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Le Orchidaceae è una delle famiglie di monocotiledoni più sviluppate; la loro produzione di fiori recisi e di piante da vaso hanno un elevato valore economico nel mercato florovivaistico internazionale. Ad oggi è usuale la coltura in vitro di orchidee attraverso la propagazione di Protocormi (Protocorm like bodies; PLBs), per germogli ascellari e callo. Uno degli obiettivi del miglioramento genetico nelle orchidee è quello di ottenere nuove varietà e combinazioni ibride commercialmente interessanti. I programmi d’incrocio tradizionali hanno finora portato a buoni risultati, ma i consumatori sono sempre desiderosi di avere nuove varietà e da qui la necessità di produrre sempre nuovo materiale con caratteristiche di interesse. Nel presente lavoro abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull’introduzione di nuova variabilità genetica in Dendrobium e Phalaenopsis spp per mezzo di un approccio biotecnologico che combini le manipolazioni cellulari e molecolari per indurre nuova variabilità genetica riducendo tempi e costi del processo. Abbiamo perciò sviluppato in Dendrobium e Phalaenopsis spp i protocolli per l’isolamento protoplasti, da foglia e PLBs, e per la loro fusione per via chimica e per elettrofusione. Abbiamo utilizzato agenti antimitotici per indurre mutanti poliploidi. Per rendere questa tecnologia più efficace ed efficiente, la citometria a flusso è stata ampliamente utilizzata per separare singolarmente i prodotti di fusione e per un rapido screening dei mutanti poliploidi. Sono stati ottenuti un buon numero di mutanti poliploidi e alcuni di questi hanno mostrato fenomeni di poliploidizzazione parziale. La citometria a flusso ci ha permesso, immediatamente dopo il trattamento, di individuare la migliore condizione per l’induzione di poliploidi, permettendo di ridurre tempi e materiale per l’ottenimento dei mutanti. La citometria a flusso in combinazione con i marcatori molecolari e le analisi citogenetiche ci hanno permesso di caratterizzare ed individuare i mutanti tetraploidi e quelli parzialmente duplicati. Orchidaceae family is one of the most developed monocotyledonous group; their pot plant and cut flower production have a high economical value in the international flower market. At first, in vitro culture protocols have been developed in this family and it is now usual to propagate orchids via protocorm-like body (PLB) formation, shoot multiplication or callus culture. One of the aims of the genetic improvement in orchids is to obtain new varieties and commercially attractive hybrid combinations. So far, the traditional breeding programs have led to very good results, but consumers desires are changeable and the need exists to generate always new stocks and to include some desirable combinations not allowed due to genetic incompatibility problems. In our research work we have focused our efforts on the introduction of new genetic variability in Dendrobium and Phalaenopsis spp by means of a biotechnological approach which combines cellular and molecular manipulations to increase genetic variability. This achievement in turn should provide a clue to address these incompatibilities and to rise new genetic variability. With this in mind, we have developed in Dendrobium and Phalaenopsisspp a protocol for leaf and PLBs protoplasts isolation and somatic hybridization via PEG (Polyethylene glycol) or electrofusion. In order to obtain polyploid mutants we used cell cycle blocking agents in vitro. To make this technological approach more effective and efficient, flow cytometry has been largely applied to recognize and sort single hybridized cells from normal ones immediately after the fusion process and for a rapid screening and identification of the new polyploid mutants. We were successful in obtaining polyploidy mutants from in vitro explants; interestingly, some of them showed a downsizing genome situation exhibiting a partial polyploidy. The flow cytometry screening proved to be an usefull tool to select polyploids and to reduce cost and time consumption for the entire process. Molecular marker (RAPD and SSR) and cytogenetic approachs were also applied to differentiate orchid mutants allowing a genetic identification of controls from tetraploids and near-tetraploids,thus reducing the general efforts to grow up very large plant population of unknown ploidy. Dottorato di ricerca in Ortoflorofrutticoltura

Dasypyrum villosum (L.) Candargy (sin. Haynaldia villosa) is an annual wild diploid grass species (2n = 2x = 14; genome VV) belonging to the Poaceae family, which is considered to be an important source of biotic and abiotic stress resistance genes for wheat breeding. Enhanced characterization of D. villosum chromosomes can facilitate exploitation of its gene pool and its use in wheat breeding programs. Here we present the cytogenetic identification of D. villosum chromosomes on slide by fluorescent in situ hybridization (FISH), with the GAA simple sequence repeat (SSR) as a probe. We also describe the isolation and the flow cytometric analysis of D. villosum chromosomes in suspension, resulting in a distinguished flow karyotype. Chromosomes were flow sorted into three fractions, according their DNA content, one of which was composed of a single type of chromosome, namely 6 V, sorted with over 85% purity. Chromosome 6 V is known to carry genes to code for important resistance and seed storage characteristics, and its isolation represents a new source of genetic traits and specific markers useful for wheat improvement.

Il presente lavoro di dottorato si è prefisso l'obiettivo di sviluppare per il cece tecniche di citogenomica a flusso attraverso la messa a punto di protocolli idonei per la sincronizzazione del ciclo cellulare e la preparazione di sospensioni cromosomiche. L'istogramma relativo all' intensità di fluorescenza (cariotipo a flusso), ottenuto dopo l'analisi dei cromosomi colorati con fluorocromi specifici per il DNA in grado di emettere radiazioni a determinate lunghezze d'onda, è servito all' individuazione del cariotipo di flusso della specie, con la rilevazione dei picchi e dei corrispondenti cromosomi sortabili. La cariotipizzazione è stata condotto su entrambi i tipi morfologici della specie, desi e kabuli. Sulle specifiche frazioni purificate di singoli tipi cromosomici è stato possibile effettuare il mappaggio fisico di regioni specifiche del genoma. Obiettivo finale del lavoro di dottorato è stato quello di localizzare sequenze specifiche per resistenza ad Fusarium oxysporum su linee desi e kabuli di cece e fornire le metodologie di base, così come è stato possibile fare per altre specie vegetali, per costruire librerie DNA subgenomiche utili per il l'individuazione e il mappaggio fisico di regioni geniche codificanti per caratteri agronomici di rilievo, fondamentali per il miglioramento genetico della specie. My Ph.D. work has been focused on the development of new flow cytogenetic techniques for chromosome manipulation and gene localization in chickpea. Most of the research efforts have been made to set up a proper methodology for celi cycle synchronization and chromosome isolation in suspension best suited for two Italian genotypes. Flow karyotyping from both types desi and kabuli chickpea was achieved using laser excited DNA specific fluorochromes. On DNA histograms, weli defined regions corresponding to single type chromosomes were identified and sorted. Sorted fractions were used for physical mapping of specific sequence linked to Fusarium oxysporum resistance in desi and kabuli chickpea, which was the main goal ofthis Ph.D. Thesis. From my research work I do hope will be possible to provide the basic methodologies to build subgenomic libraries in chickpea, useful for the identification and physical mapping of regions coding for important agronomic traits, fundamental for the genetic improvement ofthe species, as it was possible to do to other plant species. Dottorato di ricerca in Ortoflorofrutticoltura