquimicamente a microbiota psicrotrófica, bem como avaliar seu poder deteriorador no leite cru refrigerado, armazenado em tanques de expansão, individuais e coletivos, de propriedades das regiões Agreste e Sertão do Estado de Alagoas. Foram analisadas amostras de leite coletadas em 23 tanques individuais e 13 coletivos, onde se verificou a presença de bactérias psicrotróficas nos dois tipos de tanques de refrigeração, sendo um total de 105 isolados bacterianos. Foi detectada a predominância de bactérias psicrotróficas gram-negativas 78,09% (82/105), dos gêneros Pseudomonas, Enterobacter, Aeromonas, Burkholderia, Acinetobacter e Shigella, enquanto que as bactérias gram-positivas foram da ordem de 21,90% dos gêneros Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus, Micrococcus e Bacillus. Pseudomonas foi o gênero predominante com 43,81%. A grande maioria dos isolados bacterianos demonstrou alto poder de produção de enzimas extracelulares – protease, lipase e/ou lecitinase, evidenciando assim potencial deteriorador do leite e derivados. Estatisticamente não foi significativa a diferença de produção enzimática pelos isolados entre tanques individuais e coletivos, não havendo dependência entre o número de isolados bacterianos produtores de enzimas e o tipo de tanque.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2022-04-03T06:37:41Z No. of bitstreams: 1 2019 - Raysa Ramos de Oliveira.pdf: 1970759 bytes, checksum: 07e3c6bd553723a7795b6b99a95cf187 (MD5) Made available in DSpace on 2022-04-03T06:37:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2019 - Raysa Ramos de Oliveira.pdf: 1970759 bytes, checksum: 07e3c6bd553723a7795b6b99a95cf187 (MD5) Previous issue date: 2019-08-14 CAPES - Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico FAPERJ - Funda??o Carlos Chagas Filho de Amparo ? Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Enzymes present a great perspective considering their application as a biocatalyst in the many sectors. However, their high cost and low stability are still considered limiting factors in industrial-scale processes. For this reason, studies focused on immobilization and, recently, pretreatment using non-conventional media have been favorable in view of these disadvantages. This dissertation aimed to immobilize Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) in anionic (Amberlite IRA400 Cl-) and cationic (Amberlite IR120 Na+) supports by ionic adsorption, then evaluate the effects of the supercritical condition of CO2 on Immobilized TLL and compare it with the commercial TLL (Lipozyme TL IM). It was observed that the support Amberlite IRA400 Cl- presented better results of activity and protein content compared to Amberlite IR120 Na+. Afterward, the effects of carbon dioxide supercritical conditions on hydrolytic activity and enzymatic stability were evaluated. The experiments were conducted according to experimental design, varying the temperature from 35 to 75 ?C, the pressure from 80 to 300 bar and the exposure time from 1 to 6 h. The results showed an inactivation of immobilized TLL in Amberlite IR120 Na+ under all proposed conditions. On the other hand, it was observed an overactivation up to 57% in relation to of activity measured before pretreatment for immobilized TLL in Amberlite IRA400 Cl-. Then, the same experimental procedure was applied to Lipozyme TL IM (commercially immobilized lipase), aiming at a comparison between commercial and immobilized lipase in this study. For this, an overactivation of 18% was noted under the same condition proposed for TLL immobilized on Amberlite IRA400 Cl- (75 ?C, 300 bar, and 6 h). Regarding changes in the chemical binding of support and enzyme, no relevant changes were observed. However, it was possible to observe that by the differential exploratory calorimetry analysis that CO2 acted as a protector for Lipozyme TL IM increasing the stability of this lipase, while in the other supports a greater protein degradation was observed. Finally, it was found that the increase in substrate concentration (p-nitrophenyl laurate) resulted in inactivation of both free and immobilized lipase in Amberlite IRA400 Cl- and commercially. Being the largest effect observed on the immobilized TLL in Amberlite IRA400 Cl-. As enzimas apresentam uma grande perspectiva considerando sua aplica??o como biocatalisador nos mais diversos segmentos. Contudo, seu elevado custo e baixa estabilidade s?o ainda considerados fatores limitantes em processos de escala industrial. Por esse motivo, estudos focados na imobiliza??o e, recentemente, no pr?-tratamento utilizando meios n?o convencionais t?m se mostrado favor?veis frente ? essas desvantagens. A presente disserta??o teve como objetivo imobilizar a lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL) em suportes ani?nico (Amberlite IRA400 Cl-) e cati?nico (Amberlite IR120 Na+) por meio da adsor??o i?nica, em seguida, avaliar os efeitos da condi??o supercr?tica do CO2 sobre a TLL imobilizada e compar?-la com a TLL comecial (Lipozyme TL IM). Foi observado que o suporte Amberlite IRA400 Cl- apresentou melhores resultados de atividade e teor de prote?na frente ao Amberlite IR120 Na+. Posteriormente, os efeitos das condi??es supercr?ticas do di?xido de carbono sobre a atividade hidrol?tica e estabilidade enzim?tica tamb?m foram avaliados. Os experimentos foram conduzidos de acordo com um planejamento experimental, variando a temperatura de 35 a 75 ?C, a press?o de 80 a 300 bar e o tempo de exposi??o de 1 a 6 h. Os resultados mostraram uma redu??o da atividade da TLL imobilizada em Amberlite IR120 Na+ em todas as condi??es propostas. Por outro lado, foi observado uma superativa??o em at? 57% em rela??o a atividade medida antes do pr?-tratamento para a TLL imobilizada em Amberlite IRA400 Cl-. Em seguida, o mesmo procedimento experimental foi aplicado ? Lipozyme TL IM. Para este, foi notado uma superativa??o de 18% na mesma condi??o proposta para a TLL imobilizada em Amberlite IRA400 Cl- (75 ?C, 300 bar e 6 h). Em rela??o ?s mudan?as nas liga??es presentes no suporte e na enzima, n?o foram observadas altera??es relevantes. Contudo, foi poss?vel observar pela an?lise de calorimetria explorat?ria diferencial que o CO2 atuou com um protetor no complexo enzima-suporte para a Lipozyme TL IM aumentando a estabilidade dessa lipase, enquanto que nos outros suportes foi observado uma maior degrada??o das prote?nas. Por ?ltimo, foi verificado que o aumento da concentra??o do substrato (p-nitrofenil laurato) acarretou em uma inativa??o tanto da lipase livre, quanto na imobilizada em Amberlite IRA400 Cl- e comercialmente. Sendo o maior efeito observado na TLL imobilizada em Amberlite IRA400 CI

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). A levedura metilotrófica Komagataella phaffii destaca-se como sistema de expressão de proteínas recombinantes por ser capaz de produzir e secretar grandes quantidades de proteínas em altas densidades celulares, além de realizar modificações pós-traducionais típicas de eucariotos, o que a torna ideal para a produção de biocatalisadores industriais. Atualmente, os promotores constitutivos de K. phaffii têm sido pesquisados e testados devido ao interesse na capacidade de transcrição contínua do gene alvo em todas fases de crescimento do microrganismo. Os promotores constitutivos PGAP e PTEF1, que controlam a expressão dos genes codificadores da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e do fator de elongação da tradução, respectivamente, são considerados eficientes na produção de proteína heteróloga em K. phaffii. As lipases são uma classe de enzimas com aplicações na indústria de alimentos, na indústria têxtil, farmacêutica, cosmética, na produção de biodiesel e detergentes, dentre outros. Entre as lipases mais importantes de uso industrial, destacam-se as lipases de Rhizomucur miehei (RML) e de Pseudozyma antarctica (lipase B/CALB). No presente trabalho, foram construídos novos vetores integrativos com expressão baseada nos promotores PGAP e PTEF1, com o estabelecimento de uma metodologia de clonagem in vivo em E. coli, que não necessita do uso de enzimas e reagentes específicos. As construções plasmidiais foram usadas para transformar levedura. Foi obtida a produção de RML dirigida pelo promotor PTEF1 pela primeira vez em K. phaffii, e a CALB foi expressa sob controle dos promotores PGAP e PTEF1. A enzima CALB foi identificada em SDS-PAGE desnaturante como uma banda de aproximadamente 37 kDa presente no sobrenadante e confirmada como lipase em zimograma utilizando o substrato MUF-butirato. Em relação aos ensaios de atividade enzimática nas condições testadas, não foi observada diferença significativa na produção de CALB pelos diferentes promotores. The methylotrophic yeast Komagataella phaffii stands out as a recombinant protein expression system by being able to produce and secrete large amounts of proteins at high cell densities, in addition to performing post-translational modifications typical of eukaryotes, which makes it ideal for production of industrial biocatalysts. Currently, constitutives promoters of K. phaffii have been researched and tested because of the interest in its ability to perform the transcription of the target gene at all stages of the growth of the microorganism. The constitutives promoters PGAP and PTEF1, which control the genes of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and the elongation factor of the translation, respectively, are considered efficient in the production of heterologous protein in K. phaffii. Lipases are a class of enzymes with applications in the food industry, the textile industry, pharmaceuticals, cosmetics, in the production of biodiesel and detergents, among others. Among the most important lipases for industrial use, the lipases of Rhizomucur miehei (RML) and lipase B of Pseudozyma antarctica (CALB) stand out. In the present work new integrative vectors were constructed with their expression based on the TEF1 and GAP promoters establishing an in vivo cloning methodology in E. coli, which does not require the use of enzymes and specific reagents. The plasmids constructed were used to transform yeasts. The production of the Rhizomucur miehei lipase was drove by the PTEF1 promoter for the first time in K. phaffii, and the Pseudozyma antarctica lipase was expressed under the control of PGAP and PTEF1. The CALB enzyme was identified on denaturing SDS-PAGE as a band of approximately 37 kDa and confirmed as lipase in zygogram using the MUF-butyrate substrate. In relation to the enzymatic assays performed, under the tested conditions, no significant difference in CALB production was observed by the different promoters.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Enzymes are biological catalysts that present diverse applications, representing interesting perspectives for use in several branches of the industry: agribusiness, biofuels, and pharmacist. However, the recovery of broth enzymes is generally the most expensive step of a production process, as they are present in low concentration in a complex mixture of molecules. Thus, it is crucial to use appropriate (selective, efficient and inexpensive) purification processes to separate these high value-added biomolecules from complex extracts. The objective of this work was to verify the influence of the degree of hydrophobicity of different materials in hydrophobic adsorption processes, in order to characterize the enzyme-solid interaction besides to evaluate possibilities of application with main focus in the purification of biomolecules. The desorption process of the proteins was evaluated in a judicious manner by obtaining isotherms with the presence of TRITON-X-100 detergent. Initially, adsorbents constituted of silica matrices functionalized with carbon groups (C1 and C8) and octyl sepharose were tested on lipase adsorption of recombinant Bacillus thermocatenulatus (BTL-2) present in the centrifuged extract obtained after culturing and disruption of E. coli cells. The desorption isotherms, obtained in the presence of detergent, allow the evaluation of enzyme-solid interaction for the different substrates, making it possible to classify the degree of hydrophobicity of different hydrophobic supports applied to the purification of proteins. The results indicated higher enzyme-solid interaction for octyl sepharose, with greater selectivity in the adsorption process for lipase. This behavior of higher hydrophobic interaction later confirmed by high-purity lysozyme assays rather than the extract is probably due to the higher density of C8 (octyl) groups on the surface of octyl agarose with respect to C8 silica. Analysis of the results indicated that even with higher interaction, high desorption yields can be obtained for octyl agarose as a consequence of the large porosity of the particle and also of possible ionic interactions of the enzyme with the silica matrix. Thus, the particle porosity and nature of the adsorbent matrix are factors to be considered when analyzing desorption results to obtain higher protein elutriation. Despite the difficulty of desorption, the use of silica is still interesting, especially for applications of magnetic composites, due to its chemical stability and mechanical resistance. Thus, the work points out possible alternatives for the development of more efficient silica substrates for enzyme purification processes, such as higher particle porosity, higher silica matrix neutrality and preliminary tests with silica activated with less hydrophobic groups (diol ) resulting in high desorption yield of proteins, but with losses in the selectivity of the adsorption process. As enzimas são catalisadores biológicos que apresentam diversas aplicações, representando perspectivas interessantes para uso em diversos ramos da indústria, entre eles: agroindústria, biocombustíveis e farmacêutico. No entanto, a recuperação de enzimas do caldo de cultivo é geralmente a etapa mais cara de um processo de produção, pois elas estão presentes em baixa concentração em uma mistura complexa de moléculas. Assim, é crucial usar processos de purificação apropriados (seletivos, eficientes e baratos) para separar essas biomoléculas de alto valor agregado de extratos complexos. O objetivo desse trabalho foi verificar a influência do grau de hidrofobicidade de diferentes materiais em processos de adsorção hidrofóbica, de modo a caracterizar a interação enzima-sólido além de avaliar possibilidades de aplicação com principal foco na purificação de biomoléculas. O processo de dessorção das proteínas foi avaliado de modo criterioso pela obtenção de isotermas com a presença de detergente TRITON-X-100. Inicialmente, adsorventes constituídos de matrizes de sílica funcionalizados com grupos carbono (C1 e C8) e Octil-agarose foram testados na adsorção de lipase de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) recombinante presente em extrato centrifugado obtido após cultivo e rompimento de células de E. coli. As isotermas de dessorção, obtidas na presença de detergente, permitem avaliar interação enzima-sólido para os diferentes suportes, possibilitando classificar o grau de hidrofobicidade de diferentes suportes hidrofóbicos aplicados à purificação de proteínas. Os resultados indicaram maior interação enzima-sólido para Octil-agarose, com maior seletividade no processo de adsorção para a lipase. Esse comportamento de maior interação hidrofóbica posteriormente confirmado pela realização de ensaios com lisozima em alta pureza ao invés do extrato, provavelmente se deve à maior densidade de grupos C8 (Octil) existentes na superfície da Octil-agarose com relação à sílica-C8. A análise dos resultados indicou que mesmo com maior interação, rendimentos elevados de dessorção podem ser obtidos para Octil-agarose em consequência da grande porosidade da partícula e ainda de possíveis interações iônicas da enzima com a matriz de sílica. Assim, a porosidade da partícula e natureza da matriz adsorvente são fatores a serem considerados ao analisar resultados de dessorção para obtenção de maior elutriação de proteínas. Apesar da dificuldade de dessorção, a utilização de sílica ainda assim é interessante, principalmente para aplicações de compósitos magnéticos, devido à sua estabilidade química e resistência mecânica. Assim, o trabalho aponta possíveis alternativas para desenvolvimento de suportes de sílica mais eficientes para processos de purificação de enzimas, como por exemplo, maior porosidade de partícula, maior neutralidade da matriz de sílica e ainda ensaios preliminares com sílica ativada com grupos menos hidrofóbicos (diol) resultando em elevado rendimento de dessorção de proteínas, porém com perdas na seletividade do processo de adsorção. CNPq: 371939/2017-8

Submitted by Mariana Vendrasco Tacin (mari_vtacin@hotmail.com) on 2018-12-27T14:47:49Z No. of bitstreams: 1 Cultivo submerso de Aspergillus empregando óleos vegetais visando a síntese de lipases para aplicação industrial.pdf: 2282967 bytes, checksum: 9604ac965a455f1bf89adf9220b02a06 (MD5) Approved for entry into archive by Maria Irani Coito (irani@fcfar.unesp.br) on 2019-01-05T17:25:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tacin_mv_dr_arafcf_int.pdf: 2229360 bytes, checksum: 135857eb7bc370836b591adb00dd6c38 (MD5) Made available in DSpace on 2019-01-05T17:25:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tacin_mv_dr_arafcf_int.pdf: 2229360 bytes, checksum: 135857eb7bc370836b591adb00dd6c38 (MD5) Previous issue date: 2018-11-05 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As lipases são enzimas amplamente aplicadas em processos industriais. Sua obtenção por fungos filamentosos apresenta algumas vantagens em relação às outras fontes e por isso estudos de incremento de sua produção vêm sendo realizados. Aliado ao processo de obtenção, técnicas de imobilização de enzimas podem melhorar sua estabilidade em relação à temperatura e pH, e diminuir custos associados à sua aplicação devido à possibilidade de reaproveitamento da enzima imobilizada nos processos biocatalíticos. Objetivo: este trabalho teve como objetivo estudar a produção de lipases pela cepa Aspergillus sp. DPUA 1727, a imobilização da referida enzima em suporte octil-sepharose, sua caracterização na forma livre e imobilizada e a aplicação da enzima imobilizada na obtenção de ésteres. Métodos: a produção da enzima foi realizada por 96 horas em cultivo submerso, avaliando-se diferentes fontes de carbono (óleos de soja, oliva, semente de uva e de algodão) como substratos indutores da produção enzimática. Posteriormente, estudou-se a imobilização da enzima em suporte octil-sepharose® por adsorção através de interação hidrofóbica, após o meio fermentado ter sido submetido à 4 ciclos de extração do óleo residual da fermentação com n-hexano. O processo de imobilização da enzima foi realizado em cascata em 4 ciclos com a finalidade de sobrecarga da enzima no suporte. Os testes de estabilidade foram feitos por 24 horas, nas temperaturas de 30 à 70ºC e pH de 3 a 9 com a enzima livre e imobilizada. Como última etapa do trabalho, aplicou-se a enzima imobilizada na obtenção do éster propionato de isoamila. Resultados: Na etapa de produção, as melhores condições para a obtenção da enzima foram: óleo de semente de uva como indutor e 96 horas de cultivo. A lipase produzida apresentou maior atividade quando na presença do substrato p-nitrofenil propionato e, com a imobilização por 4 ciclos em suporte octil-sepharose, pode-se obter um derivado com a lipase adsorvida de peso molecular de, aproximadamente, 45 kDa. Em relação à caracterização da lipase produzida, obteve-se pH ótimo de 7,5 e 5 e, temperatura ótima de 45 e 50ºC, na sua forma livre e imobilizada, respectivamente. A enzima imobilizada apresentou uma faixa de estabilidade superior à da enzima livre em relação ao pH, sendo os valores de pH de 4, 5 e 6 para a enzima imobilizada e de 7 e 7,5 para enzima livre, ao longo de 24 horas de incubação. No ensaio de estabilidade em relação à temperatura, a enzima imobilizada foi mais estável na faixa de 40 à 60ºC e a enzima livre apresentou estabilidade de 40 à 45ºC. No teste de reuso do derivado imobilizado, após 5 ciclos, a enzima imobilizada apresentou 75% da atividade inicial a qual se manteve durante outros 15 ciclos adicionais. A possibilidade de utilização da lipase imobilizada na síntese de ésteres de bioaroma deve ser estudada em relação à especificidade dos substratos empregados, sendo a escolha destes, o álcool e o ácido, essenciais para obtenção de uma taxa de esterificação satisfatória. Conclusão: Substratos alternativos como o óleo de semente de uva podem ser empregados como indutor visando a síntese de lipases. O processo de imobilização por adsorção em suporte octil-sepharose mostrou-se eficaz não somente para imobilizar a enzima, mas também para promover a purificação, sendo que, com este método, a enzima pode ser reutilizada satisfatoriamente. É necessário conhecer a especificidade da enzima para sua utilização e obtenção do bioproduto de interesse.

Submitted by Marilene Donadel (marilene.donadel@unioeste.br) on 2021-09-21T18:16:51Z No. of bitstreams: 1 Aline_Awadallak_2018.pdf: 1009133 bytes, checksum: a5bfc443f3cef8a4ae9dad2abd7c3fb8 (MD5) Made available in DSpace on 2021-09-21T18:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aline_Awadallak_2018.pdf: 1009133 bytes, checksum: a5bfc443f3cef8a4ae9dad2abd7c3fb8 (MD5) Previous issue date: 2018-09-04 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Oils and greases (O&G) represent a class of pollutants with low affinity for water. Their removal of industrial wastewater is often challenging and involves the combination of different conventional treatment technologies, which, however, often present drawbacks such as the production of hazardous sludge and high energy consumption. One example is the biodiesel production sector, where the generated effluents are rich in oils and greases. Finding innovative treatment alternatives represents a significant contribution to operational and economic sustainability in the biofuels sector. In this context, the pretreatment of fat-rich waste water by bioremediation using biocatalysts as fungal lipases may be a promising alternative, since the production of the enzyme is low cost and presents the advantages of biodegradability (white biotechnology) and can be recovered and used in recycles, reducing the operational cost. The objective of this work was to evaluate the biodegradation of oils and greases (O&G) in wastewater effluents from biodiesel washing, by means of fungal lipase from Penicillium sumatrense obtained through the SST (Solid State Fermentation) process. The results indicated that after the bioremediation there was a reduction in all parameters evaluated, according to Resolution 430/2011 of CONAMA. The content of oils and greases decreased by 86%; to COD 5.0%; to BOD 7%; of total solids (TS) 84.5% and the pH remained at 5.76. The effluent biodegradability ratio (BOD5 / COD) calculated was 1.30. This ratio indicates that values lower than 0.6 estimate low effluent biodegradability, therefore, the value obtained in this research indicates a good biodegradability of the studied effluent. In view of the obtained results an efficient treatment was verified where the wastewater of the biodiesel production industry could be used for the purpose of launching or reuse in the industrial process, minimizing the generation of effluents in the treatment plants. Os óleos e graxas (O&G) representam uma classe de poluentes com baixa afinidade com a água. Sua remoção de águas residuais industriais é muitas vezes desafiadora e envolve a combinação de diferentes tecnologias de tratamento convencionais, os quais, no entanto, muitas vezes apresentam desvantagens como a produção de lamas perigosas e o consumo de alta energia. Um exemplo é o setor de produção de biodiesel, onde os efluentes gerados são ricos em óleos e graxas. Buscar alternativas inovadoras de tratamento representa uma contribuição significativa para a sustentabilidade operacional e economica no setor de biocombustíveis. Neste contexto, o pré-tratamento de águas residuais ricas em gorduras por biorremediação utilizando biocatalisadores como lipases de natureza fúngica poderá ser uma alternativa promissora, pois a produção da enzima é de baixo custo e apresenta as vantagens de biodegradabilidade (white biotecnology) e pode se recuperada e utilizada em reciclos, reduzindo o custo operacional. O objetivo deste trabalho foi avaliar a biodegradação de óleos e graxas (O&G) em efluentes de água residuária de lavagem do biodiesel, por meio de lipase fúngica de Penicillium sumatrense obtida através do processo de FES (Fermentação em Estado Sólido). Os resultados indicaram que após a biorremediação houve uma redução em todos os parâmetros avaliados estando de acordo com a Resolução CONAMA 430/2011. O teor de óleos e graxas reduziu 86 %; a DQO 5,0 %; a DBO 7%; de sólidos totais (ST) 84,5 % e o pH manteve-se em 5,76. A razão de biodegradabilidade do efluente (DBO5/ DQO) calculada foi de 1,30. Esta razão indica que valores menores do que 0,6 estimam baixa biodegradabilidade do efluente, portanto, o valor obtido nesta pesquisa indica uma boa biodegrabilidade do efluente estudado. Diante dos resultados obtidos verificou-se um tratamento eficiente onde as águas residuárias da indústria de produção de biodiesel poderão ser utilizadas para fins de lançamento ou reuso no processo industrial minizando a geração de efluentes nas estações de tratamento.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T19:26:03Z No. of bitstreams: 1 Kelly Cristina N R Pedro.pdf: 5615395 bytes, checksum: 3a0655641aabdebfba0d443696aeb383 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kelly Cristina N R Pedro.pdf: 5615395 bytes, checksum: 3a0655641aabdebfba0d443696aeb383 (MD5) Previous issue date: 2018-08-24 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior In this work the immobilization of commercial lipases CALB, Palatase 20000 L and Lipolase 100L all from Novozymes Latin America Ltda., and the crude aqueous enzyme extract of Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 on micro- and mesoporous materials and their subsequent use in synthesis reactions of biodiesel. The effects of lipase source, temperature and enzymatic content were studied in the esterification reactions of oleic acid and transesterification of soybean oil with ethanol using the enzymatic preparations in their aqueous form. The highest conversions in the esterification of oleic acid with ethanol were 62.3% and 74.2% obtained at 30°C and employing 30% v.v-1 of CALB and Palatase 20000L, respectively. In the reactions of biodiesel synthesis from the transesterification of soybean oil with etanol the highest yield was 97.3% using 30°C and 10% v.v-1 of Lipolase 100L. In the immobilization of enzyme preparations the effects of the type of support, sodium phosphate buffer solution concentration, enzyme concentration and the type of reaction system were investigated. The highest immobilization efficiencies for CALB (91.4%), Lipolase 100L (99.9%) and the crude aqueous enzyme extract of Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 (62.9%) were obtained when the Siral 40 support was employed, while for Palatase 20000L, the best support was Siral 20 (97.6%). The use of the 100 mM phosphate buffer decreased the immobilization efficiency of the enzyme preparations. Regardless of the type of reactor employed, it was possible to obtain immobilization efficiencies above 40%. Heterogeneous biocatalystswere tested in the reaction of ethyl oleate synthesis and an increase in the thermal stability of the immobilized biocatalyst was observed relative to its aqueous form.For CALB immobilized in Siral 40, conversion of 61.7% was obtained at 60°C. CALB and Lipolase 100L immobilized on Siral 40 and Palatase 20000L immobilized on Siral 20 could be reused while maintaining about 30% of the initial conversion after 3 batchings. Heterogeneous biocatalysts showed no activity in the transesterification reaction of soybean oil. The use of Palatase 20000L in both its aqueous and immobilized form enabled conversions of about 80% to be achieved. Thus, this biocatalyst could be used for the removal of fatty acids in preliminary stages of suitability of the acidic raw material (acid oils) for synthesis of biodiesel. Neste trabalho foi avaliada a imobilização das lipases comerciais CALB, Palatase 20000L e Lipolase 100L, todas da Novozymes Latin America Ltda., e do extrato enzimático aquoso bruto de Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 em suportes micro- e mesoporosos e seu posterior emprego em reações de síntese de biodiesel. Os efeitos do tipo de lipase, temperatura e teor enzimático foram estudados nas reações de esterificação do ácido oleico e transesterificação do óleo de soja com etanol empregando as preparações enzimáticas em sua forma aquosa. As maiores conversões na esterificação do ácido oleico com o etanol foram 62,3% e 74,2% obtidas a 30°C e empregando 30% v.v-1 das lipases CALB e Palatase 20000L, respectivamente. Nas reações de síntese de biodiesel a partir da transesterificação do óleo de soja com etanol o maior rendimento alcançado foi de 97,3% empregando 30ºC e 10% v.v-1 de Lipolase 100L. Na imobilização das preparações enzimáticas foram investigados os efeitos do tipo de suporte, da concentração da solução tampão fosfato de sódio, da solução enzimática e do tipo de sistema reacional. As maiores eficiências de imobilização para as lipases CALB (91,4%), Lipolase 100L (99,9%) e o extrato enzimático aquoso bruto de Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 (62,9%) foram obtidas quando o suporte Siral 40 foi empregado, enquanto que para a Palatase 20000L, o melhor suporte foi a Siral 20 (97,6%). O emprego da solução tampão 100 mM reduziu a eficiência de imobilização das preparações enzimáticas. Independente do tipo de reator empregado foi possível obter eficiências de imobilização superiores a 40%. Os biocatalisadores heterogêneos foram testados na reação de síntese de oleato de etila e verificou-se um aumento da estabilidade térmica do biocatalisador imobilizado em relação à sua forma aquosa. Para a CALB imobilizada em Siral 40, uma conversão de 61,7% foi obtida a 60°C. CALB e Lipolase 100L imobilizadas em Siral 40 e Palatase 20000L imobilizada em Siral 20 puderam ser reutilizadas mantendo cerca de 30% da conversão inicial após 3 bateladas. Os biocatalisadores heterogêneos não mostraram atividade na reação de transesterificação do óleo de soja. O emprego da Palatase 20000L tanto na sua forma aquosa como imobilizada possibilitou que conversões de cerca de 80% fossem alcançadas. Deste modo, este biocatalisador poderia ser utilizado para remoção de ácidos graxos em etapas preliminares de adequação da matéria-prima ácida (óleos ácidos) para síntese de biodiesel.

Os microrganismos apresentam grande diversidade metabólica, sendo capazes de produzir diferentes metabólitos de interesse biotecnológico. Dentre tais compostos, podemos destacar as enzimas, as quais possuem grande versatilidade de aplicação em diversos setores industriais, como farmacêutico, ambiental, bioenergia, têxtil, cosmético e alimentício. O solo representa um ambiente ideal para bioprospecção de microrganismos produtores de enzimas devido à grande biodiversidade microbiana naturalmente existente. Esse trabalho descreve o isolamento de bactérias produtoras de celulases, amilases, xilanases ou lipases, a partir de amostras de solo coletadas em regiões de mata preservada no bioma Cerrado, em Uberaba, MG. A atividade enzimática foi confirmada em85 das 376 bactérias isoladas em meios contendo quatro diferentes substratos, carboximetilcelulose, amido, xilano e tween 80. Baseado na quantificação enzimática, cinco linhagens foram selecionadas como melhores produtores de celulases (AB-9 (5,0 U/mL), AB-1 (4,630 U/mL), MB-3 (4,236 U/mL), MP-7 (4,282 U/mL) e ME-2 (4,444 U/mL)), cinco de amilases (AP-14 (2,506 U/mL), AE-2 (2,452 U/mL), MB-1 (1,417 U/mL), MB-18 (2,443 U/mL) e MB-22 (1,816 U/mL)), cinco de xilanases (AP-6 (5,093 U/mL), MP-9 (5,028 U/mL), ME-1 (2,870 U/mL), ME-16 (2,986 U/mL) e ME-20 (4,630 U/mL)) e cinco de lipases (AB-2 (10,064 U/mL), AB-3 (9,722 U/mL), AP-4 (2,934 U/mL), MB-7 (2,387 U/mL) e MB-4 (3,140 U/mL)). De acordo com o sequenciamento parcial do gene 16S RNAr, dos 20 isolados selecionados como melhores produtores de enzimas, 19pertencem ao gênero Bacillus e um pertence ao gênero Lysinibacillus. Além disso, 10 espécies distintas foram identificadas, compreendendo B. siamensis, B. toyonensis, B. methylotrophicus, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B. drentensis, B. subtilis, B. velezensis, L. macroides e B. wiedmannii. A caracterização parcial das enzimas resultou em grande diversidade. Celulases de B. methylotrophicus MP-7 e B. methylotrophicusMB-3 apresentaram máxima atividade em pH neutro (7 e 8), enquanto o extrato obtido a partir deB. toyonensis MB-1 mostrou alta atividade amilolítica em pH neutros a básicos (6-10). Oisolado celulolítico B. siamensisAB-9e o amilolítico B. methylotrophicusAP-14, bem como os isolados xilanolíticos e lipolíticos produziram enzimas com máxima atividade em todos os pHsavaliados (2-12). Em relação à temperatura, B. drentensis ME-2 apresentou alta atividade celulolítica a 60 °C, mesma temperatura ótima para amilases de B. methylotrophicus AP-14, B. subtilis AE-2, B. toyonensis MB-18 e B. pseudomycoides MB-22.B. toyonensis MB-1 apresentou máxima atividade amilolítica entre 40-70 °C; e os demais isolados apresentaram atividade enzimática máxima em todas as temperaturas avaliadas (10-80 °C). Apenas as xilanases produzidas por B. toyonensis MP-9 foram induzidas na presença de Fe2+, sendo as demais atividades enzimáticas não influenciadas pela presença de íons metais. O Cerrado é um bioma que abriga grande diversidade microbiana e esse estudo foi o primeiro passo para a exploração do potencial enzimático de bactérias de solo do Cerrado brasileiro. The microorganisms show great metabolic diversity, being able to produce different metabolites of biotechnological interest. Among these compounds, we can highlight the enzymes, which have great versatility of application in various industrial sectors, such as pharmaceutical, environmental, bioenergy, textile, cosmetic and food. The soil represents an ideal environment for bioprospecting of enzyme-producing microorganisms due to the great microbial biodiversity naturally existent. This work describes the isolation of cellulase, amylase, xylanase or lipase producing bacteria from soil samples collected in regions of preserved forest in the Cerrado biome, in Uberaba, MG. The enzymatica activity was confirmed in 85 of the 376 bacteria isolated in agar media containing four different substrates, carboxymethylcellulose, starch, xylan and tween 80. Based on the enzymatic quantification, five strains were selected as the best producers of cellulases (AB-9 (5.0 U/mL), AB-1 (4.630 U/mL), MB-3 (4.236 U/mL), MP-7 (4.282 U/mL) and ME-2 (4.444 U/mL)), fiveof amylases (AP-14 (2.506 U/mL), AE-2 (2.452 U/mL), MB-1 (1.417 U/mL), MB-18 (2.443 U/mL) and MB-22 (1.816 U/mL)), fiveof xylanases (AP-6 (5.093 U/mL), MP-9 (5.028 U/mL), ME-1 (2.870 U/mL), ME-16 (2.986 U/mL) and ME-20 (4.630 U/mL)),andfiveof lipases (AB-2 (10.064 U/mL), AB-3 (9.722 U/mL), AP-4 (2.934 U/mL), MB-7 (2.387 U/mL) and MB-4 (3.140 U/mL)).According to the partial sequencing of the 16S rRNA gene, of the 20 isolates selected as the best producers of enzymes, 19belong to the genus Bacillus, and one belongs to the genus Lysinibacillus. In addition, 10 distinct species were identified, comprising B. siamensis, B. toyonensis, B. methylotrophicus, B. pseudomycoides, B. thuringiensis, B. drentensis, B. subtilis, B. velezensis, L. macroides and B. wiedmannii. The partial characterization of the enzymes resulted in great enzymatic diversity. Cellulases of B. methylotrophicus MP-7 and B. methylotrophicus MB-3 showed maximum activity at neutral pH (7 and 8), while B. toyonensis MB-1 showed high amylolytic activity at neutral to basic pH (6-10). The cellulolytic isolate B. siamensis AB-9 and amylolytic B. methylotrophicus AP-14, along with the other xylanolytic and lipolytic isolates produced enzymes with maximum activity over the entire pH range evaluated (2-12). Regarding the temperature, B. drentensis ME-2 showed high cellulolytic activity at 60 °C, the same optimum temperature for amylases of B. methylotrophicus AP-14, B. subtilis AE-2, B. toyonensis MB-18 and B. pseudomycoides MB-22. B. toyonensis MB-1 showed maximum amylolytic activity in the range of 40-70 °C; and the other isolates showed maximum enzymatic activity at all evaluated temperatures (10-80 °C). Only the xylanases produced by B. toyonensis MP-9 were induced in the presence of Fe2+, and the other enzymatic activitieswere not influenced by the presence of metal ions.The Cerrado is a reservoir of microbial diversity and this study was the first step for the exploration of the enzymatic potential of soil bacteria from Brazilian Cerrado. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The use of industrial palm oil processing residues as a source of carbon and inducer for microbial lipase production can be an attractive way to add value to these residues and help reduce the costs of their production. In addition, the immobilization of these enzymes on solid supports is a way of improving their operational stability and facilitating their recovery and reuse in the process. The characteristics of the carrier and the immobilization technique employed can modulate the catalytic properties of lipases, in some cases altering their regio- and/or stereospecificities. In this context, this work had two main objectives: (i) to investigate the viability of the use of industrial palm oil residues as raw material for the production of lipase in different culture systems; (ii) to evaluate the effect of immobilization support and post-immobilization modification techniques on the activity, stability and specificity of immobilized lipase. Regarding lipase production, after the preliminary screening of 18 fungi from the Embrapa collection, the Aspergillus niger C strain was selected to evaluate lipase production by solid state (SSF) and submerged (SF) fermentation. The lipolytic activities achieved by SSF and SF of A. niger C were 15.41 and 10.46 IU/mL, respectively. The lipase produced by A. niger C by SSF showed maximum lipolytic activity at pH between 4.0 and 6.5 and at temperature between 37 and 55°C. This enzyme presented good stability at 60°C (half-life around 12 h) and greater specificity towards long carbon chain substrates, especially palm and sunflower oils. As for the immobilization step, the immobilization of a commercial lipase of Thermomyces lanuginosus (LTL) on different hydrophobic commercial supports and post-immobilization modification (glycosylation, hydroxylation and PEGylation) was first evaluated in order to verify the effect of the support and the post-immobilization modification technique on lipase activity, stability and specificity. Immobilization of LTL in Purolite C18 (support containing octadecyl groups) under different experimental conditions allowed the preparation of immobilized derivatives with different regiospecificities and reaction rates. Immobilization at pH 8.5 and 30°C in the presence of CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) produced a derivative with perfect sn-1.3 regiospecificity. On the other hand, immobilization at pH 5.0 and 4°C in the absence of CTAB produced a nonspecific derivative which catalyzed the ethanolysis of acyl groups from the sunflower oil at sn-1 and sn-3 positions very quickly as well as at sn-2 position continuously. After the chemical modification of LTL adsorbed on Purolite C18 (Purolite-LTL) with PEG, the modified derivative showed high stability in an organic solvent free system (half-life of 6 days at 40ºC) and in hexane (100% activity after 20 days at 40°C). Subsequently, the immobilization of partially purified A. niger C lipase was evaluated on the supports Purolite C18 and octyl-silica (octyltriethoxysilane-modified silica). Immobilization yields were low (28-69%, in terms of activity), compared to those obtained with LTL immobilized on the same supports (approximately 100%). However, the derivative produced by the immobilization of A. niger C lipase on Purolite C18 (Purolite-LAN) showed similar performance to the Purolite-LTL derivative in the esterification of oleic acid with n-octanol, achieving oleic acid conversions of approximately 80% after 24 h of reaction. Therefore, this work stands out in an economic-environmental context, by the use of an agroindustrial residue of the processing of palm oil as a substrate for the production of an enzyme of great economic interest in different industrial sectors and by obtaining a competitive biocatalyst with a commercial lipase in important biotechnological applications. O uso de resíduos do processamento industrial de óleo de palma como fonte de carbono e indutor para produção de lipase microbiana pode ser uma forma atrativa de agregar valor a esses resíduos e contribuir para reduzir os custos de sua produção. Além disso, a imobilização dessas enzimas em suportes sólidos é uma forma de melhorar sua estabilidade operacional e facilitar a sua recuperação e reutilização no processo. Adicionalmente, as características do suporte e a técnica de imobilização empregada podem modular as propriedades catalíticas das lipases, alterando em alguns casos suas régio- e/ou estereoespecificidades. Neste contexto, este trabalho teve dois objetivos centrais, a saber: (i) investigar a viabilidade do uso de resíduos industriais de óleo de palma como matéria-prima para a produção de lipase em diferentes sistemas de cultivo; (ii) avaliar o efeito do suporte de imobilização e de técnicas de modificação pós-imobilização sobre a atividade, estabilidade e especificidade da lipase imobilizada. Quanto à produção de lipases, após etapa preliminar de triagem de 18 fungos da coleção da Embrapa, selecionou-se a linhagem de Aspergillus niger C para se avaliar a produção de lipase por fermentação em estado sólido (FES) e submersa (FSm). As atividades lipolíticas alcançadas por FES e FSm de A. nicer C foram de 15,41 e 10,46 UI/mL, respectivamente. A lipase bruta produzida por A. niger C por FES apresentou atividade lipolítica máxima em pH entre 4,0 e 6,5 e em temperatura entre 37 e 55ºC. Essa enzima apresentou boa estabilidade a 60°C (meia-vida em torno de 12 h) e maior especificidade na hidrólise substratos de cadeia carbônica longa, destacando-se óleo de palma e girassol. Quanto à etapa de imobilização, primeiramente avaliou-se a imobilização de uma lipase comercial de Thermomyces lanuginosus (LTL) em diferentes suportes comerciais hidrofóbicos e modificação pós-imobilização (glicosilação, hidroxilação e PEGuilação) a fim de se verificar o efeito do suporte e da técnica de modificação pós-imobilização sobre a atividade, estabilidade e especificada da lipase. A imobilização de LTL em Purolite C18 (suporte contendo grupos octadecil) em diferentes condições experimentais permitiu a preparação de derivados imobilizados com diferentes regioespecificidades e taxas de reação. A imobilização a pH 8,5 e 30°C na presença de CTAB (brometo de cetiltrimetilamónio) produziu um derivado com regioespecificidade sn-1,3 perfeita. Por outro lado, a imobilização em pH 5,0 e 4°C na ausência de CTAB produziu um derivado não específico, catalisando a etanólise de grupos acil do óleo de girassol rico em ácido oleico das posições sn-1 e sn-3 de forma muito rápida e também continuamente da posição sn-2. Após a modificação química da LTL adsorvida em Purolite C18 (Purolite-LTL) com PEG, o derivado modificado apresentou alta estabilidade em sistema livre de solvente orgânico (meia-vida de 6 dias a 40ºC) e em hexano (100% de atividade após 20 dias a 40ºC). Posteriormente, avaliou-se a imobilização da lipase de A. niger C parcialmente purificada nos suportes Purolite C18 e octil-silica (silica modificada com octiltrietoxisilano). Os rendimentos de imobilização foram baixos (28 a 69%, em termos de atividade), comparados aos obtidos com a imobilização de LTL nos mesmos suportes (aproximadamente 100%). Entretanto, o derivado produzido pela imobilização da lipase de A. niger C em Purolite C18 (Purolite-LAN) apresentou desempenho similar ao derivado Purolite-LTL na esterificação de ácido oleico com n-octanol, atingindo conversões de ácido oleico de aproximadamente 80% após 24 h de reação. Destaca-se, portanto, a contribuição deste trabalho em um contexto econômico-ambiental, pelo aproveitamento de um resíduo agroindustrial do processamento do óleo de dendê como substrato para a produção de uma enzima de grande interesse econômico em diferentes setores industriais e pela obtenção de um biocatalisador imobilizado competitivo com uma lipase comercial em aplicações importantes de base biotecnológica. FAPESP: 2013/20826-0 FAPESP: 2015/10530-2 FAPESP: 2016/10636-8

Estudos vem mostrando resultados promissores na utilização da tecnologia de ultrassom para a produção enzimática de biodiesel. Estes são atribuídos ao fenômeno de cavitação gerado pelo equipamento de ultrassom, o qual promove um aumento da miscibilidade entre os reagentes, melhorando a transferência de massa e a taxa da reação, proporcionando reações mais rápidas, bem como um menor consumo de reagentes. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi otimizar as condições da reação de transesterificação do óleo de soja para a produção de biodiesel, utilizando o conceito de combi-lipase em um reator enzimático assistido por ultrassom. Foram otimizadas as condições do sistema de ultrassom: amplitude (30-70 %), pulso (30-70 %) e tempo de pulso (5-15 s), através de um delineamento composto central rotacional (DCCR). Os parâmetros reacionais: concentração de biocatalisador (5, 15 e 25 % em relação a massa de óleo) e razão molar do substrato (3:1, 6:1 e 9:1) foram estudados, assim como a influência do uso do solvente terc-butanol e de um sistema de agitação combinado ao ultrassom, na conversão de ésteres etílicos. Avaliou-se também a eficiência do combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM) frente ao uso dos biocatalisadores individualmente. Obteve-se como condições ótimas para o sistema de ultrassom: 30 % de amplitude, 50 % de pulso e 15 s de tempo de pulso, 15 % de enzima em relação a massa de óleo e uma razão molar de 3:1 etanol:óleo de soja Os rendimentos de conversão de ésteres etílicos na ausência do solvente terc-butanol foram similares aos resultados obtidos na presença deste reagente, sugerindo que a tecnologia de ultrassom é capaz de eliminar a necessidade do uso de solventes em reações de transesterificação enzimática. Entretanto, o uso combinado de um sistema de agitação com o ultrassom, reduziu o rendimento da reação. Em relação às enzimas, o combi-lipase mostrou melhores resultados para a síntese enzimática de ésteres etílicos, do que o uso das enzimas individualmente. Utilizando as condições ótimas avaliadas neste estudo e o conceito de combi-lipase em um reator assistido por ultrassom, obteve-se uma conversão de ésteres etílicos de aproximadamente 75 % em 5 horas de reação. Studies have been showing promising results for the use of ultrasonic technology in enzymatic production of biodiesel, which are attributed to the cavitation phenomenon generated by the ultrasound equipment, that promotes increased miscibility between the reactants, improving mass transfer and reaction rate, providing faster reactions as well as a lower consumption of reagents. The aim of this work was to optimize ultrasonic (amplitude, pulse and time pulse) and reaction (molar ratio and enzyme concentration) parameters, as well as the influence of solvent (tert-butanol) and ultrasound combined with mechanical stirring, on the transesterification of soybean oil catalyzed by combi-lipase biocatalyst. It was also evaluated the efficiency of the combi-lipase (75 % Novozym 435 + 10 % Lipozyme TL-IM and 15 % Lipozyme RM-IM), compared to individual lipases. The optimum conditions for transesterification reaction, were observed being: enzyme concentration, 15 % (by oil mass); ethanol:oil molar ratio, 3:1; ultrasonic amplitude 30 %, pulse, 30 % and time pulse, 15 s. The yields of conversion of ethyl esters with and without solvent were very similar, indicating that ultrasonic technology is able to supply the need of solvents in enzymatic transesterification reactions. The combined use of a mechanical stirring system with ultrasound, reduced the yields of conversion of this reaction, while the combi-lipase showed better results than the use of individual lipases for soybean oil transesterification. Using the optimum conditions evaluated in this study and the concept of combi-lipase in an ultrasonic-assisted batch reactor, led to conversions of ethyl esters of about 75% in 5 hours.

PINTO, Francisca Tatiana Regis. Obtenção de álcoois e ésteres quirais utilizando lipases e resolução cinética enzimática da ketamina e análogos. 2018. 127 f. Dissertação (Mestrado em Química)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza,2018. In this work the enantiomerically pure compounds were obtained using lipases. Chapter 1 was dedicated to the study of obtaining chiral alcohols and esters from acetophenones and derivates using the commercial CAL-B for comparison with the recombinant enzyme of Bacillus coagulans. For this, the esters rac-3a-k were initially hydrolyzed with CAL-B, presenting good results of ees (>99%), eep (>99%), C (50%) e E (>200), With the exception ofrac-3k (2,5dimethylphenyl) ethyl acetate, which showed low conversion values and e.e.s. The reaction with the recombinant carboxylesterase was done only with the substrate rac-3a used as model, however it did not present activity. While attempting to optimize expression conditions and enzymatic activity, the study of kinetic resolution via acetylation using Pseudomonas fluorescens lipase in its forms: free, commercially immobilized and immobilized on magnetic nanoparticles using the substrates rac-2a, rac-2b and rac-2f. The results showed that the kinetic resolution for these substrates catalyzed by P. fluorescens immobilized on magnetic nanoparticles was highly enantioselective with E> 200 values. In Chapter 2, the enzymatic kinetic resolution of ketamine and the analogue was studied using different commercial lipases. At first, enzymatic kinetic resolution of ketamine was achieved by hydrolysis using the carbamate of ketamine rac-5 with 8 commercial lipases, and no activity was observed in any of the enzymes studied. Subsequently, enzymatic kinetic resolution of ketamine via carbonation was performed using the CAL-B and TLL enzymes, which also did not present satisfactory results. Finally, enzymatic kinetic resolution was performed via hydrolysis of a ketamine analog rac-8. The results obtained for this reaction were also not satisfactory, and no reports were found in the literature for the synthesis or enzymatic kinetic resolution of this compound. The negative results may be related to the steric hindrance that the Cl atom and the benzene ring can generate, making it difficult to fit the enzyme-substrate and consequently preventing the reaction. Este trabalho de mestrado estudou a obtenção de compostos enantiomericamente puros utilizando lipases. O capítulo 1 foi dedicado ao estudo da obtenção de álcoois e ésteres quirais a partir de acetofenonas e derivados utilizando a enzima comercial CAL-B para comparação com a enzima recombinante de Bacillus coagulans. Para tanto, os ésteres rac-3a-k foram inicialmente hidrolisados com a CAL-B, apresentando bons resultados de ees (>99%), eep (>99%), C (50%) e E (>200), Com exceção do rac-3k acetato de(2,5-dimetilfenil)etila, que apresentou baixos valores de conversão e e.e.s. A reação com a carboxilesterase recombinante foi feita apenas com o substrato rac-3a usado como modelo, contudo a enzima não apresentou atividade. Enquanto tentava-se otimizar as condições de expressão e atividade enzimática, foi dado início ao estudo de resolução cinética via acetilação utilizando a lipase de Pseudomonas fluorescens em suas formas: livre, imobilizada comercialmente e imobilizada em nanopartículas magnéticas utilizando os substratos rac-2a, rac-2b e rac-2f. Os resultados mostraram que a resolução cinética para esses substratos, catalisada por P. fluorescens imobilizada em nanopartículas magnéticas foi altamente enantiosseletiva com valores de E> 200. No capítulo 2, estudou-se a resolução cinética enzimática da ketamina e análogos utilizando diferentes lipases comerciais. A princípio foi realizada a resolução cinética enzimática da ketamina via hidrólise utilizando o carbamato de ketamina rac-5 com 8 lipases comerciais, não sendo observada atividade em nenhumas das enzimas estudadas. Posteriormente, foi realizada a resolução cinética enzimática da ketamina via carbonatação, utilizando as enzimas CAL-B e TLL que também não apresentaram resultados satisfatórios. Por fim, foi efetuada a resolução cinética enzimática via hidrólise de um análogo da ketamina rac8. Os resultados obtidos pra essa reação também não foram satisfatórios, não sendo encontrados relatos na literatura para síntese ou resolução cinética enzimática desses compostos. Os resultados negativos podem estar relacionados ao impedimento estérico que que o átomo de Cl e o anel benzênico podem gerar, dificultando o encaixe da enzima-substrato e consequentemente impedindo a reação.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T19:26:17Z No. of bitstreams: 1 Sabrina Spagnolo Pedro da Silva.pdf: 2425238 bytes, checksum: ad372aed4d1d1bee4b25ff814c883b23 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T19:26:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabrina Spagnolo Pedro da Silva.pdf: 2425238 bytes, checksum: ad372aed4d1d1bee4b25ff814c883b23 (MD5) Previous issue date: 2017-08-31 The growing increase in the automotive fleet around the world leads to an increase demand of lubricants. Esters from dicarboxylic acids, such as adipic acid, are considered an alternative to mineral lubricants since they can attend all the challenges imposed by the new machines, both technically and environmentally. The aim of this work was to study enzymatic synthesis of dioctyl adipate by esterification and transesterification reactions using lipase as biocatalyst and verify the physico-chemical properties of a lubricant for diesel engines formulated with the synthetized dioctyl adipate. The effects of molar ratio of reactants, concentration of commercial immobilized lipase Novozym 435, and reaction temperature were studied in the conversion and synthesis of dioctyl adipate.It was also studied the removal of water and ethanol, in esterification and transesterification reactions, respectively, as well as the comparison between the chemist catalyst (such as sulfuric acid) and enzymatic catalyst. Adipic acid conversion of 100% and dioctyl adipate molar fractionof0,99 were obtained with the reaction between adipic acid and octanolat 100ºC, using 7 wt.% of Novozym 435 and adipic acid/octanol molar ratio of 1:5 with water removal by free evaporation.Similar results were found in the transesterification reactions between diethyl adipate and octanol (conversion of 100% and molar fraction of dioctyl adipate of 0,92). Chemist catalyst showed similar results to enzymatic catalysis, but reaction took less time. The dioctyl adipate synthetized by both reactions (esterification and transesterification) showed good results for all physico-chemical tests performed. It also showed great results when used in the formulation of lubricant for heavy duty motor oil, when it was added in 2% v/v. O constante aumento na frota automotiva ao redor do mundo vem levando ao aumento da demanda de lubrificantes. Ésteres de ácidos dicarboxílicos, como o ácido adípico, são uma alternativa aos lubrificantes de base mineral e satisfazem os desafios impostos pelos motores e máquina modernas, tanto na questão técnica quanto na ambiental. O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade da síntese enzimática do adipato de dioctila através das reações de esterificação e transesterificação utilizando lipase e verificar as propriedades de um lubrificante para motores diesel formulado com o adipato de dioctila sintetizado. Os efeitos da razão molar dos reagentes, concentração de lipase comercial Novozym 435 e temperatura, na conversão e na síntese de adipato de dioctila foram investigados. Também foi estudada a remoção de água nas reações de esterificação e a remoção de etanol na reação de transesterificação (ambas por livre evaporação e vácuo), bem como a comparação da catálise química (ácido sulfúrico) com a enzimática na reação de esterificação. Conversão de ácido adípico de 100% e fração molar de adipato de dioctila de 0,99 foram obtidas na reação entre o ácido adípico e octanol a 100°C, com 7 % m/m de Novozym 435 e razão molar ácido:álcool de 1:5, com remoção de água por livre evaporação. Resultados similares foram obtidos na transesterificação do adipato de dietila com octanol (conversão de 100% e fração molar de adipato de dioctila de 0,92).A catálise química mostrou resultados semelhantes à biocatálise, porém em menor tempo. O produto obtido em ambas as reações (esterificação e transesterificação) mostrou resultados satisfatórios para os ensaios físico-químicos realizados, além de apresentar ótimos resultados quando aplicado na formulação de lubrificante para motor diesel numa proporção de 2% v/v

Submitted by CLARISSA HAMAIO OKINO DELGADO null (clarissaokino@gmail.com) on 2017-08-24T17:43:35Z No. of bitstreams: 1 Tese_Clarissa_Hamaio_Okino_Delgado_versãofinal.pdf: 3029148 bytes, checksum: f9cb4b92d736943a18259dccc33472b4 (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T14:33:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RESSALVA.pdf: 28679 bytes, checksum: 26976e0ee7743a814a5f4590b6dff892 (MD5) Made available in DSpace on 2017-08-29T14:33:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RESSALVA.pdf: 28679 bytes, checksum: 26976e0ee7743a814a5f4590b6dff892 (MD5) Previous issue date: 2017-06-23 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O processamento agroindustrial brasileiro tem buscado converter cada vez mais seus resíduos em subprodutos. Neste contexto, o processamento de frutas se destaca devido à riqueza de composição das partes inicialmente consideradas resíduos, que podem incluir biomoléculas de elevado valor como enzimas e compostos bioativos. Dentre as enzimas estão as lipases que catalisam reações de hidrólise e síntese de glicerídeos e que possuem expectativas de crescimento de mercado promissoras devido à atual demanda por biocombustíveis e biorremediação. Nesse contexto, o presente trabalho avaliou os resíduos do processamento de laranja para suco e verificou que esses podem ser utilizados como fontes diretas de lipases. As lipases de laranja possuem elevada atividade em reações de hidrólise e síntese, em faixa de pH ácida a alcalina (6,0 a 8,0), termoestabilidade até 50°C e afinidade por substratos de diferentes tamanhos de cadeia (p-nPP, p-NPL e PNPB); podem ser concentradas por precipitação com sulfato de amônio e imobilizadas por adsorção; apresentam efeito sinérgico com lipases fúngicas e potencial para aplicação na biorremediação de resíduos de óleo de cozinha. Os resultados obtidos estão apresentados em 5 capítulos, sendo que o primeiro é composto pela revisão bibliográfica sobre o potencial dos resíduos gerados no processamento de frutas brasileiras como fontes de lipases e a inclusão desse processo no conceito de biorrefinarias; o segundo descreve a obtenção e caracterização bioquímica de lipases obtidas de resíduos de laranja de diferentes variedades; o capítulo 3 apresenta a otimização da atividade dessas lipases por imobilização e sinergismo com lipases fúngicas; no capítulo 4 consta a avaliação das lipases de laranja na biorremediação de óleo de cozinha; e o capítulo 5 descreve o estudo sobre a viabilidade financeira e bioquímica da produção de biodiesel por catálise química e enzimática a partir de diferentes óleos vegetais. Brazilian agroindustrial processing has sought the maximum conversion of waste into byproducts. In this context, the fruit processing stands out due to the rich composition of the parts initially considered as residues, which may include high value biomolecules such as enzymes and bioactive compounds. Among the enzymes are lipases that catalyze reactions of hydrolysis and synthesis of glycerides and which have promising market growth expectations due to the current demand for biofuels and bioremediation. In this context, the present work evaluated the wastes from processing from orange to juice and found that these can be used as direct sources of lipases. Orange lipases have high activity in hydrolysis and synthesis reactions, ranging from acid to alkaline pH (6.0 to 8.0), thermostability up to 50 ° C and affinity for substrates of different chain sizes (p-nPP, P-NPL and PNPB); this can be concentrated by ammonium sulfate precipitation and immobilized by adsorption; and have a synergistic effect with fungal lipases and potential for application in bioremediation of cooking oil residues. The results obtained are presented in five chapters. The first one consists of the bibliographical review on the potential of the residues generated in the processing of Brazilian fruits as sources of lipases and the inclusion of this process in the concept of biorefineries; The second describes the obtaining and biochemical characterization of lipases obtained from orange residues of different varieties; Chapter 3 presents the optimization of the activity of these lipases by immobilization and synergism with fungal lipases; Chapter 4 includes the evaluation of orange lipases in bioremediation of cooking oil; And chapter 5 describes the study on the financial and biochemical viability of biodiesel production by chemical and enzymatic catalysis from different plant oils. FAPESP: 2014/10962-7 FAPESP: 2015/01753-8

Ten species of Penicillium genus isolated from different habitats were evaluated as mycelium bound lipase producers to be used in the hydrolysis of vegetable oils. Using olive oil as an inducer three species (P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 and P. purpurogenum AT2008) were able to produce lipases having high mycelium bound activities (>150 U g-1) and were further characterized in relation to their biochemical and kinetic properties and specificity using vegetable oils having majority fatty acids composition in C12:0 (coconut); C16:0 (palm); C18:1 (canola) and C18:1 (soybean). All the three lipases could enrich the medium with fatty acids according to their respective selectivity and the reaction hydrolysis was found to enhance at least three folds under ultrasonic irradiations. For P. purpurogenum lipase the highest hydrolysis degree (66.8 ± 0.2%) was attained with coconut oil. Both P. italicum and P. janthinellum lipases showed high selectivity for canola oil, resulting in hydrolysis degrees of 79.9 ± 0.5% and 63.5 ± 0.6%, respectively. Analysis of the hydrolysates confirmed that the majority of the fatty acids released by P. italicum and P. janthinellum lipases was composed by oleic acid, and P. purpurogenum lipase the hydrolysate contained approximately 50% of lauric acid.

Ten species of Penicillium genus isolated from different habitats were evaluated as mycelium bound lipase producers to be used in the hydrolysis of vegetable oils. Using olive oil as an inducer three species (P. italicum AT4421, P. janthinellum CCT3162 and P. purpurogenum AT2008) were able to produce lipases having high mycelium bound activities (>150 U g-1) and were further characterized in relation to their biochemical and kinetic properties and specificity using vegetable oils having majority fatty acids composition in C12:0 (coconut); C16:0 (palm); C18:1 (canola) and C18:1 (soybean). All the three lipases could enrich the medium with fatty acids according to their respective selectivity and the reaction hydrolysis was found to enhance at least three folds under ultrasonic irradiations. For P. purpurogenum lipase the highest hydrolysis degree (66.8 ± 0.2%) was attained with coconut oil. Both P. italicum and P. janthinellum lipases showed high selectivity for canola oil, resulting in hydrolysis degrees of 79.9 ± 0.5% and 63.5 ± 0.6%, respectively. Analysis of the hydrolysates confirmed that the majority of the fatty acids released by P. italicum and P. janthinellum lipases was composed by oleic acid, and P. purpurogenum lipase the hydrolysate contained approximately 50% of lauric acid.

Submitted by Milene Stefani Pereira null (ms.pereira03@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-04-10T20:44:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_MileneSPereira.docx: 1349382 bytes, checksum: ad79bbb00d40fb2db690c23afbcb8cb0 (MD5) Rejected by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-13T13:34:25Z (GMT) Submitted by Milene Stefani Pereira null (ms.pereira03@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-04-13T13:52:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_MileneSPereira.pdf: 1714327 bytes, checksum: 67fc61ca4a2c1848a4e2cc88254c759f (MD5) Rejected by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido está sem a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-13T14:19:50Z (GMT) Submitted by Milene Stefani Pereira null (ms.pereira03@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-04-17T19:40:12Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_MileneStefaniPereira.pdf: 1752328 bytes, checksum: 43376866587e309670554758204c2cee (MD5) Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão do trabalho submetida ao Repositório Institucional UNESP deve conter o texto completo. A equipe do Repositório se encarregará de disponibilizar apenas o conteúdo parcial que segundo a Portaria UNESP 396 de 10 de setembro de 2015 consiste em: Artigo 3º V - conteúdo parcial: as páginas pré-textuais (a folha de rosto, a dedicatória, os agradecimentos, a epígrafe, o resumo na língua vernácula, o resumo em língua estrangeira, as listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e o sumário), a introdução, a conclusão ou as considerações finais e as referências do trabalho. Lembrando que: é necessário informar no formulário de submissão que a versão do trabalho a ser disponibilizada deve ser a parcial e indicar em quanto tempo a versão integral deverá ser disponibilizada, ao atingir a data limite o sistema automaticamente disponibilizará a versão completa do trabalho. Caso necessite prorrogar o prazo para disponibilização do texto completo, de acordo com o artigo 6º da Portaria UNESP 396: A data para a disponibilização do conteúdo integral poderá ser prorrogada por até mais 2 (dois) anos mediante a apresentação, via ofício, de justificativa pelo Autor ao programa de pós-graduação com no mínimo 90 (noventa) dias de antecedência à data informada para a disponibilização do conteúdo integral. Agradecemos a compreensão. on 2017-04-17T19:44:47Z (GMT) Submitted by Milene Stefani Pereira null (ms.pereira03@aluno.ibb.unesp.br) on 2017-04-18T14:27:14Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_MileneStefaniPereira.pdf: 1752328 bytes, checksum: 43376866587e309670554758204c2cee (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-18T14:38:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pereira_ms_me_araiq_par.pdf: 998576 bytes, checksum: 4e5a8af8a359da0607d999157f47664a (MD5) Made available in DSpace on 2017-04-18T14:38:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pereira_ms_me_araiq_par.pdf: 998576 bytes, checksum: 4e5a8af8a359da0607d999157f47664a (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Os resíduos agroindustriais são o destaque deste trabalho. Resíduos de laranja, uma cultura de extrema importância no Brasil, foram utilizados devido ao seu descarte abundante e pelo potencial em conter diversas moléculas de interesse biotecnológico. O objetivo foi avaliar os descartes do processamento de suco de laranja das principais variedades comerciais Hamlin, Pêra, Valência e Natal quanto à presença de enzimas e compostos bioativos. As lipases se mostraram presentes em todas as variedades de laranjas estudadas. Nas variedades Hamlin, Valência e Natal é a primeira vez que lipases são documentadas. As lipases do bagaço e polpa de Hamlin apresentaram 27,45 U/g e 31,13 U/g de atividade lipolítica, respectivamente. As proteases não foram encontradas a partir dos métodos utilizados, deixando em aberto a possibilidade de testar novas metodologias, como critério de caracterização e contribuição literária. O perfil químico dos compostos fenólicos existentes nos resíduos de laranja foi determinado e apresentou cerca de 80% de flavanonas no geral. Além disso, foi detectado alto teor de hesperidina (em mg/100 g) nos resíduos da variedade Pêra (3294,6); Hamlin (2903,2); Natal (2885,9) e Valência (2880,2). Atividades biológicas como antioxidante, antimicrobiana e sobre a viabilidade celular também foram abordadas, sendo que os resíduos apresentaram capacidade de redução do radical DPPH em torno de 70%. No entanto, não apresentaram potencial antimicrobiano frente às bactérias e fungos testados. Nos testes de viabilidade celular alguns resíduos demonstraram citotoxidade para uma linhagem celular cancerígena bucal, outros exibiram efetividade no estímulo do crescimento de fibroblastos. Esse estudo aponta um direcionamento para os resíduos da cadeia de produção do suco de laranja identificando e caracterizando moléculas, substâncias e compostos valiosos, passíveis de recuperação e aplicação. The agroindustrial residues are the highlight of this work. Orange residues, a crop of extreme importance in Brazil, were used due to their abundant disposal and the potential to contain several molecules of biotechnological interest. The objective was to evaluate the discards of the orange juice processing of the main commercial varieties Hamlin, Pera, Valencia and Natal for the presence of enzymes and bioactive compounds. Lipases were present in all varieties of oranges studied. In the Hamlin, Valencia and Natal varieties is the first time lipases are documented. The lipases of Hamlin bagasse and pulp presented 27,45 U / g and 31,13 U / g of lipolytic activity, respectively. The proteases were not found from the methods used, leaving open the possibility of testing new methodologies as a criterion of characterization and literary contribution. The chemical profile of the phenolic compounds in orange residues was determined and showed about 80% of flavanones in general. In addition, high content of hesperidin (in mg / 100 g) was detected in the residues of the Pera variety (3294,6); Hamlin (2903,2); Natal (2885,9) and Valencia (2880,2). Biological activities such as antioxidant, antimicrobial and cell viability were also addressed and the residues presented a DPPH radical reduction capacity of around 70%. However, they not showed antimicrobial potential against the bacteria and fungi tested. In the cell viability tests some residues demonstrated cytotoxicity for an oral cancer cell line, others exhibited effectiveness in stimulating the growth of fibroblasts. This study indicates a direction for the residues of the orange juice production chain identifying and characterizing molecules, substances and valuable compounds that can be recovered and applied.

FONSECA, Thiago de Sousa. Sínteses quimioenzimáticas dos fármacos (R)-luliconazol, (R)-clorprenalina e análogos e síntese química de substâncias imidazólicas. 2017. 210 f. Tese (Doutorado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. The preparation of the antifungal (R)-luliconazole (R-1) and β-agonist (R)-cloroprenaline (R-12 a) drugs and analogues (R-12 b-j) had as key step the preparation of β-halohydrins and β-haloacetates chiral, via kinetic resolution of the corresponding racemic acetates, mediated by lipase. The rac-2-chloro-1-(2,4-dichlorophenyl)ethyl acetate, rac-4 or rac-11 b was used as the "template" substrate to establish the ideal conditions for kinetic resolution via hydrolysis. Through the screening of commercial lipases, were selected the C. antarctica type B, CAL-B, immobilized on acrylic resin (Novozym 435®) and T. lanuginosus (TLL) immobilized on immobead-150, leading to the c values of 50%, e.e.s e e.e.p >92% and E of 185 and 128, respectively. Were evaluated: reaction time, temperature, enzyme/substrate ratio, pH, absence or presence of cosolvents and enzyme reuse. CAL-B was more efficient than TLL, requiring a lower enzyme/substrate ratio (0.5:1) and presenting high activity and selectivity in up to 5 cycles reactions. The best conditions for the resolution of rac-4 were the use of PO43- buffer (pH 7) in the absence of cosolvents, 15 min reaction at 45 °C, leading to c = 50%, e.e.s e e.e.p >99% and E >200. These conditions were used to resolve acetate rac-11 a, which leads to the intermediate in the synthesis of (R)-12 a as well β-haloacetates rac-11 b-j, leading to the analogous (R)-12 b-j. Adjustments in the reaction times were performed (4 h - 9 d) so that the values of c close to 50%. The esters rac-11 a-j were resolved with c ≈ 50%, values of e.e.s and e.e.p = 92 - >99% and E >200. The influence of the esters’ substituents in the time of the kinetic resolution was analyzed considering the steric and electronic effects and evoking the fitting model induced substrate-enzyme with the presence of the hydrophobic pockets. Finally, starting from (S)-2-chloro-1- (2,4-dichlorophenyl)ethanol, (S)-3, (R)-1 was obtained in 43% yield. In order to achieve an atomic economy, we converted the (S)-halohydrins (S)-10 a-j into the respective (R)-acetates (R)-11 a-j via the Mitsunobu reaction, yields ranging from 78-89%. (R)-11 a-j were transformed into the (R)-epoxides (R)-34 a-f; h-j in yields from 68-75% and (R)-11 g was transformed into (R)-halohydrin (R)-10 g in 60% yield. Subsequently, (R)-34 a-f; h-j and (R)-10 g reacted with isopropilamine, yielding (R)-12 a in 71% yield and the analogs (R)-12 b-j in yields 71-80%. Lastly, four imidazole derivatives with yields 72-90% were synthesized, and 1-phenacylimidazole (13) showed antifungal activity against phytopathogenic fungus Fusaruim sacchari, besides the anticorrosive activity for carbon steel. A preparação dos fármacos antifúngico (R)-luliconazol (R-1) e do β-agonista (R)-clorprenalina (R-12 a) e análogos (R-12 b-j) tiveram como etapa chave a obtenção de β-haloidrinas e β-haloacetatos quirais, via resolução cinética dos correspondentes acetatos racêmicos, mediada por lipase. O rac-acetato de 2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)etila, rac-4 ou rac-11 b, foi utilizado como substrato “modelo” para estabelecer as condições ideais para a resolução cinética, via hidrólise. Através da triagem de lipases comerciais, foram selecionadas a C. antarctica do tipo B, CAL-B, imobilizada em resina acrílica (Novozym 435®) e a T. lanuginosus imobilizada em immobead-150 (TLL), as quais levaram a valores de c = 50%, e.e.s e e.e.p >92% e E = 185 e 128, respectivamente. Foram avaliados: tempo reacional, temperatura, razão enzima/substrato, pH, ausência ou presença de cossolventes e reuso das enzimas. A CAL-B foi mais eficiente que a TLL, requerendo uma menor razão enzima/substrato (0,5:1) e apresentando alta atividade e seletividade em até 5 ciclos reacionais. As melhores condições para a resolução de rac-4 foi em tampão PO43- (pH 7) sem cossolventes, 15 min de reação a 45 °C, levando a c = 50%, e.e.s e e.e.p >99% e E >200. Tais condições foram utilizadas para resolver o acetato rac-11 a que leva ao intermediário na síntese da (R)-12 a, bem como dos β-haloacetatos rac-11 b-j, que levam aos análogos (R)-12 b-j. Ajustes nos tempos reacionais foram realizados (4 h - 9 d) para que os valores de c fossem ≈ 50%. Os ésteres rac-11 a-j foram resolvidos com c ≈ 50%, valores de e.e.s e e.e.p = 92 - >99% e E >200. A influência dos substituintes dos referidos ésteres no tempo da resolução cinética foi analisada considerando os efeitos estérico e eletrônico e evocando o modelo do encaixe induzido substrato-enzima com a presença dos bolsões hidrofóbicos. Finalmente, partindo do (S)-2-cloro-1-(2,4-diclorofenil)etanol, (S)-3, foi possível obter o (R)-1 com 43% de rendimento. Objetivando uma economia atômica, convertemos as (S)-haloidrinas (S)-10 a-j nos respectivos (R)-acetatos (R)-11 a-j, via reação de Mitsunobu, com rendimentos de 78-89%. (R)-11 a-f; h-j foram transformados nos (R)-epóxidos (R)-34 a-f; h-j com rendimentos de 68-75% e o (R)-11 g foi transformado na (R)-haloidrina (R)-10 g com 60% de rendimento. Subsequentemente, (R)-34 a-f; h-j e (R)-10 g reagiram com isopropilamina, levando a (R)-12 a com rendimento de 78% e análogos (R)-12 b-j com rendimentos de 71-80%. Por último, foram sintetizados quatro derivados imidazólicos com rendimentos de 72-90%, sendo que o 1-fenacilimidazol (13) apresentou atividade antifúngica frente ao fungo fitopatogênico Fusaruim sacchari, além da atividade anticorrosiva para o aço carbono.

O Cerrado é o segundo maior bioma da América do Sul, abrigando 11.627 espécies de plantas nativas já catalogadas. A grande demanda industrial por novas fontes de lipases com diferentes características tem estimulado a procura de novas cepas de micro-organismos lipolíticos. O presente estudo objetiva otimizar a produção de lipases em cultivo submerso por leveduras pouco estudadas. Foi utilizado um delineamento Plackett-Burman para avaliar o efeito de dez variáveis (pH, agitação, sulfato de amônio, peptona, triton X-100, Tween 20, azeite de oliva, extrato de levedura, sulfato de magnésio e fosfato monopotássico) na produção de lipases por duas linhagens de leveduras, considerando o nível de significância p < 0,1. Para a produção de lípase pela linhagem TAQ 616 a variável significativa foi a concentração de azeite de oliva e para biomassa foram as concentrações de azeite de oliva, triton X-100 e KH2PO4. A atividade enzimática da linhagem ABRT 461 sofreu a influência das variáveis pH, agitação e concentração de (NH4)2SO4, e para a produção de biomassa nenhuma das variáveis foi estatísticamente significativa. A linhagem ABRT 461 foi escolhida para realização de um planejamento de Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 2³. As condições ótimas de atividade enzimática geradas pelo modelo proposto foram de 114 rpm, pH 5,0 e 25 g.L-1 de concentração de (NH4)2SO4. A atividade enzimática de 84,4 U.mL-1 foi obtida após o cultivo da linhagem ABRT 461 durante 72 horas nas condições ótimas estimadas pelo modelo. The Cerrado is the second largest biome in South America, housing 11.627 native plant species already cataloged. The great industrial demand for new sources of lipases with different characteristics has stimulated the search for new strains of lipolytic microorganisms. The purpose of this study is to optimize the lipase production in submerged culture for little studied yeast. A Plackett-Burman design was used to evaluate the effect of ten variables (pH, agitation, ammonium sulfate, peptone, Triton X-100, Tween 20, olive oil, yeast extract, magnesium sulfate and potassium dihydrogenphosphate) in the lipase production by two yeast strains, considering a significance level of p < 0,1. The significant variable for strain TAQ 616 lipases production was the olive oil concentration and for biomass were olive oil, triton X-100 and KH2PO4. The enzymatic activity of lineage ABRT 461suffered the influence of pH, agitation and KH2PO4, and for biomass production any variable was statistically significant. The ABRT 461 lineage was selected to do a central composite rotational design (CCRD)2³. The optimum conditions for enzyme activity generated by the proposed model was 114 rpm, pH 5.0 and 25 g.L-1 concentration of (NH4)2SO4. The enzymatic activity of 84,4 U.mL-1 was obtained after the cultivation of ABRT 461 lineage for 72 hours in optimal conditions estimated by the model.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T19:37:03Z No. of bitstreams: 1 Anna Carolina Veiga Fercher.pdf: 1029610 bytes, checksum: 689549fc958765d98e6ad0065d34acdc (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T19:37:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anna Carolina Veiga Fercher.pdf: 1029610 bytes, checksum: 689549fc958765d98e6ad0065d34acdc (MD5) Previous issue date: 2014-10-03 Biodiesel is a biofuel which consists in a mix of monoalkylesters from long chain fatty acids. The usual method of producing this fuel is transesterification of vegetable oils with lower alcohols. In this process, the raw material should have a low content of free fatty acid (≤ 1%) and water(≤ 0.5%). As an alternative to the transesterification process stands out the use of low cost raw materials with high content of free fatty acids for the synthesis of alkyl esters through esterification reactions. Reactions for biodiesel production can be catalyzed chemically (acid and basic) or enzymatic. In enzymatic catalysis biocatalysts employed are lipases which are enzymes that catalyze hydrolysis and ester synthesis and can be obtained from microorganisms, plants and animal tissue and the most widely used is from microbial origin. The main objective of this study was to evaluate the potential of Yarrowia lipolytica s lipase a non-conventional yeast on the synthesis of esters of oleic acid in order to obtain alkyl esters (biodiesel). Effects of temperature (25, 30, 35, 40, 50 and 60oC) enzyme content (5, 10, 20, 30 and 40% v/v) and type of alcohol (methanol, ethanol, n-propanol and n-butanol) were studied in the esterification reactions of oleic acid employing enzymatic liquid produced by Yarrowia lipolytica. The results demonstrated that reactions conducted at 30oC and with 10% v/v of the enzyme extract showed higher initial reaction rate and higher conversion of oleic acid for all alcohols studied. Use of lyophilized enzyme extract (5%w/v) and SEP(solid enzymatic product) (5% w/v) from Yarrowia lipolytica was also evaluated in the esterification reaction of oleic acid with n-butanol at 30oC. The higher consumption of oleic acid has occurred in the reaction conducted with SEP. The effect of temperature (25, 30, 35, 40 and 50oC) in the synthesis of butyloleate was then investigated in reactions employing SEP as biocatalyst, and the higher conversion of oleic acid was observed at 40oC Biodiesel é um biocombustível que consiste na mistura de ésteres monoalquílicos de ácidos graxos de cadeia longa. O processo usual de produção deste combustível é a transesterificação de óleos vegetais com álcoois de cadeia curta. Nesse processo, a matéria prima deve conter baixo conteúdo de ácido graxos livres ( ≤ 1%) e água (≤ 0,5%). Como alternativa ao processo de transesterificação, destaca-se o emprego de matérias-primas de baixo custo, com elevado teor de ácidos graxos livres, para a síntese de ésteres alquílicos através de reações de esterificação. As reações de produção do biodiesel podem ser catalisadas por via química (ácida e básica) ou enzimática. Na catálise enzimática, os biocatalisadores empregados são as lipases, que catalisam a hidrólise e síntese de ésteres e podem ser obtidas a partir de microrganismos, plantas ou tecido animal, sendo as de origem microbiana as mais utilizadas. O objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial da lipase de Yarrowia lipolytica, uma levedura não convencional, na síntese de ésteres do ácido oleico visando à obtenção de ésteres alquílicos (biodiesel). Foram estudados os efeitos da temperatura (25, 30, 35, 40, 50 e 60oC), do teor enzimático (5, 10, 20, 30 e 40% v/v) e do tipo de álcool (metanol, etanol, n-propanol e n-butanol ) nas reações de esterificação do ácido oleico empregando o extrato enzimático líquido produzido por Yarrowia lipolytica. Os resultados obtidos mostraram que as reações conduzidas a 30oC e com 10% v/v do extrato enzimático apresentaram maior taxa inicial de reação. Também foi avaliada a utilização do extrato enzimático liofilizado (5% m/v) e do PES (produto enzimático sólido) (5% m/v) de Yarrowia lipolytica na reação de esterificação do ácido oleico com n-butanol a 30oC. O maior consumo de ácido oleico ocorreu na reação conduzida com o PES. O efeito da temperatura (25, 30, 35, 40 e 50oC) na síntese de oleato de butila foi, então, investigado nas reações empregando PES como biocatalisador e a maior conversão de ácido oleico foi verificada na temperatura de 40oC

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-20T19:34:46Z No. of bitstreams: 1 Disserta????o - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) Approved for entry into archive by Divis??o de Documenta????o/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T13:46:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Disserta????o - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) Approved for entry into archive by Divis??o de Documenta????o/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-23T14:19:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Disserta????o - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) Made available in DSpace on 2015-07-23T14:19:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disserta????o - Kethellin Miranda Galeno de Carvalho.pdf: 654175 bytes, checksum: 62e84f2b966219c4227a24119b3bb4f1 (MD5) Previous issue date: 2014-05-05 CAPES - Coordena????o de Aperfei??oamento de Pessoal de N??vel Superior Astrocaryum aculeatum G. F. W. Meyer popularly known as tucum?? (do Amazonas)is an Arecaceae species, an Amazon palm tree, which is considered an oilseed species with high potential for the production of biofuels. Biofuels have many advantages over fossil fuels such as the reduced toxicity and lower emission of greenhouse gases, due to the carbon cycling. This has stimulated its use and study so far. In large scale, is normally produced from vegetable oils or animal fats and methanol through the transesterification process by the homogenous alkalis catalysis. However this process is possible only to oils of fats with low contents of free fatty acids, which is not observed for most of oil sources available in the Amazon. This works aimed to study the production of biodiesel by an alternative process based on two-steps process of hydrolysis-esterification, with focus on the hydrolysis step performed by enzyme catalysis. Two lots of tucum?? kernel oil were studied. The physicalchemical parameters from both lots were determined. Lot 01 has acid value of 55.06 mg NaOH/gand lot 02 11.09 mg NaOH/g. The fatty acid composition was determined by FAME (Fatty Acid Methyl Ester) conversion and GC-FID analysis and showed that tucum?? oil has lauric, myristic and palmitic acid as major constituents. The use of lipases was initially studied by the determination of hydrolytic capacity of 11 different commercial lipases using tricaprylin as substrate. Considering the observed results and the costs of acquisition of each enzyme, two enzymes were selected for further studies, Candida rugosa (free enzyme) and Thermomyces lanuginosus (immobilized). The quantification of enzyme conversion of oil into free fatty acids was determined by two methods. The first, was developed in this work, and was based on TLC-densitometry and the other RP-HPLC was used to validate the results obtained by TLC-densitometry. This analytical method showed accuracy, precision and linearity to quantify the lipid conversion and was used to determine the enzyme activity in different experiments performed to determine the best catalytic conditions. The best conditions observed for de Candida rugosa lipase were 0.3 % of enzyme, 1 % of surfactant, phosphate buffer at pH 7.50, oil:buffer ratio of 1:1 (V:V), temperature of 40 ??C, stirring at 700 rpm for 10 hours. Then, the hydrolysis was performed in larger scale in a glass reactor and the products of both lots were converted into biodiesel by heterogeneous catalysis with ferric sulfate, in separate experiments using methanol and ethanol. Overall the best conversion was observed for the ethylic biodiesel, whose composition showed high purity that was confirmed by GC-MS analysis. The studied process based on enzymatic hydrolysis followed by esterification by heterogeneous catalysis showed very promising results that could, in theory,be applied in the conversion ofany oil source with high free fatty acid content, which is one of the most important challenges in the production of biodiesel. Astrocaryum aculeatum G. F. W. Meyer ?? conhecido popularmente como tucum?? do Amazonas e pertence ?? fam??lia Arecaceae. Uma palmeira, cujas am??ndoas dos seus frutos possuem grande potencial de ??leo, podendo ser utilizado como mat??ria-prima na produ????o de biodiesel. O biodiesel apresenta grandes vantagens frente aos combust??veis f??sseis, como a ciclagem de carbono, baixa toxicidade e o seu uso contribui para a diminui????o do efeito estufa, proporcionando um ganho ambiental para todo o planeta pela diminui????o da polui????o atmosf??rica entre outras caracter??sticas que justificam sua utiliza????o. Comercialmente ?? produzido pela rea????o de transesterifica????o por cat??lise b??sica com ??lcoois de cadeia curta. Contudo para que esse processo seja utilizado com rendimentos satisfat??rios ?? fundamental que os ??leos possuam baixos teores de ??cidos graxos livres, o que para a maior parte dos ??leos e gorduras, extra??dos de esp??cies amaz??nicas, n??o ?? poss??vel. Este trabalho teve como objetivo estudar o processo alternativo ?? transesterifica????o, dehidr??lise seguida de esterifica????o, com especial ??nfase a etapa de hidr??lise, que foi realizada pela cat??lise enzim??tica. Foram utilizados dois lotes de ??leos extra??dos das am??ndoas de tucum??. Inicialmente realizou-se a caracteriza????o f??sico-qu??mica do ??leo, onde o lote 01 apresentou ??ndice de acidez de 55,06 mg NaOH/g e o lote 02 de 11,09 mg NaOH/g. Foi realizada tamb??m a determina????o da composi????o da cadeia graxa por CG-FID. De acordo com essa an??lise os ??cidos graxos majorit??rio foram: ??cido l??urico, mir??stico e palm??tico. Foi realizada uma triagem com 11 lipases comerciais livres para definir a atividade catal??tica de cada enzima utilizando o mesmo substrato, a tricaprilina (C8:0). Considerando a atividade observada e o custo de aquisi????o das enzimas, foram selecionadas para as rea????es de hidr??lise a lipase de Candida rugosa (livre) e a lipase Thermomyces lanuginosus (imobilizada). Os ??cidos graxos produzidos nas rea????es de hidr??lise foram quantificados por um m??todo desenvolvido por CCD-densitometria. Os ??cidos graxos tamb??m foram quantificados por CLAE em fase reversa para comparar os resultados e validar os resultados. A t??cnica de CCD-densitometria mostrou ser r??pida, eficaz e precisa na quantifica????o de lip??dios. Todas as rea????es foram monitoradas e quantificadas por essa t??cnica, com o intuito de estabelecer as melhores condi????es da atividade catal??tica e o melhor resultado foi obtido utilizando a lipase de Candida rugosa nas seguintes: 0,3% do biocatalisador, tensoativo 1%, tamp??o fosfato de s??dio pH 7,50; 0,1M, propor????o ??leo:tamp??o1:1, temperatura de 40 ??C, agita????o 700 rpm em 10 horas de rea????o. Os dois lotes de ??leo foram hidrolisados enzimaticamente em quantidades maiores num reator de vidro com as duas enzimas e em seguida foram esterificados empregando o catalisador heterog??neo de sulfato f??rrico, tanto pela via met??lica como et??lica. Pelas an??lises realizadas, o biodiesel et??lico apresentou melhoresconvers??es frente ao biodiesel met??lico. As amostras de biodiesel foram analisadas tamb??m por CG-EM para confirmar a forma????o do produto et??lico. O processo de hidr??lise enzim??tica associada ?? esterifica????o por cat??lise heterog??nea apresentou resultados bastante promissores, que podem permitir o uso de mat??rias-primas com elevado ??ndice de acidez, que ?? um dos principais desafios atuais na produ????o desse biocombust??vel.

This work evaluates the immobilization of Candida antarctica lipase (Fraction B) using poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) nanoparticles as support. The effects of immobilization time (30-150 min) and pH (5-10) on lipase loading were evaluated. The stability of the immobilized enzyme towards temperature (40, 60, and 80 ºC), reuse and storage (at 4 ºC) were also determined. Furthermore, to assess its potential application in a system of interest, the immobilized lipase was used as a catalyst in the esterification of geraniol with oleic acid. The results indicated a time of 120 minutes and pH of 7 as optimal for immobilization. A 21 hour exposure of the PHBV-lipase derivative to 60 ºC showed a 33% reduction of the initial activity while storage at 4 ºC led to a residual activity (5% of the original activity). The derivative was used without significant loss of activity for 4 successive cycles. The use of the immobilized lipase as a catalyst in the production of geranyl oleate led to about 88% conversion of the initial reactants to products.

This work evaluates the immobilization of Candida antarctica lipase (Fraction B) using poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV) nanoparticles as support. The effects of immobilization time (30-150 min) and pH (5-10) on lipase loading were evaluated. The stability of the immobilized enzyme towards temperature (40, 60, and 80 ºC), reuse and storage (at 4 ºC) were also determined. Furthermore, to assess its potential application in a system of interest, the immobilized lipase was used as a catalyst in the esterification of geraniol with oleic acid. The results indicated a time of 120 minutes and pH of 7 as optimal for immobilization. A 21 hour exposure of the PHBV-lipase derivative to 60 ºC showed a 33% reduction of the initial activity while storage at 4 ºC led to a residual activity (5% of the original activity). The derivative was used without significant loss of activity for 4 successive cycles. The use of the immobilized lipase as a catalyst in the production of geranyl oleate led to about 88% conversion of the initial reactants to products.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental O trabalho iniciou-se com uma pesquisa bibliográfica sobre os microrreatores, a sua aplicação em processos enzimáticos, suportes, tipos de imobilização enzimática e sínteses de ésteres em meios não convencionais catalisadas por lipases. A primeira fase laboratorial iniciou com a obtenção das melhores condições de imobilização de lipase B da Candida antarctica (CALB) em celulose bacteriana (CB), tendo como variáveis a concentração enzimática e o tempo de contacto entre a solução e a CB. Estas condições ótimas foram selecionadas para imobilização por adsorção e por ligação covalente. As condições escolhidas foram a concentração de 4mg/mL com um tempo de exposição de 4 horas. Numa segunda fase foi testada a estabilidade operacional das imobilizações em meio aquoso, através da atividade enzimática em vários ciclos de utilização (hidrólise p-nitrofenol). No teste de estabilidade foram distinguidos dois grupos de imobilizações: as armazenadas no frigorífico (4ºC) e as armazenadas no congelador (-18ºC) para ambos os tipos de imobilização. As imobilizações do congelador apresentaram melhor resistência operacional. Não foi notada uma diferença significativa entre os dois tipos de imobilização, embora a adsorção tenha sido melhor nos primeiros ciclos e a ligação covalente ligeiramente superior nos ciclos finais. Na parte final, usando a imobilização por adsorção, foi tentada, sem sucesso, a síntese de dois ésteres, nomeadamente o propil galato e o eugenil benzoato, por serem duas moléculas com grande potencial de aplicação nas indústrias farmacêutica e alimentar. No entanto foi possível encontrar um método simples e rápido de deteção e análise dos ésteres por FTIR usando padrões. Foi também possível constatar que o propil galato e ácido gálico podem ser rapidamente detetados por titulação com hidróxido de sódio (sem indicador extra) através das diferentes cores que apresentam, amarelo e verde respetivamente. The work began with a bibliographical research on the microrreactors, its application in enzymatic processes, supports, types of enzyme immobilization and syntheses of esters in non-conventional medium catalyzed by lipases. The first laboratorial phase began obtaining the best conditions of immobilization of Candida antarctica lipase B (CALB) at bacterial cellulose (BC). The variables was enzyme concentration and the contact time between the solution and the BC. These optimum conditions were selected for immobilization by adsorption and by covalent bond. The conditions chosen were the concentration of 4mg/mL with an exposure time of 4 hours. In a second phase was tested the operational stability of the immobilizations in an aqueous medium, by enzymatic activity in several cycles of utilization (hydrolysis p-nitrophenol). In the stability test were distinguished two groups of immobilizations: the stored in the fridge (4ºC) and stored in the freezer (-18ºC) for both types of immobilization. Freezer immobilizations presented best operating resistance. It was not noticed a significant difference between the two types of immobilization, although the adsorption has been better in the first cycles and the covalent bond slightly higher than in the final cycles. In the final part, using the adsorption, it was attempted, without success, the synthesis of two esters, in particular the propyl gallate and eugenil benzoate, because they are two molecules with great potential for application in the pharmaceutical and food industries. However, it was possible to find a simple and rapid method for detection and analysis of esters by FTIR, using patterns. It was also found that the propyl gallate and gallic acid can be quickly detected by titration with sodium hydroxide (without extra indicator), through the different colours present, yellow and green respectively.

Orientador: Prof. Dr. Lúcio Cardozo-Filho Coorientador: Prof.ª Dr.ª Ivana Corrêa Ramos Leal ; Prof. Dr. Rodrigo O. M. A. de Souza Tese (doutorado em Engenharia Química)--Universidade Estadual de Maringá, Centro de Tecnologia, Dep. de Engenharia Química, 2014 Resumo: O objetivo do presente trabalho consistiu na produção enzimática de dois produtos de alto valor de mercado: o mono-oleato de glicerila (mono-oleína) e o ácido epoxioleico. A mono-oleína foi produzida pela reação de esterificação do ácido oleico com solketal (R,S-1,2 Isopropylideneglycerol) utilizando a lipase Lipozyme RM IM como biocatalisador. A reação foi conduzida em condições supercríticas. Primeiramente, o comportamento dos sistemas binário (CO2 + solketal) e ternário (CO2 + solketal + ácido oleico) foi estudado a fim de prever a solubilidade do sistema. Posteriormente, foi realizado um planejamento fatorial completo, com triplicata no ponto central, onde foi avaliada a influência de três variáveis independentes: temperatura (33 a 67°C); razão molar ácido oleico:solketal (1:0,1 a 1:6,4) e concentração da enzima (0,1 a 13% (m/m)), mantendo-se fixo o tempo em 3 horas de reação e a densidade do CO2 em 718 kg/m3. Ao finalizar o planejamento, o tempo reacional foi avaliado. A condição otimizada correspondeu ao tempo de 1 hora de reação, 60°C, 1% (m/m) de concentração de enzima e razão molar ácido oleico:solketal de 1:5, atingindo rendimentos de aproximadamente 70% em produto. O segundo produto de interesse industrial, o epóxido, foi obtido pela reação de epoxidação do ácido oleico com o acetato de etila utilizando peróxido de hidrogênio como agente oxidante. A lipase Candida antarctica B foi imobilizada em microemulsões baseadas em organogéis com hydroxyl-propyl-methyl cellulose (HPMC) e utilizada como biocatalisador. A epoxidação foi realizada em baixa pressão e em condições supercríticas, com CO2 como solvente. Em condições ambientes, a reação foi otimizada por meio de um planejamento fatorial 23 com triplicata no ponto central, que totalizou 11 experimentos. As seguintes variáveis independentes foram consideradas: temperatura (35-55°C), concentração de ácido oleico (50-100 mmol/L) e concentração de enzima (0,4-0,8 mg/mL microemulsão). A quantidade de H2O2 foi mantida fixa em 1,2 mL, pois em estudos anteriores observou-se que um excesso de oxidante não afetou a estrutura da enzima. A condição otimizada correspondeu ao tempo de 48 horas de reação, 35°C, 50 mmol/L de ácido oleico e concentração de enzima de 0,8 mg/mL de microemulsão atingindo rendimentos em epóxidos de aproximadamente 84%. O estudo da cinética da reação permitiu observar que a reação é lenta, atingindo 10% em rendimentos com 1 hora de reação. Para realizar a reação de epoxidação em condições supercríticas, o comportamento do sistema ternário (CO2 + acetato de etila + ácido oleico) foi primeiramente avaliado a fim de prever a solubilidade do sistema. Em seguida, foi realizada a reação, que não apresentou resultados satisfatórios. Foi realizado um planejamento experimental, em que o rendimento da reação foi em torno de 10% em todas as condições avaliadas. O baixo rendimento obtido na reação pode estar relacionado pela grande quantidade de água presente no sistema, e o CO2 em condições supercríticas tem sua solubilidade bastante limitada em sistemas aquosos Abstract: The aim of this work was the enzymatic production of two high-value products to market: glyceryl monooleate (monoolein) and epoxioleic acid. The mono-olein was produced by esterification of oleic acid with solketal (D,L-,1,2 Isopropylideneglycerol) using Lipozyme RM IM lipase as biocatalyst. The reaction was carry out in supercritical conditions. First, the behavior of binary (CO2 + solketal) and ternary (CO2 + solketal + oleic acid) systems was study to predict the solubility of the system. Afterwards we performed a full factorial design with three replications at the center point where the influence of three independent variables was evaluated: temperature (33-67°C), molar ratio oleic acid:solketal (1:0.1 to 1:6,4 ) and enzyme concentration (0.1 to 13% (w/w)), keeping constant the time at 3 hour reaction and the density of the CO2 in 718 kg/m3. Finally, the reaction time was evaluated. The optimized condition corresponds to the time of 1 hour of reaction, 60°C, 1% (w/w) of enzyme concentration and molar ratio oleic acid:solketal in 1:5, reaching yields of about 70 % in the product. The second product of industrial interest, the epoxide, was obtained by epoxidation reaction of oleic acid with ethyl acetate using hydrogen peroxide as oxidizing agent. Candida antarctica B lipase was immobilized in microemulsion based organogels with cellulose hydroxylpropylmethyl cellulose (HPMC) was used as biocatalyst. The epoxidation was carried out at low pressure and in supercritical conditions, using CO2 as solvent. At ambient conditions, the reaction was optimized using a 23 factorial design with center point in triplicate, totaling 11 experiments. The following independent variables were considered: temperature (35-55°C), concentration of oleic acid (50-100 mmol/L) and amount of enzyme (0.4-0.8 mg E/mL microemulsion). The amount of H2O2 was fixed in 1.2 mL, given that in previous studies it can be seen that an excess of oxidant does not affect the structure of the enzyme. The optimized condition corresponds to the time of 48 hour reaction, 35°C, 50 mmol/L oleic acid and 0.8 mg E/mL microemulsion reaching yields about 84 % in epoxides. The study of reaction kinetics allowed us to observe that the reaction is slow, reaching 10 % in income after 1 hour of reaction. To conduct the epoxidation reaction in supercritical conditions, the behavior of the ternary system (ethyl acetate + CO2 + oleic acid) was first assessed in order to predict the solubility of the system. Then, the reaction, which did not show satisfactory results, was evaluated. An experimental design was performed and the yield remained around 10 % for all conditions evaluated. A possible negative influence for this result is the large amount of water present in the system, and CO2 under supercritical conditions has very limited solubility in aqueous systems