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La tecnología phage display permite la generación de librerías de anticuerpos monoclonales para su uso en investigación, diagnóstico y terapia. En este estudio, se reporta la construcción de una librería inmune de anticuerpos presentados en bacteriófagos, contra la enzima NAD quinasa de Plasmodium falciparum. La proteína NAD quinasa recombinante fue expresada en E. coli de forma completa y truncada, y esta última se purificó desde la fracción insoluble para la construcción de la librería. Los fragmentos variables de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos, se amplificaron desde ADNc de ratón y se clonaron en el fásmido pSEX81. La presentación de la librería se realizó sobre el bacteriófago ayudador M13KO7ΔpIII, con posterior selección por afinidad. Para la identificación de los bacteriófagos, se validó un ensayo de ELISA indirecto utilizando anticuerpos IgY. Los análisis por PCR indicaron la correcta clonación de las cadenas ligeras y pesadas en el fásmido, con un tamaño de librería de 1x107 cfu. El ensayo de ELISA indirecto permitió la detección de 3.6x106 pfu/mL. Después de tres rondas sucesivas de biopanning, con un enriquecimiento de más de 50 mil veces, se lograron aislar 6 bacteriófagos-scFv monoclonales específicos contra la proteína PfNADK. La evaluación de uno de los fagos-scFv demostró alta especificidad, con capacidad para detectar desde 8.4 ng de PfNADK. Adicionalmente, cuatro fragmentos scFv se caracterización mediante secuenciación de ADN, modelado tridimensional y acoplamiento molecular, sugiriendo así la posible interacción con la PfNADK que permite su reconocimiento específico. Finalmente, el uso de esta metodología es un punto de partida importante para la producción de anticuerpos recombinantes a nivel local, lo cual reduciría los costos de estos biológicos en nuestro país. (Texto tomado de la fuente) Phage display technology enables the generation of monoclonal antibody libraries for use in research, diagnosis, and therapy. In this study, construction of an immune library of antibodies presented on bacteriophages, against the enzyme NAD kinase from Plasmodium falciparum is reported. Recombinant NAD kinase protein was expressed in E. coli in full-length and truncated form, and the latter was purified from the insoluble fraction for library construction. The variable fragments of heavy and light chains of the antibodies were amplified from mouse cDNA and cloned into the phagemid pSEX81. Library presentation was performed on the helper bacteriophage M13KO7ΔpIII, with subsequent affinity selection. For identification of bacteriophages, an indirect ELISA assay using IgY antibodies was validated. PCR analysis indicated correct cloning of the heavy and light chains in the phagemid, with a library size of 1x107 cfu. The indirect ELISA assay allowed the detection of 3.6x106 pfu/mL. After three successive rounds of biopanning, with an enrichment of more than 50 thousand times, it was possible to isolate 6 specific monoclonal bacteriophage-scFv against the PfNADK protein. The evaluation of one of the phage-scFv demonstrated high specificity, with the capacity to detect 8.4 ng of PfNADK. Additionally, four scFv fragments were characterized by DNA sequencing, three-dimensional modeling, and molecular docking, thus suggesting the possible interaction with PfNADK that allows its specific recognition. Finally, the use of this methodology is an important starting point for the production of recombinant antibodies at the local level, which would reduce the costs of these biologics in our country. Maestría Magíster en Ciencias - Bioquímica Metabolismo energético de parásitos protozoarios

RESUMEN En los últimos 10 años, los científicos han logrado simular la evolución natural en sus laboratorios. Este proceso se denomina evolución dirigida, e inicia con un gen o secuencia diana. A partir de esta secuencia del gen se generan bibliotecas de genes mutantes utilizando mutagénesis aleatoria mediante la técnica de PCR propensa a error: epPCR. Las librerías generadas son sometidas a procesos de selección o tamizaje para identificar las proteínas ganadoras de una función o funciones en particular, con respecto a la proteína de la cual se originaron. Otra manera de identificar los productos generados en este largo proceso evolutivo es por medio de los análisis de coevolución, los cuales son de mucha ayuda cuando no existen procesos de selección y el método de tamizaje disponible para encontrar mutantes es muy lento, limitando el número de mutantes a muestrear para obtener una variante mejorada. En la coevolución, se analizan los patrones de variación de residuos que forman un contacto entre sí, porque dichas mutaciones cambian el empaquetamiento de la proteína y pueden provocar modificaciones de función, estabilidad, selectividad, incluso cuando están lejos del sitio activo. La presión de selección a la que son sometidas las proteínas hace que dos residuos que se encuentran en contacto varíen de forma correlacionada cuando son importantes para la función. Por lo anterior, la evolución dirigida aunada a la coevolución son unas de las técnicas más exitosas de la biología molecular y de frontera que nos permiten explorar y mejorar las funciones en una gran cantidad de proteínas de interés médico, biotecnológico, industrial, etc, en un tiempo muy corto. ABSTRACT In the last 10 years, scientists have been able to simulate natural evolution in laboratories through the process of directed evolution, which begins with a target gene or sequence for which a mutant gene library is generated using random mutagenesis. After producing such libraries through the technique of error-prone PCR (epPCR), they are subjected to selection or screening for the identification of improved proteins towards a particular function or functions when compared to the protein that originated them. Another methodology to harness the products of the long evolutionary history is the coevolution analysis, which is very helpful when no selection strategy is feasible and the screening method available to sift mutants is very slow, limiting the number of mutants that can be sampled to find an improved variant. In the coevolution analysis, the variation patterns of residues in contact are analyzed, because mutations in these residues change the residue packing in the protein, thus, producing modifications in function, stability, selectivity, even when residue substitution is far from the active site. The selection acting on proteins force two residues in contact to vary in a correlated way when they are important for function. Therefore, directed evolution coupled with coevolution are some of the most successful techniques in molecular and frontier biology that allow us to explore and improve the functions of a large number of proteins of medical, biotechnological, industrial interest, etc., in a very short time., {"references":["Brinda K V., Vishveshwara S. Oligomeric protein structure networks: Insights into protein-protein interactions. BMC Bioinformatics 2005;6. https://doi.org/10.1186/1471-2105-6-296.","Mei G, Di Venere A, Rosato N, Finazzi-Agrò A. The importance of being dimeric. 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El diagnóstico serológico de infecciones en curso es crítico para definir el tratamiento a emplear, prevenir problemas durante la gestación (ej. toxoplasmosis), controles en trasplantes, transfusiones de sangre y epidemiología. La respuesta de anticuerpos IgM es un parámetro relevante en este tipo de diagnóstico por su aparición temprana en suero durante las infecciones. Dicha respuesta puede ser medida por inmunoensayos de serología que utilizan superficies de captura con anticuerpos convencionales anti-IgM de alta especificidad. La primera meta de este proyecto consistió en desarrollar un reactivo anti-IgM genérico altamente estandarizado basado en nanobodies biotinilados capaces de inmovilizarse en forma orientada y generar superficies de alta eficiencia de captura. Para esto se siguió una metodología que permitió la obtención de nanobodies que demostraron buen desempeño para captura de IgM mediante su evaluación en inmunoensayos modelo de diagnóstico para los virus Dengue y Zika. Otra meta del proyecto consistió en desarrollar calibradores recombinantes para inmunoensayos serológicos. Los calibradores permiten discriminar entre sueros positivos y negativos, y típicamente se formulan utilizando sueros estándares caracterizados. Debido a que son finitos, cada vez que los sueros se agotan nuevos lotes deben ser generados y validados, elevando los costos de los kits diagnósticos. En este trabajo se desarrolló un calibrador constituido por una quimera nanobody-Fc. El componente Fc contiene los dominios constantes de IgM humana y es reconocido por el nanobody anti-IgM, y el componente nanobody es específico contra el antígeno del inmunoensayo serológico, en este caso se utilizó un nanobody anti-NS1 de Zika como modelo. La quimera fue producida con altos rendimientos a partir de cultivos de células de mamíferos y demostró ser funcional en los inmunoensayos. Tanto los nanobodies anti-IgM como el calibrador se presentan como valorables herramientas en el área diagnostico capaces de mejorar la estandarización de las pruebas de diagnóstico de infecciones agudas. Agencia Nacional de Investigación e Innovación

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Cellular penetrating peptides (CPPs) belong to a new class of delivery vectors for different molecules. They are classified by their physicochemical properties into cationic, hydrophobic and amphipathic. According to their origin they can be natural, chimeric or synthetic. CPPs can bind different molecules (charges), such as imaging agents, drugs, proteins, DNA, and RNA. Some proposed mechanisms for cellular uptake of CPP are direct translocation, endocytosis, and translocation through the formation of a membrane structure.This depends on factors such as the method of binding the charge to the CPPs, temperature and pH. In the present work, CPPs that were found in the viral library Ph.D.-Phage Display, which have 10? combinations of 12 amino acid peptides, were isolated. The objective was to identify and isolate peptides capable of translocating to the pig oocyte cell membrane. Five experiments were performed independently, plus three rounds of selection (bioppaning) for each. Pig oocytes without membranes such as the granulosa layer and the pellucid zone were used. Each round of selection, to isolate the CPPs, consisted of incubating the viral library with the oocytes (15-20 in each selection), then the virus was eliminated in a first step by cell washes and finally by treatment of the oocytes with trypsin. The cell lysate was amplified in E. coli 2738 K12 and a viral plaque was performed to verify the existence of bacteriophages. From this experiment, the second round of selection was carried out and finally, from the second round of selection, the third round was carried out. Los péptidos penetrantes celulares (CPP) pertenecen a una nueva clase de vectores de administración de diferentes moléculas. Se clasifican por sus propiedades fisicoquímicas en catiónicos, hidrofóbicos y anfipáticos. De acuerdo con su origen pueden se naturales, quimérico o sintéticos. A los CPP se les puede unir diferentes moléculas (cargos), tales como agentes de imagen, cargas biológicas, drogas, proteínas, ADN y ARN. Algunos mecanismos propuestos para la captación celular de los CPP son, la translocación directa, endocitosis y translocación a través de la formación de una estructura de membrana. Lo anterior depende de factores, tales como, el método de unión del cargo al CPP, la temperatura y el pH. En el presente trabajo se aislaron CPP que se encuentran en la biblioteca viral Ph.D.-Phage Display, la cual posee 10? combinaciones de péptidos de 12 aminoácidos. El objetivo fue identificar y aislar los péptidos capaces de translocarse a la membrana celular del ovocito de cerdo. Se realizaron cinco experimentos de manera independiente, además de tres rondas de selección (bioppaning) para cada uno. Se utilizaron ovocitos de cerdo sin membranas tales como la capa de la granulosa y la zona pelúcida. Cada ronda de selección, para aislar a los CPP, consistió en incubar la biblioteca viral con los ovocitos (15-20 en cada selección) posteriormente se eliminó el virus en un primer paso por lavados celulares y finalmente por tratamiento de los ovocitos con tripsina. Se amplificó el lisado celular en E. coli 2738 K12 y se realizó un plaqueo viral para comprobar la existencia de bacteriófagos. A partir de dicho experimento se realizó la segunda ronda de selección y finalmente a partir de la segunda ronda de selección se realizó la tercera.

El objetivo del estudio fue seleccionar de una biblioteca combinatoria de fagos filamentosos clonas que mimeticen la proteína N del virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS) utilizando un anticuerpo monoclonal (SDOW17). Se utilizó una biblioteca combinatoria de fagos filamentosos (M13) que expone aleatoriamente péptidos de 7 aminoácidos en la región N-terminal fusionado con la proteína III. Para determinar el efecto del enriquecimiento después de cada ronda de selección, los fagos eluidos fueron titulados; estos se incrementaron de 4,8 x 10³ unidades formadoras de colonias (ufc) en la primera ronda a 3,2 x 10(5) ufc en la tercera. Después de tres rondas de selección, 32 clonas fueron picadas al azar, cada clona individual fue amplificada, purificada y titulada. La reactividad de la unión de las clonas a los anticuerpos anti-PRRS fue determinado utilizando un ELISA de fagos. El alineamiento de las clonas secuenciadas con la obtenida del GenBank, ubican a estas en la región aminoterminal y porción media de la proteína N del vPRRS. La secuencia consenso de las 32 clonas seleccionadas fue NYRYQ. Las secuencias de los mimotopos fueron utilizadas para calcular los epitopos de la proteína N, mediante la herramienta bioinformática del servidor Peptiope con el algoritmo PepSurf. Dos epitopos conformacionales contra el anticuerpo monoclonal antiproteína N fueron identificados, localizados en diferentes posiciones y presentados principalmente como hélices a. Los mimotopos seleccionados y epitopos conformacionales podrían ser considerados informativos para el diagnóstico de la enfermedad. The aim of the present study was to select phage clones from a combinatorial library of filamentous phage that mimic the N protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRS) using a monoclonal antibody (SDOW17). An combinatorial library of random peptide 7-mer cysteine-constrained fused to a minor coat protein (pIII) of the M13 phage was used. To determine the effect of enrichment after each round of selection, the eluted phage were titrated, bacteriophages increased from 4,8 x 10³ plaque-forming units (pfu) in the first round to 3,2 x 10(5) pfu in the third round. After three rounds of panning 32 phage clones were randomly picked, each individual clone was amplified, purified and titred. The binding reactivity of phage clones with anti-PRRS antibodies was determined using a phage ELISA. Alignments of the selected clones with the published sequences of the N protein of PRRS virus were located at the amino terminal region and middle portion of the protein. The consensus amino acid residues of the 32 mimotopes sequenced was NYRYQ. Mimotope sequences were used to calculate the epitopes of the nucleocapsid protein by the web tool of Peptiope server with PepSurf algorithm. Two conformational epitopes against monoclonal antibody anti-protein N were identified, located in a different position and appeared mainly as an a-helix. The selected mimotopes and conformational epitopes could be regarded as informative for diagnosis of disease.

The aim of the present study was to select phage clones from a combinatorial library of filamentous phage that mimic the N protein of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRS) using a monoclonal antibody (SDOW17). An combinatorial library of random peptide 7-mer cysteine-constrained fused to a minor coat protein (pIII) of the M13 phage was used. To determine the effect of enrichment after each round of selection, the eluted phage were titrated, bacteriophages increased from 4,8 x 103plaque-forming units (pfu) in the first round to 3,2 x 105pfu in the third round. After three rounds of panning 32 phage clones were randomly picked, each individual clone was amplified, purified and titred. The binding reactivity of phage clones with anti-PRRS antibodies was determined using a phage ELISA. Alignments of the selected clones with the published sequences of the N protein of PRRS virus were located at the amino terminal region and middle portion of the protein. The consensus amino acid residues of the 32 mimotopes sequenced was NYRYQ. Mimotope sequences were used to calculate the epitopes of the nucleocapsid protein by the web tool of Peptiope server with PepSurf algorithm. Two conformational epitopes against monoclonal antibody anti-protein N were identified, located in a different position and appeared mainly as an a-helix. The selected mimotopes and conformational epitopes could be regarded as informative for diagnosis of disease. &nbsp, El objetivo del estudio fue seleccionar de una biblioteca combinatoria de fagos filamentosos clonas que mimeticen la proteína N del virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS) utilizando un anticuerpo monoclonal (SDOW17). Se utilizó una biblioteca combinatoria de fagos filamentosos (M13) que expone aleatoriamente péptidos de 7 aminoácidos en la región N-terminal fusionado con la proteína III. Para determinar el efecto del enriquecimiento después de cada ronda de selección, los fagos eluidos fueron titulados; estos se incrementaron de 4,8 x 103unidades formadoras de colonias (ufc) en la primera ronda a 3,2 x 105ufc en la tercera. Después de tres rondas de selección, 32 clonas fueron picadas al azar, cada clona individual fue amplificada, purificada y titulada. La reactividad de la unión de las clonas a los anticuerpos anti-PRRS fue determinado utilizando un ELISA de fagos. El alineamiento de las clonas secuenciadas con la obtenida del GenBank, ubican a estas en la región aminoterminal y porción media de la proteína N del vPRRS. La secuencia consenso de las 32 clonas seleccionadas fue NYRYQ. Las secuencias de los mimotopos fueron utilizadas para calcular los epitopos de la proteína N, mediante la herramienta bioinformática del servidor Peptiope con el algoritmo PepSurf. Dos epitopos conformacionales contra el anticuerpo monoclonal antiproteína N fueron identificados, localizados en diferentes posiciones y presentados principalmente como hélices a. Los mimotopos seleccionados y epitopos conformacionales podrían ser considerados informativos para el diagnóstico de la enfermedad. &nbsp

Interés del estudio La adhesión a la mucosa y epitelio intestinal constituye una importante característica de los probióticos que condiciona su permanencia en el intestino y su capacidad de interactuar con el huésped. Sin embargo, la información sobre este proceso a nivel molecular es escasa. Objetivos Se abordó la caracterización de la capacidad de adhesión de una colección de cepas de la especie Lactobacillus casei, de diferentes orígenes, sobre proteínas que forman la matriz extracelular y se aplicaron diferentes técnicas analíticas para identificar factores proteicos implicados en la adhesión en una cepa modelo de L. casei. Elementos de la metodología a destacar La metodología incluye el análisis in silico de la presencia de factores de adhesión, la obtención de mutantes en L. casei y su caracterización fenotípica en adhesión a proteínas y a líneas celulares, la identificación de factores de superficie con capacidad de adhesión por espectrometría de masas y phage display y la caracterización de la adhesión de estos purificados de manera recombinante. Resultados logrados Se ha determinado que la capacidad de adhesión es multifactorial, con un componente mayoritario proteico, no existiendo relación con el origen de la cepa. Se han identificado varias proteínas de L. casei con capacidad de adhesión. Entre ellas cabe destacar proteínas de localización primaria citoplásmática (p.ej. enolasa y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) que se encuentran expuestas en superficie y presentan capacidad adhesiva. Se ha caracterizado la presencia en superficie de L. casei de proteínas ancladas covalentemente por mecanismo dependiente de enzimas sortasa. Se han identificado las sortasas presentes en L. casei y su papel en la adhesión se ha evaluado mediante la construcción de mutantes, comprobándose que parte de ellas juegan un papel en ésta. I, Muñoz Provencio, D. (2011). Caracterización de factores de adhesión a proteínas de la matriz extracelular en Lactobacillus casei [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/14013., Palancia