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Efficient capture and conversion of atmospheric carbon dioxide (CO2) is a prerequisite to develop a carbon-neutral, circular future economy. Carbon fixation is the process by which inorganic carbon is fixed into biomass. In Nature, enzymes called caboxlyases are able to capture atmospheric carbon dioxide under mild conditions and catalyze its incorporation into organic molecules. It is estimated that 400 Gt of CO2 are fixed annually solely by the enzyme ribulose-1,5-bisphophate-carboxylase/oxygenase (RuBisCO), the key enzyme of photosynthesis. In comparison, CO2 utilization by chemical industries accounts for only 0.1 Gt of carbon annually and utilizes pressurized CO2, which emphasizes our need to understand the molecular mechanism that allow carboxylases to selectively interact with a CO2 at atmospheric concentrations (0.04% vol) during catalysis. Enoyl-CoA carboxylases/reductases (ECRs) represent the fastest carboxylases known to date and is, in contrast to RuBisCO, completely specific for CO2. These enzymes catalyze the reductive carboxylation of enoyl-CoAs by oxidizing one equivalent of NADPH. ECRs represent a good case study for the understanding of the CO2 chemistry that carboxylases use. In this work, we try to gain a better understanding of the underlying catalytic principles that enable ECRs to achieve high catalytic rates. Initially we focus on understanding how the precise interaction between protein and CO2 takes place at the active site of ECRs. We were able to identify and assign a function to four conserved amino acid residues found at the active site of ECRs. Three residues are responsible for the precise positioning of CO2 for nucleophilic attack by the enolate intermediate. Additionally, one residue is able to shield the active site from water thereby preventing the irreversible protonation of the enolate. These two mechanistic principles are at the base of the efficient carboxylation in ECRs. The following chapter briefly describes how the enzyme is able to accept other electrophiles than CO2. We show that ECRs can utilize formaldehyde as an alternative electrophile to CO2 thereby yielding beta-hydroxy thioesters. The exquisite stereospecificity together with the vast range of small electrophiles make ECR a potential biocatalyst for the production of various α-substituted thioesters. The last two chapters of this work focus on the structural aspects of ECR catalysis. We were able to obtain four new crystal structures of an ECR from Kitasatospora setae and to propose a model for the catalytic cycle of this enzyme. We show that the communication between and within the dimers that compose the functional homotetramer is crucial for the fast catalytic rates observed in this ECR. A separate study aims at developing an in vivo directed evolution screen to improve the catalytic properties of an ECR from Burkholderia ambifaria. Our approach yields an evolved variant, with mutations distant from the active site. The observed improved catalytic supports the importance of the residues for the catalytic rate. Both studies revealed the importance of the residues at the interface of the ECR monomers by their impact on catalytic rates of this enzyme., Effiziente Abscheidung und Umwandlung von atmosphärischen Kohlenstoffdioxid (CO2) ist eine Voraussetzung für die Entwicklung einer zukünftigen Kohlenstoff-neutralen Resourcenvewertung. Kohlenstofffixierung ist der Prozess wodurch anorganischer Kohlenstoff in Biomasse eingebaut wird. Carboxylasen sind natürlich vorkommende Enzyme welche in der Lage sind atmosphärisches Kohlenstoffdioxid unter milden Bedingungen in organische Verbindungen einzubauen. Jedes Jahr werden circa 400 Gt CO2 alleine von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO), das Schlüsselenzym der Photosynthese, fixiert. Verglichen dazu, Verwendet die chemische Industrie nur 0.1 Gt CO2 pro Jahr und zusätzlich benötigen diese Prozesse einen hohen Druck und Temperaturen. Deshalb ist es notwendig mehr Wissen über die molekularen Mechanismen zu erhalten, welche es Carboxylasen erlauben mit CO2 unter atmosphärischen Konzentrationen (0.04% vol) zu interagieren. Enoyl-CoA Carboxylasen/Reductasen (ECRs) sind die schnellsten Carboxylasen die heutzutage bekannt sind und sind zusätzlich, im Vergleich zu RuBisCO, spezifisch für CO2. Diese katalysieren die reduktive carboxylierung von Enoyl-CoAs mit der Oxidation von NADPH. Deshalb stellen ECRs ein gutes Modellsystem dar um die CO2 Chemie von Carboxylasen zu studieren. In dieser Arbeit, versuchen wir mehr Wissen über die grundlegenden katalytischen Prinzipien zu erlangen wodurch ECRs hohe Umschlagszahlen erreichen. Im ersten Kapitel steht die Interaktion zwischen CO2 und den Aminosäuren im Aktiven Zentrum von ECRs im Vordergrund. Es wurden vier konservierte Aminosäuren identifiziert und für jede eine Funktion zugeschrieben. Die Seitenketten von drei Aminosäuren sind verantwortlich um CO2 genau zu positionieren damit der nucleophile Angriff vom Enolat Intermediat stattfinden kann. Eine vierte Seitenkette ist verantwortlich das Aktive Zentrum vor Wasser zu schützen sodass das Enolat Intermediat nicht irreversibel protoniert wird. Diese sind die Zwei grundlegenden katalytischen Prinzipien wodurch ECRs eine effiziente Carboxylierung katalysieren. Im Anschluss wird in einem Kapitel beschrieben, ob es möglich ist, dass ECRs zusätzlich zu CO2, andere Elektrophile inkorporieren können. Wir zeigen, dass ECRs Formaldehyd verwenden und somit ein beta-hydroxy Thioester bilden können. Die exzellente Stereospezifizität und die große Vielfalt an kleinen elektrophilen Verbindungen machen ECR zu einem potentiellen Biokatalysator für die Produktion von α-substituierten Thioestern. In den letzten beiden Kapiteln dieser Arbeit werden strukturelle Eigenschaften von ECRs betrachtet. Vier neue Kristallstrukturen der ECR von Kitasatospora setae wurden gelöst und ein neuer katalytischer Zyklus für dieses Enzym vorgeschlagen. Wir haben gezeigt, dass die Kommunikation zwischen, und innerhalb der Dimere welche das funktionelle Homotetramer bilden, die Grundlage für eine schnelle Katalyse darstellt. Im letzten Kapitel versuchen wir eine in vivo gerichtete Evolution Strategie zu entwickeln um die katalytischen Parameter einer ECR von Burkholderia ambifaria zu verbessern. Mit dieser Methode haben wir eine evolvierte ECR Variante erhalten die Aminosäure Mutationen außerhalb des Aktiven Zentrums aufweist. Wir konnten feststellen, dass die Umschlagszahl verbessert wurde und somit die mutierten Aminosäuren von großer Bedeutung für die Katalyse sind. In beiden Kapiteln konnte festgestellt werden, dass Aminosäuren an der Kontaktoberfläche von Monomeren bezüglich der Katalyse in ECRs eine wichtige Rolle spielen.

Ras-Proteine sind kleine intrazelluläre Regulatorproteine, die zur Superfamilie der kleinen GTPasen gehören. Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, die Hydrolysemechanismen von verschiedenen Ras-Isoformen und -Mutanten mit ATR-FTIR-Spektroskopie und zeitaufgelöster Transmissions-FTIR-Spektroskopie aufzuklären. Die onkogenen Ras-Mutanten G12V, G13V und Q61A, sowie die Off-Mutante Y32A und der Komplex aus K16A mit dem GEF SOS wurden in dieser Arbeit untersucht. Für G12V und G13V wurden Veränderungen der Phosphatschwingungen und eventuell am Magnesiumion beobachtet. Des Weiteren wurden Messungen mit Aluminiumfluorid an Ras durchgeführt, um das Analogon des Übergangszustandes beobachten zu können, wobei Spektren für Ras mit und ohne RasGAP gewonnen wurden. Für die Isoform KRas 4B wurden der Hydrolysemechanismus und das Verhalten auf einer negativ geladenen Lipidmembran beobachtet. Der Hydrolysemechanismus von immobilisierten NRas-Proteinen auf einer Lipidmembran wurde ebenfalls untersucht.

Macromolecular complexes, also termed molecular machines, facilitate a large spectrum of biological reactions and tasks crucial to the survival of cells. These complexes are composed of either protein only, or proteins bound to nucleic acids (DNA or RNA). Prominent examples for each class are the proteosome, the nucleosome and the ribosome. How such units are assembled within the context of a living cell is a central question in molecular biology. Earlier studies had indicated that even very large complexes such as ribosomes could be reconstituted from purified constituents in vitro. The structural information required for the formation of macromolecular complexes, hence, lies within the subunits itself and, thus, allow for self- assembly. However, increasing evidence suggests that in vivo many macromolecular complexes do not form spontaneously but require assisting factors (“assembly chaperones”) for their maturation. In this thesis the assembly of RNA-protein (RNP) complexes has been studied by a combination of biochemical and structural approaches. A resourceful model system to study this process is the biogenesis pathway of the uridine-rich small nuclear ribonucleoproteins (U snRNPs) of the spliceosome. This molecular machine catalyzes pre-mRNA splicing, i.e. the removal of non-coding introns and the joining of coding exons to functional mRNA. The composition and architecture of U snRNPs is well defined, also, the nucleo-cytoplasmic transport events enabling the formation of these particles in vivo have been analyzed in some detail. Furthermore, recent studies suggest that the formation of U snRNPs in vivo is mediated by an elaborate assembly machinery consisting of protein arginine methyltransferase (PRMT5)- and survival motor neuron (SMN)-complexes. The elucidation of the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly would serve as a paradigm for our understanding of how RNA-protein complexes are formed in the cellular environment. The following key findings were obtained as part of this study: 1) Efforts were made to establish a full inventory of the subunits of the SMN-complex. This was achieved by the biochemical definition and characterization of an atypical component of this complex, the unrip protein. This protein is associated with the SMN-complex exclusively in the cytoplasm and influences its subcellular localization. 2) With a full inventory of the components in hand, the architecture of the SMN-complex was defined on the basis of an interaction map of all subunits. This study elucidated that the proteins SMN, Gemin7 and Gemin8 form a backbone, onto which the remaining subunits adhere in a modular manner. 3) The two studies mentioned above formed the basis to elucidate the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. Initially, an early phase in the SMN-assisted formation of U snRNPs was analyzed. Two subunits of the U7 snRNP (LSm10 and 11) were found to interact with the PRMT5-complex, without being methylated. This report suggests that the stimulatory role of the PRMT5-complex is independent of its methylation activity. 4) Key reaction intermediates in U snRNP assembly were found and characterized by a combination of biochemistry and structural studies. Initially, a precursor to U snRNPs with a sedimentation coefficient of 6S is formed by the pICln subunit of the PRMT5-complex and Sm proteins. This intermediate was shown to constitute a kinetic trap in the U snRNP assembly reaction. Progression towards the assembled U snRNP depends on the activity of the SMN-complex, which acts as a catalyst. The formation of U snRNPs is shown to be structurally similar to the way clamps are deposited onto DNA to tether poorly processive polymerases. 5) The human SMN-complex is composed of several subunits. However, it is unknown whether all subunits of this entity are essential for U snRNP assembly. A combination of bioinformatics and biochemistry was applied to tackle this question. By mining databases containing whole-genome assemblies, the SMN-Gemin2 heterodimer is recognized as the most ancestral form of the SMN-complex. Biochemical purification of the Drosophila melanogaster SMN-complex reveals that this complex is composed of the same two subunits. Furthermore, evidence is provided that the SMN-Gemin2 heterodimer is necessary and sufficient to promote faithful U snRNP assembly. Future studies will adress further details in the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. The results obtained in this thesis suggest that the SMN and Gemin2 subunits are sufficient to promote U snRNP formation. What then is the function of the remaining subunits of the SMN-complex? The reconstitution schemes established in this thesis will be instrumental to address this question. Furthermore, additional mechanistic insights into the U snRNP assembly reaction will require the elucidation of structures of the assembly machinery trapped at various states. The prerequisite for these structural studies, the capability to generate homogenous complexes in sufficient amounts, has been accomplished in this thesis., Makromolekulare Komplexe, auch molekulare Maschinen genannt, ermöglichen eine grosse Vielfalt biologischer Reaktionen und Aufgaben, die für das Überleben von Organismen kritisch sind. Diese Komplexe bestehen entweder nur aus Protein, oder setzen sich aus Protein und Nukleinsäure (DNA oder RNA) zusammen. Prominente Beispiele für diese Klassen molekularer Maschinen sind das Proteosom, das Nukleosom oder das Ribosom. Wie sich solche Einheiten innerhalb einer Zelle zusammenlagern ist eine grundlegende Frage der Molekularbiologie. Frühere Studien hatten angeduetet, dass es möglich ist sogar sehr grosse Komplexe wie das Ribosom in vitro aus gereinigten Bestandteilen zu einem aktiven Partikel zu rekonstruieren. Die Strukturinformation, die für die Bildung von makromolekularen Komplexen erforderlich ist, liegt also in den Untereinheiten selbst. Im Gegensatz dazu mehren sich heute die Hinweise dafür, dass sich viele makromolekulare Komplexe nicht spontan zusammenlagern, sondern die Aktivität assistierender Faktoren („Assembly Chaperone“) für ihre Reifung benötigen. In dieser Arbeit wurde der Zusammenbau von RNA-Protein (RNP) Partikeln durch eine Kombination aus Biochemie und Strukturbiologie untersucht. Ein ergiebiges System, um diesen Prozess zu studieren, ist die Biogenese der RNPs (U snRNPs) des Spleissosoms. Aufgabe dieser molekularen Maschine ist das Herausschneiden nicht-kodierender Introns und das Zusammenfügen kodiereneder Exons um so funktionelle mRNA zu bilden. Die Zusammensetzung und Architektur von U snRNPs sind gut definiert. Auch ist der Kern- Zytoplasma Transport, der für die Reifung dieser Partikel notwendig sind, detailliert beschrieben worden. Außerdem weisen neueste Studien darauf hin, dass die Bildung von U snRNPs in vivo durch eine komplexe Maschinerie, die aus den Protein-Arginin- Methyltransferase 5 (PRMT5)- und Survival-Motor-Neuron (SMN)- Komplexen besteht, vermittelt wird. Die Entschlüsselung des Reaktionsmechanismus des zellulärem U snRNP Zusammenbaus würde als Musterbeispiel für unser Verständnis dienen, wie RNPs in einer Zelle gebildet werden. Folgende Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit gewonnen: 1) Es wurde zunächst versucht eine komplette Bestandsliste der Untereinheiten des SMN-Komplexes zu erstellen. Dies wurde durch die biochemische Definition und Charakterisierung einer atypischen Komponente dieses Komplexes, des Unrip Proteins, erreicht. Dieses Protein bindet ausschliesslich im Zytoplasma an den SMN-Komplex und beeinflusst dessen subzelluläre Lokalisation. 2) Die komplette Inventarisierung des SMN-Komplexes ermöglichte die Untersuchung der Wechselwirkung aller Untereinheiten und somit die Untersuchung seiner Architektur. Diese Studie zeigte, dass die Proteine SMN, Gemin7 und Gemin8 das Rückgrat des SMN-Komplexes bilden auf dem die restlichen Untereinheiten modular angeordnet werden. 3) Die zwei oben erwähnten Studien bildeten die Grundlage, den Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung zu entschlüsseln. Zunächst wurde eine frühe Phase im SMN-vermittelten U snRNP Zusammenbau analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass zwei Untereinheiten des U7 snRNP (LSm10 und 11) mit dem PRMT5-Komplex wechselwirken, ohne methyliert zu werden. Dies deutet darauf hin, dass die unterstützende Rolle des PRMT5-Komplexes von seiner Methylierungsaktivität unabhängig ist. 4) Schlüsselintermediate im Zusammenschluss von U snRNPs wurden identifiziert und durch eine Kombination von Biochemie und Strukturbiologie charakterisiert. In einer ersten Stufe bildet sich ein Vorgänger von U snRNPs mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S aus. Dieses Intermediat, bestehend aus pICln (einer Untereinheit des PRMT5-Komplexes) und Sm Proteinen, stellt eine kinetische Falle in der U snRNP Zusammenlagerung dar. Das Voranschreiten zum maturen U snRNP hängt von der Aktivität des SMN-Komplexes ab, der als Katalysator wirkt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung von U snRNPs strukturell ähnlich zu der Reaktion verläuft, die Polymerasen mit geringer Prozessivität an der DNA verankert und die als „clamp-loading“ bezeichnet wird. 5) Der menschliche SMN-Komplex setzt sich aus mehreren Untereinheiten zusammen. Es ist jedoch unbekannt, ob alle Teile des Komplexes für die Zusammenlagerung von U snRNPs notwendig sind. Diese Frage wurde durch eine Kombination aus Bioinformatik und Biochemie adressiert. Durch Datenbanksuchen in komplett sequenzierten Genomen wurde festgestellt, dass die evolutionär ursprüngliche Form des SMN-Komplexes aus den zwei Proteinen SMN und Gemin2 besteht. Die biochemische Reinigung des Komplexes der Taufliege Drosophila melanogaster offenbarte, dass er auch in diesem Organismus aus denselben zwei Untereinheiten zusammengebaut ist. Außerdem wurde der Beweis erbracht, dass das SMN-Gemin2 heterodimer notwendig und hinreichend ist, um U snRNPs akkurat zusammenzulagern. Zukünftige Studien werden weitere detaillierte Ansichten des Reaktionsmechanismus in der zellulären Zusammenlagerung von U snRNPs liefern. Die Ergebnisse, die in der vorliegenden Arbeit erhalten wurden, deuten darauf hin, dass die Untereinheiten SMN und Gemin2 des SMN-Komplexes für den Zusammenbau von U snRNPs hinreichend sind. Was also ist die Funktion der weiteren Untereinheiten des SMN-Komplexes? Die Rekonstitutionsschemata, die in dieser Arbeit etabliert wurden, werden essentiell für die Beantwortung dieser Frage sein. Darüberhinaus werden weitere mechanistische Einsichten in die Zusammenlagerung von U snRNPs von der Ermittlung von Strukturen der Assembly-Maschinerie in verschiedenen Zuständen abhängen. Die Voraussetzung für diese strukturbiologische Untersuchungen, die Möglichkeit ausreichende Mengen homogener Komplexe herzustellen, ist ebenfalls in dieser Arbeit geschaffen worden.

Ras gehört zur Familie der kleinen GTPasen. Es handelt sich um ein protoonkogenes Protein mit einer Größe von 21 kDa, und gilt als Prototyp der Ras Superfamilie. Durch seinen charakteristischen \(\it {Switch}\)-Mechanismus dient es der Kontrolle zahlreicher Prozesse in der Zelle. Beim Schaltmechanismus wechselt das Ras von seinem inaktiven GDP-Zustand in den aktivierten GTP-Zustand. Die Aktivierung erfolgt mit Hilfe von \(\textit {GEFs (Guaninnucleotid Exchange Factor)}\) durch den Austausch von GDP nach GTP. Die Inaktivierung geschieht durch eine Hydrolyse und wird durch GAPs \(\textit {(GTPase Activating Proteins)}\) katalysiert. Ziel dieser Arbeit ist die Zuordnung spezifischer Aminosäure-Schwingungen der Bindetasche der kleinen GTPase Ras im FTIR-Spektrum. Die Bindetasche umfasst den \(\textit {Switch I}\), \(\textit {Switch II}\) und den \(\it {p-Loop}\). Des Weiteren soll über die Bandenzuordnung der Einfluss auf den Reaktionsverlauf des Ras bestimmt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde der intrinsische und der GAP-katalysierte Reaktionsmechanismus der GTPase von humanem H-Ras mittels zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie auf molekularer Ebene untersucht. Die verbrückenden Schwingungen zwischen \(\beta\)- und \(\gamma\)-Phosphat in GTP wurden zugeordnet. Im Vergleich zu freiem GTP verschiebt die Ras-Anbindung die Schwingungen der Verbrückung deutlich zu tieferen Wellenzahlen. Dies ist indikativ für eine Schwächung der nachfolgend gespaltenen Bindung. Es wird eine Korrelation eines Downshifts der nu\(_{as}\) \(\beta\)(PO\(_{2}\)\(^{-}\)) mit k\(_{cat}\) als katalytisch wichtiger Faktor der dissoziativ vorgeprägten, intrinsischen GTPase identifiziert. Der Einfluss einzelner H-Brücken zum \(\gamma\)-Phosphat wird erkannt, Lysin- und Threoninbanden erstmals mittels isotopenmarkierter Aminosäuren in Ras sicher zugeordnet. Nach Einführung der ATR-Technik wird der Bindungsbruch in Ras·GTP·NF1-333 zeitaufgelöst verfolgt. Ein Intermediat der GAP-katalysierten GTPase wird im Rahmen dieser Arbeit erklärt.

Das bakterielle Reaktionszentrum von R. sphaeroides stellt ein Modellsystem zum Studium der Photosynthese dar und führt bei Lichtanregung eine Ladungstrennung durch, die von einem Bakteriochlorophyll-Dimer zu zwei Ubichinon-Molekülen, Q A und Q B, reicht. Der zentrale finale Elektronentransferschritt Q A - - Q B \(\rightarrow\) Q A Q B - wurde mit zeitauflösender Stepscan-FTIR-Differenzspektroskopie und ortsspezifischer Mutagenese untersucht. Der Q A - - Q B \(\rightarrow\) Q A Q B - -Übergang verläuft als Drei-Schritt-Prozess mit \(\tau\) 1 = 12 \(\mu\)s, \(\tau\) 2 = 150 \(\mu\)s und \(\tau\) 3 = 1,1 ms. "Conformational gating" bestimmt die ersten beiden Schritte, in denen unterschiedliche Populationen von Q B von einem intermediären Elektronendonor X reduziert werden. Die Oxidation von Q A - - ist davon entkoppelt und läuft mit einer langsameren dritten Rate ab. Mit allen Raten finden Protonentransferreaktionen statt. Das Ergebnis, dass die Reduktion von Q B der Oxidation von Q A - - vorausgeht, führt zu einem völlig neuen Mechanismusvorschlag für den Q A - - Q B \(\rightarrow\) Q A Q B - -Übergang. The bacterial reaction centre of R. sphaeroides, a model system for studying photosynthesis, performs charge separation across the membrane from a bacteriochlorophyll dimer to two ubiquinone-10 molecules, Q A and Q B. The final electron transfer step Q A - - Q B \(\rightarrow\) Q A Q B - is investigated applying time-resolved stepscan-FTIR difference spectroscopy and site-directed mutagenesis. The Q A - - Q B \(\rightarrow\) Q A Q B - transition can be described as a three-step process with \(\tau\) 1 = 12 \(\mu\)s, \(\tau\) 2 = 150 \(\mu\)s and \(\tau\) 3 = 1,1 ms. Conformational gating controls the first two steps in which different populations of Q B are reduced by an intermediary donor X. The oxidation of Q A - - is kinetically discoupled and takes place on a slower time scale. All the steps are complexly coupled to proton transfer reactions. Especially the finding that Q B reduction proceeds Q A - - oxidation leads to a completely new mechanism.

Die Sialat-Pyruvat-Lyase (EC 4.1.3.3) katalysiert die Spaltung von Sialinsäuren in Pyruvat und das entsprechende Mannosamin. Die Sialat-Pyruvat-Lyase von Clostridium perfringens wurde in E. coli exprimiert, bis zur Homogenität gereinigt und charakterisiert. Das rekombinante Enzym besitzt ein pH-Optimum von 7,6 und ein Temperaturoptimum von 65-70 °C. In Gegenwart von Pyruvat ist es moderat thermostabil bis etwa 70 °C. Das Enzym besitzt in 50 mM Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,2 eine spezifische Aktivität von 22 U/mg und einen KM-Wert für Neu5Ac von 2,1 mM. Beide Werte erhöhen sich in 250 mM Kaliumphosphatpuffer auf dann 27 U/mg und 3,2 mM. Steigende Salzkonzentrationen hemmen dagegen die Enzymaktivität. Durch zielgerichtete Mutagenese konnte gezeigt werden, dass Lysin 161 während der Katalyse eine Schiff'sche Base mit dem Substrat ausbildet. Tyrosin 133 hat ebenfalls große Bedeutung für die Enzymkatalyse, die genaue Funktion von Tyrosin 133 ist allerdings unklar. Vermutlich stabilisiert dieser Tyrosinrest die Seitenkette von Lysin 161 und/oder das gebundene Substrat und ermöglicht dadurch eine optimale Katalyse. Aspartat 187 und Glutamat 188 sind an der Bindung des Substrates im aktiven Zentrum beteiligt. Sie bilden Wasserstoffbrückenbindungen zu den Hydroxylgruppen an C8 und C9 der Sialinsäure aus. Anhand der Ergebnisse aus den Mutagenesestudien wurde das Modell zum Reaktionsmechanismus der Sialat-Pyruvat-Lyasen modifiziert.