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In der multizentrischen POMINC-Studie wurde der Effekt der Kombinationstherapie von Ruxolitinib und Pomalidomid bei Myleofibrose-Patient*innen untersucht. Diese Arbeit hatte als Zielsetzung die Analyse der angewendeten Lebensqualitätsfragebögen. Als Grundlage dafür wurde der von den Patient*innen zu jedem Zyklus ausgefüllte „Myeloproliferative Neoplasm Symptom Assessment Form“ (MPN-SAF) und der Fragebogen der Quality of Life Group der „European Organization for Research and Treatment of Cancer“ (EORTC QLQ-C30, version 3.0) verwendet. Die Analyse wurde sowohl in einer Gesamtübersicht aller Studienteilnehmer*innen als auch getrennt nach den zwei Kohorten mit jeweils unterschiedlicher Pomalidomid-Dosierung durchgeführt. Zu den am stärksten belastenden Symptomen zur Baseline zählten für die POMINC-Patient*innen bei beiden ausgewerteten Fragebögen die Fatigue-betreffenden Symptome sowie die Dyspnoe des QLQ-C30. Die geringste Beeinträchtigung stellten Fieber >37,8 °C, Kopfschmerzen, Obstipation sowie Übelkeit und Erbrechen dar. Nach dem zwölften Zyklus (12 Monate) gab es in beiden Bögen lediglich minimale Veränderung dieser Verteilung. Die Analyse der Symptomstärken im Therapieverlauf ergab allerdings deutliche Änderungen einzelner Symptome und zeigte zudem eine unterschiedlich starke Aussagekraft der Fragebögen mit deutlicheren Ergebnissen des MPN-SAF. Die stärksten Verbesserungen zeigten sich in beiden Fragebögen zusammengefasst bei Fatigue, Schlaflosigkeit, Appetitlosigkeit und dem Gewichtsverlust. Der Vergleich der beiden Kohorten zeigte, dass sich die Symptomlastverbesserung deutlicher in Kohorte 1 abzeichnete, bei der die Patient*innen keine Erhöhung der Pomalidomid-Dosis erhielten. Es ist anzunehmen, dass die schlechteren Ausgangsbedingungen der zweiten Kohorte - und dabei vor allem der höhere Anteil an Ruxolitinib-Vorbehandelten - zu einem geringeren Ansprechen auf die Therapie geführt haben könnten. Die Zusammenhangsüberprüfung ergab sowohl bei den Patientenmerkmalen als auch dem Therapieverlauf keine statistisch signifikanten Ergebnisse. Grund dafür könnte eine unzureichende Stichprobenanzahl oder die geringere Power nicht-parametrischer Tests sein. Deswegen kann ein Einfluss der Kriterien - wie beispielsweise Vorbehandlungen mit Ruxolitinib oder Erythrozytenkonzentrat-Gaben vor der Therapie - auf den Therapieeffekt nicht sicher ausgeschlossen werden. Somit zeigt die Kombinationstherapie relevante Verbesserungen der – von Patient*innen wahrgenommenen – Lebensqualität. Einen evidenten Rückschluss auf den Einfluss der höheren Pomalidomid-Dosierung gab es jedoch nicht.

Erythrozytosen können je nach Ätiologie in primäre und sekundäre sowie erworbene und kongenitale Entitäten eingeteilt werden. Aufgrund ihrer Seltenheit und der aufwendigen molekulargenetischen Austestung werden familiäre Erythrozytosen oft erst spät diagnostiziert. Diese Arbeit soll eben jene unterdiagnostizierten kongenitalen Erythrozytosen, mit besonderem Augenmerk auf die Erstmanifestation und Diagnostik, in den Vordergrund rücken. Dazu wird zunächst die Klassifikation der Erythrozytosen anhand der aktuellen Literatur beschrieben, anschließend werden Patientenfälle passend zu den Subgruppen vorgestellt. In der Diskussion werden jene Patientinnen und Patienten mit besonderen Mutationen in der molekulargenetischen Untersuchung mit der Literatur verglichen. Depending on etiology, erythrocytoses can be divided into primary and secondary as well as acquired and congenital entities. Due to their rarity and the complex molecular genetic testing, familial erythrocytoses are often diagnosed late. This work is intended to focus on those underdiagnosed congenital erythrocytoses, with special attention to the initial manifestation and diagnosis. In the first part, erythrocytoses are described based on current literature. The second part focuses on patient cases matching with the subgroups. In the discussion, those patients with special mutations in molecular genetic testing are compared with the literature. eingereicht von Julia Dickinger-Bierecker Angefertigt am Ordensklinikum Linz Elisabethinen, Abteilung Interne I für Hämatologie mit Stammzelltransplantation, Hämostaseologie und medizinische Onkologie Masterarbeit Universität Linz 2023

Hintergrund: Mittels neuerer Technologien wie dem Next-Generation Sequencing (NGS) lassen sich genetische Ursachen als Grund für die Entstehung von Erkrankungen sowie auch für den Verlauf und somit den Erfolg beziehungsweise Misserfolg einer Therapie erklären. Diese genetischen Marker werden an Anzahl immer mehr und auch spezifischer, sodass eine Analyse dieser in kurzer Analysedauer gefordert wird. Hinzukommt, dass die Qualitätssicherung eine entscheidende Rolle im Gesundheitswesen eingenommen hat und demnach, vergleichbare und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden müssen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es von eigenem Interesse, sowie aufgrund der neuen In-vitro-Diagnostika Verordnung (IVDR), die mit 2022 in Kraft tritt, eine Validierung sowie Implementierung dieses Panels entsprechend der Norm ISO 15189 zu gestalten. Methode: Zur Validierung eines NGS Custom Panels (Fa. Illumina) für hämato-onkologische Fragestellungen wurden nahezu 200 verschiedene bekannte Proben analysiert. Aufgrund der notwendigen Sensitivität des Panels für die Variante V617F des JAK2 Gens, wurden die Proben unter anderem in Duplikaten beziehungsweise Triplikaten analysiert. Ergebnisse: Es konnten mittels Referenzproben alle Mutationen detektiert werden. Es gab weder falsch positive noch falsch negative Varianten zu detektieren. Bezüglich des JAK2 Gens konnten hinsichtlich der notwendigen und gewünschten niedrigen Limit of Detection (LoD) sowie Sensitivität alle Ziele erreicht werden. Es können Varianten bis zu einer VF% von 0,5 ohne Einschränkungen erfasst werden. Konklusion: Die Validierung sowie Implementierung dieses Panels konnte unter Berücksichtigung der ISO 15189 durchgeführt werden, somit dürfte der Akkreditierung dessen nichts widersprechen. Background: Using newer technologies such as next-generation sequencing (NGS), genetic causes can be explained as the reason for the development of diseases and the success or failure of a therapy. Due to this technology, these genetic markers are also becoming more and more specific, so that new analyzes are desired in a short time, for which the implementation of a new NGS panel for genetic analyzes is necessary. In addition, quality assurance has taken a decisive role in the healthcare system and therefore comparable and reproducible results must be achieved. In order to achieve this goal, it is in our own interest, as well as due to the new in vitro diagnostics regulation (IVDR) that will come into force in 2022, to design a validation and implementation of this panel in accordance with the ISO 15189 standard. Methods: To validate an NGS custom panel (Illumina) for hemato-oncological issues, almost 200 different known samples were analyzed. Due to the necessary sensitivity of the panel for the variant V617F of the JAK2 gene, the samples were analyzed partially in duplicates or triplicates. Results: All mutations could be detected using reference samples. There were no false positive or false negative variants to be detected. With regard to the JAK2 gene, all goals could be achieved with regard to the necessary and desired low limit of detection (LoD) and sensitivity. Variants up to a VF% of 0.5 can be reported without restrictions. Conclusions: The validation and implementation of this panel could be carried out taking into account ISO 15189, so the accreditation should not contradict this. vorgelegt von: Sophie Barth Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2021

In the past years, cancer-immunotherapy has gained more and more momentum. To this end, several studies provide evidence that immunological control can contribute to remission, long-term control, or even cure of malignant disease. Apart from unspecific strategies including immune checkpoint inhibitors, advanced antigen-specific approaches hold the promise to target cancer cells more specifically. Particularly T-cell-based strategies are on the advance to restore immune responses and thereby improve the outcome in patients. The prerequisite for such approaches is the selection of feasible targets for anti-cancer T-cell responses. Ideally, such targets are tumor-associated peptides that are frequently and exclusively presented by human leukocyte antigen (HLA) on malignant cells. To identify such antigens, our group implemented a mass spectrometry-based approach with subsequent immunological characterization of the identified peptides. This thesis aims at the further characterization of the identified T-cell epitopes for the development of antigen-specific immunotherapy concepts to target myeloproliferative neoplasms (MPNs) and multiple myeloma (MM). CHAPTER 1 illustrates the comprehensive mapping of the naturally presented immunopeptidome landscape in chronic myeloid leukemia (CML). We detected spontaneous preexisting T-cell responses against novel, frequently presented, highly immunogenic, CML-associated peptides and induced multifunctional and cytotoxic antigen-specific T cells de novo in CML samples. Thus, we validated these antigens as prime targets for T-cell-based immunotherapy. In CHAPTER 2 we identified novel frequently presented MPN-associated peptides in primary samples of BCR-ABL-negative MPN patients. Alignment of MPN- and acute myeloid leukemia (AML)-exclusive antigens revealed a significant proportion of shared proteins. In consequence, we detected in vitro multifunctional memory T cells specific for AML-associated T-cell epitopes in MPN patients. CHAPTER 3 provides a proof-of-concept study for the natural HLA-dependent presentation of peptides derived from intracellular domains of established tumor-associated surface antigens as potential targets for immunotherapy. We identified the HLA-B*18 ligand P(BCMA)B*18 derived from the B-cell maturation antigen on primary MM and chronic lymphocytic leukemia (CLL) samples. P(BCMA)B*18 is highly immunogenic as demonstrated by spontaneous BCMA-specific T-cell responses in MM samples. Combination of P(BCMA)B*18 with in vitro immune checkpoint inhibition in MM samples induced multifunctional cytotoxic T cells de novo. P(BCMA)B*18 is thus a promising target for immunotherapy and immunomonitoring in B-cell malignancies. Taken together, we provide a novel category of highly immunogenic antigens for tailored off-the-shelf T-cell-based and combinatorial immunotherapy approaches to target hematological malignancies and to circumvent leukemic transformation and progression of disease. In den vergangenen Jahren hat die Tumor-Immuntherapie zunehmend an Bedeutung gewonnen. Insbesondere Antigen-spezifische Therapien sind ein vielversprechender Ansatz für eine gezielte Bekämpfung von Krebszellen. Zahlreiche Studien zeigen, dass die Aktivierung des Immunsystems zur Reduktion der Tumorlast, Langzeitkontrolle oder Heilung von Tumorerkrankungen beitragen kann. Insbesondere T-Zell-basierte Strategien können hierzu einen wertvollen Beitrag leisten. Die Grundvoraussetzung hierfür ist die Auswahl geeigneter Antigene, die eine gezielte anti-Tumor T-Zell-Antwort ermöglichen. Diese Antigene sind Tumor-assoziierte Peptide, die idealerweise hochfrequent und exklusiv über humanes Leukozytenantigen (HLA) von malignen Zellen präsentiert werden. Zur Identifizierung solcher Antigene hat unsere Gruppe einen Massenspektrometrie-basierten Ansatz mit anschließender immunologischer Charakterisierung entwickelt. Diese Dissertation befasst sich vorrangig mit der Charakterisierung der identifizierten, HLA-präsentierten Peptide zur Entwicklung Antigen-spezifischer Immuntherapie-Konzepte gegen myeloproliferative Neoplasien (MPNs) und das Multiple Myelom (MM). KAPITEL 1 beschreibt die umfangreiche Analyse der natürlich präsentierten HLA-Liganden in Primärproben der chronischen myeloischen Leukämie (CML). Gegen die identifizierten, hochfrequent präsentierten, CML-assoziierten Antigene konnten wir spontane Gedächtnis-T-Zell-Antworten sowie de novo induzierte, multifunktionale und zytotoxische T-Zellen in Proben von CML Patienten nachweisen. Diese Antigene konnten somit als geeignete Ziel- strukturen für T-Zell-basierte Immuntherapien bestätigt werden. In KAPITEL 2 identifizierten wir in Primärproben BCR-ABL-negativer MPN-Patienten hochfrequente MPN-assoziierte Peptide. Der Vergleich von MPN- mit akute myeloische Leukämie (AML)-exklusiven Antigenen zeigte einen beachtlichen Anteil gemeinsamer Proteine. Hierauf basierend konnten wir multifunktionale Gedächtnis-T-Zellen gegen AML-assoziierte T-Zell-Epitope in vitro in MPN Patienten detektieren. KAPITEL 3 beschreibt natürlich präsentierte Peptide aus intrazellulären Domänen bekannter Tumor-assozierter Oberflächenantigene als mögliche Zielstrukturen für Immuntherapien. Hierzu identifizierten wir in Proben von MM Patienten den HLA-B*18 Liganden P(BCMA)B*18 aus dem B-Zell-Reifungsantigen. Die Immunogenität von P(BCMA)B*18 konnte durch spontane T-Zell-Antworten in MM Patientenproben bestätigt werden. Des Weiteren induzierte P(BCMA)B*18 in Kombination mit Immuncheckpoint-Inhibitoren in vitro multifunktionale, zytotoxische T-Zellen in MM Proben. P(BCMA)B*18 ist daher ein vielversprechendes Zielantigen für Immuntherapien von B-Zell-Erkrankungen. Zusammenfassend beschreiben wir neue, immunogene Zielstrukturen für T-Zell-basierte Immuntherapien zur gezielten Bekämpfung hämatologischer Neoplasien und deren Vorstufen.

In dieser Dissertation wurden JAK2V617F-mutierte MPN-Patienten auf Mutationen in den epigenetischen Regulatoren ASXL1, DNMT3A und TET2 untersucht. Insgesamt konnte bei 28,5% (12/42) der Patienten eine Mutation in mindestens einem der genannten Gene nachgewiesen werden. Alle Träger einer solchen Mutation waren homozygot JAK2V617F-mutiert. Was den klinischen Verlauf anbelangt, scheint das Vorhandensein einer ASXL1-Mutation mit einem erhöhten Risiko der Transformation in eine sekundäre Myelofibrose assoziiert zu sein.

In den vergangenen Jahren wurden bei myeloproliferativen Erkrankungen zahlreiche Mutationen beschrieben, über deren genaue molekulare Mechanismen oder die zeitliche Abfolge, im Sinne einer klonalen Evolution, deren prognostische Wertigkeit sowie deren Korrelation mit Knochenmarkmorphologie und Klinik war jedoch wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Verläufe von myeloproliferativen Erkrankungen und MDS/MPN an sequentiellen Knochenmarkbiopsien untersucht. Es wurde sowohl der morphologische als auch der klinische Verlauf zur Einordnung in Gruppen betrachtet und die Verläufe mit einer Untersuchung von molekularen Mechanismen der Progression, dem zeitlichen Verlauf der Mutationen und möglicher additiver Effekte dieser Mutationen korreliert. Ein besonderer Fokus lag auf der Bedeutung der Mutationen im SRSF2- und im TP53-Gen. Die Untersuchungen erfolgten an einem Studienkollektiv von insgesamt 133 Fällen bzw. 75 Patienten, von denen 30 Patienten (37,3%) progredient waren, 45 Patienten (62,7%) eine stabile myeloproliferative Erkrankung (Kontrollgruppe) hatten. Es zeigte sich, dass die SRSF2-Mutation signifikant häufiger in der Gruppe der progredienten myeloproliferativen Erkrankungen vorkam, insbesondere bei Progression in Richtung eines MDS. Als frühe somatische Mutation eignet sich die Mutation möglicherweise schon bei Erstdiagnose zur Risikostratifizierung. Ebenso stellt die SRSF2-Mutation bei MDS/MPN-UC eine sehr häufige Mutation dar, kann somit als ein mögliches diagnostisches Werkzeug dienen. Das Auftreten einer TP53 Überexpression verursacht bei einem Teil der Patienten eine Transformation der MPN in Richtung einer akuten myeloischen Leukämie, es zeigte die in der Literatur beschriebene Tendenz, dass TP53-Mutationen erst zum Zeitpunkt einer leukämischen Transformation auftreten. Im untersuchten Kollektiv kamen SRSF2- und starke TP53 Überexpression als Hinweis auf Mutation nicht gemeinsam vor, JAK2- und SRSF2-Mutation waren ebenfalls seltener koinzident. Wie durch Vorarbeiten bei der CMML gezeigt, lässt sich mittels RFLP der SRSF2-Mutationsstatus zuverlässig und schnell aus dem Knochenmark-trepanat identifizieren, in der vorliegenden Arbeit konnte dies bei den verschiedenen MPN-Entitäten, sekundären MDS, MDS/MPN und sekundären akuten myeloischen Leukämien gezeigt werden. Die immunhistochemische Methode zur Darstellung der TP53-Überexpression von Saft et al. eignet sich gut um Fälle mit erhöhtem Risiko der Progression am Knochenmarktrepanat festzustellen.

Der Begriff „Myeloproliferative Neoplasien“ (MPN) umfasst gemäß der WHO-Klassifikation von 2008 heterogene Formen myeloischer Stammzellerkrankungen. Eine wichtige Gruppe bilden die BCR-ABL1-negativen MPN essentielle Thrombozythämie (ET), Polyzythämia vera (PV) und primäre Myelofibrose (PMF). Grundsätzlich zeigen die oben genannten Entitäten einen chronischen, langsam progredienten Verlauf, ihnen ist jedoch gemein, dass sie in eine sekundäre, akute myeloische Leukämie (sAML) transformieren können, was mit einer sehr schlechten Prognose für die betroffenen Patienten einhergeht. Basierte die Einteilung der BCR-ABL1-negativen MPN vormals ausschließlich auf Blut- und Knochenmarkveränderungen sowie den damit verbundenen klinischen Symptomen, so erlauben moderne molekulargenetische Untersuchungen seit einiger Zeit auch bei diesen Entitäten eine an den jeweils vorliegenden genetischen Aberrationen orientierte Einteilung. Inzwischen ist eine Vielzahl den MPN zugrunde liegender genetischer Aberrationen bekannt, deren prominentester Vertreter die Punktmutation V617F im JAK2-Gen darstellt, von der weit über 90% der PV-Patienten bzw. gut die Hälfte der ET/MF-Patienten betroffen sind und die nach Entwicklung eines JAK-Inhibitors ein potentes therapeutisches Target darstellt. Die vorliegende Arbeit soll zum einen einen Beitrag zur weiteren molekularen Charakterisierung der MPN leisten und zum anderen die Benennung von Kandidatengenen und deren pathogenetischer Relevanz ermöglichen. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die Identifizierung von möglicherweise leukämierelevanten Genveränderungen gelegt. Dazu wurde in einem ersten Schritt ein Kollektiv von 87 Myelofibrose-Patienten mittels SNP-Arrays analysiert: Diese Arrays ermöglichen eine genomweite Detektion von Kopiezahlveränderungen (copy number alterations, CNA) und kopiezahlneutraler Heterozygotieverluste (uniparentale Disomien, UPD). Dabei konnten im untersuchten Kollektiv 83 CNA und 27 UPD in 53/87 (60%) Patienten identifiziert werden. Besonders interessant sind dabei Mikrodeletionen (