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Tesis por compendio de publicaciones, [EN] Plants have multiple chemical components which can be called active because they produce diverse effects or responses in the organism. Parasitism represents a serious public health problem, mainly in tropical and subtropical regions. From a pharmaceutical point of view, the use of extended-release systems is a critical parameter in their interaction with biological systems. The present study aimed to investigate the antiparasitic effects of methanolic extracts and their fractions, of Argemone mexicana and Kalanchoe daigremontiana (The parasites of clinical importance model studied were Entamoeba histolytica, richomonas vaginalis, Strongyloides venezuelensis, and Schistosoma mansoni), as well as their main active component, in in-vitro experiments. Also, it was investigated the cytotoxic and cytoprotective activity of the extracts, fractions, and active molecule in human erythrocytes. There were prepared methanolic extracts from leaves and dry stems of A. mexicana and K. daigremontiana, they were phytochemically characterized and fractionation was carried out with solvents of different polarity. Later, it was determined the percentage of viability and the average inhibitory concentration (IC50) being the methanolic leaf fraction the most effective with IC50 of 39, 56, and 15 μg/mL over E. histolytica, T. vaginalis, and S. venezuelensis respectively, for S. mansoni it was lethal at 50 μg/mL. The active fraction was analyzed by liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry (MS) and the berberine alkaloid (Ber) was identified which presented IC50 of 3.3, 1.9, 5.8, and 1.7 respectively on E. histolytica, T. vaginalis, S. venezuelensis, and S. mansoni. Finally, it was determined the cytotoxic and cytoprotective capacity using the technique of hemolysis in erythrocytes. To nanoencapsulate the active molecule and obtain polymeric nanoparticles (NP) with a size ≤ 200 nm and polydispersity index (PDI) ≤ 0.2 and without cytotoxic effect. Eudragit EPO, E100, L100, and L100-55 polymers were used, which yielded particle sizes of 150, 200, 72.2, and 168 nm with a Ber encapsulation percentage of 72.3, 38.4, 47.1, and 17.6, respectively., [ES] Las plantas poseen múltiples componentes químicos los cuales se pueden denominar como representan un grave problema de salud pública, principalmente en regiones tropicales y subtropicales. Desde el punto de vista farmacéutico, el uso de sistemas de liberación prolongada son un parámetro clave en su interacción con sistemas biológicos. El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos antiparasitarios de extractos metanólicos y sus fracciones, de Argemone mexicana y Kalanchoe daigremontiana (Los parásitos de importancia clínica modelo estudiados fueron Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis, Strongyloides venezuelensis y Schistosoma mansoni), así como de su principal componente activo, en experimentos in-vitro. También, se investigó la actividad citotóxica y citoprotectora de los extractos, fracciones y molécula activa en eritrocitos humanos. Se prepararon extractos metanólicos de hojas y tallos secos de A. mexicana y K. daigremontiana, se caracterizaron fitoquímicamente y se realizó fraccionamiento con solventes de distinta polaridad. Posteriormente, se determinó el porcentaje de viabilidad y la concentración inhibitoria media (IC50) siendo la fracción metanólica de hoja la más efectiva con IC50 de 39, 56 y 15 μg/mL sobre E. histolytica, T. vaginalis y S. venezuelensis respectivamente, para S. mansoni fue letal a 50 μg/mL. La fracción activa se analizó por cromatografía de líquidos (HPLC) acoplada a espectrometría de masas (MS) y se identificó el alcaloide berberina (Ber) el cual presento IC50 de 3.3, 1.9, 5.8 y 1.7 respectivamente sobre E. histolytica, T. vaginalis, S. venezuelensis y S. mansoni. Finalmente, se determinó la capacidad citotóxica y citoprotectora mediante la técnica de hemólisis en eritrocitos. Con el objeto de nanoencapsular la molécula activa y obtener nanopartículas poliméricas (NP) con tamaño ≤ 200 nm e índice de polidispersidad (PDI) ≤ 0.2 y sin efecto citotóxico. Se utilizaron polímeros Eudragit EPO, E100, L100 y L100-55 los cuales arrojaron tamaños de partícula de 150, 200, 72.2 y 168 nm con un porcentaje de encapsulación de Ber del 72.3, 38.4, 47.1 y 17.6 respectivamente.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] La fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (FHCC) es una zoonosis transmitida por garrapatas,principalmente aquellas del género Hyalomma spp. Está producida por un arbovirus, el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo (VFHCC) y representa la enfermedad viral transmitida por garrapatas con mayor extensión a nivel mundial. Produce brotes cada año en Europa, Asia y África, con predominio en el hemisferio norte durante los meses más calurosos del año (de mayo a octubre). El espectro clínico de esta enfermedad oscila desde sintomatología leve o inespecífica hasta la aparición de fiebre hemorrágica con elevado riesgo de mortalidad (10-40 %). El riesgo potencial de su utilización como arma biológica es una de las razones por la cual el VFHCC ha sido incluido como un patógeno prioritario para la investigación y el desarrollo por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en los últimos años. Como enfermedad emergente que es, el endemismo de la FHCC es desconocido en áreas geográficas consideradas libres de transmisión hasta el momento. De este modo, el estudio de seroprevalencia en la Comunidad de Castilla y León, donde se produjo el primer caso, permitirá evaluar el endemismo de esta enfermedad en el oeste de España. Además, se desconoce la situación epidemiológica en Castilla y León, por lo que los resultados de este trabajo tendrán una aplicación práctica desde el punto de vista de la Salud Pública, pues definirán las necesidades de políticas de detección de casos y cribado de pacientes durante los períodos de primavera-verano en esta comunidad autónoma y probablemente en el resto del territorio español, evitando retrasos en diagnóstico que elevan el riesgo de mortalidad, tanto por el riesgo para el personal sanitario como para el individuo ingresado con este diagnóstico. Por todo lo anteriormente expuesto y dada la situación actual, se ha considerado pertinente realizar esta Tesis Doctoral que tiene como objetivo principal estudiar la situación epidemiológica de la FHCC y realizar una evaluación del riesgo en la Comunidad Autónoma de Castilla y León, tras conocer la situación epidemiológica del VFHCC en Europa mediante una revisión inicial, amplia y sistemática. Los resultados de esta Tesis Doctoral pueden ser de gran utilidad como herramienta para la toma de decisiones de Salud Pública dirigidas a la vigilancia, prevención y control de la FHCC en nuestro entorno.

[ES] Esta tesis tiene como objetivo conocer las caracteristicas epidemiologicas, clinicas, analiticas y parasitologicas de las tres especies de filariosis diagnosticadas mas frecuentemente en nuestro medio. Los objetivos más especiífcos: 1. Identificar la frecuencia de casos asintomaticos en pacientes con filariosis. 2. Definir la frecuencia de aparicion de los diferentes sintomas en las tres especies de filariosis analizadas: Onchocerca volvulus, Loa loa y Mansonella perstans. 3. Estudiar las diferencias clinicas y analiticas entre nativos de zona endemica y viajeros a zonas endemicas. 4. Determinar los criterios diagnosticos mas frecuentes en cada una de las especies y sus diferencias entre las poblaciones estudiadas. 5. Delimitar el tiempo de residencia necesario en zona endemica de filariosis para adquirir la enfermedad, asi como delimitar cuanto tiempo despues de haber salido de zona endemica se pueden diagnosticar las filariosis., [EN] This thesis aims to know the epidemiological, clinical, and parasitological the analytical three species of filariasis diagnosed more frequently in our environment. Specifc objectives: 1. Identify the frequency of asymptomatic cases in patients with filariasis. 2. Define the frequency of occurrence of different symptoms in the three species of filariasis analyzed: Onchocerca volvulus, Loa loa and perstans Mansonella. 3. To study the clinical and analytical differences between natives and travelers endemic area to endemic areas. 4. Determine the most frequent diagnostic criteria in each of the species and their differences between the populations studied. 5. Define the required period of residence in endemic filariasis area to acquire disease, also define how long after you have left area endemic filariasis can be diagnosed.

[ES]Las enfermedades con resistencia/sensibilidad poligénicas dependen de la suma de efectos de genes con efecto débil, que interactúan entre ellos y el ambiente, provocando que en las mismas condiciones unos individuos desarrollen enfermedad grave y otros no. Estos genes son difíciles de localizar en el hombre, por la heterogeneidad genética y la compleja interacción con el medio. Sin embargo, el ratón ofrece modelos simplificados de líneas puras y cruzamientos para la disección genética de rasgos complejos. El estudio se concibió para identificar los patofenotipos asociados a la infección por «Schistosoma mansoni» empleando un modelo de cruce retrógrado o «backcross». También se pretendió encontrar regiones cromosómicas (eQTL) implicadas en la susceptibilidad a la infección y ligadas a los patofenotipos definidos. Para generar el «backcross» (F2BX), se cruzaron hembras F1C57CBA con machos CBA/2J, para enriquecer nuestra cohorte en alelos de susceptibilidad. Los 120 ratones generados, se infectaron con 150 cercarias de «S. mansoni» y se necropsiaron a las 9 semanas postinfección. Se midieron magnitudes parasitológicas, patológicas e inmunológicas para obtener grupos o patofenotipos de enfermedad. El «backcross» mostró menor de número de vermes y huevos en hígado que el cruce F1C57CBA y más parecido en número de granulomas a la línea parental más susceptible (CBA/2J). Se observó que en el «backcross» no había diferencias entre ratones machos y hembras salvo en el número de granulomas. Mediante el estudio de K-medias y PCA y correlaciones entre las variables parasito-patológicas, se observaron cuatro niveles de gravedad. En el análisis de variación entre medias de los patofenotipos se observó asociación con el daño hepático, independientemente del número de vermes recuperados. Se realizó el genotipado de los ratones con 958 SNPs significativos y su asociación a los fenotipos. En conclusión, tras generar el «backcross», con gran heterogeneidad, para estudiar la influencia de la infección por «S. mansoni», los cuatro patofenotipos observados en la esquistosomosis mansónica experimental en un cruzamiento retrógrado, parecen relacionados con el daño hepático. Las poblaciones celulares tienen importancia en la progresión de la enfermedad y los niveles de anticuerpos no están asociados con la gravedad de la infección. De las 18 regiones cromosómicas eQTL encontradas, hay una en el cromosoma 18 de ratón relacionada con el daño hepático, homóloga con el cromosoma 18 humano, en la región 18q11.2-12.3.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] La amphimeriosis es una nueva enfermedad soonótica emergente que afecta a los humano y es causada por el parásito trematodo de vías biliares Amphimerus sp. perteneciente a la familia Opisthorchiidae, transmitido por la ingesta de peces de río crudos o poco cocinados. En el año 2011, reportamos altas tasas de prevalencia de infección en la población indígena Chachi que habita en áreas tropicales húmedas, rurales y remotas de la región noroccidente del Ecuador. Además,se evidenciaron altas tasas de infección en animales domésticos (perros y gatos) residentes en éstas comunidades. Se conoce muy poco sobre la sintomatología causada y el tratamiento de esta enfermedad. La detección microscópica de los huevos en heces, es el método actual para diagnosticar la infección en humanos y animales. Sin embargo, este método tiene baja sensibilidad y la morfología de los huevos puede confundir con otros trematodos hepáticos e intestinales presentes en las heces. Para mejorar la sensibilidad y especificidad del diagnóstico de desarrollaron y validaron un ensayo inmunoenzimático (ELISA) para detectar anticuerpos circulantes IgG anti-Amphimerus sp. y la técnica molecular tipo LAMP (Loop mediated isothermal amplification). Para el estudio del ELISA se utilizaron antígenos solubles totales del parásito adulto Amphimerus sp. Se aplicó la técnica en 219 sueros de personas infectadas y saludables. La sensibilidad y especificidad de la prueba fue de 85,0% y 71,0% respectivamente. Se encontró reactividad cruzada con Paragonimus mexicanus, Fasciola hepatica, Schistosoma spp, Taenia solium, Strongyloides stercoralis, Mansonella spp. y Vampirolepis nana. Para el estudio tipo LAMP, se amplificaron los 4 cebadores a partir de una secuencia de 459 pb del gen ITS2 de Amphimerus spp. se desarrolló una PCR convencional y un LAMP (LAMPhimerus). Se evaluaron las sensibilidades y especificidades tanto de la PCR como de LAMPhimerus. El límite de detección de ambas pruebas fue de 1 pg de ADN genómico. No hubo reacciones cruzadas con ADN de 19 parásitos utilizados, incluidos C. sinensis y O. viverrini. La evaluación en campo se realizó con 44 muestras de heces conservadas en alcohol al 80% la sensibilidad y especificidad para LAMPhimerus fue de 76,7% y 80,7%, respectivamente. Además se aplicó la técnica LAMPhimerus en 102 muestras de heces conservadas en papel de filtro común. Se obtuvo una sensibilidad de y una especificidad de 79.17% y una especificidad de 65.98%. Las pruebas ELISA y LAMPhimerus, resultaron eficientes para uso en condiciones de campo y podrían ser aplicadas en el diagnóstico clínico de esta nueva enfermedad infecciosa tropical desatendida emergente, en seguimientos post-tratamiento y en programas de control y vigilancia de la enfermedad humana y de los reservorios domésticos y silvestres.

Tesis por compendio de publicaciones, [POR]Esquistossomose, uma doença parasitária causada por trematódeos dogênero Schistosoma, é uma das principais doenças tropicais desantendidas.Atualmente não há um método diagnóstico adequado, como técnicas parasitológicase sorológicas têm problemas de sensibilidade e especificidade. O diagnósticomolecular não é rotineiramente utilizada, particularmente em áreas endémicas epobre. A técnica LAMP é uma amplificação de ADN é realizada sob condiçõesisotérmicas. Tem as vantagens de ser rápida, sensível, específica, permite que osresultados de discriminação visual e pode ser aplicada como um diagnóstico point-ofcare.Neste trabalho foram concebidos, desenvolvidos e aplicados métodosmoleculares baseados na tecnologia LAMP para o diagnóstico de Schistosomamansoni e Schistosoma haematobium, e para detectar caracóis infectados com S.mansoni. Em primeiro lugar, uma técnica foi desenvolvida para a amplificação de ADNde S. mansoni, chamada SmMIT-LAMP, o qual provou ser eficaz para a detecção doparasita na fase aguda da infecção. A sua aplicação em amostras humanas e decaracois numa área endémica de baixa transmissão no Brasil tem mostrado altasensibilidade em relação às técnicas convencionais de diagnóstico e sua utilidadepara identificar focos de transmissão da doença. Estes estudos são detalhados notrabalho 1 e 5. Em seguida, outro método LAMP (Sh-LAMP) para a detecção de S.haematobium foi concebido. Ele foi otimizado em amostras clínicas de urina no laboratório com e sem extracção de ADN (Rapid-Heat LAMPellet method) e,subsequentemente, avaliadas com sucesso numa zona de transmissão em Angola.Além disso, Sh-LAMP mostrou elevada reprodutibilidade no laboratório dereferência. Estes estudos são recolhidos no trabalho 2 e 4. Finalmente, Biompha-LAMP mostrou-se útil para a detecção de S. mansoni emcaracóis infectados experimentalmente. Este estudo é o trabalho detalhado 3., [ES]La esquistosomosis, una enfermedad parasitaria producida por trematodos del género Schistosoma, es una de las principales enfermedades tropicales desantendidas. En la actualidad no se dispone de un método de diagnóstico adecuado ya que las técnicas parasitológicas y serológicas presentan problemas de sensibilidad y especificidad. El diagnóstico molecular no se utiliza de forma rutinaria, particularmente en zonas endémicas y de bajos recursos. El LAMP (loop-mediated isothermal amplification) es una técnica de amplificación de ADN que se realiza en condiciones isotérmicas. Presenta las ventajas de ser rápida, sensible, específica, permite la discriminación visual de los resultados y puede ser aplicada como diagnóstico point-of-care. En este trabajo se diseñaron, desarrollaron y aplicaron métodos moleculares basados en la tecnología LAMP para el diagnóstico de Schistosoma mansoni y Schistosoma haematobium, así como para la detección de caracoles infectados con S. mansoni. En primer lugar, se desarrolló una técnica de amplificación de ADN de S. mansoni, denominada SmMIT-LAMP, que ha mostrado su efectividad para la detección del parásito en la fase aguda de la infección. Su aplicación en muestras humanas y de caracoles en un área endémica de baja transmisión en Brasil ha demostrado una alta sensibilidad en comparación con las técnicas de diagnóstico clásicas, así como su utilidad para la identificación de focos de transmisión de la enfermedad. Estos estudios se detallan en los trabajos 1 y 5. A continuación se diseñó otro método LAMP (Sh-LAMP) para la detección de S. haematobium. Se puso a punto en muestras clínicas de orina en el laboratorio con y sin extracción previa de ADN (Rapid-Heat LAMPellet method) y posteriormente se evaluó con éxito en una zona de alta transmisión en Angola. Además, Sh-LAMP mostró una elevada reproducibilidad en un laboratorio de referencia. Estos estudios se encuentran recogidos en los trabajos 2 y 4. Finalmente, Biompha-LAMP mostró ser una herramienta útil para la detección de S. mansoni en caracoles infectados experimentalmente. Este estudio se encuentra detallado en el trabajo 3.

Tesis por compendio de publicaciones, [EN] Identifying and characterising proteins which use Plasmodium merozoites to invade host cells represents an important strategy for developing a method for controlling these parasites. However, basic P. vivax research has been delayed due to difficulties in propagating it in vitro as the parasite prefers to invade reticulocytes; there is a low percentage of these in adult human peripheral blood (1%-2%) and they are difficult to obtain with high purity, in a sufficient amount and totally viable. Consequently, knowledge is scarce regarding the amount of molecules being expressed by P. vivax and which of them represent good candidates for inclusion in an effective vaccine. This study has been aimed at evaluating the proteome of a primate-adapted P. vivax strain; antigenic molecules able to bind to human reticulocytes have been characterised. Analysing the P. vivax VCG-1 strain proteome led to detecting 734 proteins, some of them essential in key steps for establishing merozoite invasion of target cells. Furthermore, 811 A. nancymaae primate erythrocyte components (vital Plasmodium hosts) were identified; 51 of them were integral membrane proteins, 7 described as Plasmodium receptors. The presence, transcription, expression and antigenicity of genes encoding three P. vivax molecules (PvARP, PvRBSA and PvGAMA) were identified. Particularly interesting was the finding that a higher percentage of PvRBSA and PvGAMA bound to reticulocytes abundantly expressing the CD71 receptor (CD71hi), thereby suggesting that these molecules could be participating in P. vivax merozoite preferential selection for human reticulocytes. This the first study in Colombia which has determined the protein composition of a primate-adapted P. vivax strain as well as A. nancymaae erythrocytes. More importantly, P. vivax molecules were characterised which appear to be suitable candidates for being evaluated as components of a vaccine against malaria caused by the parasite species., [ES] La identificación y caracterización de proteínas que utilizan los merozoitos de Plasmodium para invadir a su célula hospedera, representan una estrategia importante para desarrollar un método de control contra estos parásitos. A pesar de ello, la investigación básica en P. vivax está retrasada por su difícil propagación in vitro, debido a la preferencia que tiene el parásito por invadir reticulocitos, los cuales se encuentran en escaso porcentaje en sangre periférica de humanos adultos (1-2%) y son difíciles de obtener con alta pureza, en suficiente cantidad y totalmente viables. Como consecuencia de lo anterior, el conocimiento del número de moléculas que expresa P. vivax y cuáles de ellas son candidatas para componer una vacuna, es escaso. En este estudio, se evaluó el proteoma de una cepa de P. vivax adaptada a primates y se caracterizaron moléculas antigénicas y con capacidad de adhesión a reticulocitos humanos. En el análisis del proteoma de la cepa VCG-1 de P. vivax, se detectaron 734 proteínas, algunas esenciales en los pasos clave para establecer la invasión del merozoito a su célula diana. Además, se identificaron 811 componentes de eritrocitos (hospederos vitales de Plasmodium) del primate A. nancymaae, de los cuales 51 son proteínas integrales de membrana, 7 descritas como receptores de Plasmodium. Por otro lado, se identificó la presencia, transcripción y expresión de los genes codificantes de tres moléculas de P. vivax: PvARP, PvRBSA y PvGAMA, así como su antigenicidad. De particular interés, se encontró que PvRBSA y PvGAMA se unen en mayor proporción a reticulocitos que expresan el receptor CD71 de forma abundante (CD71hi), lo que sugiere que estas moléculas pueden estar participando en la selección preferencial que tienen los merozoitos de P. vivax por los reticulocitos humanos. Este es el primer estudio en Colombia donde se determina la composición proteica de una cepa de P. vivax adaptada a primates, así como la de eritrocitos de A. nancymaae. Como resultado más importante, se caracterizaron moléculas de P. vivax que son candidatos idóneos a ser evaluados como componentes de una vacuna contra la malaria causada por esta especie parasitaria.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES] Han pasado unos 160 años desde que Theodor von Siebold y Theodor Bilharz hicieron la primera descripción de una de las especies del género Schistosoma, S. haematobium (Cox et al., 2004) hasta que un grupo de investigadores liderados por Matt Berriman del Sanger Institute (UK) anotaran la primera secuencia del genoma de otra especie de Schistosoma, S. mansoni (Berriman et al., 2009). Durante este recorrido en el tiempo, Fujiro Katsurada descubre S. japonicum en el valle de Katayama y lo encuadra como una especie zoonótica. En la década de los sesenta se describieron otras especies de esquistosomas humanos como S. intercalatum y S. mekongi (Ohmae et al., 2004). En los últimos años se ha identificado una nueva especie en humanos denominada S. guineensis (Webster et al., 2006). La esquistosomiasis es adquirida por contacto con agua dulce contaminada con larvas natatorias -cercarias- del parásito, emitidas por diferentes especies de caracoles (hospedadores intermediarios), que penetran activamente por la piel. Tras su penetración, la cercaria pierde la cola transformándose en esquistosómula, la cual realiza una migración necesaria para su pre-maduración, pasando por los pulmones y volviendo a la circulación general para llegar finalmente a los vasos sanguíneos de diferentes localizaciones donde termina su maduración. Los vermes adultos de S. mansoni, S. japonicum, S. mekongi y S. intercalatum se asientan en los vasos mesentéricos, y los de S. haematobium llegan a los vasos que irrigan la vejiga urinaria. En estas localizaciones, los vermes macho y hembra entran en contacto para su total maduración y comienzo de la oviposición. Los huevos del parásito comienzan a ser eliminados con la orina (S. haematobium) o las heces (otras especies) del individuo infectado tras un período que oscila entre 35 y 70 días, alcanzando el agua y liberando los miracidios que penetran en los caracoles de diversos géneros para transformarse y multiplicarse en su interior hasta convertirse en cercarias y así cerrar el ciclo biológico. Una minoría se quedan atrapados en diferentes tejidos, formando los granulomas que es el hecho patogénico principal y el que da lugar a los síntomas y signos clínicos que se presentan en la fase crónica de esta infección. Los datos epidemiológicos indican que 779 millones de personas viven en 76 países endémicos de esquistosomiasis. Además, se estima que existen 250 millones de personas infectadas (80% en África subsahariana), 120 millones con sintomatología, 20 millones con enfermedad grave y una mortalidad anual de 280.000. La incapacidad ponderada por año de vida (DALY) es de 1,35 millones (King et al., 2005). La mayor prevalencia en áreas endémicas es en los adolescentes y disminuye generalmente en edad adulta. Se estima entre 60-80% de infección activa en niños de edad escolar y del 20-40% en adultos (Colley et al., 2014). Respecto a su distribución geográfica, se conoce que en el continente americano solo existe S. mansoni. En África conviven S. haematobium, S. intercalatum y S. guineensis y en Asia habitan S. japonicum y S. mekongi. En Europa era considerada una enfermedad importada, aunque en los últimos años se han registrado casos autóctonos en Córcega (Francia) debidos a S. haematobium (Holtfreter et al., 2014), si bien algunos investigadores apuntan a la existencia de híbridos S. haematobium/S. bovis. Desde el punto de vista clínico, la esquistosomiasis puede debutar con prurito en las primeras 24 horas siguientes a la penetración de las cercarias a través de la piel. Este cuadro es más llamativo en personas infectadas por parásitos aviares. Se observa más en viajeros y pasa desapercibida en personas residentes en áreas endémicas (Meltzer et al., 2006). La fase aguda o también denominada “Fiebre de Katayama” (Ross et al., 2007) se produce entre las 2-8 semanas después de la exposición y se debe a la reacción inmunológica desencadenada frente a la fase de migración del parásito. Se caracteriza por presentar fiebre, lesiones cutáneas (exantema, urticaria), afectación pulmonar (tos, disnea) y eosinofilia. En general es autolimitada, aunque en algunas ocasiones los síntomas pueden persistir más de diez semanas presentando diarrea, pérdida de peso, dolor abdominal, hepatoesplenomegalia, etc. La fase crónica de la esquistosomiasis aparece meses o años después de la infección y se debe a la reacción granulomatosa formada en torno a los huevos atrapados en hígado, bazo, intestino y otras localizaciones más lejanas como pulmones y sistema nervioso. Se presenta con más frecuencia en personas residentes en áreas endémicas de la enfermedad. Los métodos de diagnóstico parasitológico directo Kato-katz (Katz et al., 1972) y filtración de orina son los más utilizados para detectar estos parasitosis sin embargo poseen escasa sensibilidad y no son efectivos en la fase aguda de a enfermedad. Se han desarrollado diferentes métodos serológicos tanto de detección de antígeno como de anticuerpos (Pardo et al., 2007). La detección de anticuerpos tiene la limitación de presentar reactividad cruzada con otras infecciones producidas por helmintos. En los últimos años se han desarrollado técnicas moleculares (PCR, LAMP, etc…) utilizando diferentes muestras biológicas (heces, orina,..) (Sandoval et al., 2006). El fármaco de elección para el tratamiento de la esquitosomosis es el praziquantel, la dosis recomendada es 20mg/Kg cada 12 horas. Este fármaco es muy efectivo frente a vermes adultos pero tiene poca efectividad frente a esquistosómulas. Esta puede ser la razón de la aparición de resistencias en zonas endémicas. No obstante, en estas zonas existen reinfecciones continuas por la exposición de la población a aguas contaminadas con la fase infectiva del parásito. Estas son las principales razones para desarrollar una vacuna efectiva contra esta importante parasitosis. En la actualidad no existe ninguna vacuna disponible y los escasos estudios con determinadas moléculas no han llegado a fases clínicas avanzadas.

Tesis por compendio de publicaciones, [ES]Las Enfermedades Tropicales Olvidadas o Desatendidas representan un grupo de infecciones que afectan a una gran parte de la población humana, especialmente aquella que vive en condiciones de pobreza y donde las condiciones higiénicas y sanitarias son deficientes. Estas enfermedades son causadas por diferentes agentes infecciosos entre los que se encuentran parásitos, virus y bacterias, siendo los parásitos los que causan mayor afectación a los seres humanos. A pesar de que actualmente la mayoría de estas enfermedades se pueden tratar eficazmente con agentes quimioterapéuticos, aspectos como la generación de resistencias a los fármacos de elección, su elevada citotoxicidad y generación de efectos adversos, que pueden llegar a ser graves, hacen que la búsqueda de nuevas alternativas para su tratamiento y/o prevención sea una prioridad. El Departamento de Química Farmacéutica (Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca) tiene una gran experiencia en el diseño y síntesis de compuestos con actividad antiparasitaria, especialmente en la obtención de derivados de la esfingosina, compuesto con una importante actividad biológica. Junto con la amplia experiencia del Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales de la Universidad de Salamanca (CIETUS) en el manejo de modelos experimentales y ciclos biológicos de agentes infecciosos, en el presente estudio, evaluamos la eficacia antiparasitaria de diversos compuestos derivados de esfingosina, principalmente aminoalcoholes y diaminas, frente al protozoo Trypanosoma cruzi, agente causal de la Enfermedad de Chagas, parasitosis ampliamente distribuida, no solo en el continente americano, sino también en países no endémicos y el nematodo Strongyloides stercoralis, agente causal de la estrongiloidosis, una geohelmintosis ampliamente distribuida en el mundo. Además, dada la experiencia que el CIETUS ha adquirido durante los últimos años en el conocimiento de la actividad antiparasitaria de alquilfosfolípidos, entre los que se encuentran edelfosina, miltefosina y perifosina, en el presente estudio también evaluamos la actividad anti-Strongyloides de la edelfosina, mediante ensayos in vitro e in vivo, además de investigar acerca de su mecanismo de acción en ensayos in vitro, utilizando la técnica de TUNEL. Los estudios in vitro utilizando macrófagos peritoneales de ratón demostraron la baja citotoxicidad de la mayoría de los compuestos derivados de esfingosina, así como de los alquilfosfolípidos en un amplio rango de concentraciones. La actividad in vitro frente a epimastigotes de Trypanosoma cruzi puso en evidencia la alta actividad de 5 compuestos derivados de esfingosina, 3 aminoalcoholes y 2 diaminas, mientras que la actividad in vitro frente a tripomastigotes intracelulares en fibroblastos de ratón mostraron una elevada actividad de 1 aminoalcohol. En lo referente a los estudios de actividad frente a S. venezuelensis, los estudios in vitro evidenciaron una buena actividad de 4 derivados de esfingosina, 2 aminoalcoholes y 2 diaminas, los cuales llevados a posteriores estudios in vivo demostraron buena actividad de 1 aminoalcohol. Respecto a la actividad antiparasitaria de los alquilfosfolípidos edelfosina, miltefosina y perifosina frente a S. venezuelensis, encontramos una mejor actividad, tanto in vitro como in vivo de edelfosina en un amplio rango de concentraciones, la cual está relacionada con un mecanismo similar a apoptosis. El conjunto de resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral nos llevaron a la identificación de nuevos compuestos derivados de esfingosina, así como de edelfosina, como prototipos que precisan ser refinados para la obtención de candidatos y ser utilizados en las parasitosis producidas por T. cruzi y S. stercoralis.

329 p.-29 fig.-6 tab.-3 apéndices.-Tesis doctoral en formato compendio artículos/publicaciones., Los parásitos son organismos eucariotas (unicelulares o pluricelulares) que viven en el interior o sobre el tejido vivo de otro organismo más organizado denominado hospedador. El término parásito proviene del nombre dado a unos sacerdotes auxiliares que “sentados al lado del alimento” -sentido etimológico- del sacrificio, participaban más tarde de la ofrenda; de aquí el uso despectivo que se le da a dicha palabra que además, tiene el término, desde su origen griego (para, junto a y sitos, trigo, comida). La generalización biológica se debe a los médicos veterinarios romanos que denominaron así a aquellos animales que vivían y se alimentaban a expensas de otros. En las primeras definiciones de los parásitos se trataba de diferenciarlos de los depredadores, insistiendo en que, aunque la asociación era para la adquisición de alimentos, se tendía a conservar la vida del hospedador y a no proporcionarle beneficio alguno, sino al contrario, efectos dañinos o acciones patógenas.Todosestos conceptos se completaron al observar la naturaleza de la asociación; el carácter fisiológico de la misma; la interdependencia bioquímica con tendencia a la estabilidad por pérdida o adquisición mutua de información genética donde los parásitos han desarrollado mecanismos que son capaces de manipular el genoma de su hospedador compatible, orquestando cambios en los nucleos de sus células que alteran la expresión génica en favor del parásito [1, 2]. Recientemente los enfoques más informativos del Ácido Desoxirribonucleico (ADN) (secuencias de genes, polimorfismos de un solo nucleótido del inglés Single Nucleotide Polymorphism (SNP), y los microsatélites) [3], se han utilizado ampliamente para inferir la influencia de la genética en los diferentes aspectos de la biología del parásito., Por otra parte, de forma general, las acciones perjudiciales son mutuas o en ambas direcciones. La posible «bondad» de algunos parasitismos, o del parasitismo, en general, no existe. Algunos hospedadores van cambiando su metabolismo, ganando peso, o modificando su comportamiento. Por el contrario, los parásitos hallan ventajas adaptativas en conservar la expresión génica de la virulencia. Si los factores de virulencia son mantenidos por la selección natural, ocasionando una disminución del bienestar del hospedador, inevitablemente se producirá también la correspondiente selección para la resistencia del hospedador. Así, se mantiene el equilibrio inestable y dinámico de la comunidad antagónica de dos seres vivos de distinta especie en asociación definida como parasitismo [4, 5]. La gran mayoría de los parásitos pertenecen a uno de los siguientes Phylum: Apicomplexa, Microspora, Ciliophora, Plathelminthes, Nematoda y Arthropoda. Los helmintos se encuentran en dos de ellos Plathelminthes y Nematoda. Se han descrito cerca de 25.000 especies de nematodos. Muchos de ellos son parásitos de insectos, plantas o animales, pero también existen especies de vida libre como Caenorhabditis elegans. Sobre la base de las estimaciones mundiales, entre 75.000 y 300.000 especies de helminto nfectan a los vertebrados terrestres y acuáticos; entre estos, 287 son conocidos en los seres humanos, el 95% de los cuales son especies zoonóticas y aproximadamente el 25% de la población mundial está infectada con estos organismos [3]. La gran mayoría de los platelmintos parásitos pertenecen a las clases, Monogenea, Digenea (gr. dis, “doble” y genos, “raza”) y Cestoda (tenias) (figura I.1), y las dos primeras clases son comúnmente denominadas “trematodos”. Todos los trematodos que residen en los seres humanos son de la clase Digenea. Tienen complejos ciclos de vida indirectos, en los que incluyen uno o varios hospedadores intermediarios (Ej. caracoles terrestres), ejemplo de estos parásitos son los esquistosoma, objeto de esta Tesis Doctoral.

[ES]La infección causada por Fasciola hepatica es una trematodosis ampliamente distribuida en el mundo, causando importantes pérdidas económicas a nivel veterinario. Se estima que hay 17 millones de personas infectadas y que entre 91 a 170 millones de personas residen en zonas con posibilidad de adquirir la enfermedad. El triclabendazol continúa siendo el fármaco de elección para el tratamiento de la fasciolosis tanto a nivel veterinario como en humanos. La aparición de estirpes resistentes al triclabendazol hacen que la vacunación sea una prioridad para la prevención de la enfermedad. En el presente estudio, realizamos una búsqueda de todas las proteínas de Fasciola hepatica que se encontraban descritas en el servidor web del Centro Nacional de Información en Biotecnología (NCBI). Una vez obtenidas la secuencia de aminoácidos de las proteínas encontradas, seleccionamos aquellas que presentaban péptido señal y ausencia de regiones transmembrana. A partir de su secuencia de aminoácidos y haciendo uso de las herramientas de bioinformática BepiPred y SYFPEITHI diseñamos 12 péptidos con epítopos B y 12 péptidos con epítopos T, los cuales fueron sintetizados químicamente empleando una metodología de síntesis de péptidos en fase sólida. Los estudios in vitro utilizando macrófagos peritoneales de ratón mostraron que los péptidos sintéticos no presentan citotoxicidad en el rango de concentraciones utilizadas en este estudio. Estudiamos la respuesta inmunológica inducida en ratones BALB/c inmunizados con los péptidos sintéticos utilizando el sistema ADAD de vacunación, previamente descrito y utilizado en nuestro grupo de investigación. Analizamos la producción de anticuerpos de los tipos IgG, IgG1, IgG2a, IgE e IgM en diferentes tiempos durante el procedimiento de inmunización, comparando el efecto tanto de los péptidos (B o T) como del inmunomodulador utilizado (AA0029 o PAL). Evaluamos los niveles de citocinas de los tipos Th1, Th2, Treg y Th17 en sobrenadantes de cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos sintéticos, así como cambios en los niveles de subpoblaciones de linfocitos B y T y subpoblaciones linfocitarias asociadas a la generación de memoria inmunológica. Aplicando un análisis estadístico univariante y multivariante seleccionamos los péptidos denominados B1, B2, B5, B6, T14, T15 y T16 que pertenecen a proteínas de amebaporo y catepsina B de F. hepatica. Además, el análisis estadístico demostró que el uso del imunomodulador AA0029 induce, en general, una respuesta inmunológica más potente que el inmunomodulador PAL. Para los estudios de protección, los péptidos fueron administrados individualmente y, de acuerdo al tipo de respuesta inmunológica inducida, se realizaron combinaciones de los péptidos. Cuando los ratones inmunizados fueron infectados con metacercarias de F. hepatica, obtuvimos diferentes niveles de protección medidos como porcentaje de supervivencia, recuperación de vermes y magnitud del daño hepático. La inmunización de ratones con la combinación de los péptidos T14, T15 y T16 produjo una supervivencia del 71,4%, así como una reducción significativa en el número de vermes y en la magnitud de las lesiones hepáticas. Estos datos indican que el uso de múltiples antígenos es necesario para obtener mejores resultados de protección. Finalmente, analizamos el transcriptoma en esplenocitos de ratones inmunizados con dicha combinación de péptidos mediante la tecnología de microarrays de Affymetrix, encontrando que la inmunización aumenta la expresión de genes implicados en rutas de señalización sobre producción de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno, así como de rutas de señalización de Il-12 e IL-8. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que el uso de péptidos sintéticos procedentes de diferentes moléculas del parásito pueden ser posibles candidatos vacunales contra la fasciolosis causada por F. hepatica. Sin embargo, futuros estudios de inmunización en modelos naturales de fasciolosis deben ser realizados para validar nuestros resultados.

Parte del texto en inglés y parte en español., [ES] La esquistosomosis es una enfermedad endémica de los países situados en la franja del trópico y representa una de las parasitosis más importantes a nivel mundial. Es una enfermedad multifactorial en la que el componente genético de la respuesta inmune del hospedador juega un papel principal en el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, en el ser humano dicho componente se ve fuertemente influenciado por diversos factores socioeconómicos, ambientales, de distribución y densidad del hospedador intermediario. Los cruces experimentales de ratón suponen una buena estrategia para identificar posibles rasgos genéticos implicados en la susceptibilidad a la infección. En la presente Tesis Doctoral se presenta un informe y tres artículos de investigación que tratan de abordar esta hipótesis. En primer lugar, en el informe: Identificación de Quantitative Trait Loci (QTLs) implicados en la respuesta inmune del ratón en condiciones basales: Rastreo genético y aproximación multivariante se presenta la metodología de cruce retrógrado de ratón y los resultados procedentes del análisis de ligamiento de un estudio sobre genética cuantitativa del proceso inflamatorio y las variables inmunológicas a nivel basal en una población de ratón backcross (SPRET/Ei x FVB/N) x FVB/N. En segundo lugar, la subespecie de ratón Mus spretus representa una gran oportunidad para el estudio de enfermedades de rasgos complejos puesto que presenta una gran divergencia genética respecto al ratón Mus musculus, especie comúnmente utilizada en el laboratorio. Hasta el momento no se conoce el comportamiento de esta especie de ratón respecto a la resistencia/susceptibilidad a la infección por S. mansoni. Se incluye el artículo: Chistosoma mansoni infection in SPRET/Ei mice: a multivariate approach donde se realiza una exploración de las variables inmunológicas y hematológicas de esta subespecie de ratón en respuesta a la infección experimental de S. mansoni. En tercer lugar, el artículo: Identifying phenotypes involved in the susceptibility to Schistosoma mansoni infection in F1B6CBA mice presenta los resultados obtenidos del análisis de la esistencia/susceptibilidad a la esquistosomosis en dos cepas de ratón divergentes y la generación del cruce F1 como paso previo a la generación de la población backcross. Este estudio preliminar ayudará a dilucidar el papel del fondo genético en la resistencia/susceptibilidad a la infección y a elegir los fenotipos inmunitarios responsables de la resistencia/susceptibilidad a la enfermedad. Por otro lado, gran parte de las medidas de control de la esquistosomosis en países en vías de desarrollo recae sobre el uso del praziquantel como única medida eficaz para el control de esta enfermedad. El praziquantel es un fármaco seguro y eficaz que actúa sobre las formas adultas del parásito. Sin embargo, su uso masivo ha hecho que la OMS reconociera la necesidad de identificar nuevos compuestos como alternativas al praziquantel para evitar la aparición de resistencias. En la última década tan sólo los derivados de la artemisina han surgido como un complemento a la terapia frente a la esquistosomosis. Por último, en esta Tesis Doctoral se incluye el artículo: Systematic review and meta-analysis of Artemisinin based therapies for the treatment and prevention of schistosomiasis en el que se presenta el uso del meta-análisis como una herramienta para dilucidar la posible incorporación de los derivados de la artemisina en el tratamiento y control de la esquistosomosis en zonas endémicas, [EN] Schistosomiasis is endemic in the countries situated on the fringe of the tropics and is one of the most important parasitic disease worldwide. Is a multifactorial disease in which the genetic component of the host immune response plays a major role in the development of the disease. However, in humans this component is strongly influenced by various socio-economic, environmental, distribution and density of intermediate host. The mouse experimental crosses are a good strategy to identify possible genetic traits involved in susceptibility to infection. In this PhD thesis is a report and three research articles that seek to address this hypothesis. First, in the report: Identification of Quantitative Trait Loci (QTLs) involved in the immune response of mice at baseline: Tracking genetic and multivariate approach presents the methodology retrograde crossing mouse and the results from linkage analysis A study on the inflammatory process quantitative genetics and immunological variables at baseline in a population of mouse backcross (SPRET / Ei x FVB / N) x FVB / N. Secondly, the mouse Mus spretus subspecies represents a great opportunity for the study of complex traits diseases since it has a large genetic divergence over the mouse Mus musculus, a species commonly used in the laboratory. So far no one knows the behavior of the mouse species for resistance / susceptibility to infection by S. mansoni. It includes article: Chistosoma mansoni infection in SPRET / Ei mice: a multivariate approach which performs a scan of immunological and hematological variables of this subspecies of mouse in response to experimental infection of S. mansoni. Third, the article: Identifying the susceptibility phenotypes involved in. to Schistosoma mansoni infection in mice F1B6CBA presents the results obtained from the analysis of the esistance / susceptibility to schistosomiasis two divergent mouse strains and F1 generation of the cross as a precursor to generation backcross population. This preliminary study will help elucidate the role of genetic background in the resistance / susceptibility to infection and immune phenotypes choose responsible for resistance / susceptibility to disease. On the other hand, most of the measures of schistosomiasis control in developing countries dependent on the use of praziquantel as the only effective measure to control the disease. Praziquantel is a safe and effective drug that acts on the adult forms of the parasite. However, its widespread use has made the WHO recognized the need to identify new compounds as alternatives to praziquantel to prevent the emergence of resistance. In the last decade only the artemisinin have emerged as an adjunct to therapy against schistosomiasis. Finally, in this thesis includes Article: Systematic review and meta-analysis of Artemisinin-based therapies for the treatment and prevention of schistosomiasis in which we present the use of meta-analysis as a tool to elucidate the possible incorporation of the artemisinin in the treatment and control in endemic schistosomiasis

Algunos capítulos en español, otros en inglés., [ES] In Vitro and In Vivo Efficacy of Ether Lipid Edelfosine against Leishmania spp. and SbVResistant Parasites En este artículo, demostramos que la edelfosina es el más potente de los ALPs para matar diferentes especies de Leishmania spp. Usando diferentes metodologías tanto in vitro como in vivo, hemos observado el potencial efecto terapéutico de este compuesto en comparación con otros ALPs, incluyendo a la miltefosina, compuesto disponible en algunos países para el tratamiento de las formas viscerales, cutáneas y mucocutáneas de la enfermedad. La miltefosina clínicamente ha mostrado diferentes índices de curación y riesgo de generar resistencia a corto plazo. Sin embargo, la edelfosina tiene mayor eficacia en este estudio, retrasando el tiempo de aparición de resistencia in vitro. En nuestro trabajo, este compuesto ocasiona la muerte del parásito por apoptosis-like; inhibiendo la proliferación celular a dosis bajas. Se ha observado también que atraviesa la membrana del macrófago y se deposita en el interior de los amastigotes, ocasionando disminución significativa de la carga parasitaria, sin intervención del óxido nítrico del macrófago. Estudios in vivo han demostrado la eficacia de edelfosina tanto en el modelo experimental murino como en el hámster, reduciendo en ambos la carga parasitaria en los animales tratados. Este efecto antiparasitario ha sido comprobado también cuando los animales se infectaron con cepas resistentes al SbV. Teniendo en cuenta nuestro estudio podemos generar la siguiente escala de actividad anti-Leishmania: edelfosina>perifosina>miltefosina>erucilfosfocolina. Nuestros resultados indican que la edelfosina es una buena alternativa para el tratamiento de la leishmaniosis y que podría utilizarse en ensayos clínicos en humanos, sobre todo en países donde existe resistencia a los antimoniales Presence of a Rac/Akt-like gene in Leishmania parasites as a putative stress response protein and therapeutic target in leishmaniasis Este estudio demuestra la existencia de una proteína de 56-kDa del tipo RAC/AKT-like, conservada en todas las especies de Leishmania spp (93-99% identidad); esta quinasa podría tener un papel importante en la supervivencia del parásito dadas las diferentes condiciones de estrés celular que experimenta durante su complejo ciclo de vida. Esta quinasa RAC/AKT-like es un posible ortólogo de la proteína AKT de humanos y de otras especies. La AKT en una quinasa de la familia de proteínas llamadas AGC evolutivamente conservadas en eucariotas; AKT está involucrada en la supervivencia de diferentes tipos de cáncer por lo tanto se considera un importante blanco de la quimioterapia. Esta quinasa forma parte de la ruta se señalización PI3K/AKT la cual controla la supervivencia, metabolismo y ciclo celular, entre otros. En parásitos, esta ruta de señalización no está caracterizada, aunque algunos estudios informáticos plantean la existencia de proteínas asociadas a ella. Para nuestra investigación, se establecieron condiciones de estrés celular, aumentando la temperatura o disminuyendo los nutrientes en el medio de cultivo. Se detectó una fosfo-señal correspondiente a una proteína de 56-KDa en los extractos proteicos. Anticuerpos específicos contra la proteína AKT de humanos reconocieron la proteína; el anticuerpo usado fue un anti-p-AKT (Thr308) y el p-AKT (Ser 473), estos dos sitios son fosfo-activados en la AKT humana para la total actividad de la proteína. En Leishmania solo observamos actividad fosfo-treonina y los análisis bionformáticos revelaron que Leishmania tiene una treonina en su motivo hidrofóbico y no una serina como en los humanos. Después de un análisis bioinformático se encontró que solo T. cruzi tiene una serina en ese motivo. El gen clonado y secuenciado en este estudio codifica una proteína de 510 aminoácidos con una identidad entre 25-26% con la humana; sin embargo, esta proteína conserva los tres típicos dominios de estas proteínas (Pleckstrin (PH), Quinasa (Ser/Thr) y AGC). Además, utilizando un inhibidor químico de la proteína AKT de humanos en el cultivo de parásitos estresados se obtiene una alta apoptosis-like a las pocas horas de su incubación en promastigotes y amastigotes. Datos boinformáticos del tipo docking insilico demuestran una posible interacción entre el inhibidor y la RAC/AKT-like. Estudios más profundos de esta quinasa podrán, desarrollar esta idea (RAC/AKT-like como diana terapéutica) The HSP90 inhibitor 17-AAG potentiates the antileishmanial activity of the ether lipid edelfosine Este artículo sugiere que la terapia combinada entre edelfosina y el antibiótico 17-AAG análogo de geldanamicina, puede ser efectivo contra la infección ocasionada por Leishmania spp. Nuestros datos, publicados previamente, han demostrado el potencial efecto terapéutico de la edelfosina en diferentes especies de Leishmania. Sin embargo, sabemos que la monoterapia tiene el riesgo de generar resistencia temprana a los medicamentos. En este estudio demostramos que el co-tratamiento con 17-AAG, un inhibidor químico de la proteína HSP90 de humanos, que está actualmente en fases de estudio clínico para el tratamiento de tumores, puede generar un efecto sinérgico con otros compuestos anti-Leishmania, ya que este compuesto demostró su capacidad de detener el ciclo celular del parásito en G0/G1, interrumpiendo así la progresión del ciclo celular del parásito. En nuestras investigaciones, cuando evaluamos la eficacia de la edelfosina in vitro contra la cepa de L. infantum, encontramos que este compuesto fue poco efectivo; sin embargo, cuando se realizó el co-tratamiento in vitro con 17-AAG se aumento el efecto apoptótico-like. Este hallazgo supone que se podría controlar el aumento de la carga parasitaria mientras se establece un tratamiento o durante el mismo, así como prevenir la aparición de clones resistentes al tratamiento, In vitro and In vivo Efficacy of Ether Lipid Edelfosine against Leishmania spp. and SbV-Resistant Parasites Abstract Background: The leishmaniases are a complex of neglected tropical diseases caused by more than 20 Leishmania parasite species, for which available therapeutic arsenal is scarce and unsatisfactory. Pentavalent antimonials are currently the first-line pharmacologic therapy for leishmaniasis worldwide, but resistance to these compounds is increasingly reported. Alkyl-lysophopsoholipid analogs (ALPs) constitute a family of compounds with antileishmanial activity, and one of its members, miltefosine, has been approved as the first oral treatment for some visceral and cutaneous leishmaniasis. However, its clinical use can be challenged by less impressive efficiency in patients infected with some Leishmania species, including L. braziliensis and L. mexicana, and by proneness to develop drug resistance in vitro. Methodology/Principal Findings: We found that ALPs ranked edelfosine perifosine miltefosine erucylphosphocholine for their antileishmanial activity and capacity to promote apoptosis-like parasitic cell death in promastigote and amastigote forms of distinct Leishmania spp., as assessed by proliferation and flow cytometry assays. Effective antileishmanial ALP concentrations were dependent on both the parasite species and their development stage. Edelfosine accumulated in and killed intracellular Leishmania parasites within macrophages. In vivo antileishmanial activity was demonstrated following oral treatment with edelfosine of mice and hamsters infected with L. major, L. panamensis or L. braziliensis, without any significant side-effect. Edelfosine also killed SbV-resistant Leishmania parasites in in vitro and in vivo assays, and required longer incubation times than miltefosine to generate drug resistance. Conclusions/Significance: Our data reveal that edelfosine is the most potent ALP in killing different Leishmania spp., and it is less prone to lead to drug resistance development than miltefosine. Edelfosine is effective in killing Leishmania in culture and within macrophages, as well as in animal models infected with different Leishmania spp. and SbV-resistant parasites. Our results indicate that edelfosine is a promising orally administered antileishmanial drug for clinical evaluation. Presence of a Rac/Akt-like gene in Leishmania parasites as a putative stress response protein and therapeutic target in leishmaniasis Abstract Background: A subgroup of serine/threonine protein kinases named as related to A and C protein kinases (RAC), or protein kinase B (PKB)/AKT, have been identified in several organisms including Trypanosoma cruzi parasites. Despite the role of Trypanosoma cruzi PKB protein is unknown, PKB/AKT protein plays a critical role in mammalian cell signaling, promoting cell survival under stress conditions and apoptosis inactivation. Methodology/Principal Findings: We have found that antibodies against human AKT recognized a protein of about 56-kDa in Leishmania promastigote extracts. A phosphoprotein band was detected by using anti-human-p-AKT(Thr308), but not anti-human-p-AKT(Ser473), antibodies, in extracts from Leishmania spp. exposed to stressful experimental conditions, such as nutrient deprivation or heat shock. Incubation of AKT inhibitor X with Leishmania spp. promastigotes under stressful conditions or with Leishmania-infected macrophages led to parasite cell death. We have cloned and sequenced a novel gene from Leishmania donovani (MHOM/IN/80Dd8), named Ld-Rac/Akt-like, that encoded a 510 amino acid protein closely related to RAC/PKB proteins from other Leishmania (93-99% identity) and Trypanosoma (32-35% identity) species, as well as mammalian AKT1/2/3 (25-26% identity). Ld-RAC/AKT-like protein contains the typical pleckstrin, protein kinase and AGC kinase domains, major mammalian PKB/AKT hallmarks. In contrast to mammalian AKT that contains key phosphorylation sites at Thr308 and Ser473 in the activation loop and hydrophobic motif, respectively, Ld-RAC/AKT-like protein has a Thr residue in both motifs. By domain sequence comparison, we classified AKT proteins from different origins in four major categories that included different parasites. Conclusions/Significance: Our data suggest that the herein reported Ld-RAC/AKT-like protein may represent a Leishmania ortholog of mammalian AKT, which by functional homology with its mammalian counterpart might be involved in parasite stress response and survival. Thus, this gene might become a new therapeutic target, and inhibition of this putative survival signaling could be a novel approach in antileishmanial drug discovery. The HSP90 inhibitor 17-AAG potentiates the antileishmanial activity of the ether lipid edelfosine Abstract HSP90 is an abundant protein in Leishmania parasites that plays a major role in the parasite survival under stress conditions. Here we found that the HSP90 inhibitor 17-AAG induced cell cycle arrest at G0/G1 in L. infantum and L. panamensis promastigotes, and highly potentiated the induction of cell death by an apoptotic-like process mediated by the ether phospholipid edelfosine. These data suggest that the combined treatment of 17-AAG and edelfosine might be a novel and effective approach of combination therapy in the treatment of leishmaniasis

[EN] Background: There are no systematic studies in our country to analyze the health of immigrant children so know the overall health situation in low-income immigrant children, with special emphasis on imported infections is the aim of this thesis. It was made by a general health screening and combining classic parasitological diagnostic tools and new diagnostic techniques and molecular immune. Objectives: 1. Assess the overall health of the population immigrant child seen in consultation for Tropical Medicine, University Hospital of Salamanca. 1.1. Assess nutritional status and dental. 1.2. To study the prevalence and causes of hematological and enzymatic changes frequently. 1.3. Meet childhood vaccination coverage established in the countries of origin. 1.4. Know the requirements to the combined vaccine vacunacionales HBV / HAV as the study population. 2. To evaluate the presence and specific characteristics of imported communicable infections in a group of immigrant children. 2.1. Study the prevalence of latent tuberculosis infection in children using methods Quantiferon TB Gold In Tube ®. 2.2. Studying the prevalence of diseases: syphilis, hepatitis B virus and hepatitis C virus, human T-lymphotropic virus type 1 and 2 and human immunodeficiency virus. 3. To assess the prevalence of parasitic infection imported in the same population. 3.1. Determine the prevalence of intestinal parasitic diseases by coprology. 3.2. To evaluate the presence of tissue parasitic infections using direct parasitological diagnostic tools, serological and / or molecular. April. To study the frequency and causes of eosinophilia in the study population. 4.1. Quantifying the prevalence and intensity of imported relative and absolute eosinophilia. 4.2. Evaluation of the most frequent causes of eosinophilia imported. 4.3. To determine the predictive values of imported eosinophilia and the presence of increased total IgE as markers of parasitic infection. Design: Prospective observational study of health screening including consecutive cases. Study Subjects: The study population comprised 18 children from low-income countries that were assessed in the query Tropical Diseases and Zoonoses Travel Medicine Endemic Infectious Unit, University Hospital of Salamanca from January 1, 2007 until July 1, 2011. Following the principles of the Declaration of Helsinki and the Belmont Report was obtained written informed consent for the study. Phases of the study. 1. Recruitment of subjects included in the different objectives of the study during the period of January 1, 2007 until July 1, 2011. 2. Conducting clinical protocol-analytic assessment of patients during the period of January 1, 2007 until July 1, 2011. 3. Obtaining blood and urine samples for different analyzes. 4. Preparation of serum and urine for conducting serological and molecular studies. 5. Obtaining samples for direct parasitological studies of blood, feces, urine and skin. 6.Analisis of results and publication, [ES] Antecedentes: No existen en nuestro país estudios sistemáticos que analicen el estado de salud de los menores inmigrantes por lo tanto conocer la situación general de salud en menores inmigrantes de renta baja, con especial énfasis en las infecciones importadas es el objetivo de esta tesis doctoral. Se realizara mediante un cribado de salud general y combinando herramientas de diagnóstico clásico parasitológico y nuevas técnicas de diagnóstico inmunológico y molecular. Objetivos: 1. Valorar el estado general de salud de la población menor inmigrante atendidos en la consulta de Medicina Tropical del Hospital Universitario de Salamanca. 1.1. Valorar el estado nutricional y odontológico. 1.2. Estudiar la prevalencia y causas de alteraciones hematológicas y enzimáticas más frecuentes. 1.3. Conocer la cobertura de vacunación infantil establecida en los países de procedencia. 1.4. Conocer las necesidades vacunacionales para la vacuna combinada VHB/VHA según la población de estudio. 2. Evaluar la presencia y características específicas de las infecciones importadas transmisibles en un colectivo de inmigrantes menores. 2.1. Estudiar la prevalencia de infección tuberculosa latente en menores utilizando métodos de Quantiferon TB Gold In Tube®. 2.2. Estudiar la prevalencia de enfermedades transmisibles: sifilis, virus de la hepatitis B y virus de la hepatitis C, virus T-linfotrópico humano tipo 1 y 2 y virus de la inmunodeficiencia humana. 3. Valorar la prevalencia de infecciones parasitarias importadas en la misma población. 3.1. Conocer la prevalencia de enfermedades parasitarias intestinales mediante coprología. 3.2. Evaluar la presencia de infecciones parasitarias tisulares utilizando herramientas de diagnóstico parasitológico directo, serológico y/o molecular. 4. Estudiar la frecuencia y causas de eosinofilia en la población de estudio. 4.1. Cuantificación de la prevalencia e intensidad de eosinofilia absoluta y relativa importada. 4.2. Evaluación de las causas mas frecuentes de eosinofilia importada. 4.3. Determinar los valores predictivos de la eosinofilia importada y la existencia de incremento de IgE total como marcadores de infección parasitaria. Diseño Estudio observacional prospectivo, de cribado de salud con inclusión consecutiva de casos. Sujetos de estudio La población de estudio está compuesta por los menores de 18 años procedentes de países de renta baja que se valoraron en la consulta de Enfermedades Tropicales, Medicina del Viajero y Zoonosis Endémicas de la Unidad de Infecciosas del Hospital Universitario de Salamanca desde 1 de enero de 2007 hasta 1 de julio de 2011. Siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki y del Informe Belmont se obtuvo consentimiento informado por escrito para la realización del estudio. Fases del estudio. 1. Reclutamiento de sujetos incluidos en los diferentes objetivos del estudio durante el periodo de 1 enero de 2007 hasta el 1 de Julio de 2011. 2. Realización del protocolo clínico-analítico de evaluación de los pacientes durante el periodo de 1 enero de 2007 hasta el 1 de Julio de 2011. 3. Obtención de muestras de sangre y orina para los diferentes análisis. 4. Obtención del suero y orina para la realización de estudios serológicos y moleculares. 5. Obtención de muestras para los estudios parasitológicos directos de sangre, heces, orina y piel. 6. Analisis de resultados y publicación.