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Las metodologías de edición genómica, especialmente aquellas basadas en el sistema CRISPR/Cas9 se han establecido en los últimos años como herramientas poderosas al servicio del mejoramiento vegetal. Recientemente se han reportado metodologías de edición genómica “libres de DNA” en plantas, las cuales garantizan la no incorporación de ADN foráneo al genoma y confieren ventajas a las variedades editadas desde el punto de vista de su regulación. Algunos países, entre ellos Estados Unidos y países de la región (Argentina y Brasil), han optado por una regulación en la que no se considera a los organismos editados dentro de la categoría de OGM. Esto repercutirá en la reducción de costos y tiempos de liberación de las nuevas variedades, así como en la percepción pública sobre los alimentos derivados de ellas. Resulta ventajoso que nuestro país se mantenga actualizado en las tecnologías que apoyan el mejoramiento vegetal. En este sentido, este proyecto buscó generar dos productos de utilidad: primero, una metodología optimizada para la edición genómica libre de DNA y segundo, una metodología de remplazo alélico valiéndose del sistema CRISPR/Cas9. Agencia Nacional de Investigación e Innovación

El descubrimiento del complejo CRISPR/Cas, formado por repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas asociadas a la nucleasa Cas, ha supuesto una revolución en el campo de la edición génica e ingeniería genética, convirtiéndose en la herramienta dominante para la manipulación génica de los sistemas biológicos. Este sistema fue hallado en el mecanismo de inmunidad adquirida de bacterias y arqueas, permitiendo incorporar material genético de fagos y plásmidos invasores en su ADN para, tras una nueva infección, ser capaces de reconocerlo mediante crRNA y degradarlo con los dominios nucleasa de Cas. La tecnología CRISPR/cas utiliza esta herramienta de reconocimiento y escisión del ADN presente en la naturaleza y la traslada a la edición génica, permitiendo a los investigadores silenciar, activar, añadir y cambiar genes o secuencias específicas. Además, a lo largo de los años, CRISPR/Cas ha sido modificada para conseguir técnicas más específicas y seguras que permiten aplicarlas en diversos campos de la biotecnología y la medicina, especialmente en la investigación y la terapéutica de enfermedades hasta ahora incurables. En este trabajo se realizará una revisión bibliográfica sistemática para explicar los principales métodos de edición génica y, más en profundidad, el funcionamiento de CRISPR/Cas9 como herramienta líder de edición. Describiré su estructura, sus características y sus modificaciones más importantes como las nicasas, los Editores de Bases y el Prime Editing, y además desarrollaré sus aplicaciones en la actualidad., Grado en Medicina

[ES] En los últimos años, la tecnología CRISPR ha revolucionado la ingeniería del genoma en las plantas. El sistema CRISPR / Cas ofrece una alternativa para la generación de rupturas de doble cadena de ADN (DSB) en un lugar específico, allanando el camino para mejorar los rasgos del organismo. La desactivación de genes se basa en los errores del mecanismo de reparación de ADN de unión final no homóloga (NHEJ) tras la producción de DSB hechos a propósito en los genes de interés, lo que da como resultado la interrupción de sus secuencias codificantes. En esta tesis de Master, hemos analizado la generación de estos DSB mediada por CRISPR-Cas12a / Cas9, así como explorar diferentes parámetros que podrían mejorar el rendimiento de Cas12a y Cas9 en N. benthamiana. Entre ellos, se evaluó la influencia de la temperatura en las eficiencia de edición, la capacidad de "multiplexing" de diferentes ortólogos de Cas o la implementación del sistema CRISPR / ErCas12a recientemente descrito. Además, estudiamos la fiabilidad de los algoritmos disponibles para predecir el rendimiento del ARN guía en N. benthamiana observando que los algoritmos disponibles para Cas12a son más precisos que los disponibles para Cas9. En contraste, la reparación de DSB mediada por HR permite su modificación dirigida al introducir una molécula de ADN donante con los cambios previstos para su reparación. Estas son la base de la modificación dirigida de genes y las estrategias de "knock-in". Sin embargo, su eficiencia reducida cuando se aplica en plantas ha limitado su utilidad. Por esta razón, esta tesis de Master también se ha centrado en un sistema para mejorar su rendimiento en N. benthamiana, evaluando el uso de replicones basados ​​en ADN, como geminivirus, para la introducción de la secuencia de ADN utilizada en estas estrategias de edición mediadas por recombinación homóloga., [EN] Over the past years, CRISPR technology has revolutionized genome engineering in plants. The CRISPR/Cas system provides an alternative for the generation of DNA Double Strand Breaks (DSBs) at a specific target locus, paving the way for improving organism traits. Gene knockout relies on the errors of the non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism upon the production of DSBs deliberately on the genes of interest, resulting in the disruption of their coding sequences. In this Master s thesis, we have analyzed CRISPR-Cas12a/Cas9-mediated generation of these DSBs, as well as explored different parameters that could improve Cas12a and Cas9 performance in N. benthamiana. Among them, temperature influence on the editing efficiencies, multiplexing capacity of different Cas orthologues, or the implementation of the recently described CRISPR/ErCas12a system were tested. Additionally, we studied the reliability of the available algorithms to predict guide RNAs performance in N. benthamiana observing that algorithms available for Cas12a are more accurate than those available for Cas9. In contrast, HR-mediated repair of DSBs allows their deliberate modification by introducing a donor DNA molecule with the intended changes for its repairing. These are the basis of gene targeting and gene knock-in strategies. Nevertheless, their reduced efficiency when applied in plants have limited their utility. For this reason, this Master s thesis has also focused on a system to improve their performance in N. benthamiana, evaluating the use of DNA-based replicons, such as geminiviruses, for the delivery of the DNA sequence used on these HR-mediated editing strategies.

Hace solo dos años fuimos testigos de la impactante noticia que anunciaba la corrección del gen anómalo de la enfermedad hereditaria miocardiopatía hipertrófica en embriones humanos por medio de la técnica CRISPR/CAS9 1, 2. Esta noticia movilizó la opinión científica y pública porque era el comienzo de la edición de embriones humanos. En ese momento se plantearon dudas éticas y de validación científica. Fil: Becu, Damasia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina

La herramienta CRISPR-Cas9 permite la edición genómica de un sitio específico del DNA en células individuales u organismos complejos. La modificación de la nucleasa Cas9 ha permitido la utilización de esta técnica para crear distintos modelos celulares, animales, hacer screenings funcionales o realizar terapia génica en tan solo 5 años después de su descripción. Actualmente se está empezando a utilizar en clínica, se han aprobado ya dos terapias, en China y Estados Unidos. Debido a su auge el conocimiento de esta técnica es imprescindible para cualquier investigador. En este trabajo se presentan los tipos de mutaciones que permite realizar CRISPR-Cas9, su aplicación en el descubrimiento de fármacos, la generación de modelos animales para el estudio de enfermedades y los últimos avances logrados en terapia génica. The CRISPR-Cas9 tool allows the genomic editing of a specific DNA site in individual cells or complex organisms. The modification of Cas9 nuclease allowed the use of this technique to create different cellular models, animal models, make functional screenings or perform gene therapy in only 5 years since its description. Currently CRISPR is being used in clinical practice, two therapies have already been approved in China and the United States. Due to its boom, the knowledge of this technique is required for any researcher. In this paper we present the types of mutations performed with CRISPR-Cas9, its application in drug discovery, the generation of disease animal models and the latest advances in gene therapy. L'eina CRISPR-Cas9 permet l'edició genòmica d'un lloc específic del DNA en cèl·lules individuals o organismes complexos. La modificació de la nucleasa Cas9 ha permès la utilització d'aquesta tècnica per crear diferents models cel·lulars, animals, fer screenings funcionals o realitzar teràpia gènica en tan sol 5 anys després de la seva descripció. Actualment s'està començant a utilitzar en clínica, s'han aprovat ja dues teràpies, a Xina i Estats Units. A causa del seu auge el coneixement d'aquesta tècnica és imprescindible per a qualsevol investigador. En aquest treball es presenten els tipus de mutacions que permet realitzar CRISPR-Cas9, la seva aplicació en el descobriment de fàrmacs, la generació de models animals per a l'estudi de malalties i els últims avanços assolits en teràpia gènica.

Traballo fin de grao (UDC.CIE). Bioloxía. Curso 2016/2017 [Resumen] El descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas y concretamente del sistema CRISPR-Cas9 ha supuesto una revolución en el campo de la ingeniería genómica y la biotecnología, puesto que permite editar cualquier región del genoma de cualquier organismo de manera altamente eficaz, precisa y económica. Así, desde su descubrimiento como un sistema natural de inmunidad adaptativa en organismos procariotas, sus características estructurales y funcionales han sido estudiadas y redefinidas hasta obtener variantes de CRISPR-Cas9 que incrementan la versatilidad de esta maquinaria para su empleo en investigación e industria. En el presente trabajo se realiza una revisión teórica de las características generales, estructura y función de CRISPR-Cas9 en la naturaleza así como de las funciones y aplicaciones que lo perfilan como una de las más novedosas y eficaces herramientas biotecnológicas conocidas. Además, para ejemplificar su empleo como mecanismo de edición genómica, se llevará a cabo el diseño de un proyecto experimental mediante el diseño de un oligonucleótido que permitirá la introducción y expresión de la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) en el organismo eucariota Saccharomyces cerevisiae. [Abstract] The discovery of CRISPR-Cas systems and specifically the CRISPR-Cas9 system has led to a revolution in the field of genomic engineering and biotechnology, since it allows to edit any region of the genome of any organism in a highly effective, precise and economical way. Thus, since its discovery as a natural system of adaptive immunity in prokaryotic organisms, its structural and functional characteristics have been studied and redefined until obtaining variants of CRISPR-Cas9 that increase the versatility of this machinery for its use in research and industry. In the present work a theoretical review of the general characteristics, structure and function of CRISPR-Cas9 in the nature as well as of the functions and applications that profile it as one of the most novel and effective known biotechnological tools. In addition, to exemplify its use as a genomic editing mechanism, the design of an experimental project will be carried out by designing an oligonucleotide that will allow the introduction and expression of the GFP (Green Fluorescent Protein) protein in the eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae. [Resumo] O descubrimento dos sistemas CRISPR-Cas e concretamente do sistema CRISPRCas9 supuxo unha revolución no campo da inxeniería xenómica e a biotecnoloxía, posto que permite editar calquera rexión do xenoma de calquera organismo de maneira altamente eficaz, precisa e económica. Así, dende o seu descubrimento como un sistema natural de inmunidade adaptativa en organismos procariotas, a súas características estructurais e funcionais foron estudadas e redefinidas ata obter variantes de CRISPRCas9 que incrementan a versatilidades desta maquinaria para o seu emprego en investigación e industria. No presente traballo realízase unha revisión teórica das características xerais, estructura e función de CRISPR-Cas9 na natureza así como das funcións e aplicacións que o perfilan como unha das máis novedosas e eficaces ferramentas biotecnolóxicas coñecidas. Ademáis, para exemplificar o seu emprego como mecanismo de edición xenómica, levaráse a cabo o deseño dun proxecto experimental mediante o deseño dun oligonucleótido que permitirá a introducción e expresión da proteína GFP (Green Fluorescent Protein) no organsimo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Las nuevas tecnologías para la edición de genomas, como los TALEN y el sistema CRISPR/Cas9, representan una gran oportunidad para mejorar características deseables en diferentes organismos. Los TALEN son el resultado del acoplamiento de nucleasas a los TALE (Transcription Activator-Like Effectors), los cuales son efectores naturales de gran importancia en la patogénesis de las especies de Xanthomonas. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) es el agente causal del añublo bacteriano de la yuca, quien durante el proceso patogénico es capaz de translocar sus efectores a la célula vegetal mediante el sistema de secreción tipo tres (SSTT). Actualmente no hay protocolos estándar para la edición de genomas en yuca. En este estudio se exploró la posibilidad de translocar efectores sobre callo embriogénico friable (CEF) a través de la inoculación con Xam, con el fin de determinar el potencial de este patógeno como sistema de entrega de TALEN. El CEF de dos variedades de yuca susceptibles (COL2215 y cv. 60444) se cocultivaron con la cepa Xam668 a diferentes tiempos. Posteriormente, se evaluó la expresión de marcadores correspondientes a los genes blanco conocidos para los TALE presentes en esta cepa bacteriana. Aunque no se logró demostrar la translocación de los mismos en el tejido embriogénico, sí se lograron establecer condiciones adecuadas de cocultivo con Xam y el efecto que la infección bacteriana tiene sobre la regeneración de embriones a partir de este tejido. Palabras clave: cultivo de tejidos vegetales, edición de genomas, sistema de secreción tipo tres, efectores TALE, transformación. New technologies for genome edition, such as TALENs and CRISPR/Cas9 system, are a great opportunity to improve desirable features in different organisms. TALENs are the result from coupling nucleases and TALEs (Transcription Activator-Like Effectors), which are natural effectors with an important role in pathogenicity for the Xanthomonas species. Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) is the cassava bacterial blight causal agent, and this pathogen is able to translocate its effectors to the plant cell during pathogenesis by using the type-three secretion system (TTSS). Currently, there are no standard protocols for genome edition in cassava. In this study, we explored the possibility to translocate effectors to friable embryogenic calli (FEC) through Xam inoculation, in order to establish the potential of this pathogen as a TALEN delivery system. Friable embryogenic calli derived from two different susceptible varieties (COL2215 and cv. 60444) were co-cultured with the strain Xam668 using different culture times. Subsequently, we evaluated the expression of makers corresponding to reported target genes for TALEs present in this bacterial strain. Although we were not able to demonstrate effector translocation, we established the conditions for co-culturing cassava calli and Xam and determined the effects derived from bacterial infection on embryo regeneration from FECs.Key words: Genome edition; plant tissue culture; TALEs; transformation; type-three secretion system.

Desde su descubrimiento, a finales de la década de los ochenta, hasta la actualidad, las secuencias denominadas CRISPR, se han revelado como instrumentos a través de los cuáles provocar cambios dirigidos en secuencias génicas de interés. El conocimiento de su función y actuación natural en microorganismos permitió a los científicos, sospechar sus posibles aplicaciones como herramienta de edición genómica ya que el sistema era capaz de reconocer elementos genéticos externos, incorporarlos y, tras esto, identificarlos mediante apareamiento de bases y cortarlos. Es este último mecanismo, el de identificación por apareamiento de bases y corte de la secuencia, el que se aprovecha en aplicaciones de ingeniería genómica. La herramienta se compone de dos elementos claramente diferenciados, la fracción nucleotídica constituida, normalmente, por el sgRNA y, la fracción enzimática representada por Cas9. Una vez introducido el sistema en la célula requerida, el sgRNA diseñado de manera específica, guía y señaliza a la proteína Cas9 la posición de la secuencia a modificar mientras que es esta última la que induce un doble corte en el DNA celular. A partir de este momento, es tarea de los sistemas de reparación celular el introducir la mutación deseada. Se tienen dos vías de reparación, la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la vía de reparación directa por homología (HDR). Mediante la vía NHEJ se promueven mutaciones de inserción o deleción que generan, por un cambio en la pauta de lectura, un codón de terminación y, por tanto, una disrupción del gen. Si lo que se desea es modificar la secuencia génica sin truncarla, se debe proporcionar a la célula un molde de reparación portador de la mutación puntual pretendida y se sigue la vía HDR. No obstante, modificando de diferente manera la proteína Cas9, la herramienta es capaz de provocar otro tipo de cambios o de ejercer diversas funciones como la de regulador transcripcional entre otras. Así pues, la importancia del sistema CRISPR-Cas como herramienta de edición genómica, recae en su capacidad para guiar y marcar dianas en el DNA no mediante interacciones DNA-proteína, sino mediante un apareamiento DNA-RNA que promete ser más específico. A través del desarrollo de la técnica de uso y la optimización y depuración de la misma, se prevé que, en un futuro, sea posible la aplicación rutinaria de la tecnología CRISPR-Cas tanto en investigación básica, dónde ya se emplea, como en biotecnología y medicina.