Search

The subtilase cytotoxin (SubAB) belongs to the family of AB5 toxins and is produced together with Shiga toxin (Stx) by certain Stx-producing E. coli strains (STEC). For most AB-type toxins, it is assumed that cytotoxic effects can only be induced by a complete holotoxin complex consisting of SubA and SubB. However, it has been shown for SubAB that the enzymatically active subunit SubA, without its transport and binding domain SubB, induces cell death in different eukaryotic cell lines. Interestingly, the molecular structure of SubA resembles that of the SubAB complex. SubA alone is capable of binding to cells and then being taken up autonomously. Once inside the host cell, SubA is transported, similar to the SubAB holotoxin, via a retrograde transport into the endoplasmatic reticulum (ER). In the ER, it exhibits its enzymatic activity by cleaving the chaperone BiP/GRP78 and thereby triggering cell death. Therefore, the existence of toxic single SubA subunits that have not found a B-pentamer for holotoxin assembly might improve the pathogenic potential of subtilase-producing strains. Moreover, from a pharmacological aspect, SubA might be an interesting molecule for the targeted transport of therapeutic molecules into the ER, in order to investigate and specifically modulate processes in the context of ER stress-associated diseases. Since recent studies on bacterial AB5 toxins contributed mainly to the understanding of the biology of AB-type holotoxins, this mini-review specifically focus on that recently observed single A-effect of the subtilase cytotoxin and addresses whether a fundamental shift of the traditional AB5 paradigm might be required., publishedVersion

Lipids are the building blocks for cellular membranes; they provide signalling molecules for membrane dynamics and serve as energy stores. One path of their synthesis is initiated by glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), which in Dictyostelium resides on the endoplasmic reticulum. When an excess of fatty acids is present, it redistributes to storage organelles, the lipid droplets. Mutants, where the GPAT was eliminated by homologous recombination, produce fewer lipid droplets and are almost devoid of triacylglycerols (TAG), rendering them more resistant to cell death and cell loss in the developmental stages preceding fruiting body formation. The enzyme most closely related to GPAT is called FARAT, because it combines a fatty acyl-reductase (FAR) and an acyltransferase (AT) domain in its sequence. The protein is confined to the lumen of the peroxisome, where it transfers a fatty acid to dihydroxyacetone-phosphate initiating the synthesis of ether lipids, later completed at the endoplasmic reticulum. A mutant lacking FARAT produces lipid droplets that are devoid of the storage lipid monoalkyl-diacyl-glycerol (MDG), but the efficiency of spore formation in the developmental cycle is largely unaltered. Instead, these mutants are strongly impaired in phagocytosis of yeast particles, which is attributed to reduced synthesis of membrane phospholipids containing ether-linked chains.

Durch einen Prozess, der als sekundäre Endosymbiose bezeichnet wird, wurde eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen. Dies führte zur Entstehung der komplexen Plastiden von Cryptophyten, Haptophyten, Heterokontophyten und Apicomplexa. Das Genom dieser ehemaligen Rotalge wurde im Laufe der Evolution dramatisch reduziert und zum größten Teil in den Wirtskern transferiert. Dies führte dazu, dass die meisten plastidären Proteine nun im Zellkern des Wirtes kodiert sind und aus dem Cytosol in die Plastide importiert werden müssen. Es mussten entsprechende Translokationsmechanismen entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht neue Komponenten der dritten Plastidenmembran zu identifizieren, welche auf die äußere Chloroplastenmembran primärer Plastiden zurückgeht. Diese Membran unterscheidet sich von anderen plastidären Membranen durch die Präsenz von β-barrel Proteinen, die für die äußeren Membranen von Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten charakteristisch sind. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen wurden putative plastidäre β-barrel Proteine vorhergesagt und als Fusionsproteine in P. tricornutum lokalisiert. Es wurden von 23 Proteinen, vier in der Plasmamembran, vier im Cytosol, fünf im ER, fünf außerhalb der Plastide und fünf in der Plastide lokalisiert. Es konnte kein Protein in der dritten Plastidenmembran identifiziert werden. Die Vorhersagealgorithmen sind nicht dafür geeignet eukaryote Proteome auf β-barrel Proteine hin zu analysieren. Des Weiteren lag ein anderes Problem in der Beschaffenheit der Genmodelle, welche die Basis der Vorhersage bildeten. In einem zweiten Projekt wurde die Subkompartimentierung des ERs in P. tricornutum untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass das ER in ein hostER, die Kernhülle (NE) und das cER eingeteilt werden kann, wurde untersucht, ob sich hER und cER in ihrer Funktion unterscheiden. Basierend auf der Annahme, dass hER und cER durch den Tag-Nacht-Zyklus der Photosynthese unterschiedlichen physiologischen Bedingungen ausgesetzt sind, wurde gefolgert, dass einige Funktionen wie zum Beispiel die Proteinqualitätskontrolle und -faltung auf das hER beschränkt sein könnten. Daher wurden Faktoren der UPR in P. tricornutum untersucht. Überraschenderweise konnten IRE1 und PERK in Heterokontophyten und Haptophyten identifiziert werden. Lokalisationsstudien der UPR-Faktoren zeigten, dass diese hauptsächlich auf das hER und den NE beschränkt sind, wohingegen hDer1-2 als Beispiel für Proteindegradation im gesamten ER und Transporterproteine wie Tpt1 hauptsächlich im cER vorhanden sind. Die Abwesenheit der UPR im cER lässt sich durch die Physiologie begründen. Außerdem wirft die Präsenz von PERK und IRE1 in Protisten ein neues Licht auf die Sichtweise der Evolution der UPR. So ist eine alternative Entstehungsgeschichte der UPR denkbar., In a process termed secondary endosymbiosis a red alga was established as an endosymbiont. This led to the evolution of the complex plastids found in cryptophytes, haptophytes, heterokontophytes and apicomplexans. The genome of this former red alga was drastically reduced and mostly transferred into the host nucleus. Thus, most plastidal proteins are now encoded in the host nucleus and have to be imported from the cytosol into the plastid. Appropriate transport mechanisms had to be evolved. The aim of this work was the identification of new components of the third plastid membrane. It evolved from the outer chloroplast envelope of primary plastids. This membrane is distinct from other plastidal membranes due to the fact that it presumably contains β-barrel proteins which are characteristic of outer membranes of gram-negative bacteria, mitochondria and chloroplasts. With different algorithms putative plastidal β-barrel proteins were predicted and localized as fusion proteins in P. tricornutum. Out of 23 proteins, four were localized to the plasma membrane. Four other proteins were localized to the cytosol. Five proteins were localized to the ER. Additionally five proteins were localized to various compartments outside the plastid and five proteins were localized to the plastid. There were no new proteins of the third plastidal membrane identified. The used prediction algorithms are not suited to analyze a eukaryotic genome for β-barrel proteins. Moreover, the quality of the predicted gene models of the database complicated the analysis. In the second part of this work the subcompartmentalization of the ER of P. tricornutum was analyzed. Based on the classification of the ER into a hostER, nuclear envelope and cER the functions of these two subcompartments were tested. Based on the assumption that hER and cER are exposed to different physiological conditions during night and day, functions as protein quality control and protein folding might be restricted to the hER. Therefore, factors of the UPR were studied. Surprisingly, IRE1 and PERK were identified in heterokontophytes and haptophytes. Localization studies of these UPR factors showed that these are indeed mainly found in the hER and only in minor concentrations in the nuclear envelope and cER. hDer1-2 which takes part in protein degradation shows an equal distribution over the complete ER, while transporter proteins like Tpt1 are mainly found in the cER and nuclear envelope. The absence of the UPR factors in the cER can be explained by different physiological conditions during night and day inside of these two subcompartments. Additionally, the presence of PERK and IRE1 in protists sheds a new light on the evolution of the UPR. An alternative evolutionary history is conceivable.

Durch einen Prozess, der als sekundäre Endosymbiose bezeichnet wird, wurde eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen. Dies führte zur Entstehung der komplexen Plastiden von Cryptophyten, Haptophyten, Heterokontophyten und Apicomplexa. Das Genom dieser ehemaligen Rotalge wurde im Laufe der Evolution dramatisch reduziert und zum größten Teil in den Wirtskern transferiert. Dies führte dazu, dass die meisten plastidären Proteine nun im Zellkern des Wirtes kodiert sind und aus dem Cytosol in die Plastide importiert werden müssen. Es mussten entsprechende Translokationsmechanismen entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht neue Komponenten der dritten Plastidenmembran zu identifizieren, welche auf die äußere Chloroplastenmembran primärer Plastiden zurückgeht. Diese Membran unterscheidet sich von anderen plastidären Membranen durch die Präsenz von β-barrel Proteinen, die für die äußeren Membranen von Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten charakteristisch sind. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen wurden putative plastidäre β-barrel Proteine vorhergesagt und als Fusionsproteine in P. tricornutum lokalisiert. Es wurden von 23 Proteinen, vier in der Plasmamembran, vier im Cytosol, fünf im ER, fünf außerhalb der Plastide und fünf in der Plastide lokalisiert. Es konnte kein Protein in der dritten Plastidenmembran identifiziert werden. Die Vorhersagealgorithmen sind nicht dafür geeignet eukaryote Proteome auf β-barrel Proteine hin zu analysieren. Des Weiteren lag ein anderes Problem in der Beschaffenheit der Genmodelle, welche die Basis der Vorhersage bildeten. In einem zweiten Projekt wurde die Subkompartimentierung des ERs in P. tricornutum untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass das ER in ein hostER, die Kernhülle (NE) und das cER eingeteilt werden kann, wurde untersucht, ob sich hER und cER in ihrer Funktion unterscheiden. Basierend auf der Annahme, dass hER und cER durch den Tag-Nacht-Zyklus der Photosynthese unterschiedlichen physiologischen Bedingungen ausgesetzt sind, wurde gefolgert, dass einige Funktionen wie zum Beispiel die Proteinqualitätskontrolle und -faltung auf das hER beschränkt sein könnten. Daher wurden Faktoren der UPR in P. tricornutum untersucht. Überraschenderweise konnten IRE1 und PERK in Heterokontophyten und Haptophyten identifiziert werden. Lokalisationsstudien der UPR-Faktoren zeigten, dass diese hauptsächlich auf das hER und den NE beschränkt sind, wohingegen hDer1-2 als Beispiel für Proteindegradation im gesamten ER und Transporterproteine wie Tpt1 hauptsächlich im cER vorhanden sind. Die Abwesenheit der UPR im cER lässt sich durch die Physiologie begründen. Außerdem wirft die Präsenz von PERK und IRE1 in Protisten ein neues Licht auf die Sichtweise der Evolution der UPR. So ist eine alternative Entstehungsgeschichte der UPR denkbar.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Aspekte zur Faltung und Assemblierung oligomerer Proteine bearbeitet. Zum einen wurden die Expression und die Sekretion des mono-klonalen Antikörpers MAK33 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae analysiert. Die in das Kulturmedium abge-gebe-nen Antikörperketten (wenige µg/l) waren z.T. fragmentiert und formten keine aktiven Antikörper. Innerhalb der Zelle wurden die Ketten im ER und im Cytosol - in löslicher und unlöslicher Form -, sowie in den Vakuolen nachgewiesen. Auch die Koexpression von murinem BiP und Hefe-Hac1 führte zu keiner Erhöhung der Sekretionsrate der Antikörperketten. Insgesamt lassen diese Beobachtungen auf eine Überlastung des Hefesystems bzw. auf eine fehlerhafte Faltung der Antikörperketten innerhalb der Hefezelle schließen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit Untersuchungen zur Stabilität und Struktur der Prolyl-4-Hydroxylase unter nativen und re-duzieren-den Bedingungen. Desweiteren wurde die Rekonstitution des Prolyl-4-Hydroxylase-Tetramers aus den isolierten Unter-einheiten analysiert. Two aspects of folding and assembly of oligomeric proteins were investigated in this thesis. First, expression and secretion of the monoclonal antibody MAK33 in the yeast Saccharo-myces cerevisiae were analyzed. Small amounts of antibody chains (in the range of µg/l) were secreted into the culture medium. These chains were partially fragmented and did not assemble to active antibodies. Inside the cell, antibody chains were detected in the ER and in the cytosol - in soluble and insoluble form - and in vaculoes. Coexpression of murine BiP and yeast Hac1 did not result in an increase of secretion. These results suggest overloading of the cell system as well as incomplete and erroneous folding of the antibody chains in the cell. In the second part of the thesis, stability and structure of prolyl-4-hydroxylase were analyzed under native and reducing conditions. Additionally, reconstitution experiments of the tetramer of prolyl-4-hydroxylase from the isolated subunits were performed.

Neben ihrer Bedeutung in der Medizin sind Antikörper ideale Modellproteine für grundlegende Studien zur Strukturbildung und Faltung von sekretorischen Proteinen. In dieser Arbeit wurden E. coli knockout-Mutanten bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, aktive Fab Fragmente eines monoklonalen Antikörpers im Cytoplasma zu produzieren. Des weiteren wurden die Faltung dieses Fab Fragments in vitro und der Einfluß von Faltungshelfern auf den Faltungsprozeß detaillierter untersucht. Dabei wurde insbesonders die Kooperation zwischen dem ER residenten Hsp70 Homologen BiP und der Proteindisulfidisomerase PDI analysiert. Die Ergebnisse dieser Faltungsstudien sowie die Aufklärung des ATPase Zyklus von BiP erlauben Einblicke in die Faltung von sekretorischen Proteinen im ER und die Funktionsweise und Regulation molekularer Chaperone. Beside their importance in medicine, antibodies are ideal model proteins for basic studies in structure formation and folding of secretory proteins. In this thesis, E. coli knock out strains were compared concerning their ability to produce active Fab fragments of a monoclonal antibody in the cytoplasm. Further, the in vitro folding of this Fab fragment and the influence of folding helpers on the folding process were investigated in detail. In this context, the cooperation between the ER resident Hsp70 homologue BiP and the protein disulfide isomerase (PDI) was analyzed. The results of this folding studies as well as the dissection of the ATPase cycle of BiP allow us deeper insights in the folding of secretory proteins in the ER and the function and regulation of molecular chaperones.

Im ersten Teilprojekt der vorliegenden Dissertation wurde das Calpastatin, der endogene Inhibitor der Calpaine, mittels NMR-Spektroskopie strukturell charakterisiert. Das Calpastatin umfasst eine aminoterminale Domäne mit unbekannter Funktion und vier inhibitorisch aktive Domänen. Sowohl das rekombinante Volllängenprotein als auch isolierte inhibitorische Domänen zeigten volle Aktivität. Die rekombianten Proteine wiesen ungewöhnliche physikochemische Eigenschaften auf. Eine strukturelle Charakterisierung der ersten inhibitorischen Domäne mittels NMR-Spektroskopie ergab, dass das Protein in Lösung unter physiologischen Bedingungen unstrukturiert vorliegt. Aufgrund der experimentellen Daten und einer Analyse der Primärstruktur konnte das Calpastatin in die Familie der unter physiologischen Bedingungen ungefalteten Proteine eingeordnet werden. Im zweiten Teilprojekt wurde ein ATP-abhängiger Peptidtransport in der Hefe S. cerevisiae untersucht. Die Transportaktivität konnte durch subzelluläre Fraktionierungen im Endoplasmatischen Retikulum der Hefe lokalisiert werden. Die Volumenabhängigkeit des Transports an mikrosomalen Vesikeln und der Einsatz semi-intakter Hefezellen sprechen dafür, dass es sich bei der beobachteten Aktivität um einen Import von Peptiden handelt. Weitere Experimente zeigten, dass die Transportrate von der Reaktionstemperatur und der Peptidkonzentration abhängig ist. Eine Beteiligung der Hefeproteine Mdl1p und Mdl2p am Transport konnte anhand von Deletionsmutanten ausgeschlossen werden. Ferner konnten beide Proteine anhand von subzellulären Fraktionierungen in mitochondrialen Membranen nachgewiesen werden. The structural characterisation of calpastatin, the endogenous inhibitor of calpaine, by NMR spectroscopy was the first subproject of this thesis. Calpastatin comprises an aminoterminal domain of unknown function and four inhibitory active domains. Both the full length protein and the isolated inhibitory domains showed full activity. The recombinant proteins possessed exceptional physico-chemical properties. NMR studdies of the first inhibitory domain of calpastatin revealed an unstructured conformation in solution. Based on the experimental data and the analysis of the primary structure calpastatin was shown to be a member of the family of natively unfolded proteins. An ATP-dependent peptide translocation in the yeast S. cerevisiae was subject of the second subproject. The transport activity was localized to the endoplasmic reticulum of yeast by subcellular fractionation. The transport was shown to be dependent on the volume of microsomal vesicles and was also detected in semi-intact yeast cells. Both results argue for an peptide import into the lumen of the endoplasmic reticulum. Further experiments regarding the transport rate showed a dependency on the reaction temperature and peptide concentration. Mutant yeast strains indicated the yeast proteins Mdl1p and Mdl2p to be not involved in the transport process. Both proteins were localized to mitochondrial membranes by subcellular fractionation.

Die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) ist Teil des Qualitätskontrollsystems am ER, um der Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER entgegenzuwirken. Hierbei werden ERAD-Substrate mit Hilfe von E3-Ligasen wie z.B. HRD1 ubiquityliert und anschließend durch den p97-Ufd1-Npl4 Komplex aus der ER-Membran extrahiert. Im Zytosol werden diese extrahierten Proteine vom 26S Proteasom abgebaut. Für die Retrotranslokation von ERAD- Substraten werden zudem die Membranproteine Derlin-1 und VIMP benötigt, welche mit p97 assoziieren und einen Proteinkomplex bilden. HERP ist ein ER-lokalisiertes Protein, dessen Synthese durch den UPR (unfolded protein response) als Antwort auf die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER induziert wird. Dies deutet auf eine Rolle von HERP im ERAD hin. Interessanterweise besitzt HERP eine sogenannte UBL-Domäne. Für andere Proteine mit UBL-Domäne konnte eine Interaktion dieser Domäne mit dem Proteasom nachgewiesen werden. Daher kann angenommen werden, dass HERP ebenfalls mit dem Proteasom interagiert und dies zur ER- Membran rekrutiert, wo es für den Abbau von ERAD-Substraten benötigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von HERP innerhalb des UPR zu ermitteln. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass HERP essentiell für den Abbau des ERAD-Modell- Substrates CD3-delta ist. Somit hat HERP tatsächlich eine Rolle im ERAD. Außerdem wird eine direkte Interaktion von HERP mit der E3-Ligase HRD1 nachgewiesen. Es wird zudem gezeigt, dass HERP und HRD1 einen Proteinkomplex mit p97, Derlin-1 und eventuell auch mit VIMP bilden. Dieser ERAD Komplex ist folglich sowohl für die Ubiquitylierung als auch die Retrotranslokation von ERAD-Substraten verantwortlich und garantiert somit die effiziente Prozessierung von Proteinen aus dem ER. Zudem wird gezeigt, dass die UBL-Domäne von HERP im Gegensatz zu anderen UBL- Domänen nicht mit dem Proteasom interagiert. Somit kann nicht mehr davon ausgegangen werden, dass Proteasombindung eine Gemeinsamkeit aller Proteine mit UBL-Domäne ist. Dagegen wird eine Interaktion der UBL-Domäne von HERP mit dem deubiquitylierenden Enzym USP7 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass auch Deubiquitylierung eine wichtige Rolle im ERAD-Prozess spielt. ER-associated protein degradation (ERAD) is part of the ER quality control system dealing with the accumulation of misfolded proteins in the ER. This process requires polyubiquitylation of ERAD substrates involving E3 ligases, such as HRD1, and their subsequent extraction from the ER membrane by the p97-Ufd1-Npl4 complex. Retrotranslocation of substrates into the cytosol for degradation by the 26S proteasome also involves the membrane proteins Derlin-1 and VIMP, which are associated with p97 to form a protein complex. The ER-resident protein HERP was shown to be upregulated by the unfolded protein response pathway (UPR) upon the accumulation of misfolded proteins in the ER. It was therefore considered to function in ERAD. Interestingly, HERP contains a UBL domain. In other proteins this domain facilitates an interaction with the proteasome, suggesting that HERP might recruit the proteasome to the ER membrane for efficient ERAD. The aim of this study was to investigate the function of HERP within the UPR. The findings presented here demonstrate that HERP is essential for the degradation of a model ERAD substrate. Thus, HERP indeed has a role in ERAD. Moreover, the data show that HERP directly interacts with the E3 ligase HRD1 and the two proteins form a common protein complex with p97, Derlin-1 and possibly also with VIMP. This suggests that both ubiquitylation and retrotranslocation of ER proteins are performed by one protein complex, enabling an efficient processing of ERAD substrates. This study also demonstrates that the UBL domain of HERP does not share the proteasome binding property of other UBL domains, suggesting that proteasome binding cannot be considered a general feature of all UBL domains. Instead, the HERP UBL domain is able to interact with the deubiquitylating enzyme USP7. Therefore, deubiquitylation might also be an important aspect in the proteasome-dependent degradation of misfolded ER proteins.

Der Transport in das endoplasmatische Retikulum (ER) ist der erste Schritt in der Biogenese sekretorischer Proteine. Im Säuger erfolgt der Transport hauptsächlich cotranslational, was eine enge Kooperation zwischen Ribosom, Translokon an der ER-Membran und luminalen Proteinen erfordert. Die Hauptkomponente des Translokons ist der Sec61-Komplex, der die Translokationspore bildet. Weitere Komponenten, Sec62p und Sec63p, wurden identifiziert. Diese Proteine (a) kommen in äquimolaren Konzentrationen mit Sec61a (Untereinheit des Sec61-Komplexes) vor (b) interagieren miteinander und mit dem Sec61-Komplex und (c) seine Ho-mologe in der Hefe sind für den posttranslationalen Transport und Sec63p auch für den cotranslationalen Transport essentiell. Dies deutet darauf hin, dass Sec62p und Sec63p des Säugers am cotranslationalen Transport beteiligt sind. Eine Sequenzanalyse von Sec62p zeigt die Anwesenheit eines im Hefeprotein nicht konservierten basischen Peptidmotives, das charakteristisch für ribosominteragierende Proteine ist. In der vorliegenden Arbeit wurden Fragmente des Säuger-Sec62p in E. coli synthetisiert und es wurde durch klassische Ribosomenbindungs- und Fraktionierungstudien gezeigt, dass Sec62p durch seine N-terminale cytosolische Domäne direkt mit Ribosomen interagiert. Hierbei handelt es sich um eine bei physiologischer Salzkonzentration stabile elektrostatische Interaktion, wofür das basische Motiv wichtig ist. Mittels Kompetitionsanalysen für die Bindung an Ribosomen wurde gezeigt, dass die Bindungsstelle von Sec62p mit dem Bereich des Ribosoms, das für die Interaktion mit dem Translokon verantworlich ist, überlappt, und dass diese Bindungsstelle auch von dem Hsp40-Chaperon Mtj1p/ERj1p verwendet wird. Die funktionelle Bedeutung der Sec62p-Ribosom-Interaktion wurde in einem zellfreien in vitro-Translationssystem untersucht. Sec62p wirkt inhibitorisch auf die Proteinsynthese von sekretorischen und nicht-sekretorischen Proteinen. Hierbei handelt es sich um eine Hemmung der Initiation der Translation. Die Interaktion von Sec62p am ribosomalen Tunnelausgang bewirkt Veränderungen in der Translationsfaktorenbindungstelle des Ribosoms, was auf einen allosterischen Wirkungsmechanismus für die Induktion der Translationshemmung hindeutet. Der Einfluss von Sec62p auf die Proteinsynthese bei Translokationsvorgängen wird diskutiert und anhand der Analogien mit Mtj1p wird eine Regulation von Sec62p über seine Interaktion mit Sec63p vorgeschlagen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten unterstützen ein Modell, bei dem Sec62p durch die Interaktion mit Ribosomen und wahrscheinlich auch durch Interaktion mit Sec63p einen Informationsaustausch zwischen dem Cytosol und dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums vermittelt. Das luminale Hsp70-Chaperon BiP ist an mehreren Stadien des cotranslationalen Proteintransports beteiligt. Für späte Schritte der Translokation wurde beobachtet, dass BiP durch seine Interaktion mit dem zu transportierenden Substrat die Translokationseffizienz erhöht. Es wurde vorgeschlagen, dass in Analogie zum Hefe-System BiP die naszierende Kette während ihrer Translokati-on bindet und dadurch die Unidirektionalität des Transports zum Lumen gewährleistet. Bei der cotranslationalen Translokation in Vesikeln, die keine luminalen Proteine enthalten, können bereits luminal modifizierte Translokationssubstrate zurück ins Cytosol gelangen. Daher besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion von BiP mit dem Substrat tatsächlich erst nach dem vollständigen Transport des Substrats erfolgt, um dieses im ER-Lumen zu halten. In der vorliegenden Arbeit wurde der cotranslationale Transport in einem in vitro-System mit Proteoliposomen rekonstituiert, wobei das Protein Avidin als artifizielles luminales Protein anstelle von BiP und biotinylierte Substrate eingesetzt wurden. Die gewonnenen Daten zeigen, dass die Bindung des Substrats, die zur Erhöhung der Transporteffizienz führt, sowohl während als auch nach seiner Translokation erfolgt. Dies bestätigt die bisher vermutete Funktion von BiP, die Unidirektionalität des cotranslationalen Transports zu sichern, und zeigt darüber hinaus eine erweiterte Funktion von BiP bei der Retention von bereits translozierten Substraten im Lumen des ER. Diese Erkenntnise bringen neue Aspekte im Zusammenhang mit der Termination der Translokation, die in einem Modell dargestellt werden. The transport into the endoplasmic reticulum (ER) is the first step in the biogenesis of secretory proteins. In mammalian cells this transport occurs mainly cotranslationally and requires a tight cooperation between the ribosome, the translocon at the ER-membrane, and luminal proteins. The Sec61-complex that builds the translocation pore is the main component of the translocon. Further components, namely Sec62p and Sec63p, have been identified. These proteins a) are present in equimolar concentrations with the Sec61a subunit of the Sec61-complex, b) interact with each other and with the Sec61-complex and c) in yeast are essential for the posttranslational transport (Sec63p for the cotranslational transport as well). This suggests that mammalian Sec62p and Sec63p are involved in cotranslational protein transport. The sequence analysis of Sec62p reveals the presence of a basic peptide motif which is not conserved in the yeast homolog and that is characteristic of ribosome interacting proteins. In the present work, fragments of the mammalian Sec62p were synthesized in E. coli and analyzed in classical ribosome binding assays. It was shown that Sec62p interacts directly with ribosomes through its N-terminal domain. This interaction is an electrostatic and at physiological salt concentrations stable one, for which the basic motif in Sec62p is important. Through competition analysis for the binding to ribosomes it was shown, that the binding site of Sec62p at the ribosome is overlapping with the binding site of the translocon and of the Hsp40-chaperone Mtj1p/ERj1p. The functional significance of the Sec62p-ribosome interaction was analyzed in a cell-free in vitro-translation system. Sec62p inhibits the protein synthesis of secretory and non-secretory proteins. To do this, Sec62p acts at the level of translation initiation. The interaction of Sec62p with the ribosomal tunnel causes changes in the ribosomal binding site for the translation factors. This points to an allosteric mechanism by which Sec62p induces the inhibition of translation. The influence of Sec62p on protein synthesis is discussed and in analogy to Mtj1p a regulation of Sec62p through its interaction with Sec63p is proposed. The data that have been obtained in this work support a model in which Sec62p mediates an information exchange between the cytosol and the lumen of the endoplasmic reticulum through its interaction with ribosomes and probably Sec63p. The luminal Hsp70-chaperone BiP participates in several stages of cotranslational protein transport. For late steps of translocation it was shown, that BiP increases the translocation efficiency through its interaction with the transport-substrate. It was suggested that, in analogy to the yeast system, BiP binds to the nascent chain during its translocation and determines the unidirectionality of the transport into the lumen. However, studying the cotranslational translocation into vesicles lacking luminal proteins, it was shown, that luminally modified transport-substrates can get back into the cytosol. Thus, there is the possibility that BiP actually interacts with the substrate not during but after its transport to retain it in the ER-lumen. In the present work the cotranslational transport was reconstituted in an in vitro-system with proteoliposomes where biotinylated substrates and the protein avidin, as an artificial luminal protein instead of BiP, were used. The results of this analysis show that the binding of the transport-substrates leads to an increase in transport-efficiency and occurs both during and after translocation of the substrates. This confirms the so far assumed function of BiP in ensuring the unidirectionality of the transport and, additionally, gives evidence of a more extensive function of BiP in the retention of already translocated substrates in the lumen of the endoplasmic reticulum.

In der vorliegenden Arbeit wurde MIDA1 als cytosolisches Homolog des ER-Hsp40 ERj1p charakterisiert. Eine Hsp70/Hsp40-typische Interaktion von MIDA1 mit Hsc70 konnte nachgewiesen werden, bei der die ATPase-Aktivität von Hsc70 stimuliert wurde. Weiter konnte gezeigt werden, dass MIDA1 an Ribosomen binden kann, was zu einer Reduktion der Translationseffizienz führte. In Analogie zu ERj1p befindet sich die Bindungsstelle von MIDA1 am Ribosom möglicherweise in unmittelbarer Nachbarschaft zum Ribosomenausgangskanal. Daher ist es denkbar, dass Hsc70 durch MIDA1 zum Ribosom rekrutiert wird, um dort mit der naszierenden Kette, sobald diese den Ribosomen-ausgangskanal verlässt, zu interagieren. Darüber hinaus wurde das Hsp40/Hsp70-Chaperonnetzwerk des ER des Pankreas weiter charakterisiert: Grp170, ein Hsp70-verwandtes Protein im ER, konnte aus Hundepankreas-Mikrosomen isoliert werden. Mit Gelfiltrationen konnte die Bildung eines Komplexes aus Grp170 und BiP nachgewiesen werden, der bei Anwesenheit von ATP dissoziiert. Weiter konnte gezeigt werden, dass der Nukleotidaustausch von BiP durch Grp170 stimuliert wird. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von BiP und einem J-Protein wurde auch eine Stimulation der Grp170-ATPase beobachtet, ohne dass es dabei offenbar zu einer Bindung des J-Proteins an Grp170 kommt. Das bereits als Nukleotidaustauschfaktor bekannte Protein BAP wurde rekombinant in E. coli synthetisiert und seine Nukleotidaustausch-Aktivität bestätigt. Anschließend konnte die durch BAP bewirkte zusätzliche Stimulation des durch ERj1p oder ERj2p aktivierten ATPase-Zyklus von BiP bestimmt und mit dem Effekt von Grp170 verglichen werden. Das Hsp40-Homolog ERj4p konnte ebenfalls in E. coli synthetisiert und seine Funktionalität durch die Interaktion mit BiP einschließlich einer Stimulation von dessen ATPase-Aktivität gezeigt werden. Die Affinität von ERj4p sowie der J-Domäne von ERj5p zu BiP wurden im Biacore-System bestimmt. Somit konnte das Hsp40/Hsp70-Chaperonnetzwerk des ER eines definierten Zelltyps erstmals vollständig quantitativ charakterisiert werden. The cytosolic Hsp40-homologue MIDA1 and the Hsp70/Hsp40-chaperone network of the endoplasmic reticulum in pancreatic cells has been characterized. A typical Hsp70/Hsp40-interaction of MIDA1 with Hsc70 was demonstrated, at which the ATPaseactivity of Hsc70 was stimulated. Further more, an association of MIDA1 to ribosomes has been shown, leading to a reduction in transcriptional efficiency. The binding site at the ribosome is possibly located in close proximity to the ribosomal exit site. Therefore one can speculate, that the function of MIDA1 is to recrute Hsc70 to the ribosome where it can bind to the nascent chain leaving the exit tunnel. Grp170 is a Hsp70-related protein in the lumen of the ER. It has been demonstrated, that Grp170 forms a complex together with the other lumenal Hsp70 BiP in the absence but not in the presence of ATP. Grp170 accelerates the nucleotide exchange of BiP and in countermove a J-activated BiP stimulates the ATPase activity of Grp170. Besides Grp170, there is another lumenal protein, namely BAP, that shows a nucleotide exchange activity. The additional stimulation by BAP of the ERj1 and ERj2 stimulated BiP ATPase turnover has been determined. Further, the affinity of ERj4 and the J-domain of ERj5 for the binding to BiP has been detemined by surface plasmon resonance spectroscopy and compared with affinities of other J-proteins.

Toxoplasma gondii is an obligatorily intracellular living, parasitical protozoon of great medical importance particularly in two cases: On the one hand with first infection during a pregnancy, which can harm the Foetus. On the other hand as opportunistic pathogen in immunocompromised patients (e.g. AIDS). Here a reactivation of continuous stages could lead to death. A starting point for the fight against the parasites represents a special metabolic pathway, the glycosylphosphatidylinositol (GPI) biosynthesis. GPIs consist of a conserved hydrophilic glycan structure, which can be modified by side chains, and a hydrophobic inositol-phospholipid. Like numerous other parasitic protozoa the T. gondii major surface proteins are anchored by GPIs in the cell surface - a blocking of the GPI biosynthesis leads to killing the parasites. In order to fight only the parasites with therapeutic efforts and not to affect the GPI biosynthesis that is likewise taking place in the host cells however, detailed knowledge of this metabolic pathway is necessary. A system of permeabilized Tachyzoites of T. gondii was developed and the distribution of GPI anchor precursors and further GPI biosynthetic intermediates over the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) was examined for the first time. The cell membrane is effectively permeabilized by hypotonic treatment, which remains ER with this treatment intact. This system was used, in order to label GPIs with different radioactive precursor molecules (sugar nucleotides). The GPI intermediates formed by permeabilized Toxoplasma were characterized on the basis of specific enzymatic treatments and chemical hydrolyses and compared with already well-known data. It was stated that the hydrophilic components of the GPI intermediates match with the described structures. In addition it could be proven in this work that before starting the mannosylation steps an acylation from GlcN-PI to GlcN-(acyl)-PI at the inositol takes place. Following radioactive labelling of the glycolipids the enzyme PI-PLC, which cleaves between hydrophilic and hydrophobic portion of the GPIs, was used to examine orientation of the GPI biosynthesis intermediates in the ER membrane. It could be shown that both early, and higher glycosylated intermediates and even GPI anchor precursors to the predominant part exhibit a cytoplasmic orientation in the ER membrane. In connection with transient acylation of the inositol ring a repeated change of the different intermediates over the ER membrane ("flip-flop") seems possible. For the first time it could be shown here that such large GPI anchor precursors with an additional hydrophilic side chain, consisting of N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, cross a lipid bilayer membrane., Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren.

Sekretorische Proteine und Proteine der Kompartimente des sekretorischen Transportweges müssen die Membran des Endoplasmatischen Retikulums überqueren, um an ihren Wirkungsort zu gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurden frühe Schritte des kotranslationalen Transports von Proteinen durch die ER-Membran untersucht. Signalsequenzen leiten diese Proteine als ribosomengebundene Intermediate an die ER-Membran. Die Ribosomen binden dort an den Sec61p-Komplex, der als Ribosomenrezeptor wirkt und gleichzeitig den proteinleitenden Kanal in der Membran bildet. Die Assoziation von Ribosomen mit dem Sec61p-Komplex verläuft in zwei Phasen. Die initiale Bindung ist sensitiv gegenüber hohen Salzkonzentrationen. Die Ribosomenbindung wird salzresistent, wenn die naszierende Kette in den Kanal inseriert und der Sec61p-Komplex die Signalsequenz erkennt. Sowohl Ribosomen ohne naszierende Kette als auch Ribosomen, die Proteine ohne Signalsequenzen synthetisieren, sind nur zur initialen salz-sensitiven Bindung an den Sec61p-Komplex fähig. Signalsequenzen interagieren im Cytosol mit SRP (engl.: Signal Recognition Particle). In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Signalsequenzen außerdem von Calmodulin gebunden werden. SRP und Calmodulin scheinen für die Interaktion mit Signalsequenzen einen ähnlichen Mechanismus zu benutzen, der wiederum mit der Signalsequenzerkennung durch den Sec61p-Komplex verwandt ist. Alle Ribosomen, unabhängig davon ob und welches Protein sie translatieren, können mit dem Sec61p-Komplex interagieren und daher um Bindungsplätze an der ER-Membran kompetitieren. Wenn SRP an die Signalsequenz einer naszierenden Kette gebunden ist, erhalten diese Ribosomen jedoch einen Vorteil in der Kompetition. Nur sie können Ribosomen ohne naszierende Kette oder Ribosomen, die ein cytosolisches Protein translatieren, vom Sec61p-Komplex verdrängen und sich selbst dann einen Translokationsort sichern, wenn alle Bindingsplätze an der Membran besetzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden dreidimensionale Strukturen von Komplexen aus Ribosom und proteinleitendem Translokationskanal vorgestellt, die der ersten und zweiten Phase der Ribosomenbindung entsprechen. Überraschenderweise unterscheiden sich diese beiden Stadien strukturell nicht. In beiden Fällen existieren definierte Verbindungen zwischen Ribosom und Kanal, die eine Lücke von etwa 20 Angström zwischen dem Ribosom und der Membranoberfläche überbrücken. Die Lücke stellt eine Verbindung zum Cytosol her, die eventuell dazu dient, naszierende Ketten ins Cytosol zu entlassen, wenn diese nicht ins Lumen des ER transportiert werden sollen. Weiterhin zeigen wir, daß der Kanal in nativen Membranen größer ist als der Kanal, der nur aus gereinigtem Sec61p-Komplex besteht. Dieser größere Kanal besitzt eine zusätzliche lumenale Domäne, die von der Oligosaccharyltransferase oder vom TRAP-Komplex gebildet wird. The first step in the secretory pathway is the translocation of proteins across the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis project, early stages of cotranslational protein translocation in mammalian cells were studied. Proteins following the secretory pathway are targeted to the ER as ribosome-nascent chain complexes by their N-terminal hydrophobic signal sequences. The nascent chain is translocated across the ER membrane through a hydrophilic channel formed by the Sec61p complex, which also functions as the ribosome receptor. The initial binding of ribosomes to the ER membrane is salt-sensitive. After insertion of the nascent chain into the translocation channel and signal sequence recognition by the Sec61p complex, the ribosome is bound in a salt-resistant manner. The membrane binding of ribosomes lacking nascent chains and of ribosomes carrying nascent chains without signal sequences is always salt-sensitive. It is known that in the cytosol, the signal sequence binds to the signal recognition particle (SRP). Here we show that another cytosolic factor, the small regulatory protein calmodulin, can interact with signal sequences. Our data suggest that both SRP and calmodulin use a similar mechanism for substrate binding and recognition. In fact, this mechanism may be related to signal sequence recognition by the Sec61p complex. Previously the question has been raised of how efficient targeting of ribosome-nascent chain complexes (RNCs) carrying a signal sequence is possible when all ribosomes, regardless of the presence or nature of a nascent chain, can bind to the Sec61p complex. We demonstrate that all ribosomes compete for common binding sites at the ER membrane and that SRP functions as a positive effector to give RNCs carrying a signal sequence an advantage over other ribosomes. RNCs with a signal sequence and bound SRP can displace ribosomes without a nascent chain and ribosomes synthesizing cytosolic proteins from the membrane and can therefore secure a translocation site even when all ribosome binding sites at the ER membrane are occupied. A structural analysis by single particle cryo electron microscopy revealed that ribosome-translocation channel complexes do not differ in the salt-sensitive or the salt-resistant stage of ribosome binding to the ER membrane. Furthermore our data show that the ribosome is linked to the translocation channel by a discrete number of connections. Even in the presence of a translocating nascent chain the ribosome-membrane junction is not completely sealed towards the cytosol. Instead, a sizable gap exists between the ribosome and the surface of the membrane that may allow nascent polypeptide chains to enter the cytosol when their translocation across the ER membrane is prevented. We also show that translocation channels derived from native microsomes are larger than channels derived from purified Sec61p complex. These larger channels contain a wider central pore and an additional lumenal domain, which is formed by the oligosaccharyl transferase or by the TRAP complex.

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können Proteine entweder co- oder posttranslational durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden. Sie besitzen eine Signalsequenz, die sie zu einem hydrophilen Kanal in der Membran bringt, durch den der Transport erfolgt. Die zentrale Komponente des Translokationsapparates in der Membran ist der aus den Untereinheiten Sec61p, Sbh1p und Sss1p bestehende Sec61p-Komplex. Beim Proteintransport wirkt der Sec61p-Komplex zusammen mit anderen Faktoren: Im cotranslationalen Transport geht er eine feste Bindung mit Ribosomen ein; der posttranslationale Transport erfordert die Assoziation mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex unter Bildung des sogenannten Sec-Komplexes. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur des Sec61p-Komplexes durch Elektronenmikroskopie analysiert. Er liegt in Detergenzlösung in ringförmigen Strukturen mit einem Durchmesser von ~82Å und einer zentralen Pore von ~21Å vor. Jeder Ring besteht aus drei oder vier heterotrimeren Sec61p-Komplexen. Die oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes entsprechen vermutlich proteinleitenden Kanälen der Membran des Endoplasmatischen Retikulum. In Membranen wird ihre Bildung durch die Bindung von Ribosomen oder die Interaktion mit dem Sec62/63p-Komplex induziert. Eine dreidimensionale Struktur, die durch Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten wurde, zeigt, daß das Ribosom so an den Sec61p-Komplex bindet, daß der Tunnel im Ribosom, durch den die naszierende Polypeptidkette das Ribosom verläßt, genau in die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers mündet. Es existiert also ein kontinuierlicher Kanal, der sich vom Peptidyltransferase-Zentrum im Ribosom durch die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers erstreckt, durch den naszierende Polypeptidketten cotranslational direkt in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden könnten. In dieser Arbeit wurde ein dem Sec61p-Komplex verwandter heterotrimerer Komplex in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum identifiziert, der aus den Untereinheiten Ssh1p, Sbh2p und Sss1p besteht. Sss1p ist beiden trimeren Komplexen gemein; Ssh1p und Sbh2p sind homolog zu Sec61p bzw. Sbh1p. Durch Deletion von Ssh1p und Sbh2p wurde gezeigt, daß der Ssh1p-Komplex wie der Sec61p-Komplex am Transport von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum beteiligt ist. Der Ssh1p-Komplex ist mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert und bildet in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen, aber interagiert nicht mit dem Sec62/63p-Komplex. Wir postulieren daher, daß der Ssh1p-Komplex ausschließlich den cotranslationalen Transport von Proteinen vermittelt. Beim posttranslationalen Transport interagiert das vollständig synthetisierte Modellsubstrat Prepro-Alphafaktor mit vielen cytosolischen Proteinen. Die cytosolischen Chaperone Hsp70 und TRiC konnten als Interaktionspartner identifiziert werden. Bei der Bindung des Prepro-Alphafaktors an die Membran werden die cytosolischen Proteine freigesetzt. Wir verwendeten einen Photoquervernetzungsansatz, um zu untersuchen, wie die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im Bindungsschritt durch den Sec-Komplex erkannt wird. Die Signalsequenz-bindungsstelle wird hauptsächlich von Sec61p gebildet und befindet sich an der Grenzfläche zur Lipiddoppelschicht. Die gebundene Signalsequenz ist in einer helikalen Struktur fixiert und wird auf gegenüberliegenden Seiten von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p umgeben. Sec62p und Sec71p, zwei Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes, flankieren gemeinsam eine Seite der Signalsequenzhelix, befinden sich aber in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p. Es wird ein Modell vorgeschlagen, das beschreibt, wie die Bindung der Signalsequenz den Translokationskanal für den Transport öffnen könnte. Protein transport across the membrane of the endoplasmic reticulum occurs either co- or posttranslationally in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In both cases, polypeptides are directed to a translocation apparatus in the membrane by virtue of their signal sequences and then transported across the lipid bilayer through a protein-conducting channel. The major component of the protein translocation apparatus in the membrane is the heterotrimeric Sec61p complex consisting of the subunits Sec61p, Sbh1p and Sss1p. During translocation the Sec61p complex associates with other factors: In the cotranslational mode it interacts with ribosomes, whereas in the posttranslational mode it associates with the tetrameric Sec63/62p complex to form the so-called Sec complex. Here, we have analyzed the structure of the Sec61p complex by electron microscopy. In detergent this complex forms ring-like structures with a diameter of about 82Å and a central pore of about 21Å. Each ring contains 3 or 4 heterotrimeric Sec61p complexes. In membranes the formation of ring structures of the Sec61p complex is induced by its association with ribosomes or the Sec62/63p complex. We propose that the ring-like Sec61p oligomers represent protein-conducting channels of the endoplasmic reticulum membrane. A 3-dimensional structure of the ribosome-Sec61p complex obtained by electron-cryo-microscopy and single particle reconstruction showed, that the central pore of the Sec61p oligomer aligns precisely with the exit of a tunnel traversing the large ribosomal subunit that forms the passageway for the nascent chain. Thus, in cotranslational translocation a continuous channel extending from the ribosome through the Sec61p oligomer could guide the nascent chain directly into the lumen of the endoplasmic reticulum. Furthermore, we have discovered a trimeric protein complex in the yeast endoplasmic reticulum membrane that is structurally related to the Sec61p complex. This so-called Ssh1p complex consists of Ssh1p, a distant relative of Sec61p, of Sbh2p, a homolog of the Sbh1p subunit of the Sec61p complex, and of Sss1p, a component common to both trimeric complexes. In contrast to Sec61p, Ssh1p is not essential for cell viability, but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential for cell viability, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperature and accumulate precursors of secretory proteins in the cytosol. Like the Sec61p complex, the Ssh1p complex forms ring-like structures in detergent and interacts with membrane-bound ribosomes, but it does not associate with the Sec62/63p complex. We therefore postulate that the Ssh1p complex functions exclusively in the cotranslational pathway of protein translocation. In the posttranslational transport process the newly synthesized translocation substrate prepro-a-factor associates with a large number of cytosolic proteins including the chaperones Hsp70 and TRiC. Upon binding of prepro-a-factor to the Sec complex all cytosolic proteins are released. Using a photo-crosslinking approach and a unique mapping technique we have investigated, how the signal sequence of prepro-a-factor is recognized by the Sec complex during the binding step. The signal sequence contacts primarily the multispanning membrane protein Sec61p. The bound signal sequence adopts a helical structure that interacts on opposite sides with transmembrane domains 2 and 7 of Sec61p, respectively. Sec62p and Sec71p, two subunits of the Sec62/63p complex, contact one side of the signal sequence, but are further away than Sec61p. Our data show, that the signal sequence binding site is located at the interface of the protein channel and the lipid bilayer. We suggest that binding of the signal sequence could open the channel for polypeptide transport.

Der Eintritt löslicher oder membranständiger Proteine in den Sekretionsweg beginnt mit dem Transport der Proteine durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Translokationspore wird durch den heterotrimeren Sec61-Komplex gebildet. Homologe Membranproteine der alpha- und gamma-Untereinheit dieses Komplexes sind bislang in allen daraufhin untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gefunden worden. Es handelt sich somit um einen entwicklungsgeschichtlich hoch konservierten Mechanismus des Proteintransports durch Membranen. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben uns mittlerweile ein komplexes Bild des Translokationsgeschehens vermittelt. Die vorliegende Arbeit beleuchtet einen völlig neuen Aspekt der Proteintranslokation: Es zeigt sich, daß Gene, die für Komponenten des Sec61-Komplexes kodieren, in sehr unterschiedlichen eukaryotischen Organismen unabhängig voneinander dupliziert wurden und sich im folgenden nebeneinander weiterentwickelten. Die Untersuchung dieser sog. paralogen Gene und ihrer Genprodukte zum einen in Säugerzellen und zum anderen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Gegenstand der Arbeit. In Säugerzellen finden sich zwei sehr ähnliche SEC61a-Gene (knapp 80% Identität auf Nukleinsäureebene, etwa 94% auf Aminosäureebene), deren Expression in verschiedenen Organen und Embryonalstadien der Maus analysiert wurde. In allen bislang getesteten Geweben wurden beide Gene exprimiert. Deutliche Unterschiede zeigten sich allerdings in der Stärke der Expression: Während die Expressionshöhe des bereits bekannten SEC61a-I-Gens relativ konstant war, variierte die des paralogen SEC61a-II-Gens zwischen den einzelnen Organen. Der selektive Vorteil zweier paraloger SEC61a-Gene für den Säugerorganismus liegt somit möglicherweise in der unterschiedlichen Regulierbarkeit ihrer Expression. In Saccharomyces cerevisiae finden sich paraloge Proteine und dafür kodierende Gene sowohl für die alpha-Untereinheit Sec61p als auch für die beta-Untereinheit Sbh1p des heterotrimeren Sec61p-Komplexes. Der Grad der Identität liegt mit 32% zwischen Sec61p und Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) allerdings erheblich niedriger als in Säugerzellen. Sbh1p und Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) sind zu etwa 50% identisch. Für die gamma-Untereinheit Sss1p wurde kein paraloges Protein gefunden. Es konnte gezeigt werden, daß die beiden, hier neu beschriebenen Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen, heterotrimeren Komplex, den Ssh1p-Komplex, bilden, der ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert ist und eine Funktion beim Proteintransport durch diese Membran hat. Im Gegensatz zu SEC61 ist SSH1 nicht essentiell, wenn auch das Ssh1p für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Die Deletion des SBH2-Gens zeigt keinen Phänotyp, was allerdings für die des SBH1-Gens ebenfalls gilt. Erst das Fehlen beider Proteine führt zu einem temperatur-abhängigen Wachstumsphänotyp und zu Defekten in der Translokation. Der entscheidende Unterschied zwischen dem Sec61p- und dem Ssh1p-Komplex scheint darin zu bestehen, daß der Sec61p-Komplex modulartig einsetzbar ist: als trimerer Komplex bei der kotranslationalen Translokation und im heptameren Sec-Komplex beim posttranslationalen Proteintransport. Demgegenüber deuten die Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes darauf hin, daß dieser nicht mit dem tetrameren Sec62p-Sec63p-Komplex zum heptameren Sec-Komplex assoziieren kann. Vielmehr läßt er sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen nachweisen, was auf eine ausschließliche Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der kotranslationalen Translokation schließen läßt., Soluble or membrane proteins entering the secretory pathway are first translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The proteins move through a channel formed by the heterotrimeric Sec61-complex. Homologues of the alpha- and gamma-subunit of this complex have been found in a wide variety of procaryotic and eucaryotic organisms indicating an evolutionary highly conserved mechanism for translocating proteins across membranes. Several recent investigations contributed to a complex understanding of this process. The work presented here sheds light on a completely new aspect of protein translocation across the ER-membrane: Interestingly genes coding for components of the Sec61-complex are found to have been duplicated independently in diverse eucaryotic organisms giving rise to so called paralogous genes (= intraspecies homologues) co-evolving after duplication. These paralogous genes and their gene products in mammalian cells as well as in the yeast Saccharomyces cerevisiae have been analyzed in detail. Mammalian cells possess two very similar SEC61a-genes (about 80% identity on nucleic acid level, about 94% on protein level). Their expression has been analyzed for several murine organs and embryonic stages. All tissues tested so far showed expression of both genes though the level of expression differed significantly: whereas expression of the already known SEC61a-I-gene seemed to be more or less constant across different tested organs, expression levels of the paralogous SEC61a-II-gene were not. Consequently the ability to differentially regulate the expression of the two paralogous SEC61a-genes may be of selective advantage for the mammalian organism. In the yeast Saccharomyces cerevisiae paralogous proteins of the alpha-subunit Sec61p as well as for the beta-subunit Sbh1p of the heterotrimeric Sec61p-complex can be found. The paralogous alpha-subunits Sec61p and Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) are less well conserved (32% identity) than the mammalian paralogues. Sbh1p and Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) are 50% identical. No paralogous protein was found for the gamma-subunit Sss1p. Instead, it could be shown that the new proteins Ssh1p and Sbh2p together with Sss1p are found in a heterotrimeric complex, the Ssh1p-complex, which like the Sec61p-complex localizes to the ER-membrane and has a function in translocating proteins across this membrane. In contrast to Sec61p Ssh1p is not essential for cell viability but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperatures and show translocation defekts in vivo as well as in vitro. The most intriguing difference between the Sec61p-and the Ssh1p-complex might be that the Sec61p-complex has a role in both co- and post-translational translocation pathways, as a separate entity and as part of the heptameris Sec-complex, respectively. However, there was no evidence for the Ssh1p-complex being part of an heptameric complex together with the tetrameric Sec62p-Sec63p-complex, but association of the trimeric Ssh1p-complex with membrane-bound ribosomes could be shown, making it likely that the Ssh1p-complex functions exclusively in the co-translational pathway of protein transport.