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Begomoviruses (family Geminiviridae) cause serious diseases in many crop families. Since 2013, the Spanish isolate of tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) has been a limiting factor for cucurbits production in the Mediterranean basin, forcing farmers to adapt new management and control techniques. Although it is well-known that begomoviruses are naturally transmitted by the whitefly Bemisia tabaci, the capacity of these viruses to be vertically transmitted through seeds remains controversial. Clarifying the potential ToLCNDV seed transmission is essential to understand the epidemiology of this threating-for-cucurbits virus and to design appropriate control strategies. We assessed ToLCNDV distribution in the leaves, flowers and seeds of the infected plants of susceptible Cucumis melo accessions and toleration to the infected genotypes of Cucurbita moschata by conventional and quantitative PCR. We analyzed whether the viral particle was transmitted to offspring. We also evaluated ToLCNDV presence in commercial seeds of cucurbits (zucchini (Cucurbita pepo), melon (C. melo), cucumber (Cucumis sativus) and watermelon (Citrullus lanatus)) and in their progenies. As the assayed seedlings remained symptomless, we increased the reliability and accuracy of detection in these samples by searching for replicative forms of ToLCNDV by combining Southern blot hybridization and rolling-circle amplification (RCA). However, integral genomic DNA was not identified in the plants of offspring. Although the seedborne nature of ToLCNDV was confirmed, our results do not support the transmission of this virus from contaminated seeds to progeny.

[ES] Las mutaciones puntuales dirigidas a través de técnicas de edición del genoma tienen un gran potencial para desarrollar variedades mejoradas de cultivos, ya que muchos rasgos agronómicos están determinados por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). La edición de bases es una nueva técnica de edición del genoma que permite la creación de cambios precisos de un solo par de bases de una manera programable. Hay dos tipos de editores de base (BE): los editores de base de citosina (CBE) que realizan conversiones de base de C-a-T y los editores de base de adenina (ABE) que realizan conversiones de base de A-a-G. Recientemente, se han desarrollado CBE para ediciones de base C-a-G o C-a-A para animales y bacterias. En este estudio, desarrollamos CBE para la edición de bases C-a-G / C-a-A en plantas. Para cuantificar la eficiencia de la edición, desarrollamos un sistema de selección de GFP para detectar rápidamente la edición de base en protoplastos de maíz. El sistema emplea un reportero de GFP inactivo que se activa con la conversión de bases de C-a-G o C-a-A. Se probaron siete CBE y seis reporteros GFP, sin embargo, no se observó edición de base de C-a-G o de C-a-A usando los reporteros. La edición de bases puede variar según el gene diana. Por lo tanto, evaluar los editores de base en genes endógenos puede proporcionar una estimación más precisa de la eficiencia de edición del editor de base en genes que codifican para rasgos específicos en plantas. Probamos trece sitios diana dentro de seis genes de maíz (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) mediante edición de base única y multiplex. Once de los sitios de diana [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1 (2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2)], EMP16 (5-1, 5-2)] mostró >10% de edición C-a-T y solo un sitio diana [DWF4 (4-2)] mostró un 9% de edición C-a-G. Nuestros resultados sugieren que nuestros BE tienen una baja actividad de edición C-a-G / C-a-A y que utilizar genes endógenos para cuantificar este tipo de ediciones pu, [EN] Targeted point mutations via genome editing techniques have great potential for developing improved crop varieties as many important agronomic traits are determined by single nucleotide polymorphisms (SNPs). Base editing is a new genome-editing technique that enables the creation of precise single base-pair changes in a programmable manner. There are two types of base editors (BEs): Cytosine Base editors (CBEs) that make C-to-T base conversions and Adenine Base Editors (ABEs) that make A-to-G base conversions. Recently, CBEs for C-to-non-T base edits have been developed for mammalian and bacterial systems. In this study, we developed CBEs for C-to-G/C-to-A base editing in plant systems. To quantify editing efficiency, we developed a GFP screening system to quickly detect base editing in maize protoplasts. The system employs an inactive GFP reporter that is activated upon C-to-G or C-to-A base editing. Seven CBEs and Six GFP reporters were tested, however, no C-to-G or C-to-A base editing was observed using the reporter systems. Base editing activity can vary depending on the target site. Thus, testing base editors on endogenous targets can give a more accurate estimation of base editor editing efficiency on specific traits in plants. Here, we tested thirteen target sites within six maize genes (GRF1, FEA3, SMK1, LG2, DWF4, EMP16) by single and multiplex base editing. Eleven of the target sites [GRF1, FEA3 (1-1, 1-2), SMK1(2-1, 2-2), LG2 (3-1, 3-2), DWF4 (4-1, 4-2), EMP16 (5-1, 5-2)] showed >10% of C-to-T base editing and only one target site [DWF4 (4-2)] showed a 9% of C-to-G base editing. Our results suggest that our BEs have low C-to-G/C-to-A editing activity and that endogenous targets can be a better approach than a fluorescent reporter system to quantify C-to-G or C-to-A editing outcomes.

[ES] La familia de las cucurbitáceas (Cucurbitaceae) está constituida por una gran diversidad de géneros y especies, entre los que se encuentran cultivos de elevado valor agronómico como el pepino (Cucumis sativus). Entre los principales factores que amenazan su cultivo y producción a nivel mundial destacan las enfermedades causadas por virus. En España, el virus de la hoja rizada del tomate de Nueva Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV) se detectó por primera vez en el sudeste peninsular durante la campaña 2012-2013 infectando sobre todo cultivos de calabacín. Sin embargo, en los últimos años se ha descrito un incremento de la incidencia de esta virosis en explotaciones intensivas de pepino, mermando las cosechas y su rentabilidad económica. La estrategia de control más efectiva para combatir las enfermedades víricas es el empleo de variedades que incorporen genes de resistencia. En trabajos previos, los grupos de virología y mejora genética de cucurbitáceas del COMAV-UPV llevaron a cabo un cribado de colecciones de germoplasma de C. sativus que incluían accesiones de diversos orígenes geográficos. Estas evaluaciones permitieron identificar tres fuentes de resistencia al virus en pepino, todas ellas procedentes de la India. El objetivo de este Trabajo Final de Máster es el estudio del tipo de herencia que controla la resistencia al ToLCNDV en una de las accesiones de pepino resistentes al virus. Para ello, se ha realizado el cruce entre plantas del genotipo resistente con un genotipo susceptible. Los híbridos F1 obtenidos se han autofecundado y retrocruzado para generar las poblaciones segregantes F2 y BC. Todas las plantas de las diferentes familias obtenidas han sido inoculadas mecánicamente con un clon infeccioso del virus y fenotipadas según su nivel de sintomatología y carga viral por tissue printing. La proporción de plantas resistentes:susceptibles observadas en cada población segregante es compatible con un modelo de herencia monogénico recesivo, [EN] The cucurbit family (Cucurbitaceae) is constituted by diverse genera and species, among which are crops of high agronomic value such as cucumber (Cucumis sativus). Among the main factors that threaten its cultivation and production worldwide are diseases caused by viruses. In Spain, Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) was detected for the first time in southern peninsular during the 2012-2013 season, infecting mainly zucchini crops. However, an increasement in the incidence of this virus has been described recently in intensive cucumber farms, reducing harvests and their economic profitability. The most effective control strategy to control viral diseases is the use of varieties with resistance genes. In previous works, both Virology and Cucurbit Breeding groups at COMAV-UPV institute carried out a screening of C. sativus germplasm collections that included accessions from diverse geographical origins. These evaluations made possible to identify three sources of resistance to the virus in cucumber, all of them original from India. The objective of this Final Master's Thesis is the study of the inheritance that controls resistance to ToLCNDV in one of the virus-resistant cucumber accessions. For this purpose, crosses between resistant and susceptible cucumber plants were carried out. The resulting F1 hybrids have been selfed and backcrossed to generate the segregating populations F2 and BCs. All the plants belonging to the different families have been mechanically inoculated with an infectious clone of the virus and phenotyped according to symptom development and viral load by tissue printing. The ratio of resistant:susceptible plants observed in each segregating population is consistent with a recessive monogenic inheritance pattern. A genotyping assay by single nucleotide polymorphism (SNPs) molecular markers, distributed along the seven chromosomes of C. sativus, was performed to identify the region or regions of the cucumber genome involved in the res

Tesis por compendio, [ES] En las últimas décadas, se ha observado un incremento en la emergencia de nuevas virosis en los cultivos del sudeste español, principal región abastecedora de frutas y hortalizas al resto de Europa. Entre las virosis emergentes más recientes en esta área de cultivo, se encuentra el tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartito transmitido por moscas blancas (Bemisia tabaci). En 2012 se detectó por primera vez en las provincias de Murcia y Almería, y desde entonces se está propagando por otros países de la cuenca del Mediterráneo, generando graves daños en los cultivos de cucurbitáceas, y limitando la producción, principalmente, de calabacín (Cucurbita pepo) y melón (Cucumis melo). En esta tesis doctoral se ha desarrollado un programa de mejora genética enfocado a la obtención de variedades de cucurbitáceas resistentes al aislado español del ToLCNDV(-ES). Por primera vez, hemos identificado fuentes de resistencia al ToLCNDV en el género Cucurbita y en pepino (Cucumis sativus). Todas las accesiones resistentes que describimos pertenecen a tipos silvestres o variedades locales, la mayoría originarias de la India, donde se describió por primera vez el ToLCNDV. Es posible que en esta área se haya producido un fenómeno de co-evolución entre plantas silvestres de cucurbitáceas y este begomovirus. Dos accesiones de Cucurbita moschata han mostrado un elevado nivel de resistencia, y a pesar de su cruzabilidad intermedia con C. pepo, ha sido posible la obtención de descendencia interespecífica y la transferencia parcial de la resistencia. Las accesiones resistentes identificadas se han caracterizado para determinar el tipo de herencia que regula la resistencia al ToLCNDV. Mediante el desarrollo de poblaciones segregantes de mejora y el aprovechamiento de herramientas genéticas de mapeo y cartografía hemos identificado tres QTLs que controlan la resistencia al ToLCNDV en melón, uno de efecto mayor y herencia parcialmente dominante en el cro, [EN] Different factors promote the emergence of new viruses in crops of the Southeastern Spain, the main supplier region of vegetables and fruits to the rest of European countries. A new strain of tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) is among the most recent emergent viral diseases in this farming area, a bipartite begomovirus naturally transmitted by whiteflies (Bemisia tabaci). This strain was first detected in 2012 in the provinces of Murcia and Almeria, from where it propagated to other Mediterranean countries. ToLCNDV generates severe damages in cucurbits, decreasing yields mainly in squash (Cucurbita pepo) and melon (Cucumis melo) crops. In this doctoral thesis, a breeding program has been developed to obtain cucurbit varieties with resistance to the Spanish strain of ToLCNDV(-ES). Although cucurbit germplasm with resistance genes to this virus is poor and localized in few accessions, in this work we have identified for the first-time resistance sources to ToLCNDV in Cucurbita spp. and cucumber (Cucumis sativus). All resistant accessions here described are landraces or wild types not domesticated or with low levels of genetic manipulation. Moreover, most of these genotypes are originals from India, where ToLCNDV was first described. Likely, the occurrence of co-evolution events took place between wild cucurbits plants and this begomovirus. Despite not identifying resistance sources in squash, two Cucurbita moschata accessions have shown high resistance levels. Both species present intermediate crossability, even so the obtention of interspecific offspring and the partial transference of the resistance was possible. The resistant accessions identified in the works of this thesis and those identified by our group in previous assays, have been characterized to determine the heritage controlling ToLCNDV resistance. The development of breeding segregating populations and exploiting getenic tools for mapping and cartography, we identifed three QTLs controlling, [CA] Durant les últimes dècades, s'ha observat un increment en l'emergència de noves virosis als cultius del sud-est espanyol, principal regió proveïdora de fruites i hortalisses a la resta d'Europa. Entre les virosis emergents més recents en aquesta àrea de cultiu, es troba un nou aïllat del tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), un begomovirus de genoma bipartit transmés per mosca blanca (Bemisia tabaci). En 2012 es va detectar per primera vegada a les províncies de Múrcia i Almeria, i des d'aleshores s'està propagant per altres països de la conca del Mediterrani, ací genera greus danys en els cultius de cucurbitàcies, i hi limita la producció, principalment de carabasseta (Cucurbita pepo) i meló (Cucumis melo). En aquesta tesi doctoral s'ha desenvolupat un programa de millora genètica enfocat a l'obtenció de varietats de cucurbitàcies resistents a l'aïllat espanyol del ToLCNDV(-ES). Hem pogut identificar per primera vegada fonts de resistència al ToLCNDV en el gènere Cucurbita i en cogombre (Cucumis sativus). Totes les accesions resistents que descrivim pertanyen a tipus silvestres o varietats locals, la major part originaris de l'Índia, on es va descriure per primera vegada el ToLCNDV. És possible que en aquesta àrea s'haja produït un fenomen de coevolució entre plantes silvestres de cucurbitàcies i aquest begomovirus. Dos accesions de Cucurbita moschata han mostrat un elevat nivell de resistència, i tot i la compatibilitat intermèdia que presenten ambdues espècies, ha sigut possible l'obtenció de descendència interespecífica i la transferència parcial de la resistència. Les accessions resistents identificades s'han caracteritzat per tal de determinar el tipus d'herència que regula la resistència al ToLCNDV. Mitjançant el desenvolupament de poblacions segregants de millora i l'aprofitament de ferramentes genètiques de mapeig i cartografia, hem identificat tres QTLs que controlen la resistència al ToLCNDV en meló, un d'efecte major i herència parcialment dom

[EN] The performance of snake melon [Cucumis melo var. flexuosus (L.)] in organic farming was studied under high biotic and salt stress conditions. Soilborne diseases (mainly caused by Macrophomina phaseolina and Neocosmospora falciformis), combined with virus incidence [Watermelon mosaic virus (WMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), and Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV)] and Podosphaera xanthii attacks, reduced yield by more than 50%. Snake melon susceptibility to M. phaseolina and Monosporascus cannonballus was proved in pathogenicity tests, while it showed some degree of resistance to Neocosmospora keratoplastica and N. falciformis. On the contrary, salt stress had a minor impact, although a synergic effect was detected: yield losses caused by biotic stress increased dramatically when combined with salt stress. Under biotic stress, grafting onto the melon F(1)Pat81 and wild Cucumis rootstocks consistently reduced plant mortality in different agroecological conditions, with a better performance compared to classic Cucurbita commercial hybrids. Yield was even improved under saline conditions in grafted plants. A negative effect was detected, though, on consumer acceptability, especially with the use of Cucurbita rootstocks. Cucumis F(1)Pat81 rootstock minimized this side effect, which was probably related to changes in the profile of sugars, acids, and volatiles. Grafting affected sugars and organic acid contents, with this effect being more accentuated with the use of Cucurbita rootstocks than with Cucumis. In fact, the latter had a higher impact on the volatile organic compound profile than on sugar and acid profile, which may have resulted in a lower effect on consumer perception. The use of Cucumis rootstocks seems to be a strategy to enable organic farming production of snake melon targeted to high-quality markets in order to promote the cultivation of this neglected crop.

[EN] Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) is a bipartite whitefly transmitted begomovirus, responsible since 2013 of severe damages in cucurbit crops in Southeastern Spain. Zucchini (Cucurbita pepo) is the most affected species, but melon (Cucumis melo) and cucumber (Cucumis sativus) are also highly damaged by the infection. The virus has spread across Mediterranean basin and European countries, and integrated control measures are not being enough to reduce economic losses. The identification of resistance genes is required to develop resistant cultivars. In this assay, we studied the inheritance of the resistance to ToLCNDV previously identified in two Cucurbita moschata accessions. We generated segregating populations crossing both resistant pumpkins, an American improved cultivar Large Cheese (PI 604506) and an Indian landrace (PI 381814), with a susceptible C. moschata genotype (PI 419083). The analysis of symptoms and viral titers of all populations established the same monogenic recessive genetic control in both resistant accessions, and the allelism tests suggest the occurrence of alleles of the same locus. By genotyping with a single nucleotide polymorphism (SNP) collection evenly distributed along the C. moschata genome, a major quantitative trait locus (QTL) was identified in chromosome 8 controlling resistance to ToLCNDV. This major QTL was also confirmed in the interspecific C. moschata x C. pepo segregating populations, although C. pepo genetic background affected the resistance level. Molecular markers here identified, linked to the ToLCNDV resistance locus, are highly valuable for zucchini breeding programs, allowing the selection of improved commercial materials. The duplication of the candidate region within the C. moschata genome was studied, and genes with paralogs or single-copy genes were identified. Its synteny with the region of chromosome 17 of the susceptible C. pepo revealed an INDEL including interesting candidate genes. The chromoso

[EN] Several viral diseases affect cucurbits, with different economic effects depending on the region and the year. However, there are not recent studies on the incidence of specific viruses. During the 2018 summer season, surveys were carried out in open field melon (Cucumis melo), squash (Cucurbita spp.) and watermelon (Citrullus lanatus) crops in most of the main producer areas under commercial (AGL2017-85563-C2 1R and 2R) and organic farming (PROMETEO/2017/078). Samples from plants with virus-like symptoms were analyzed by RT-PCR/PCR with specific primers, hybridization and/or ELISA, to detect Cucumber mosaic virus (CMV), Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV), Watermelon mosaic virus (WMV), Moroccan watermelon mosaic virus (MWMV), Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV), Cucurbit chlorotic yellows virus (CCYV), Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) and Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV). Samples from fields in Murcia (south-eastern Spain), Castilla-La Mancha (central Spain) and Comunidad Valenciana (eastern Spain) were analyzed. At least one of these viruses was detected in approximately 80% of the samples. WMV was the most frequently detected in samples of the three crops. ZYMV, CMV, CYSDV and ToLCNDV were present with lower incidence, mainly identified in mixed infections with WMV.

En este artículo se presentan las características generales, que incluyen rasgos anatómicos, morfológicos y fisiológicos, de los hongos. Los hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas y sin clorofila. Tradicionalmente, los hongos se han distribuido en clados que ahora se sabe que no tienen cercanía filogenética. Estos clados se denominan Ophisthokonta, grupo que incluye a los hongos verdaderos; Amoebozoa, que engloba a los hongos mucilaginosos; Rhizaria, que incluye a los endoparásitos plasmodioforomicetes; Stramenopila que comprenden a los pseudohongos, llamados así porque derivaron de algas que perdieron su capacidad de fotosintetizar; y por último Excavata, que integra un pequeño grupo de hongos, los acrásidos.

[ES] El proyecto se basa en el descubrimiento del mejor método para extraer proteínas de productos cárnicos de origen vegetal y en la comprensión de la composición de estos productos gracias a un análisis proteómico y lipidómico y a la puesta a punto del método de extracción. El análisis de proteómico se realizó con 3 productos diferentes, una hamburguesa de carne de vacuno y dos hamburguesas de base vegetal: Impossible Burger de Impossible Foods y Beyond Burger de Beyond Meat. Cada muestra de las tres analizadas tiene 3 réplicas para tener suficientes datos para el análisis estadístico. El primer paso es poner a punto el método de análisis proteómico de productos cárnicos para hacer más eficiente la extracción de proteínas, se seleccionan 3 métodos diferentes para ser analizados. Los métodos seleccionados son: sonicación con un hervido previo de la muestra, homogeneización y por último homogeneización con mortero mediante la conversión en polvo de la muestra. Las muestras son procesadas siguiendo el protocolo de extracción de proteínas por precipitación de acetona, este protocolo es proporcionado por el laboratorio a partir del trabajo previo en proteómica. Después de la extracción de la proteína, las proteínas son digeridas con tripsina y finalmente las 27 muestras son analizadas por Shotgun proteomics en HPLC-MS, para posteriormente realizar el análisis bioinformático siguiendo los pasos del tutorial de laboratorio, utilizando Trans Proteomic Pipeline (TPP). Los datos finales son filtrados gracias a una escritura Python para analizar sólo las proteínas que se encuentran en la muestra con una presencia significativa. En el análisis lipidómico, primero se desarrolla un método para extraer los lípidos de este producto cárnico de origen vegetal. El cloroformo es el disolvente utilizado para permitir la extracción de lípidos. Los lípidos son esterificados para tener la estructura adecuada para el análisis lipídico en el GC-MS. Los datos finales se analizan con el soft, [EN] The project is based on the discovery of the best method to extract proteins from plant-based meat products and the understanding of these product composition thanks to proteomics and lipidomic analysis and the tune-up of the extraction method. The proteomics analysis was performed with 3 different products, a normal beef burger, and two plant-based burgers: Impossible Burger from Impossible Foods and Beyond Burger from Beyond Meat. Each sample of the three analyzed has 3 replicates to have enough data for the statistical analysis. The first step is to tune-up of the method of proteomic analysis for meat products to do more efficient the protein extraction, 3 different methods are selected to be analyzed. The methods selected are sonication with a previous boiling of the sample, homogenizer and then homogenizer with grinder by previously convert into powder the sample. The samples are processed following the protocol of protein extraction by acetone precipitation, this protocol is provided by the lab from the previous work in proteomics. After the protein extraction, the proteins are digested with trypsin and finally, the 27 samples are analyzed in the HPLC-MS shotgun proteomics and then the bioinformatic analysis is performed following the steps of the lab tutorial, using Trans Proteomic Pipeline (TPP). The final data is filtrated thanks to a Python script to analyze only the proteins that are in the sample with a significant presence. In the lipidomic analysis, first, a method to extract the lipids from this plant-based meat product is developed. The chloroform is the solvent used to allow the lipid extraction. The lipids are esterified to have the proper structure for the lipidomics analysis in the GC-MS. The final data is analyzed with the software Chromeleon 7.2 from Thermo Scientific. The results show that there is no significant difference between the 3 methods analyzed and the ingredients discovered are mainly storage proteins to simulate the consistenc

Ginkgo biloba es el único representante de los ginkgópsidos, grupo de gimnospermas que surgió hace casi 300 millones de años. Se trata de un árbol caducifolio, con hojas flabeladas que crecen en macroblastos y braquiblastos. Es una especie dioica. Los individuos machos forman sacos polínicos en el extremo de pedicelos que se localizan alrededor de un eje que surge de los braquiblastos. A su vez, los individuos hembra forman primordios seminales en el extremo de un pedicelo bifurcado, que surge también de los braquiblastos. Actualmente, se encuentra en los cinco continentes como árbol ornamental y urbano. Contiene además numerosos compuestos químicos con aplicaciones medicinales.

Para producir plantas transgénicas en la biotecnología actual, se utilizan genes marcadores de selección (GMS) ya que facilitan la selección de las plantas transformadas de las no transformadas. Sin embargo, después de que se haya producido el evento transgénico, el GMS en el genoma de las plantas transgénicas no sirve de nada. Además, la presencia de este tipo de genes que, por lo general, expresan productos proteínicos que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, genera una gran preocupación social si estas plantas son comercializadas, debido a su presencia en los alimentos, los piensos y el medio ambiente. Por ello, la eliminación de los GMS de las plantas transgénicas, especialmente de los productos comerciales, ha recibido una gran atención en los últimos años. Son varias las tecnologías disponibles, siendo una de las más empleadas la de la co-transformación, es decir, transformación separada del GMS y del gen de interés (GI) y la posterior eliminación del GMS por cruzamiento y segregación en la siguiente generación

[EN] Artificial small RNAs (sRNAs), including artificial microRNAs (amiRNAs) and synthetic trans-acting small interfering RNAs (syn-tasiRNAs), are used to silence viral RNAs and confer antiviral resistance in plants. Here, the combined use of recent high-throughput methods for generating artificial sRNA constructs and the Tomato spotted wilt virus (TSWV)¿Nicotiana benthamiana pathosystem allowed for the simple and rapid identification of amiRNAs with high anti-TSWV activity. A comparative analysis between the most effective amiRNA construct and a syn-tasiRNA construct including the four most effective amiRNA sequences showed that both were highly effective against two different TSWV isolates. These results highlight the usefulness of this high-throughput methodology for the fast-forward identification of artificial sRNAs with high antiviral activity prior to timeconsuming generation of stably transformed plants.

[ES] El virus de la hoja rizada del tomate de Nueva Delhi (ToLCNDV, Tomato Leaf Curl New Delhi Virus) se detectó en España, a finales de 2012, causando importantes daños en cultivos de cucurbitáceas (principalmente, en calabacín, melón y pepino). Se trata de un begomovirus (familia Geminiviridae) originario de la India, que es transmitido de manera natural por la mosca blanca Bemisia tabaci. Como en todas las enfermedades de etiología viral, la mejor estrategia para controlar la enfermedad consiste en el desarrollo de variedades resistentes que ayuden a frenar la infección de este patógeno. Esto requiere la identificación de fuentes naturales de resistencia. Con ese fin, se ha cribado una colección de entradas de pepino (Cucumis sativus) de diferentes orígenes geográficos, usando un protocolo de transmisión mecánica puesto a punto en un trabajo anterior. La respuesta al virus se evaluó visualmente a los 15 y 30 días después de la inoculación (dpi) según una escala de 0 (ausencia de síntomas) a 4 (síntomas muy severos) y para determinar el contenido viral se empleó la hibridación de tejido impregnado en membrana (Tissue printing) y la PCR semicuantitativa. Todas las entradas evaluadas fueron altamente susceptibles y acumularon una elevada carga viral, excepto algunas accesiones procedentes de la India que permanecieron prácticamente asintomáticas y con una carga viral muy baja 30 dpi. Estas entradas pueden ser utilizadas como fuente de tolerancia a ToLCNDV en programas de mejora genética de pepino que ayuden a reducir las pérdidas causadas por el virus., [EN] Tomato Leaf Curl New Delhi Virus (ToLCNDV) was detected in Spain at the end of 2012, causing significant damage to cucurbit crops (mainly zucchini, melon and cucumber). It is a Begomovirus (Geminiviridae family) which is native to India, it is transmitted naturally by the whitefly Bemisia tabaci. As in all diseases of viral etiology, the best strategy to control the disease consists of the development of resistant varieties, that help to stop the infection of this pathogen. This requires the identification of natural sources of resistance. With that purpose, a collection of cucumber (Cucumis sativus) entries from different geographical origins were screened, using a mechanical transmission protocol developed in previous work. The response to the virus was evaluated visually at 15 and 30 days post-inoculation (dpi) according to a scale that ranges from 0 (absence of symptoms) to 4 (very severe symptoms). To determine the viral content, membrane impregnated tissue hybridization (Tissue printing) and semicuantitative PCR were used. All entries evaluated were highly susceptible and accumulated a high viral load, except some accessions from India that remained virtually asymptomatic and with a very low viral load 30 dpi. These inputs can be used as a source of ToLCNDV tolerance in cucumber breeding programs, in order to help reduce the losses caused by the virus.

[ES] Las virosis inciden de forma cada vez más grave en el valor final de la producción y en la rentabilidad de los cultivos. Así, en algunas zonas geográficas han llegado a convertirse en el principal factor limitante del cultivo. De particular importancia son los problemas causados por virosis emergentes. Dos ejemplos recientes de enorme gravedad se han dado los últimos años en cultivos de cucurbitáceas del sureste español. Por un lado, en otoño de 2012 en Murcia y Almería, se observaron síntomas de una nueva enfermedad viral en calabacín acompañados en muchos casos de una parada del crecimiento. El causante de esta nueva enfermedad es el virus de la hoja rizada del tomate de Nueva Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV). El virus se encuentra ya muy difundido en España, afectando a otros cultivos como pepino, melón, sandía, calabaza y tomate. Por otro lado, desde 1996 también se ha detectado el virus del mosaico verde jaspeado del pepino (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) causando daños importantes en las principales especies hortícolas de la familia de las cucurbitáceas. Un aspecto epidemiológico importante a tener en cuenta es el de la transmisión de estos virus a partir de semillas procedentes de plantas infectadas. Las plántulas germinadas a partir de semillas infectadas podrían actuar como primera fuente de inóculo en el campo, para su posterior transmisión agravando el impacto económico en los cultivos. El objetivo de este Trabajo Final de Grado se centra en comprobar si en semillas comerciales de cucurbitáceas (calabacín, melón, pepino y sandía) es posible detectar los virus ToLCNDV y CGMMV. Si esto fuese así, se analizará de que aislado se trata. La identificación de las fuentes primarias de inóculo puede ayudar a reducir la propagación del virus y la gravedad de los efectos sobre la producción de cucurbitáceas., [EN] Virus diseases have an increasingly serious impact on the final value of production and the profitability of crops. Thus, in some geographical areas they have become the main factor limiting cultivation. Of particular importance are the problems caused by emerging viruses. Two recent examples of enormous seriousness have been given in recent years in cucurbitaceae crops in southeastern Spain. On the one hand, in the autumn of 2012 in Murcia and Almería, symptoms of a new viral disease were observed in zucchini accompanied in many cases by a stop of growth. The cause of this new disease is the curly leaf virus of tomato of New Delhi (Tomato leaf curl New Delhi virus, ToLCNDV). The virus is already widespread in Spain, affecting other crops such as cucumber, melon, watermelon, squash and tomatoes. On the other hand, since 1996 it has also been detected the green mottle mosaic virus of the cucumber (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) causing important damages in the main horticultural species of the cucurbit family. An important epidemiological aspect to take into account is the transmission of these viruses from seeds from infected plants. Seedlings germinated from infected seeds could act as the first source of inoculum in the field, for subsequent transmission aggravating the economic impact on crops. The objective of this Final Degree Project is to check whether it is possible to detect the ToLCNDV and CGMMV viruses in commercial seeds of cucurbits (zucchini, melon, cucumber and watermelon). If this were possible, it will be analyzed what isolate it is. The identification of the primary sources of inoculum can help to reduce the spread of the virus and the severity of the effects on the production of cucurbits.

En este artículo vamos a presentar las características vegetativas y ecológicas de los cicadópsidos. Los cicadópsidos conforman una de las líneas evolutivas que surgieron con la aparición de las semillas. Son plantas gimnospermas muy antiguas, de las que únicamente quedan alrededor de unas 185 especies repartidas por casi todos los continentes, en zonas tropicales y subtropicales. Se trata de especies leñosas, con tallos aéreos o subterráneos gruesos y ricos en almidón. Las hojas son grandes y rígidas, pinnadas o bipinnadas, con una gran diversidad morfológica. Desde el punto de vista etnobotánico, el almidón de los cicadópsidos se emplea para alimentación humana. Estas plantas son también ricas en compuestos químicos neurotóxicos exclusivos de este grupo vegetal. Además, algunas de ellas se emplean como plantas ornamentales. Por último, los cicadópsidos mantienen relaciones específicas con insectos, y son capaces de mantener una simbiosis con cianobacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico en sus raíces coraloides.

En este artículo se presentan las características reproductivas de los cicadópsidos. Los cicadópsidos conforman una de las líneas evolutivas de las gimnospermas, que surgieron con la aparición de las plantas con semillas o espermatófitos. Todas las especies de cicadópsidos son dioicas: los individuos están diferenciados por sexo. Los individuos machos producen los granos de polen en los sacos polínicos, localizados en el envés de escamas que se sitúan en estróbilos terminales. A su vez, los individuos hembras contienen primordios seminales localizados en la parte pedicular de escamas con extremo ensanchado, o bien en la base de dicho segmento. Estas escamas se disponen helicoidalmente en estróbilos o masas. En cada primordio seminal, una megaespora se transforma en un gametófito femenino haploide, que produce ovocélulas. La polinización es anemófila o entomófila, mediada fundamentalmente por coleópteros. Cuando ocurre la fecundación de la ovocélula por parte de los espermatozoides, se forma un cigoto que se transforma en embrión protegido por un tejido nutricio y una testa. El conjunto es la semilla, que en el caso de los cicadópsidos posee colores vivos.

[ES] El virus del mosaico de la alfalfa (AMV) infecta alfalfa y a más de 600 especies vegetales de interés agronómico como tomate, patata o pimiento. El virus se transmite a través de polen, semillas y pulgones. El genoma del virus está formado por 3 moléculas de ácido ribonucleico (RNA 1, RNA 2 y RNA 3) de cadena sencilla y de polaridad positiva. Los RNAs 1 y 2 codifican las subunidades de la replicasa viral; el RNA 3 codifica la proteína de movimiento (MP) y sirve como molde para la síntesis de un RNA subgenómico (sgRNA 4) que codifica la proteína de cubierta (CP). En este virus, la CP es una proteína multifuncional que está implicada en diversos procesos del ciclo infectivo del virus. Los virus como parásitos intracelulares necesitan alterar la función de diferentes componentes del huésped para multiplicarse. En muchos casos, los virus utilizan sus propias proteínas virales para interaccionar con factores del huésped y así subvertir su función en favor del patógeno. En el caso del AMV, la implicación de la CP en diferentes procesos del ciclo replicativo la hace una excelente candidata para identificar proteínas del huésped que interaccionen con esta proteína y participen en el ciclo viral. En este trabajo, en primer lugar, se ha abordado la construcción de un RNA 3 modificado para expresar una segunda copia de la CP del AMV fusionada al epítopo de la hemaglutinina (HA) (3xHACP). Esta proteína modificada puede ser inmunoprecipitada utilizando un anticuerpo contra el epítopo HA fusionado a resinas comerciales. Además, se han puesto a punto una serie de protocolos de inmunoprecipitación de 3xHACP, tanto de fracciones nucleares como citoplásmicas procedentes de células infectadas. Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la duplicación de la CP con la copia 3xHACP en el RNA 3 no interfiere en el proceso de replicación de este RNA viral. Este RNA 3 modificado constituye una herramienta molecular que podría utilizarse en estudios de co-inmunoprecipitación, [EN] The alfalfa mosaic virus (AMV) infects alfalfa and more than 600 plant species of agronomic interest such as tomato, potato or pepper. The virus is transmitted through pollen, seeds and aphids. The genome of the virus is formed by 3 molecules of ribonucleic acid (RNA 1, RNA 2 and RNA 3) of single chain and of positive polarity. RNAs 1 and 2 encode the subunits of the viral replicase; RNA 3 encodes the movement protein (MP) and serves as a template for the synthesis of a subgenomic RNA (sgRNA 4) that codes for the coat protein (CP). In this virus, the CP is a multifunctional protein that is involved in various processes of the infectious cycle of the virus. Viruses as intracellular parasites need to alter the function of different host components to multiply. In many cases, viruses use their own viral proteins to interact with host factors and thus subvert their function in favor of the pathogen. In the case of AMV, the involvement of the CP in different processes of the replication cycle makes it an excellent candidate to identify host proteins that interact with this protein and participate in the viral cycle. In this work, first, the construction of a modified RNA 3 to express a second copy of the CP of the AMV fused to the epitope of hemagglutinin (HA) (3xHACP) has been addressed. This modified protein may be immunoprecipitated using an antibody against the HA epitope fused to commercial resins. Subsequently, a series of 3xHACP immunoprecipitation protocols have been developed for both nuclear and cytoplasmic fractions of infected cells. The results obtained in this work show that the duplication of the CP with the 3xHACP copy in RNA 3 does not interfere in the replication process of this viral RNA. This modified RNA 3 constitutes a molecular tool that could be used in co-immunoprecipitation (Co-IP) studies to identify host factors that interact with CP.

[EN] Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV) is a whitefly-transmited virus that causes serious damage to different cultivated plant species mainly belonging to the Solanaceae and Cucurbitaceae families. The complex epidemiological factors associated with this disease make the seeking and use of genetically resistant varieties as one of the most efficient, sustainable and frequently employed strategies to control viral infections in the fields. In the case of melon, resistance to mechanical transmission of ToLCNDV has been identified in Cucumis melo subsp. agrestis, in three accessions of the Momordica group and in two wild accessions. The genetic control of the resistance derived from one of the wild sources has been studied recently and a major locus in chromosome 11 has been found, along with two modifier regions located in chromosomes 2 and 12. Previous studies have reported the active role of different genes regarding ToLCNDV resistance in different species. In this work we have validated by qPCR twelve of these genes by determining the transcriptomic changes in leaves of a resistant Momodica and a susceptible Piel de Sapo genotypes along a time course experiment after infection with ToLCNDV. The transcript amount of the genes Cm ARP4 and Cm NAC domain protein, was differentially higher in the inoculated susceptible genotype when compared to the inoculated resistant one. For other validated genes, the resistant accession showed higher levels of expression. The location of Cm ARP4 in a modifier QTL of chomosome 2, suggest that the accumulation of transcripts of this gene is associated to the level of ToLCNDV accumulation and degree of symptoms development. The molecular bases of ToLCNDV resistance regarding the expression results for these candidate genes in melon are discussed as well and their potential use in TILLING platforms and breeding strategies of the species.

Los genes marcadores de selección (GMS) y los agentes de selección son extraordinariamente útiles durante la transformación de plantas ya que facilitan la selección de las células transformadas de una matriz que consta principalmente de células no transformadas. La mayoría de los GMS expresan productos proteínicos que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, y posteriormente permanecen en las plantas genéticamente modificadas (GM). La presencia de estos genes y sus productos en las plantas GM y, posteriormente, en los alimentos, los piensos y el medio ambiente, son motivo de preocupación para el público en general y están sujetos a regulaciones gubernamentales especiales en muchos países. En los últimos años, la eliminación de los GMS de las plantas transgénicas, especialmente de los productos comerciales, ha recibido una gran atención. Son varias las tecnologías disponibles, siendo una de las más populares la que elimina los GMS mediante el empleo de recombinasas específicas del sitio.

El uso de plantas para la producción de vacunas constituye una alternativa atractiva a los sistemas tradicionales de producción de vacunas, debido a que resultan más baratas, seguras y fáciles de administrar. Algunas ventajas de los sistemas de expresión vegetal son la ausencia de contaminación con patógenos humanos y animales y la producción de grandes cantidades de vacuna, que incluso podría usarse como vacuna comestible en frutas y hortalizas, a bajo coste, eliminando la necesidad de extracción y purificación, lo que supondría una importante ventaja para satisfacer las grandes demandas de los países en vías de desarrollo. Existen dos sistemas para expresar las vacunas en la planta; una es la transformación genética estable y la otra es la expresión transitoria usando virus de plantas. Este artículo docente está centrado en la segunda estrategia, y más concretamente, en la presentación de epítopos fusionados a la proteína de cubierta del virus vegetal.

[ES] Los futuros desarrollos en biología sintética de plantas requerirán que previamente se haya definido una serie de elementos genéticos capaces de desarrollar funciones precisas y específicas en las células donde se expresan. Recientemente, el grupo de investigación Biotecnología de Virus de Plantas (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) ha desarrollado circuitos genéticos capaces de realizar operaciones lógicas básicas (YES, OR y AND) en plantas, cuya señal de salida es la acumulación de pigmentos endógenos visibles a simple vista y cuantificables espectrofotométricamente. Estos circuitos se basan en la actividad del factor de transcripción Rosea1 de Antirrhinum majus que induce la producción de antocianinas. Cuando este factor de transcripción se fusiona a un fragmento amino terminal de la RNA polimerasa NIb del virus del mosaico de la sandía es inactivo. Sin embargo, cuando entre estos dos elementos se interpone la diana de reconocimiento de la proteasa NIa (NIaPro) de un potyvirus y se coexpresa esta proteasa altamente específica en el tejido de la planta, su actividad libera al factor de transcripción con la consiguiente acumulación de antocianinas. En este trabajo, utilizando el circuito sintético YES de acumulación de antocianinas desencadenado por la expresión de NIaPro, se ha analizado la eficiencia de las proteasas de una serie de especies distintas de potyvirus pertenecientes a distintos clados en su árbol filogenético. Con ello se ha pretendido aumentar el número de proteasas específicas disponibles para futuros desarrollos de biología sintética. Para ello se clonaron los cDNAs de las NIaPro de diez potyvirus y, mediante expresión transitoria en Nicotiana benthamiana mediada por Agrobacterium tumefaciens, se enfrentaron a sus dianas peptídicas incluidas en diferentes versiones de la puerta YES. La eficiencia del procesamiento de cada proteasa se determinó cuantificando la acumulación de antocianinas en el tejido infiltrado de N. benthamiana, [EN] Future research in plant synthetic biology will require definitions of new elements able to develop precise and specific functions in cells. Recently, the research group Plant Viruses Biotechnology (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) has developed different genetic circuits capable of performing basic logic operations (YES, OR and AND) in plants. The output signal of these circuits is the accumulation of plant endogenous pigments, which are visible to the naked eye and are also spectrophotometrically quantifiable. These circuits are based on the activity of the Antirrhinum majus transcription factor Rosea1 that induces anthocyanins production. When this transcription factor is fused with an amino terminal fragment of the watermelon mosaic virus RNA polymerase (NIb) is inactive. However, when between these elements the potyvirus NIa protease (NIaPro) recognition site is interposed, and this highly specific protease is coexpressed in the plant tissue, the proteolytic activity produces the release of the transcription factor, which triggers the anthocyanin accumulation. In this work, using the YES anthocyanin accumulation synthetic circuit triggered by the expression of NIaPro, we have analized the efficiency of potyvirus proteases that belong to different clades of the potiviral phylogenetic tree. With this, we want to increase the number of specific proteases available for future developments in synthetic biology. To this end, we have cloned the NIaPro cDNAs of ten potyviruses and, by transient expression in Nicotiana benthamiana mediated by Agrobacterium tumefaciens, they faced their peptide targets included in different versions of the YES gate. The processing efficiency of each protease was determined by quantifying anthocyanin accumulation in the infiltrated tissue of N. benthamiana. The results showed that the NIaPro of tobacco etch virus, turnip mosaic virus, and plum pox virus are very efficient in the recognition of their specific target. O

[ES] España es el segundo país en cuanto a área agrícola cultivada en la Unión Europea y se posiciona como el primer país con superficie de viñedo a nivel mundial, con más de novecientas mil hectáreas cultivadas en toda la península. Por lo tanto, el sector vitivinícola español tiene gran relevancia a nivel mundial. La normativa de la Unión Europea obliga a la regulación fitosanitaria de los productos vegetales que son introducidos en los países miembros. La legislación española, así mismo, prohíbe la introducción y propagación en el país de virus y organismos afines, infecciosos para variedades de Vitis, y obliga al control de aquellos fitopatógenos sobre los que ya se tiene constancia. Por lo que es necesario controlar los patógenos que afectan a estos cultivos a fin de evitar pérdidas de producción y de calidad del producto vegetal final. En este sentido, los virus de mayor relevancia económica para el cultivo de la vid son Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Strawberry latent ringspot virus (SLRSV), Raspberry ringspot virus (RPRSV), Arabis mosaic virus (ArMV) y Tomato black ring virus (TBRV). En este proyecto, se pretende desarrollar una metodología de PCR para la detección múltiple de los principales virus que afectan a vid, anteriormente mencionados, en una misma muestra vegetal. Para ello se diseñaron cebadores específicos de regiones conservadas entre cepas de la misma especie viral, como son los genes que codifican para las proteínas de la cápsida, así como sondas específicas de cada especie viral marcadas con diferentes fluoróforos. De este modo, se diseñaron “in silico” parejas de cebadores que teóricamente pudieran amplificar en base a sus características moleculares (porcentaje de citosina y guanosina, formación de homodímeros y heter, [EN] Spain is the second country with highest agricultural cultivated area in the European Union and it is positioned as the first country in large cultured vineyard surface worldwide, with more than nine hundred thousand hectares cultivated. Therefore, the Spanish wine sector is economically important at international level. The phytosanitary directive of the European Union controls the sanitary state of plant products that are introduced in or move between the member countries. The Spanish law also prohibits the introduction and spread of phytopathological viruses and other infectious organisms in Vitis, thus it forces to the control of those viral species. In this way, it is necessary to detect these pathogenic viruses in order to avoid losses in grape production and in the final product quality. On this regard, the viruses of major economic relevancy infecting grapevine varieties are Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll-associated virus 2 (GLRaV-2), Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine fanleaf virus (GFLV), Strawberry latent ring spot virus (SLRSV), Raspberry ringspot virus (RPRSV), Arabis mosaic virus (ArMV) and Tomato black ring virus (TBRV). To reduce the number, cost and time of analysis, there is a need in detecting several viruses in a single genetic analysis. In this project, three PCR-multiplex tests have been developed in order to detect the above indicated principal grapevine viral species. For this aim, specific primers of conserved genomic regions, like capsid protein coding genes, were designed, as well as specific TaqMan probes, labeled with different dyes, targeting each of the viral species studied. Each couple of primers, was designed on the basis of its molecular characteristics (percentage of cytosine and guanine, self-dimers and hetero-dimer formation…) and the optimum PCR conditions were tested ¨in silico¨. Onc

En este artículo vamos a presentar las características vegetativas y ecológicas de los equisetos, últimos supervivientes del gran grupo de la clase Sphenopsida, que alcanzó su apogeo durante el Carbonífero. Son plantas vasculares, con largos y profundos rizomas que les permiten vivir en medios húmedos alterados. De los rizomas surgen tallos aéreos verdes y huecos de apariencia articulada, con microfilas y ramificaciones en verticilos. Poseen una gran cantidad de sílice en la epidermis, por lo que han sido empleados tradicionalmente para pulir materiales duros. Además, los equisetos tienen propiedades medicinales.

[EN] Several isolates of Parietaria mottle virus (PMoV), a member of the genus Ilarvirus, have been described that affect tomato plants. These isolates, named PMoV-T, cause rings and a bright necrotic mosaic on young leaves that progresses to necrosis of the leaves, stem and apex. Fruits of affected plants display corky rings and brown patches, which develop into ridges with necrotic scars. The virus has been described in tomato plants in several European countries, including Italy, France, Greece and Spain. In addition, an outbreak of a necrosis disease of tomato in California in 2008 was shown to be caused by a new ilarvirus species related to PMoV. The genome of PMoV-T is composed of three single-stranded positive-sense RNAs. Phylogenetic analysis of PMoV isolates from different hosts and geographical origins revealed important structural differences and the existence of two coat-protein types according to their size. Moreover, the PMoV isolates sequenced so far clustered in four different clades that were not related with host specificity. Non-isotopic molecular hybridization, tissue printing hybridization, indirect enzyme-linked immunosorbent assay (I-ELISA) and direct tissue-printing immunoassay using a polyclonal antiserum and one-step RT-PCR assays have been set up for routine detection of the virus. The virus was mechanically transmitted from Parietaria officinalis pollen extracts to other host species, including tomato and pepper. In addition, viral transmission can be facilitated by different insect species, some of them used for biological control (e.g., mirids), in a non-persistent manner. It has been suggested that elimination of P. officinalis plants surrounding tomato crops could help to restrain virus spread. However, further studies will be needed to prevent PMoV-T becoming a threat to tomato and pepper crops.

Plant viruses are obligate intracellular parasites that require living host cells to complete their life cycle. Plants present several defense mechanisms, including posttranscriptional gene silencing (PTGS). In response, viruses have developed several strategies in which they use own suppressor proteins of the silencing. These proteins inhibit host antiviral response by interacting with key silencing machinery factors involved in viral RNA recognition, dsRNA processing, RISC complex assembly, and signal amplification. There are some identified viruses encoding in their genome several proteins with suppressor silencing activity therefore each one can affect different stages of the path. In subgroup 2 of the Ilarvirus, the activity of 2b protein is unknown. In the case of cucumber mosaic virus (CMV), protein 2b is involved in systemic long-distance movement of the virus and acts as a suppressor of PTGS. In subgroup 2 members of Ilarvirus, by homology, it has been proposed a similar function for putative 2b protein. Therefore, the general objective of this Final Master's Work is to determine the possible function of putative 2b protein as suppressor of the PTGS at local level in Spinach latent virus (SpLV) and Asparagus virus 2 (AV2). ORFs of both putative 2b proteins were cloned in binary plasmids to allow their transient expression by agroinfiltration. Both cassettes were expressed in plants of Nicotiana benthamiana 16c which constitutively express the green fluorescent protein (GFP). Results suggest that none of these putative 2b proteins would have PTGS suppression activity, so that unlike the CMV 2b protein, that of the Ilarvirus would not exhibit PTGS silencing activity at the local level., Los virus vegetales son parásitos intracelulares obligados que necesitan células hospedadoras vivas para completar su ciclo. Las plantas presentan una serie de mecanismos de defensa, entre ellos el del silenciamiento génico post-transcripcional o PTGS (posttranscriptional gene silencing). Como respuesta los virus han desarrollado una serie de estrategias en las que usan proteínas propias supresoras del silenciamiento. Estas proteínas inhiben la respuesta antiviral del huésped por medio de la interacción con factores clave de la maquinaria de silenciamiento implicados en el reconocimiento de RNA viral, el procesamiento de dsRNAs, el ensamblaje del complejo RISC y la amplificación de señal. Se han identificado virus que codifican en su genoma varias proteínas con actividad supresora del silenciamiento de forma que cada una puede afectar a etapas diferentes de la ruta. En el subgrupo 2 de los Ilarvirus se desconoce si codifican proteínas con dicha actividad. En el caso del Cucumovirus del mosaico del pepino (CMV) se ha comprobado que la proteína 2b interviene en el movimiento sistémico a larga distancia del virus y actúa como supresor del PTGS. Por homología se ha propuesto que esa misma proteína 2b en los miembros del subgrupo 2 de los Ilarvirus, debería tener funciones similares. Por tanto, el objetivo general de este Trabajo Final de Máster consiste en determinar la posible función de la proteína 2b del virus latente de la espinaca (Spinach latent virus, SpLV) y del virus 2 del esparrago (Asparagus virus 2, AV2) como supresora del PTGS a nivel local. Para ello, las ORFs de ambas proteínas se clonaron en plásmidos binarios bajo la expresión del promotor 35S para su expresión transitoria mediante agro-infiltración. Ambas construcciones fueron expresadas en plantas de Nicotiana benthamiana 16c las cuales expresan constitutivamente la proteína verde fluorescente (GFP). Los resultados obtenidos sugieren que ninguna de estas proteínas tendría actividad de supresión del PT

La biotecnología vegetal se apoya en dos enfoques para introducir y expresar genes heterólogos en plantas: la transformación genética estable y la expresión transitoria utilizando vectores virales. En este artículo docente se revisan las ventajas e inconvenientes de los dos enfoques, haciendo especial hincapié en la expresión transitoria de proteínas a partir de vectores virales de la primera generación que son aquéllos que emplean el virus completo para promover la infección.

Existen dos métodos para producir proteínas recombinantes en plantas: la transformación estable del genoma nuclear o de cloroplastos y la expresión transitoria mediante vectores virales. En este artículo se presentan las estrategias disponibles para el desarrollo de vectores virales, usados como vehículos para la expresión de genes foráneos en plantas.