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Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de lectura: 20-09-2017, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 20-03-2019, El receptor nicotínico para la acetilcolina del subtipo 7 (7-nAChR) está ampliamente distribuido en células del sistema nervioso central (SNC), tanto neuronas como células gliales. Mientras que el receptor expresado por las neuronas modula la liberación de ciertos neurotransmisores (glutamato, dopamina y serotonina), el expresado por la microglía controla el exceso de inflamación cerebral en respuesta a un estímulo lesivo. En el genoma humano se ha identificado un nuevo gen híbrido (CHRFAM7A) resultante de la combinación del gen CHRNA7, que codifica para la subunidad nicotínica 7, y del gen FAM. Durante mucho tiempo fue desconocida la función de la subunidad nicotínica codificada por el gen híbrido, dup7. En 2011, nuestro grupo demostró, por primera vez, que el dup7 se comportaba como un dominante negativo de la actividad del 7-nAChR en un modelo de expresión heteróloga, los ovocitos de Xenopus. Este hallazgo fue corroborado en estudios posteriores realizados por otros grupos. Hasta la fecha, se desconoce cuál puede ser el papel fisiopatológico de dup7 en células de mamíferos, así como el mecanismo por el que se produce la interacción 7/dup7 o las consecuencias fisiopatológicas de dicha interacción. Polimorfismos del gen CHRFAM7A han sido asociados a ciertas enfermedades neuropsiquiátricas, como la depresión, la esquizofrenia, el Alzheimer o la demencia por cuerpos de Lewy. En la etiopatogenia de la depresión han sido propuestas varias teorías, una de las cuales propugna la existencia de una inflamación basal en el paciente con elevación de los niveles de citoquinas proinflamatorias. En base a todo lo anterior, el objetivo central de este trabajo ha sido evaluar si dup7 interacciona físicamente con la subunidad 7 formando un receptor pentamérico mixto, en líneas celulares de mamíferos de tipo neuroendocrino (GH4C1), inmune (RAW 264.7) y neuronal (SHSY5Y), así como dilucidar el papel fisiopatológico de dicha interacción en la neurotransmisión. Para el estudio funcional, se procedió a la obtención de clones con sobreexpresión estable de dup7 de células SH-SY5Y. Los principales hallazgos del presente trabajo demuestran que células de mamíferos, de diversa naturaleza, son capaces de formar un receptor nicotínico mixto con la subunidad 7 (7dup7-nAChR) en detrimento de la formación de 7- nAChR homoméricos. La consecuencia fisiológica de la incorporación de dup7 a la estructura pentamérica del nAChR es la reducción de la señal de [Ca2+]i y la neurosecreción mediada por el 7-nAChR. Dado el papel modulador de 7-nAChR en la liberación de neurotransmisores y su actividad antiinflamatoria, nos propusimos averiguar si los niveles de expresión de 7 y dup7 ARNm de células de sangre periférica de pacientes depresivos correlacionaban con la gravedad de la enfermedad y la respuesta al tratamiento farmacológico. Los resultados arrojaron una perfecta correlación inversa entre ambos marcadores, indicando que la expresión de 7 ARNm puede ser un buen marcador del curso evolutivo de la depresión. Más aún, nos preguntamos si fármacos antidepresivos con diferentes mecanismos de acción, podrían ejercer su efecto terapéutico a través de la regulación de la expresión de las diferentes subunidades nicotínicas, modulando de este modo, la neurosecreción y la neuroinflamación. Nuestros resultados revelan que determinados fármacos aumentan la expresión 7 ARNm en neuronas y/o microglía conduciendo a una mayor liberación de neurotransmisores y una disminución de la neuroinflamación, lo cual puede contribuir a la acción antidepresiva de dichos fármacos.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología y Terapéutica. Fecha de lectura: 5-09-2017, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 05-03-2019, El receptor nicotínico para la acetilcolina del subtipo α7 (α7 nAChR) presenta una amplia distribución en el organismo. Este subtipo de receptor ha sido identificado en queratinocitos, adipocitos, células inmunes, endoteliales, bronquiales y tumorales, desempeñando importantes funciones en cada una de estas localizaciones. En base a lo anterior, no es extraño que una deficiente actividad del α7 nAChR, o una reducción del número de receptores, hayan sido implicados en la etiopatogenia de diversos procesos patológicos neuropsiquiátricos (esquizofrenia, trastorno bipolar, Alzheimer, Parkinson), así como en enfermedades inflamatorias y neoplásicas. En el año 1998, Gault y cols identificaron en el cromosoma 15 del genoma humano un nuevo gen híbrido, el CHRFAM7A. El híbrido resulta de la combinación de un duplicado parcial del gen CHRNA7, que codifica para la subunidad α7 del nAChR, con el gen FAM7A. Nuestro grupo logró, por primera vez, identificar la función del transcrito del gen duplicado, el dupα7, el cual se comporta como un modulador endógeno de la actividad del α7 nAChR en ovocitos (de Lucas Cerrillo y col., 2011). Dada la implicación del α7 nAChR en múltiples procesos patológicos humanos, en este trabajo de Tesis nos planteamos estudiar la actividad de este receptor, y su posible modulación por dupα7, en enfermedades de gran importancia clínica como la sepsis, un prototipo de enfermedad inflamatoria extrema, y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Se ha recurrido a utilizar una combinación de técnicas, incluyendo las de biología celular y molecular, bioquímica, microscopía confocal y técnicas específicas para el estudio de la actividad tumorogénica in vitro e in vivo de líneas celulares tumorales. Nuestros resultados derivados del estudio piloto realizado en pacientes sépticos revelan que los que presentan niveles de expresión altos de α7 ARNm y bajos de dupα7 en CMSP muestran un mejor control de la inflamación y mejor pronóstico. Por otro lado, nuestros resultados in vitro e in vivo con líneas celulares de NSCLC muestran que la sobreexpresión de dupα7 bloquea la progresión tumoral secundaria a la activación del α7 nAChR por nicotina y NNK. Adicionalmente, los datos obtenidos en biopsias pareadas tumorales y no tumorales de pacientes con NSCLC indican la sobreexpresión del α7 ARNm y la disminución del dupα7 en las muestras tumorales respecto a las no tumorales, lo que refuerza el papel decisivo del α7 nAChR en el desarrollo tumoral, así como la capacidad moduladora negativa de dupα7 en este proceso.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología. Fecha de Lectura: 02-12-2022, Varios ensayos clínicos han demostrado peor evolución clínica y menor respuesta a la quimioterapia (quimiorresistencia), incluyendo a los derivados del platino, de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) fumadores frente a no fumadores. Datos preliminares in vitro de nuestro laboratorio han revelado que la nicotina del tabaco, y su nitrosamina derivada NNK, a través de la activación de receptores nicotínicos para la acetilcolina del subtipo α7 (α7-nAChRs) expresados en las células epiteliales y tumorales de pulmón, están implicadas en la anterior quimiorresistencia al interferir con el efecto citotóxico de cisplatino a nivel de la apoptosis. Sin embargo, se desconocen los mecanismos moleculares puestos en marcha por el α7-nAChR para interferir con el efecto proapoptótico de cisplatino, o si dicha resistencia a cisplatino mediada por el anterior subtipo de receptor se reproduce in vivo. También permanece por dilucidar si otros subtipos del nAChR, distintos al α7-nAChR, contribuyen a la anterior quimiorresistencia, así como si los hallazgos in vitro e in vivo relativos al mecanismo molecular implicado en la quimiorresistencia pueden ser corroborados en la clínica. En base a lo anterior, esta Tesis Doctoral tiene como OBJETIVO GENERAL tratar de resolver las cuatro incógnitas planteadas. Con este propósito hemos realizado experimentos in vitro utilizando diversas variantes de la línea celular humana de adenocarcinoma de pulmón A549 [salvaje, o con distintas subunidades del nAChR (α3, α5, β4, α7) silenciadas con siRNAs específicos (knockdown) o mediante CRISPR-Cas9 (knockout)], junto a experimentos in vivo en un modelo xenográfico murino de NSCLC, combinados con experimentos en tumores primarios de 107 pacientes con NSCLC, tanto fumadores (n = 59) como no fumadores (n = 48). En los experimentos in vitro e in vivo se ha empleado cisplatino como agente quimioterápico, y en el conjunto de la Tesis una combinación de técnicas que incluyen la PCR cuantitativa, citometría de flujo, microarrays proteicos, inmunoblot, inmunohistoquímica y ensayos de tumorogenicidad. Nuestros principales hallazgos son los siguientes: (i) se identifican las proteínas quinasas y factores de transcripción cuya actividad es desregulada por nicotina, a través del α7-nAChR, promoviendo la supervivencia celular y, por tanto, contrarrestando el efecto citotóxico de cisplatino; (ii) se corrobora in vivo el papel determinante del α7-nAChR en la resistencia a cisplatino inducida por nicotina en el tumor xenográfico NSCLC del ratón; (iii) se constata, también in vivo, que en la resistencia a cisplatino inducida por nicotina subyace un aumento de expresión de proteínas antiapoptóticas y disminución de las proapoptóticas en el tumor xenográfico; (iv) la anterior alteración del patrón de expresión génica de proteínas reguladoras de apoptosis inducida por nicotina in vivo es corroborada en tumores primarios NSCLC de fumadores frente a no fumadores; (v) se demuestra que otros subtipos de nAChRs, además del α7-nAChR, contribuyen a la anterior quimiorresistencia. En conjunto, nuestros resultados in vitro, in vivo y en tumores primarios de pacientes con NSCLC revelan el mecanismo molecular que subyace en la resistencia a la quimioterapia inducida por el consumo de tabaco en este tipo de tumor. A través de este mecanismo, los componentes del tabaco nicotina/NNK, activando α7-nAChRs y otros subtipos de nAChRs, alterarían la capacidad apoptótica celular generando un “estado antiapoptótico” en el tumor que lo haría refractario al efecto citotóxico de la quimioterapia. En base a nuestros hallazgos, la presente Tesis aporta argumentos científicos sólidos para concienciar a médicos, pacientes, y población en general, acerca de que el consumo de tabaco no solo es la principal causa prevenible de cáncer y muerte por cáncer, sino también del previsible fracaso terapéutico y peor evolución que este hábito puede ocasionaren en los pacientes con NSCLC y otros tumores asociados al tabaquismo, La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovación de España bajo el proyecto SAF2017SAF2017-8268982689-R

Tesis doctoral inédita leída en la Universida Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: junio-2016, Introducción Se desconoce si el tratamiento con inhibidores de proteasa potenciados (IP) en monoterapia (MT) es capaz de preservar la función neurocognitiva de los pacientes VIH+. Métodos Estudio longitudinal diseñando para evaluar la función neurocognitiva en pacientes VIH+ avirémicos y sin comorbilidades neuropsiquiátricas graves, tratados con un IP en MT o asociado a 2 nucleósidos (TT). A todos los pacientes se les realizó, basalmente y al año de seguimiento, una evaluación neurocognitiva (14 tests, 7 dominios) y un control analítico en sangre y en el liquido cefalorraquídeo (LCR), si presentaban deterioro neurocognitivo (DNC). Se compararon entre la MT y la TT: la prevalencia, la incidencia y el perfil del DNC; así como los niveles de inflamación y de carga viral de VIH en LCR. Igualmente se evaluó mediante por ANCOVA si la MT era factor de riesgo de DNC de forma cruda o ajustada por aquellas covariables que modificaban esta relación >15%. Resultados Basalmente se incluyeron 96 pacientes en MT y 95 en TT. De ellos 67 completaron el protocolo en cada grupo de tratamiento. En comparación, los pacientes en TT eran mas jóvenes, tenían recuentos de linfocitos CD4 (basal y nadir) menores y llevaban menos tiempo infectados por VIH, en tratamiento y suprimidos que los pacientes en MT. Los pacientes en MT y en TT presentaron un funcionamiento basal y una evolución neurocognitiva, global y por dominios cognitivos, similar. Sus tasas de deterioro y de declinar cognitivo fueron igualmente equiparables. Los niveles de carga viral de VIH y de inflamación en el subgrupo de pacientes diagnosticados basalmente de DNC en MT o TT fueron también similares. La MT no demostró ser un factor de riesgo, crudo o ajustado, de DNC. Conclusiones En base a los resultados obtenidos, la evolución del funcionamiento neurocognitivo y el riesgo de deterioro neurocognitivo, en pacientes VIH sin comorbilidades graves, es independiente de que la supresión virológica se mantenga con un IP en MT o asociado con 2 nucleósidos

Tesis doctoral inédita, leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 18 de mayo de 2016, Introducción. Las alteraciones de la densidad mineral ósea (DMO) son frecuentes en los pacientes VIH. Evaluamos la pérdida de DMO y la evolución de los biomarcadores de metabolismo óseo asociadas al inicio del tratamiento antirretroviral comparando 2 pautas con y sin nucleósidos. Métodos. Se incluyeron pacientes infectados por VIH naïve a tratamiento antirretroviral que participaban en el subestudio óseo del ensayo clínico abierto, randomizado NEAT001/ANRS143, que evaluó eficacia y seguridad de darunavir (800 mg una vez al día) potenciado con ritonavir (100 mg una vez al día) acompañado de raltegravir (400 mg dos veces al día, pauta ahorradora de nucleósidos) o tenofovir (245 mg una vez al día) y emtricitabina (200 mg una vez al día, pauta estándar). Los criterios de inclusión fueron: carga viral VIH superior a 1000 copias/mL, recuento de células CD4 inferior a 500 cels/μL, excepto en los pacientes con infección sintomática. Los criterios de exclusión fueron: HBsAg positivo, embarazo, malignidad activa, aclaramiento de creatinina inferior a 60 mL/min, tratamiento para la osteoporosis, corticoides sistémicos o tratamiento con estrógenos. Se evaluó como objetivo primario el porcentaje medio de cambio en la DMO en columna, cadera y cuello femoral y los cambios en los biomarcadores óseos a las 48 semanas de seguimiento en las 2 pautas de tratamiento. Resultados. Se incluyeron 133 pacientes, 65 pacientes en el grupo de DRV/r + RAL y 68 pacientes en el grupo de DRV/r + TDF/FTC. A las 48 semanas de seguimiento el grupo tratado con DRV/r + TDF/FTC presento una mayor pérdida de DMO frente a la pauta libre de NRTI, diferencia media -1.49% (IC95% -2.94, - 0.04) en la columna lumbar, -2.04% (IC95% -3.53, -0.55) en el cuello femoral y - 2.57% (IC95% -3.79, -1.35) en la cadera. En cuanto a los nuevos casos de osteoporosis y de osteopenia, no se encontraron diferencias entre los 2 grupos de tratamiento, sin embargo el grupo expuesto a DRV/r + TDF/FTC presentó pérdida DMO ≥5% en 42.7% de los pacientes, frente al 13.9% del grupo tratado con DRV/r + RAL, (p=0.0002). No se encontraron diferencias entre los dos grupos en la aparición de nuevas fracturas. En cuanto a los biomarcadores óseos, se encontró un incremento significativamente mayor en el grupo tratado con DRV/r + TDF/FTC en tanto en los biomarcadores de formación como de resorción. La pérdida ósea ≥5% se asoció a niveles bajos de P1NP en la randomización (p=0.02). Discusión. Las pautas ahorradoras de NRTI, basadas en raltegravir, se asocian con una menor pérdida de DMO que las pautas convencionales, pudiendo ser consideradas en pacientes con alto riesgo de osteopenia y/o de osteoporosis., Introduction. Alterations in bone mineral density (BMD) are common in HIV patients. We evaluate BMD loss and evolution of biomarkers of bone metabolism associated with the initiation of antiretroviral therapy comparing two regimens with and without nucleosides. Methods. Antiretroviral-naïve adults with HIV were included into bone substudy of open clinical trial, randomized NEAT001 / ANRS143, which evaluated efficacy and safety of darunavir (800 mg once daily) boosted with ritonavir (100 mg once day) plus raltegravir (400 mg twice daily, NRTI-sparing regimen) or tenofovir (245 mg once daily) and emtricitabine (200 mg once daily, standard regimen). Inclusion criteria were: HIV viral load above 1000 copies/mL, CD4 count below 500 cells/uL, except in patients with symptomatic infection. Exclusion criteria were: HBsAg positive, pregnancy, active malignancy, creatinine clearance less than 60 mL / min, treatment for osteoporosis, systemic corticosteroids or oestrogen therapy. We evaluated the average percentage change in BMD at the spine, hip and femoral neck and changes in bone biomarkers at 48 weeks of follow-up in the 2 treatment guidelines as the primary objective. Results. 133 patients, 65 patients were included in the group of DRV/r + RAL and 68 patients in the DRV/r + TDF/FTC. At 48 weeks of follow-up, the group treated with DRV/r + TDF/FTC presented a higher BMD loss comparing to sparing-NRTI regimen, mean difference -1.49% (95% CI -2.94, -0.04) in lumbar spine, -2.04% (95% CI -3.53, -0.55) in femoral neck and -2.57% (95% CI -3.79, -1.35) in hip. Regarding to the new cases of osteoporosis and osteopenia, no differences between the 2 treatment groups were found, however the group treated with DRV/r + TDF/FTC presented loss DMO ≥5% in 42.7% of the patients, compared to 13.9% of the group treated with DRV/r + RAL (p = 0.0002). No differences between the two groups in the occurrence of new fractures were found. On the topic of bone biomarkers, a significantly greater increase in the group treated with DRV/ r + TDF/FTC in both formation and resorption biomarkers was found. Multivariate analyses showed relationship between bone loss greater than ≥5% and low levels of P1NP at randomization (p = 0.02). Discussion. The NRTI-sparing regimen, based on raltegravir, was associated with lower BMD loss than conventional regimen, and may be considered in patients with high risk of osteopenia or osteoporosis.

Tesis doctoral inédita, leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 02 de febrero de 2016

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 28 de Junio de 2013

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 16 de Noviembre de 2012.

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina. Departamento de Medicina. Fecha de lectura:26 de Junio de 2012

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 29 de Enero de 2009

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 23 de Septiembre de 2004

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 16 de Septiembre de 2004

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Medicina. Fecha de lectura: 8 de Julio de 2004

El receptor soluble de la transferrina (sTfR), es un nuevo marcador clínico del metabolismo del hierro, cuya utilidad diagnóstica todavía no está bien aclarada. El objetivo de este trabajo es evaluar la relación existente entre la concentración sérica de sTfR, y el metabolismo férrico en condiciones patológicas. Para ello se ha evaluado una serie de 172 pacientes con diversas enfermedades hematológicas, en quienes se realizó un examen hematimétrico completo, parámetros habituales del metabolismo del hierro, y estudiod e médula ósea. Los resultados demuestran que la concentración sérica de sTfR aumenta en situaciones de deficiencia funiconal de hierro tanto en la ferropenia como en el bloqueo del metal en los macrófagos, y también enla hiperplasia eritropoyética. Los niveles del parámetro descienden en la hipoplasia eritropoyética. En pacientes con alteraciones patológicas en la maduración de la serie roja, el comprotamiento del sTfR no es afectado por estos factores en la misma maginitud que en el resto de los pacientes. Este marcador no se comporta como un reactante de fase agusa. El sTfR no es un parámetro sensible ni específico para detectar la feropenia, porque no es un marcador del compartimento de depósito orgánico de hierro. Este parámetro puede ser utilizado como indicador de la deficiencia funcional de hierro, y también del grado de eritropoyesis . Pero si se utiliza como índice de deficiencia, se necesita conocer el grado de actividad eritropoyética del paciente. Y viceversa, su utilización como indicador de eritropoyesis, precisa el conocimiento del status férrico del individuo

El conocimiento de que las citoquinas pueden modular muchos aspectos de la respuesta inmune nos ha llevado a estudiar el efecto que diversos neuropeptidos podrían ejercer sobre su síntesis y liberación, asi como su influencia en la síntesis de otros mediadores de la respuesta inmune, como leucotrieno b4 y la neopterina. Por otra parte se sabe que tanto el envejecimiento como determinadas enfermedades se asocian a una respuesta inmune deficiente o alterada, que en el envejecimiento podría deberse a una alteración de las interacciones entre sistemas nervioso e inmune. Los resultados encontrados demuestran que el neuropeptido y, somatostatina, peptido intestinal vasoactivo y peptido liberador de gastrina a concentraciones fisiologicas aumentan, en general, la producción in vitro de il-1beta, il-6 y tnf-alfa por leucocitos humanos de sangre periferica en adultos jóvenes, ancianos sanos y ancianos diabéticos. Además, estos neuropeptidos pueden modular in vivo la producción de citoquinas inducida por activadores policlonales como el lipopolisacarido. Los neuropeptidos investigados no modifican la producción de leucotrieno b4 por células blancas de sangre periferica en ninguno de los grupos estudiados. Sin embargo si se incrementa la síntesis de neopterina, en general, por la acción del npy, somatostatina y grp. Los resultados encontrados confirman la interrelación entre los sistemas inmunes y nervioso, a la vez que se muestra una ruptura de esta relacion durante el envejecimiento y en pacientes con diabetes mellitus no insulin dependiente, aunque la producción de citoquinas y otros mediadores se mantenga.