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Orientador: Luis Eduardo Soares Netto Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Glutarredoxinas (Grxs) são pequenas oxidorredutases que possuem pelo menos um resíduo de cisteína conservado em seus sítios ativos e têm atividade dissulfeto redutase dependente de tiol. Embora Grxs estejam envolvidas em diversos processos celulares, como enovelamento protéico e proteção contra espécies reativas de oxigênio, poucos substratos biológicos dessas enzimas são conhecidos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, oito Grxs foram identificadas (ScGrx1-8); destas ScGrx1-2 são ditiólicas e possuem o motivo Cys-Pro-Tyr-Cys em seus sítios ativos. Ambas Grxs ditiólicas são citosólicas, embora ScGrx2 também seja encontrada na mitocôndria. Neste trabalho, mostramos que ScGrx2 possui atividade específica como oxidorredutase quinze vezes maior do que ScGrx1, embora estas enzimas compartilhem 64% de identidade e 85% de similaridade de seqüência. A análise cinética bi-substrato mostrou que ScGrx2 possui tanto um menor KM para glutationa quanto um maior turnover que ScGrx1. Com o intuito de compreender melhor estas diferenças bioquímicas, determinamos os valores de pKa da cisteína N-terminal (Cys27) dos sítios ativos destas duas proteínas e demonstramos que estes parâmetros não justificam a diferença de atividade observada. Tentando identificar características estruturais relacionadas a essa diferença de atividade, determinamos as estruturas cristalográficas de ScGrx2 na forma oxidada e do mutante ScGrx2-C30S ligado à glutationa a 2.05 e 1.91 Å de resolução, respectivamente, e comparamos estas estruturas com as estruturas de ScGrx1 descritas por Håkansson & Winther, 2007. As análises estruturais nos permitiram formular a hipótese de que substituições dos resíduos Ser23 e Gln52 de ScGrx1 por Ala23 e Glu52 em ScGrx2 poderiam modificar a capacidade da cisteína C-terminal do sítio ativo de atacar o dissulfeto misto formado entre a cisteína Nterminal e glutationa. Nossa hipótese foi testada através de ensaios enzimáticos com proteínas mutantes. Acreditamos que as diferenças funcionais e estruturais observadas entre ScGrx1 e ScGrx2 possam refletir em variações na especificidade por substratos e indicam que estas enzimas possuem funções biológicas não redundantes em S. cerevisiae. Abstract: Glutaredoxins (Grxs) are small thiol-dependent oxidoreductases with disulfide reductase activity endowed by at least one cysteine at their active sites. Although Grxs are implicated in many cellular processes, including protein folding and protection against reactive oxygen species, few of their targets are known. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, eight Grxs isoforms were identified (ScGrx1-8). Two of them (ScGrx1-2) are dithiolic, possessing a conserved Cys-Pro-Tyr-Cys motif. Both dithiol glutaredoxins are cytosolic, however ScGrx2 is also located at the mitochondria. In spite of the fact that ScGrx1 and ScGrx2 share 85% of amino acid sequence similarity, we have shown that ScGrx2 is fifteen times more active as oxidoreductase than ScGrx1. Further characterization of the enzymatic activities through two-substrate kinetics analysis revealed that ScGrx2 possesses both a lower KM for glutathione and a higher turnover than ScGrx1. To better comprehend these biochemical differences, the pKa of the N-terminal active site cysteines (Cys27) of these two proteins were determined. Since the pKa values of ScGrx1 and ScGrx2 Cys27 residues are very similar, these parameters cannot account for the difference observed between their specific activities. In an attempt to better understand the mechanisms and differences between yeast dithiol Grxs activities, we elucidated the crystallographic structures of ScGrx2 in the oxidized state and of the ScGrx2-C30S mutant with a glutathionyl mixed disulfide at resolutions of 2.05 and 1.91 Å, respectively. Comparisons among these structures and those of ScGrx1 (Håkansson & Winther, 2007) provided insights into the remarkable functional divergence between these enzymes. We hypothesize that the substitutions of Ser23 and Gln52 in ScGrx1 by Ala23 and Glu52 in ScGrx2 can modify the capability of the active site C-terminal cysteine to attack the mixed disulfide between the N-terminal active site cysteine and the glutathione molecule. Mutagenesis studies supported this hypothesis. The observed structural and functional differences between ScGrx1 and ScGrx2 may reflect variations in substrate specificity and non-redundant biological functions. Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Ana Carolina de Mattos Zeri, Eduardo Granado Monteiro da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin Resumo: Manacá (MAcromolecular micro and NAno CrystAllography), primeira linha de luz em fase de comissionamento no Sirius (LNLS/CNPEM), é dedicada a diversos experimentos de cristalografia aplicadas em pequenas e macromoléculas, incluindo a recente técnica de cristalografia serial (SX). SX utiliza o feixe de microfoco e alto fluxo de fontes de luz avançadas, como o Sirius, para adquirir padrões únicos de difração de milhares de cristais por experimento, possivelmente, à temperatura ambiente. Um dos maiores desafios para SX é a união de conjuntos de dados parciais, aleatoriamente orientados no espaço recíproco, como se tivessem sido obtidos a partir da rotação de cristal único. Quanto ao dado final, o objetivo principal é extrair os melhores resultados dentro de uma variedade de combinações possíveis entre os subconjuntos de dado. Para solucionar isso, tem sido aplicados diferentes algoritmos, cada um com seus respectivos parâmetros a serem ajustados para toda coleta de dados. O objetivo dessa dissertação é fornecer uma rotina de processamento automático de dados para experimentos de SX realizados na Manacá. Construímos um script, em Python, que agirá como uma interface entre os usuários e os programas que estão sendo desenvolvidos para SX (CrystFEL, nXDS, cctbx.xfel, ccCluster, BLEND, xscale_isocluster, entre outros). Os usuários poderão chamar, de forma prática, diferentes programas de processamento, otimizar os parâmetros que melhor ajustem os seus dados, explorar visualmente as figuras de mérito e escolher as melhores opções de processamento. A fim de testar nossa rotina de processamento automático de dados, realizamos três experimen- tos durante o comissionamento científico da Manacá. Primeiramente, foram medidos 21 cristais de AmeGH128, no modo de oscilação (9.15 keV, tamanho de feixe variando de 20 a 60 µm), em 77K. Desse experimento, obtivemos um total de cerca de 64800 padrões de difração. Em seguida, cole- tamos 64 cristais de lisozima criocongelados, em modo grid-scan (12.69 keV, tamanho do feixe de 25 µm, fluxo de 10¹² ph/s). Nesse experimento, foram coletadas 2910 imagens no total. O mesmo experimento foi realizado em 20 cristais de lisozima em temperatura ambiente, utilizando um porta-amostra desenvolvido internamente pelo nosso grupo, selado com Kapton. Nessas condiçõs, nós obtivemos um total de 601 imagens. Os padrões de difrações obtidos foram usados como entrada para duas principais vias de proces- samento de SX: Hierarchical Cluster Analysis HCA (ccCluster) e imagens instantâneas (CrystFEL). Nosso script pôde indexar os padrões de difração com sucesso, de acordo com os parâmetros de célula unitária já conhecidos. Nosso fluxo de processamento de dados é versátil para verificação da qualidade dos dados e ajuste de parâmetros. Na rotina de imagens instantâneas, melhor qualidade final dos dados pode ser atingida, refinando a taxa de indexação e aumentando o número de cris- tais coletados. Todavia, a ferramenta de processamento de dados de SX é funcional e customizável para os usuários da Manacá. SX é uma promessa para o estudo de dinâmica de proteínas resolvida no tempo, e na descoberta de proteínas que são difíceis de cristalizar, como estruturas de proteínas de membrana. Possibilitar essa técnica na Manacá terá grande impacto em diversas áreas, desde descobrimento de drogas para tratamentos efetivos de doenças até otimização da produção de biocombustíveis renováveis Abstract: Manacá (MAcromolecular micro and NAno CrystAllography), first beamline in commissioning at Sirius (LNLS/CNPEM), is dedicated to a range of crystallography experiments applied to small and macro molecules, including the most recent technique of serial crystallography (SX). SX takes advantage of microfocus beam and higher flux from advanced light sources, such as Sirius, to acquire unique diffraction patterns from several tens of thousands of microcrystals per experiment, possibly, at room temperature. One of the biggest challenges for SX is to merge partial datasets, randomly oriented in the reciprocal space, as if they had been obtained from a single crystal rotation. Regarding final data, the main goal is to extract the best results from a range of all possible subdataset combination. To solve this, it has been applied different algorithms, each with their respective parameters that should be adjusted to every data collection. The aim of this dissertation is to provide an automated data processing pipeline for SX experiments on Manacá. We have built a script, in Python, that will act as an interface between users and new software being developed for SX (CrystFEL [5], nXDS, cctbx.xfel, ccCluster[3], BLEND[4], xscale isocluster, among others). Users will be able to, with minimal effort, call different data processing programs, adjust parameters that best fit their data, visually explore the figures of merit and choose the best data processing options. In order to test our data processing pipelines, we have performed three experiments during the Manacá’s scienctific commisioning. Firstly, it was measured 21 crystals of AmeGH128, in oscillation mode (9.15 keV, beam size varying from 20 to 60 µm ), at 77K. From that experiment, we obtained a total of around 64800 diffraction patterns. Afterwards, we collected 64 cryocooled lysozyme crystals, in grid-scan mode (12.69 keV, beam size 25 µm, flux at sample 10¹² ph/s). In this experiment, it was collected 2910 images in total. The same experiment was done on 20 lysozyme crystals at room-temperature, using an in-house build sample device, sealed with Kapton. In this condition, we obtained a total of 601 images. The diffraction patterns were used as an input for the two main branches of SX data processing: Hierarchical Cluster Analysis HCA (ccCluster) and snapshot images routine (CrystFEL). Our script could successfully index the diffraction patterns, according to the already known unit cell parameters. Our SX automatic data processing pipeline is versatile for immediate data quality verification and software parameters adjustments. In the snapshot routine, better final data quality might be achieved by tuning the indexing rate and increasing the number of crystals measured. Nevertheless, the SX data processing tool is functional and customizable for Manacá future users. Serial Crystallography is a huge promise for the study of time-resolved protein dynamics and in the revealing of proteins structures that are extremely difficult to crystallize, as membrane protein structures. Enabling this technique on Manacá will have a great impact in a variety of fields, from drug discovery for effective treatment of diseases to the optimization of renewable biofuels production Mestrado Física Mestra em Física CNPQ 143239/2019-8

Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. Resumo: O piruvato é considerado o ponto central do metabolismo celular, chave para a geração de energia e blocos biossintéticos. Quando a oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico é necessária, o piruvato citosólico deve ganhar acesso à matriz mitocondrial em um processo que se acredita envolver ativamente duas subunidades carreadoras de piruvato mitocondrial (MPC) organizadas em hetero-oligômeros. Desde 2012, quando as identidades moleculares de mamíferos MPC1 e MPC2 (e MPC3 em leveduras) foram finalmente apresentadas, vários estudos in vitro e in vivo revelaram uma interação inesperada entre duas ou mesmo três subunidades de proteínas que definem diferentes conjuntos funcionais, em um contexto metabólicos específicos; estes têm implicações claras na fisiologia da homeostase e em algumas doenças. No entanto, o mecanismo funcional baseado em estrutura de MPC permanece indefinido, apesar dos intensos esforços empregando ferramentas computacionais e técnicas experimentais de última geração. Nesta tese, a produção recombinante de MPC humano, através de uma estratégia de co-expressão, é incialmente descrita; no entanto, não foi observada formação substancial de complexos e, predominantemente, subunidades individuais foram purificadas. Em contraste com MPC1, que co-purifica com uma chaperona de levedura, demonstramos que os homo-oligômeros MPC2 promovem o transporte eficiente do piruvato em proteolipossomos. Os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas do MPC2 assemelham-se aos demonstrados anteriormente para o MPC na literatura. De maneira distinta, a inibição química do transporte é observada apenas para um derivado de tiazolidinediona. O papel de transporte autônomo para MPC2 é validado em células, quando a expressão ectópica de MPC2 humano em levedura sem MPC endógeno estimulou o crescimento e aumentou o consumo de oxigênio celular. A detecção de várias espécies oligoméricas de MPC2 em isolados mitocondriais, proteínas purificadas e bicamadas lipídicas artificiais sugerem complexos funcionais de alta ordem (> 2 subunidades). Mudanças significativas no conteúdo da estrutura secundária de MPC2, conforme sondado por dicroísmo circular de radiação sincrotron, suportam ainda mais a interação entre a proteína e os ligantes. A cristalografia de raios X foi prejudicada pela incapacidade de se obter cristais adequados tanto, por difusão de vapor, quanto em fase cúbica lipídica, apesar da obtenção de condições iniciais promissoras. Por fim, a análise por crio-microscopia eletrônica de MPC2 reconstituído em nanodiscos de copolímeros sintéticos permitiu a proposição de uma montagem estequiométrica para o complexo. Coletivamente, nossos resultados fornecem bases para o papel independente do MPC2 na homeostase e doenças relacionadas ao metabolismo desregulado do piruvato e representam uma rota promissora para a determinação de um modelo atômico de alta resolução para MPC2 humano. Abstract: Pyruvate is considered the central hub in the cellular metabolism, key for the generation of both energy and biosynthetic blocks. When the oxidation of pyruvate by the citric acid cycle is required, cytosolic pyruvate must gain access to the mitochondrial matrix in a process thought to actively involve two mitochondrial pyruvate carrier (MPC) subunits assembled into heterotypic oligomers. Since 2012, when molecular identities of mammalian MPC1 and MPC2 (and MPC3 in yeast) were presented, range of in vitro and in vivo studies has since revealed an unexpected interplay between two or even three protein subunits that define different functional assemblies on a metabolic context-specific basis; these have clear implications on the physiology of homeostasis and diseases. However, the structure-based functional mechanism of MPC remains elusive, despite intensive efforts by different research groups that employ state-of-the-art computational tools and experimental techniques. In this thesis, the recombinant production of human MPC through a co-expression strategy is first described; nevertheless, substantial complex formation was not observed, and predominantly individual subunits were purified. In contrast to MPC1, which co-purifies with a host chaperone, we demonstrated that MPC2 homo-oligomers promote efficient pyruvate transport into proteoliposomes. The derived functional requirements and kinetic features of MPC2 resemble those previously demonstrated for MPC in the literature. Distinctly, chemical inhibition of transport is observed only for a thiazolidinedione derivative. The autonomous transport role for MPC2 is validated in cells when the ectopic expression of human MPC2 in yeast lacking endogenous MPC stimulated growth and increased oxygen consumption. Multiple oligomeric species of MPC2 across mitochondrial isolates, purified protein and artificial lipid bilayers suggest functional high-order complexes. Significant changes in the secondary structure content of MPC2, as probed by synchrotron radiation circular dichroism, further supports the interaction between the protein and ligands. X-ray crystallography was hampered by the inability to grow suitable crystals by vapor diffusion and in lipidic cubic phase, despite the successful obtention of promising hit conditions. Lastly, cryo-electron microscopy analysis of MPC2 reconstituted into synthetic copolymer nanodiscs allowed for the proposition of a stoichiometric assembly. Collectively, our results provide the initial framework for the independent role of MPC2 in homeostasis and diseases related to dysregulated pyruvate metabolism and may represent a promising route for the determination of a high-resolution atomic model for human MPC2. Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES 001 FAPESP 2015/02734-7; 2019/02261-2

Orientador: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Neste trabalho realizamos estudos estruturais com duas proteínas, a Q4DV70 de Trypanosoma cruzi e a mesotelina de Homo sapiens. O objetivo foi contribuir para a compreensão da função dessas proteínas, as quais possivelmente são importantes para a doença de Chagas e o câncer, respectivamente. A proteína Q4DV70 estava anotada no genoma de T. cruzi como hipotética conservada. Em nosso estudo, a proteína foi pela primeira vez detectada em amostras do parasita. Essa expressão ocorre na fase epimastigota, mas não na fase tripomastigota metacíclica, indicando que a proteína pode ter uma função importante no ciclo de vida do T. cruzi. A estrutura cristalográfica da Q4DV70 foi resolvida por substituição molecular e refinada com dados até 1,5 Å de resolução. Ela apresenta enovelamento tiorredoxina, formado por uma folha ß de 5 fitas cercada por duas hélices a de cada lado. As proteínas que apresentam maior identidade seqüencial e superposição estrutural com Q4DV70 são as tiorredoxinas e PDIs, oxidorredutases de pontes dissulfeto. Porém, as duas cisteínas do sítio ativo dessas proteínas estão substituídas por serinas em Q4DV70, o que impossibilita a função de formação, redução ou isomerização de pontes dissulfeto. Diversas tiorredoxina-like apresentam atividade chaperona independente da função oxidorredutase. Essa função está relacionada a regiões hidrofóbicas na superfície e/ou depende da presença de outro domínio. Q4DV70 é monomérica, composta apenas pelo domínio tiorredoxinalike, e não apresenta regiões hidrofóbicas em sua superfície. Além disso, não demonstrou capacidade de aumentar o enovelamento da GAPDH de T. cruzi. Esses resultados indicam que Q4DV70 não apresenta atividade chaperona. Mesotelina é uma proteína expressa em mesotélio normal e em diversos tipos de câncer, como mesotelioma, câncer de ovário e de pâncreas e leucemia mielóide aguda. Ela é considerada um marcador diagnóstico para esses cânceres e tem sido alvo para o desenvolvimento de drogas anti-tumor. Além disso, ela interage com MUC16, uma proteína presente na superfície de células de câncer de ovário. Apesar da reconhecida importância e uso da mesotelina, pouco se sabe sobre sua estrutura e função. A proteína foi purificada em condições desnaturantes e submetida ao re-enovelamento por diálise. Experimentos de dicroísmo circular, fluorescência e proteólise limitada comprovaram que a mesotelina foi corretamente re-enovelada. Essa amostra foi submetida a ensaios de cristalização, os quais resultaram em cristais que difrataram a baixa resolução. A estrutura de baixa resolução da mesotelina foi calculada a partir de dados de espalhamento de raios X a baixo ângulo e mostra que sua forma é alongada e curvada. O espectro de dicroísmo circular da mesotelina é típico de proteínas ricas em hélices a. Recentemente foi proposto que a estrutura da mesotelina é formada por uma estrutura em super-hélice, composta por repetições do tipo ARM, as quais apresentam 3 hélices a cada uma. Nossos resultados experimentais indicam que esse modelo teórico está correto. Proteólise limitada com quimotripsina resultou em um domínio estável de 20 kDa na região N-terminal da proteína. Esse domínio contém os 64 resíduos descritos como possível sítio de ligação a MUC16 e deve ser formado pelas 4 primeiras repetições do tipo ARM, de acordo com o modelo publicado. Abstract: In this work we carried out studies with two proteins, Q4DV70 from Trypanosoma cruzi and mesothelin from Homo sapiens. The aim was to help the understanding of the function of these proteins which possibly are important to Chagas disease and cancer, respectively. Q4DV70 protein was annotated in T. cruzi genome as a conserved hypothetical protein. In our studies, the protein was detected for the first time in parasite samples. Its expression occurs in the epimastigote form but not in the metacyclic trypomastigote form indicating that Q4DV70 is important for the pathogen life cycle. Q4DV70 crystal structure was solved by molecular replacement and refined with data to 1.5 Å maximum resolution. It shows a thioredoxin fold, formed by a five stranded ß-sheet flanked by two a-helixes in each side. The proteins more sequentially identical and better structurally superposed to Q4DV70 are thioredoxins and protein disulfide isomerases, which are disulfide oxidoreductases. However, the cysteine residues from CXXC motif of the active site are replaced by serines in Q4DV70, what prevents the function of formation, reduction and isomerization of disulfide bonds. Different thioredoxin-like proteins show chaperone activity independent of oxidoreductase function. This function is related to hydrophobic regions on the surface and/or is dependent of another domain. Q4DV70 is monomeric, composed only by thioredoxin-like domain and does not show hydrophobic regions on its surface. Moreover the protein does not increase the refolding of GAPDH from T. cruzi. These results indicate that Q4DV70 does not present chaperone activity. Mesothelin is a protein expressed in normal mesothelium and in different types of cancer, such as mesothelioma, ovarian cancer, acute myeloid leukemia and cancer of pancreas. It is considered a diagnostic marker for these cancers and it has been used in the development of antitumor drugs. Besides that, it binds to MUC16, a protein present on the surface of ovarian cancer cells. In spite of its recognized significance and use in cancer, little is known about its structure and function. The protein was purified under denaturing conditions and submitted to refolding by dialysis. Circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis experiments confirmed that mesothelin was correctly refolded. This sample was submitted to crystallization trials that resulted in crystals which diffracted at low resolution. The low resolution structure of mesothelin was calculated from small angle X-ray scattering data and it shows an elongated and curved shape. The circular dichroism spectrum for mesothelin is typical of proteins that are rich in a-helixes. Recently it was proposed that mesothelin has a superhelix structure made by ARM repeats which are composed by 3 a-helixes each one. Our experimental results indicate that this theoretical model is correct. Limited proteolysis with chymotrypsin resulted in a stable domain of 20 kDa in the Nterminal region of the protein. This domain has the 64 residues described as the possible binding site for MUC16 and should be composed by the first four ARM repeats according to the model. Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular