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[ES] Las plantas están bajo el ataque continuo de múltiples patógenos, pero solo los que tienen éxito logran causar infecciones. Los patógenos exitosos hacen uso de un armamento diverso que puede interferir o manipular el sistema inmunológico de la planta. En los últimos años, los RNA pequeños (sRNA) se han indicado como una nueva clase de efectores. Los sRNA son RNA reguladores no codificantes que inducen el silenciamiento génico mediante la carga en proteínas Argonaute (AGO)/complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). Los patógenos y parásitos son capaces de traficar estos efectores de ARNs hacia sus huéspedes, provocando el silenciamiento de genes en un fenómeno conocido como "interferencia de ARN entre reinos", RNAi CROSS-KINGDOM, (ckRNAi). Curiosamente, este fenómeno puede ser bidireccional. A pesar de la creciente evidencia de ckRNAi en una amplia variedad de interacciones, la dinámica coevolutiva entre los loci productores de sRNA y los sitios objetivo de sRNA en los huéspedes está poco estudiada. Una pregunta clave que surge con respecto a la evolución de los efectores de sRNA en un contexto de ckRNAi es si esas secuencias son el resultado de la presión de selección. Debido a que la eficiencia de ckRNAi depende de la complementariedad entre los efectores de sRNA y sus sitios objetivo, durante la carrera armamentista se esperaría que las mutaciones en los sitios objetivo se seleccionen para evitar la complementariedad. Por otro lado, también se esperaría una diversificación de las secuencias efectoras de sRNA para que el patógeno siga el ritmo de las variaciones del sitio objetivo del huésped. Sin embargo, este tipo de dinámica coevolutiva no está clara para los parásitos con una coevolución menos estricta, es decir, los patógenos generalistas. Por lo tanto, surge otra pregunta: ¿cómo se puede mantener este tipo de interacción a lo largo del tiempo evolutivo en patógenos con una amplia gama de huéspedes? Una hipótesis alternativa es que los organismos productores de efectores de sRNA implementan una plétora de secuencias de sRNA, algunas de las cuales pueden alcanzar la transcripción del huésped por casualidad. Esta última se conoce como una "estrategia de escopeta". Con el fin de arrojar luz sobre la dinámica coevolutiva entre los efectores de sRNA y sus sitios objetivo, se realizaron análisis comparativos genómicos en el patógeno generalista necrotrófico Botrytis cinerea. Se examinó la presencia de múltiples efectores de sRNA en 99 poblaciones de Botrytis y se formaron grupos. Además, se evaluó la conservación del sitio objetivo en una amplia gama de hospedantes. Asimismo, se exploraron las variaciones en las secuencias efectoras de sRNA y su correlación con las sustituciones del sitio diana. Los resultados mostraron que las poblaciones de Botrytis no se agruparon en función de sus huéspedes de origen, origen geográfico o agresividad. Sin embargo, se formaron dos grupos principales basados en la presencia de sRNA derivados de elementos transponibles. Los análisis de conservación mostraron que algunos sitios objetivo están altamente conservados en múltiples huéspedes de Botrytis, pero la mayoría de los sitios no están conservados. No se encontraron secuencias compensatorias entre las variaciones de las secuencias de sRNA y las sustituciones en los sitios diana conservados. En general, estos resultados sugerirían que B. cinerea puede seguir una estrategia de escopeta, pero se necesitan más estudios para confirmar esta hipótesis. Finalmente, este trabajo incluye una revisión de la literatura sobre la coevolución en las interacciones planta-parásito, así como los antecedentes teóricos tanto de los sRNA como de los ckRNAi., [EN] Plants are under the continuous attack of multiple pathogens, but only successful ones manage to cause infections. Successful pathogens make use of a diverse armament that can interfere with or manipulate the plant immune system. In recent years, small RNAs (sRNAs) have been indicated as a new class of effectors. sRNAs are non-coding regulatory RNAs that induce gene silencing by loading into Argonaute (AGO)/RNA-induced silencing complex (RISC) proteins. Pathogens and parasites are capable of trafficking these sRNA effectors into their hosts, causing gene silencing in a phenomenon known as "Cross-kingdom RNA interference" (ckRNAi). Interestingly, this phenomenon can be bidirectional. Despite increasing evidence for ckRNAi in a wide variety of interactions, the coevolutionary dynamics between the sRNA-producing loci and the sRNA target sites in the hosts is poorly studied. One key question that arises regarding the evolution of sRNA effectors in a context of ckRNAi is whether those sequences are the result of selection pressure. Because ckRNAi efficiency depends on the complementarity between the sRNA effectors and their target sites, during arms race it would be expected that mutations in the target sites are selected to avoid complementarity. On the other hand, a diversification of the sRNA effector sequences would also be expected for the pathogen to keep pace with the host's target site variations. Nevertheless, this kind of co-evolutionary dynamic is unclear for parasites with a less stringent co-evolution, i.e., generalist pathogens. Hence, another question arises: how can this kind of interaction be maintained throughout evolutionary time in pathogens with a broad range of hosts. An alternative hypothesis is that the sRNA effector-producing organisms deploy a plethora of sRNA sequences of which some are able to hit host transcript by chance. The latter is known as a "shotgun strategy". In order to shed light on the co-evolutionary dynamics between sRNA effectors and their target sites, genomic comparative analyses in the necrotrophic-generalist pathogen Botrytis cinerea were performed. The presence of multiple sRNA effectors in 99 Botrytis populations was examined and clusters were formed. Additionally, the target site conservation in a wide range of hosts was evaluated. Likewise, the variations in the sRNA effector sequences and their correlation with target site substitutions were explored. The results showed that the Botrytis populations were not clustered based on their source hosts, geographical origin, or aggressiveness. However, two main clusters were formed based in the presence of sRNAs derived from transposable elements. Conservation analyses showed that some target sites are highly conserved across multiple Botrytis hosts, but with most sites being non-conserved. Compensatory sequences between the variations of the sRNA sequences and the substitutions in conserved target sites were not found. Overall, these results would suggest that B. cinerea may follow a shotgun strategy, but further studies are necessary to confirm this hypothesis. Finally, this work includes a literature review on the co-evolution in plant-parasite interactions, as well as theoretical background of both sRNAs and ckRNAi.

RESUMEN En los últimos 10 años, los científicos han logrado simular la evolución natural en sus laboratorios. Este proceso se denomina evolución dirigida, e inicia con un gen o secuencia diana. A partir de esta secuencia del gen se generan bibliotecas de genes mutantes utilizando mutagénesis aleatoria mediante la técnica de PCR propensa a error: epPCR. Las librerías generadas son sometidas a procesos de selección o tamizaje para identificar las proteínas ganadoras de una función o funciones en particular, con respecto a la proteína de la cual se originaron. Otra manera de identificar los productos generados en este largo proceso evolutivo es por medio de los análisis de coevolución, los cuales son de mucha ayuda cuando no existen procesos de selección y el método de tamizaje disponible para encontrar mutantes es muy lento, limitando el número de mutantes a muestrear para obtener una variante mejorada. En la coevolución, se analizan los patrones de variación de residuos que forman un contacto entre sí, porque dichas mutaciones cambian el empaquetamiento de la proteína y pueden provocar modificaciones de función, estabilidad, selectividad, incluso cuando están lejos del sitio activo. La presión de selección a la que son sometidas las proteínas hace que dos residuos que se encuentran en contacto varíen de forma correlacionada cuando son importantes para la función. Por lo anterior, la evolución dirigida aunada a la coevolución son unas de las técnicas más exitosas de la biología molecular y de frontera que nos permiten explorar y mejorar las funciones en una gran cantidad de proteínas de interés médico, biotecnológico, industrial, etc, en un tiempo muy corto. ABSTRACT In the last 10 years, scientists have been able to simulate natural evolution in laboratories through the process of directed evolution, which begins with a target gene or sequence for which a mutant gene library is generated using random mutagenesis. After producing such libraries through the technique of error-prone PCR (epPCR), they are subjected to selection or screening for the identification of improved proteins towards a particular function or functions when compared to the protein that originated them. Another methodology to harness the products of the long evolutionary history is the coevolution analysis, which is very helpful when no selection strategy is feasible and the screening method available to sift mutants is very slow, limiting the number of mutants that can be sampled to find an improved variant. In the coevolution analysis, the variation patterns of residues in contact are analyzed, because mutations in these residues change the residue packing in the protein, thus, producing modifications in function, stability, selectivity, even when residue substitution is far from the active site. The selection acting on proteins force two residues in contact to vary in a correlated way when they are important for function. Therefore, directed evolution coupled with coevolution are some of the most successful techniques in molecular and frontier biology that allow us to explore and improve the functions of a large number of proteins of medical, biotechnological, industrial interest, etc., in a very short time., {"references":["Brinda K V., Vishveshwara S. Oligomeric protein structure networks: Insights into protein-protein interactions. BMC Bioinformatics 2005;6. https://doi.org/10.1186/1471-2105-6-296.","Mei G, Di Venere A, Rosato N, Finazzi-Agrò A. The importance of being dimeric. 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Los estudios que analizan los factores determinantes en la asociación de ácaros y roedores hospedadores en el Neotrópico son escasos. Un lugar interesante para analizar estos factores es la Cuenca del Plata. En esta área los roedores del género Oligoryzomys (Cricetidae), comúnmente llamados “colilargos”, están ampliamente distribuidos y asociados con gran diversidad de ácaros lelápinos. Esta amplia distribución expone a la fauna de ácaros a distintos factores, tanto bióticos como abióticos. En la Cuenca del Plata se encuentran en simpatría y alopatría, las especies Oligoryzomys flavescens, O. fornesi y O. nigripes, lo que los hace un buen modelo para estudiar asociaciones o factores asociados a la fauna acarológica. El objetivo general de esta tesis fue determinar la distribución de los ácaros lelápinos (Laelapidae: Mesostigmata) en asociación con sus respectivos hospedadores, analizar factores que pudieran explicar dicha distribución e inferir si la asociación parásito-hospedador se debe a procesos coevolutivos o de host-switching. Para esto, se analizaron comunidades de ácaros lelápinos en O. flavescens, O. fornesi y O. nigripes, haciendo énfasis en las poblaciones de ácaros del género Laelaps (Laelapinae). Con fines comparativos se incluyeron además Laelaps spp. asociados a otros miembros de las tribus Oyzomyni y Akodontini. Se realizó extracción de ADN de forma no destructiva, lo que permitió una posterior aclaración de las muestras para su observación bajo microscopio óptico. Para su estudio se utilizó un enfoque integrador abarcando estudios cualitativos, métricos (lineales y geométricos) y moleculares. Además, se realizó un análisis multivariado incluyendo factores bióticos y abióticos para determinar cuáles factores influyeron en la abundancia de ácaros. Se analizó un total de 5151 ácaros lelápinos, recuperados de la prospección de 119 O. flavescens, 19 O. fornesi y 217 O. nigripes. Estos ácaros fueron identificados como: Androlaelaps fahrenholzi (5%), Gigantolaelaps wolffsohni (15%), Mysolaelaps microspinosus (13%), Mysolaelaps parvispinosus (21%), Laelaps schatzi (4%), L. paulistanensis (29%) y Laelaps sp. nov. 1 (12%). El empleo de las distintas técnicas de análisis taxonómico utilizadas en esta tesis permitió la detección de nuevas especies y la determinación de otras ya descritas. Gracias a esto, se reconocieron cuatro especies nuevas de Laelaps para la ciencia (L. schatzi, Laelaps sp. nov.1, Laelaps sp. nov. 2, Laelaps sp. nov. 3) y se actualizaron los registros previos de ácaros para roedores de la Cuenca del Plata. Los resultados de esta tesis indican una especificidad de estos ácaros por lo menos al nivel genérico. Para la mayoría de las especies mencionadas se pudieron postular procesos coevolutivos. Los estudios moleculares revelan, además, que es muy factible considerar a Laelaps como un género polifilético. Los resultados indican que no existe un único factor que determine los patrones de distribución de los ácaros laelápidos en la Cuenca del Plata. Por el contrario, se observó que su distribución estaba determinada por múltiples factores, relacionados particularmente con el hospedero (p. ej. su comportamiento, el sexo o preferencias del hábitat). Esto se refleja en el hecho que en cinco de las siete especies estudiadas, el patrón de asociación parásito-hospedador se mantuvo a lo largo de la distribución geográfica, lo que sugiere una escasa influencia ambiental. Esta tesis esclarece y amplía las asociaciones parásito-hospedador entre los lelápinos y roedores Oligoryzomys spp. en un gradiente geográfico y contribuye al conocimiento de la diversidad de estos ácaros. Además, el protocolo de extracción de ADN no destructivo desarrollado en esa tesis permite una solida identificación morfológica de los lelápidos. Muy pocos estudios siguen este procedimiento, a pesar de las ventajas que presenta en esta área. La combinación entre métodos morfogeométricos y moleculares podría actuar como una herramienta estandarizada para la identificación de los ácaros y proporcionar relaciones filogenéticas entre ellos. Asimismo, se puede destacar la utilidad/importancia de tratar cada morfotipo potencialmente como especie no descrita, ya que la existencia de posibles especies "ocultas" en un complejo de especies o especies crípticas podría afectar a la correcta interpretación de los datos. Para futuros estudios, se propone explorar otras variables que podrían determinar los patrones de distribución de los ácaros como por ejemplo las particularidades de cada hospedador asociado, incluyendo el comportamiento y sus rasgos ecológicos., Facultad de Ciencias Naturales y Museo