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The strategy for cloning a 306 bp rat STAT5b fragment, amplified by RT-PCR, into an expression vector is described.The main difference between STAT5a and STAT5b lies within the 3' region of their respective cDNAs, therefore a fragment in this region was amplified. Cloning was achieved by using the new system TOPO-TA recommended, for products difficult to be cloned.The fragment was subcloned into pBlueScript Il SK vector and characterized by sequencing and restriction analysis. Subcloning was done in order to obtain sense and antisense RNA probes by in vitro transcription. This specific probe has been used to quantify STAT5b mRNA levels in liver from male rats, by a soluiiori hybridization RNAase protection assay., Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento de 306 pb del gen de STAT5b de rata, amplificado por la técnica de RT-PCR. Se amplificó una región en el terminal 3' donde se encuentra la mayor diferencia entre las secuencias del cADN de las isoformas STAT5a y STAT5b de rata. La clonación se logró utilizando el nuevo sistema TOPO-TA recomendado para productos de dificil clonación. El fragmento se subclonó en el vector pBlueScript II SK y se caracterizó mediante secuenciación y análisis de restricción. La subclonación se realizó con el propósito de poder obtener sondas sentido y antisentido de ARN por transcripción in vitro. Esta sonda específica se empleó para cuantificar niveles de mARN de STAT5b en hígado de ratas macho mediante la técnica de hibridización en solución o ensayo de protección de ARNasas.

This work describes the production of JAK2 by recombinan, methods, using a baculovirus expression vector. Sf9 cells from the ovary tissue of Spodoptera frugiperda were infected with an optimal virus dilution of 10plIml medium and harvest was done at 72 h postinfection. Approximately 5 x 107cells were infected, extracts were collected, ultrafiltered and subjected to ionic exchange chromatography on DEAE-Sephacel, and JAK2 was partially purified by a continuos ionic gradient (1 0-500 mM NaCI). JAK2 was identified by Western blot with a polyclonal antibody raised in rabbits against 758-776 residues from murine JAK2. Results showed that the protein obtained by this method is in phosphorylatedl activated state., El presente trabajo describe la producción de la proteina recombinante JAK2, empleando un sistema de vectores de expresión baculovirales. La infección de células Sf9, derivadas del tejido de ovario de Spodoptera frugiperda, permitió establecer las condiciones óptimas de dilución del virus en 10 pllml de medio y de tiempo de recolección en 72 horas postinfección. Se recolectaron y ultrafiltraron extractos correspondientes a la infección de 5 x 10' células, aproximadamente, y se sometieron a cromatografia de intercambio iónico (DEAE-Sephacel), lográndose purificar parcialmente la proteina JAK2 por medio de un gradiente continuo de fuerza iónica (NaCI 10-500 mM). La presencia de JAK2 se verificó por Western blot, empleando un anticuerpo policlonal producido en conejo contra los residuos 758-776 de JAK2 de ratón. Los resultados indicaron que la proteína obtenida por este sistema de expresión se sintetiza en forma fosforiladalactivada.

Control of cytokine activity is provided in certain cases by the generation of soluble forms of the receptor, which mainly function as binding proteins, although some other agonistic properties have been described. The objective of the present study was to identify the growth hormone binding protein (GHBP) and the prolactin binding protein (PRLBP) in human serum. GHBP was partially purified by a new method using Sepharose-immobilized hGH and separated and detected by electrophoresis and immunotransference (Western blot) using an antibody against the GH receptor. We found that human serum GHBP is a complex mixture of proteins with molecular weights in the range of 27 to 62 kDa, structurally related to the receptor and whose origin is still unknown. Sera from breast cancer patients and pregnant subjects showed the same protein profile although the levels were lower than the normal ones. those in pregnant subjects being the lowest. A 150 kDa protein, which dissociates into two subunits of 50 and 30 kDa, was identified by an anti-PRL receptor antibody, consistent with previous reports. According to the molecular weight and the lack of hGH binding activity observed, it is likely that the protein is nota soluble form of the receptor but rnight be an anti-idiotipic antibody in human serum. No differences in the protein profile were observed in the three sera investigated. The results suggest the presence of a prolactin binding protein, related to the receptor and whose origin awaits further studies., Una de las formas de regulación de la actividad de ciertas citocinas es la generación de formas solubles del receptor, las cuales actúan principalmente como proteínas de unión, aunque también se les han atribuido funciones de carácter agonista. El objetivo de este trabajo fue el de establecer la presencia de proteinas de unión a hormona de crecimiento (GHBP) y prolactina (PRLBP) en suero humano. La GHBP se purificó parcialmente mediante un nuevo método empleando hormona humana de crecimieiito (GH, growth hormone) humana inmovilizada sobre Sepharosa y su separación y detección se realizó por medio de electroforesis e inmunotransferencia (Western blot), utilizando un anticuerpo dirigido contra el receptor de GH. Los resultados mostraron que la GHBP de suero humano es una mezcla compleja de proteínas con pesos en el rango de 27 a 62 kDa, relacionadas estructuralmente con el receptor de GH y cuyo origen está por determinarse. El suero proveniente de pacientes con cáncer de seno en estados 3 y 4, así como el de embarazo, mostró el mismo perfil de proteínas aunque sus niveles fueron en todos los casos inferiores a la normalidad, siendo los más bajos los de embarazo. En cuanto a la PRLBP, mediante anticuerpos antirreceptor, se identificó una proteina sérica de 150 kDa disociable en dos subunidades de pesos 50 y 30 kDa, consistente con lo informado por otros autores. De acuerdo con el peso establecido y a su incapacidad para unir hGH, se concluyó que no es una forma soluble del receptor y se sugiere que puede ser un anticuerpo antiidiotípico presente en suero humano. No se encontraron diferencias en el perfil ni en el contenido de la PRLBP en los tres tipos de suero analizados. Los resultados obtenidos ponen en evidencia la existencia de una proteina de unión a prolactina relacionada con el receptor de PRL y cuyo origen en humanos está por establecerse.

Total IGF-I in some tissues (liver, kidney, heart, lung, thymus, spleen and skeletal muscle) from normal adult rats was measured by specific radioimmunoassay (RIA). Acid-ethanol extraction (AE), currently utilised to separate IGF-I binding proteins (IGFBPs) in serum prior to RIA, was assessed in tissue analysis and was compared with AE followed by crioprecipitation. It was found that AE extraction does not completely remove IGFBPs, whereas the additional crioprecipitation step releases approximately 20% more IGF-I from the tissues. Rat IGF-I tissue distribution was finally established by RIA. The method here described is useful for the study of the metabolic or nutritional IGF-I regulation, Se establecieron los contenidos totales de IGF-I en algunos tejidos de rata adulta normal (hígado, riñón, corazón, pulmón, timo, bazo y músculo esquelético) por medio de radioinmunoanálisis (RIA) específico. La efectividad de la extracción ácido-etanólica (AE), corrientemente empleada para eliminar la interferencia de las proteínas de unión del IGF-I (IGFBPs) en el análisis del factor en suero, se evaluó para las muestras de tejidos y se comparó con la extracción AE seguida de crioprecipitación (AEC). Los resultados mostraron que la extracción AE no permite remover completamente las IGFBPs y que con el paso adicional de crioprecipitación se libera aproximadamente 20% más de IGF-I de los tejidos. Finalmente, por medio de RIA se estableció la distribución tisular de este factor de crecimiento en rata. El método aquí descrito puede aplicarse en estudios de regulación metabólica o nutricional del IGF-l.

The strategy for cloning a PCR-amplified STAT5 fragment into an expression vector is described. By optimising the magnesium level and the annealing temperature in the PCR reaction, target fragment amplification was achieved, using mouse STAT5b cDNA as a template. The PCR product was cloned and probe identity was confirmed by restriction analysis and sequencing. This probe was used in a solution hybridisation-Rnase protection assay to quantify STAT5 mRNA in female rats' livers and thymus lymphocytes. A higher STAT5 mRNA expression was found in liver., Se describe la estrategia empleada para clonar, en un vector de expresión, un fragmento del gen de STAT5 amplificado por la técnica de PCR. Variando la concentración de magnesio y la temperatura de alineación, se logró amplificar el fragmento deseado a partir de un cADN de STAT5b de ratón. El producto de PCR se clonó y se comprobó la identidad de la sonda mediante análisis de restricción y secuenciación. Esta sonda se usó en el ensayo de protección con ribonucleasa A o hibridización en solución, para cuantificar el mARN de STAT5 en hígado y linfocitos de timo de ratas hembras. Se encontró una mayor expresión del mARN de STAT5 en hígado.