Search

В работе описывается оригинальная методика детекции коллатеральной активности CRISPR/Cas13a-рибонуклеазы, основанная на оценке деградации рибосомальной РНК. В качестве анализирующего прибора используется биоанализатор Agilent 2100. Данный подход является альтернативой существующим методам детекции и имеет ряд преимуществ по сравнению с ними в том случае, когда не требуется количественная оценка активности. На примере тестового образца определены оптимальные концентрации и соотношения компонентов реакционной смеси, необходимые для получения наиболее показательного результата. Предлагаемая методика может быть использована для качественной оценки активности препаратов рекомбинантной рибонуклеазы Cas13а, полученных при разных условиях гетерологической экспрессии белка и его очистки, а также для тестирования направляющих РНК., The paper describes an original technique for detecting the collateral activity of CRISPR/Cas 13a ribonuclease based on the assessment of ribosomal RNA degradation. The Agilent 2100 bioanalyzer is used as an analyzing device. This approach is an alternative to existing detection methods and has a number of advantages over them in the case when a quantitative assessment of activity is not required. On the example of the test sample, the optimal concentrations and ratios of the components of the reaction mixture, which are necessary to obtain the most indicative result, were determined. The proposed technique can be used for qualitative assessment of the activity of recombinant ribonuclease Cas13a preparations obtained under different conditions of heterologous protein expression and purification, as well as for testing guide RNAs.

An algorithm combining advantages of the Edman degradation method and de novo mass-spectrometric sequencing was developed. The protein from the “Diaskintest” diagnostic test was used for analysis. The protein was digested with trypsin and 5 steps of Edman degradation were carried out sequentially for the mixture of peptides. At each stage, the resulting mixture was analyzed by shotgun mass spectrometry analysis. The results of mass-spectrometry were analyzed both by the well-known de novo sequencing programs Novor and PepNovo+, and by own program that clustered individual spectra with a C-terminal signature formed by Y-ions. This approach allows us to determine confidently the amino acid sequence of the N-terminal part of the peptides obtained after the protein hydrolysis by trypsin., В работе рассмотрен алгоритм, позволяющий объединить преимущества таких методов как деградация по Эдману и масс-спектрометрическое de novo секвенирование. В качестве тестового белка в работе использовали белок-реагент для кожного теста “Диаскинтест”. Белок подвергали расщеплению трипсином и для смеси пептидов последовательно проводили 5 шагов деградации по Эдману. На каждом этапе полученную смесь подвергали протеомному панорамному анализу. Результаты анализировали как известными программами de novo секвенирования Novor и PepNovo+, так и собственной программой, кластеризующей отдельные спектры по C-концевой сигнатуре, образованной Y-ионами. Показано, что использование данного подхода позволяет уверено определить аминокислотную последовательность N-концевой части пептидов, полученных при гидролизе белка.

The concentration of ciliary neurotrophic factor (CNTF) was measured in lacrimal fluid (LF) using Human CNTF Quantikine ELISA kit (“R&D Systems”, USA) on a ChemWell 2910 automatic analyzer (“Awareness Technology Inc.”, USA). We initially attempted to use commercial kits, designed for serum and plasma CNTF detection, to quantify lacrimal CNTF. The results, however, were rarely above the minimum detection level of the kits, most likely due to matrix complexity and low concentrations of CNTF in diluted LF (LF had to be diluted because of the small volume of collected samples). The optimal sensitivity and the lowest background for the best minimum quantifiable value were determined empirically. Phosphate buffer solution containing 1% bovine serum albumin was selected as an optimal diluent for CNTF measurements in small fluid samples. A standard curve was produced using the calibrating solutions 0-250 pg/ml. Acid treatment of LF samples before the analysis allowed to increase the detectable concentration of the CNTF two-fold. The 1:3 dilution was selected based on the available volume of collected LF and a reasonable variation coefficient. The described protocol allowed to develop a sandwich ELISA optimized for lacrimal CNTF., Определение цилиарного нейротрофического фактора – ciliary neurotrophic factor (CNTF) в слёзной жидкости (СЖ) человека рутинными лабораторными методами затруднено из-за его низкой концентрации в структурах глаза и недостаточного количества материала для анализа. Были подобраны условия для определения CNTF в СЖ твердофазным методом иммуноферментного анализа (ИФА) на основе набора Human CNTF Quantikine ELISA Kit (“R&D Systems”, США) с использованием автоматического иммуноферментного анализатора ChemWell 2910 Combi (“Awareness Technology Inc.”, США). Предварительная кислотная обработка проб СЖ позволила вдвое повысить концентрацию CNTF. Полностью автоматизированная система проведения анализа и выбор разбавителя с низкой оптической плотностью бланка (0.011) обеспечили линейную зависимость калибровочного графика от 0 до 250 пг/мл с возможностью его использования для расчета концентрации CNTF в области низких значений. Рабочие характеристики оптимизированной тест-системы ИФА (линейность метода, предел обнаружения, воспроизводимость, интерференция матрицы) в указанном диапазоне концентраций соответствовали критериям приемлемости для используемого метода определения. Разведение образцов СЖ в четыре раза, совмещённое с кислотной обработкой проб, оказалось оптимальным для получения стабильных результатов при проведении анализа. В этом случае концентрация CNTF в пробе составляла в среднем 10.4±0.4 пг/мл с коэффициентом вариации 4.2% и близостью определяемых значений к ожидаемым величинам на уровне 104%.

The highly sensitive method of surface plasmon resonance (SPR) detection of low concentrations of target proteins based on the biosensor signal enhancement by using gold nanoparticles (similar to “sandwich” assay type) is described. The commercial protein preparations of beta-2-microglobulin (B2M) as a model biomarker and polyclonal (Pab) and monoclonal antibodies (Mab) to B2M were used. It has been shown that this universal and reproducible method can be applied for SPR analysis of other protein biomarkers by analogy with the biomarker protein B2M. The present work is also focused on the experimental protocol description. The protocols of gold nanoparticles (GNP) synthesis, obtaining the conjugates of Pab/GNP and measuring their concentration, the protocol of Mab covalent immobilization on the optical chip CM5 of a biosensor and also SPR registration of molecular interactions Mab-biomarker and in the “sandwich” assay type Mab-biomarker-Pab or Mab-biomarker-Pab/GNP are considered in detail., Описан высокочувствительный метод детекции низких концентраций целевых белков с помощью усиления сигнала оптического биосенсора на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием золотых наночастиц (по типу “сандвич”). В качестве модели биомаркера использован коммерческий белковый препарат бета-2-микроглобулина (B2M), а также препараты поликлональных (Pab) и моноклональных антител (Mab) к B2M. Данный метод анализа вследствие его универсальности и воспроизводимости может быть применён для анализа любых белковых биомаркеров. Подробно рассмотрены экспериментальные протоколы синтеза золотых наночастиц (GNP), получения их конъюгатов с поликлональными антителами (Pab/GNP), спектрофотометрического определения концентрации наночастиц и конъюгатов, ковалентной иммобилизации Mab на поверхности оптического чипа СМ5 биосенсора, регистрации взаимодействий Mab-биомаркер и формирования типа “сандвич” Mab-биомаркер-Pab и Mab-биомаркер-Pab/GNP.

The development of the integral platform “From Gene to Lead”, consolidated computer methods, bioinformatics researches, and experimental approaches, significantly accelerated and optimized base structure search in the field of drug design. The necessity of the experimental verification of hundreds virtual structure hypothesis (results of molecular data base selections or de novo construction) requires demands the usage of the high-through out and sensitive methods for validation possible interaction between numerous of selected compounds and particular molecular targets and evaluation of affinity, kinetics and thermodynamics. Surface plasmon resonance (SPR) technology makes it possible to solve all these problems. In this article the methodical aspects of the optical SPR-biosensor usage in the field of drug prototypes selection are described using the human cytochrome P450(51) catalyzing one of the key step of cholesterol biosynthesis as an example., Интеграция различных компьютерных, биоинформатических и экспериментальных технологий в единую платформу, покрывающую путь “от гена до прототипа лекарства”, значительно ускорила и оптимизировала поиск базовых структур для создания новых лекарственных препаратов. При этом необходимость экспериментальной проверки найденных компьютерными методами сотен структурных гипотез, представляющих собой выборки из молекулярных баз данных или сконструированных de novo соединений, требует привлечения быстрых и чувствительных скрининговых методов анализа их возможных взаимодействий с белком-мишенью. А в случае позитивного результата и возможности количественной оценки аффинности, кинетики и термодинамики межмолекулярного взаимодействия. Технология поверхностного плазмонного резонанса (SPR) позволяет решать все перечисленные задачи. В данной статье рассматриваются методические аспекты применения оптического SPR биосенсора для поиска прототипов лекарственных средств на примере цитохрома Р450(51) человека, катализирующего ключевую стадию биосинтеза холестерина.

This paper focuses on experimental data of electroanalysis of enzymes, proteins, peptides, DNA, and medicinal preparations, obtained by authors. Methods for enzyme electrodes preparation, methods for kinetic parameters calculations based on analysis of electrochemical data. Results are described as algorithm for efficient electrochemical reaction of biomolecules., Рассмотрены методы электроанализа биологических молекул, таких как ферменты, белки, пептиды, ДНК, лекарственные препараты. Описаны методы получения ферментных электродов, методы расчёта кинетических параметров реакций на основе анализа электрохимических данных. Результаты представлены в виде алгоритма, позволяющего осуществить выбор типа электрода для проведения соответствующей электрохимической реакции.

Determination of protein concentration in biological samples is an important task for biological research, as well as for medicine and routine clinical biochemistry. The introduction of stable isotope-labeled peptide standards (SIS) made it possible to determine accurately absolute protein concentrations in proteomic studies. The correct choice of SIS and the systematic way to develop a s method for selected reaction monitoring (SRM) are very important steps that are crucial for further identification and measurements of protein concentration. In this paper, we summarize our experience of selecting SIS for measuring the protein concentration by SRM. The results are presented in the form of an algorithm that describes the main stages of the SIS selection and the main points in the development of SRM methods for the targeted protein detection and determination of protein concentrations in biological samples., Определение концентраций белков является важной задачей в биологии и медицине, а также используется в клинической лабораторной практике для диагностики заболеваний. Измерения абсолютных концентраций белков в масс-спектрометрии стали возможны благодаря внедрению в практику внутренних стандартов, которые в точности соответствуют химической структуре измеряемого вещества, но синтезированы с использованием изотопно-меченых молекул. Правильный выбор внутреннего стандарта и систематических подход в разработке методики мониторинга выбранных реакций (Selected Reaction Monitoring, SRM) определяет качество идентификации и точность измерения концентрации таргетного белка. В данной работе суммирован наш опыт по выбору пептидного стандарта для измерения концентрации белков. Результаты представлены в виде алгоритма, который учитывает основные стадии выбора внутреннего стандарта и основные моменты разработки методов детекции и определения концентрации белков