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Las enfermedades hemotrópicas afectan animales que viven en zonas tropicales y subtropicales del mundo, debido a la presencia de vectores transmisores de los agentes, tales como garrapatas y moscas hematófagas. Dentro de este grupo de enfermedades se encuentran la anaplasmosis, tripanosomosis y babesiosis bovina, las cuales afectan negativamente las producciones ganaderas, por lo que el diagnóstico certero permite el control y tratamiento racional de estas enfermedades. En Ecuador, estas enfermedades han sido poco estudiadas, por lo que el objetivo del presente trabajo fue realizar una prospección sobre la presencia de estos hemotrópicos en la Provincia de Pastaza, para lo cual se evaluaron tres fincas ganaderas, ubicadas en la región Amazónica del Ecuador, Provincia de Pastaza, donde se realizó el diagnóstico de anaplasmosis y tripanosomosis por ELISAi y babesiosis mediante la prueba de PCR. En esta evaluación se obtuvo una prevalencia del 65,5 % de anticuerpos anti MSP5r de Anaplasma marginale; 31,03 % anti Trypanosoma spp. por ELISAi y 0 % para Babesia spp. por PCR. No se encontró ningún tipo de correlación de la presencia de anticuerpos (anti A. marginale o Trypanosoma spp.) con el hematocrito ni con las proteínas totales. Igualmente no se observó diferencias significativas de los anticuerpos anti MSP5r con la presencia o ausencia de garrapatas en las fincas. En conclusión, se puede señalar la elevada seroprevalencia de Trypanosoma spp. y A. marginale en la zona estudiada, por lo que resulta eminente el establecimiento de medidas de control. Otro aspecto importante, fue el haber encontrado fincas sin garrapatas con la presencia de anticuerpos de anti MSP5r, señalando la posible presencia de otros vectores en esta zona.

24 páginas, 6 figuras, 3 tablas, The dUTPase (Dut) enzymes, encoded by almost all free-living organisms and some viruses, prevent the misincorporation of uracil into DNA. We previously proposed that trimeric Duts are regulatory proteins involved in different cellular processes; including the phage-mediated transfer of the Staphylococcus aureus pathogenicity island SaPIbov1. Recently, it has been shown that the structurally unrelated dimeric Dut encoded by phage ϕNM1 is similarly able to mobilize SaPIbov1, suggesting dimeric Duts could also be regulatory proteins. How this is accomplished remains unsolved. Here, using in vivo, biochemical and structural approaches, we provide insights into the signaling mechanism used by the dimeric Duts to induce the SaPIbov1 cycle. As reported for the trimeric Duts, dimeric Duts contain an extremely variable region, here named domain VI, which is involved in the regulatory capacity of these enzymes. Remarkably, our results also show that the dimeric Dut signaling mechanism is modulated by dUTP, as with the trimeric Duts. Overall, our results demonstrate that although unrelated both in sequence and structure, dimeric and trimeric Duts control SaPI transfer by analogous mechanisms, representing a fascinating example of convergent evolution. This conserved mode of action highlights the biological significance of Duts as regulatory molecules., This work was supported by grants, BIO2013-42619-P and BIO2016-78571-P, from the Ministerio de Economia y Competitividad (Spain) and grant Prometeo II/2014/029 from Valencian Government (Spain) to AM, and grants MR/M003876/1 from the Medical Research Council (UK), BB/N002873/1, from the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, UK), and ERC-ADG-2014 Proposal n° 670932 Dut-signal from EU to JRP. EM was supported by CSIC JAE-Doc postdoctoral contract (Programa «Junta para la Ampliación de Estudios») co-funded by the European Social Fund. JRC and CA were supported by FPU13/02880 and FPI BES-2014-068617 predoctoral fellowships respectively. X-ray diffraction data collection was supported by Diamond Light Source block allocation group (BAG) Proposal, MX14739, and Spanish Synchrotron Radiation Facility ALBA Proposal 2016071762. The research leading to these results has received funding from the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under BioStruct-X, grant agreement N°283570. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Los probióticos se definen como microorganismos vivos que, cuando son administrados en adecuadas cantidades, confieren beneficios para la salud del huésped. Entre estos efectos beneficiosos figuran la reducción de los síntomas de mala digestión de la lactosa, reducción de hipercolesterolemia, disminución de la duración y gravedad de procesos diarreicos, mejora de la barrera de permeabilidad intestinal, prevención de algunos tipos de cáncer por adsorción o inactivación de agentes genotóxicos, incremento de la resistencia a infecciones intestinales y extraintestinales, atenuación de la enfermedad inflamatoria intestinal, y prevención de alergias (especialmente alimentarias). La cepa C4 de Lactobacillus plantarum ha sido aislada de kéfir y largamente estudiada en nuestro laboratorio por su potencial probiótico. En la presente memoria de tesis doctoral se describen nuevas actividades y propiedades que configuran el potencial probiótico de esta cepa. L. plantarum C4 resistió las condiciones de la digestión gastrointestinal simulada in vitro; en presencia del fructooligosacárido prebiótico FOS se prolongó la viabilidad de la bacteria que adquirió la capacidad de inhibir cepas de las bacterias patógenas intestinales Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium y Enterococcus faecalis. L. plantarum C4 ejerció antibiosis sobre Clostridium difficile y demostró capacidad para inactivar sus citotoxinas, efectos mediados por la producción de ácidos. Además, L. plantarum C4 inhibió de forma significativa la mutagenicidad del 2-nitrofluoreno sobre la cepa auxotrofa S. typhimurium TA98 en el ensayo de Ames, en condiciones en las que la viabilidad de C4 se vió abolida, lo que sugiere un mecanismo de adsorción que retira el mutágeno. Ensayos de inmunomodulación in vitro, sobre líneas celulares, e in vivo, en animales de experimentación, demostraron un excelente comportamiento de la cepa probiótica, que potenció mecanismos defensivos sin una contrapartida proinflamatoria en las condiciones basales, lo que se reflejó finalmente en un incrementos de la resistencia en el modelo de infección experimental del ratón por Y. enterocolitica. La discusión general de estos resultados pone de manifiesto que L. plantarum utiliza mecanismos directos (antibiosis, inactivación o adsorción de toxinas y de mutágenos) e indirectos (a través de la modulación de mecanismos inmunitarios) para producir los diversos efectos beneficiosos que se describen por primera vez en esta memoria., Tesis Univ. Granada. Programa Oficial de Doctorado en: Biología Fundamental y de Sistemas

Dental practice is regulated by biosafety methods, techniques and procedures; because one of the most important factors to be taken into account within the consultation is infection control. Orthodontic treatment aims to increase the quality of life of the patient by improving the function of the masticatory appliance and dentofacial aesthetics. This requires a correct treatment plan and the application and control of forces on the teeth through the use of mechanical devices and intraoral attachments. La práctica odontológica es regulada por métodos, técnicas y procedimientos de bioseguridad; debido a que uno de los factores de mayor importancia que se deben de tomar en cuenta dentro de la consulta es el control de infecciones. El tratamiento de ortodoncia tiene por objetivo aumentar la calidad de vida del paciente mediante la mejora de la función del aparato masticatorio y de la estética dentofacial para esto es necesario un correcto plan de tratamiento así como la aplicación y el control de fuerzas sobre los dientes mediante la utilización de dispositivos mecánicos y aditamentos intraorales.

Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous pathogen able to infect humans, animals, and plants. Chemotaxis was found to be associated with the virulence of this and other pathogens. Although established as a model for chemotaxis research, the majority of the 26 P. aeruginosa chemoreceptors remain functionally un-annotated. We report here the identification of PA5072 (named McpK) as chemoreceptor for α-ketoglutarate (αKG). High-throughput thermal shift assays and isothermal titration calorimetry studies (ITC) of the recombinant McpK ligand binding domain (LBD) showed that it recognizes exclusively α-ketoglutarate. The ITC analysis indicated that the ligand bound with positive cooperativity (Kd1 = 301 μM, Kd2 = 81 μM). McpK is predicted to possess a helical bimodular (HBM) type of LBD and this and other studies suggest that this domain type may be associated with the recognition of organic acids. Analytical ultracentrifugation (AUC) studies revealed that McpK-LBD is present in monomer-dimer equilibrium. Alpha-KG binding stabilized the dimer and dimer self-dissociation constants of 55 μM and 5.9 μM were derived for ligand-free and αKG-bound forms of McpK-LBD, respectively. Ligand-induced LBD dimer stabilization has been observed for other HBM domain containing receptors and may correspond to a general mechanism of this protein family. Quantitative capillary chemotaxis assays demonstrated that P. aeruginosa showed chemotaxis to a broad range of αKG concentrations with maximal responses at 500 μM. Deletion of the mcpK gene reduced chemotaxis over the entire concentration range to close to background levels and wild type like chemotaxis was recovered following complementation. Real-time PCR studies indicated that the presence of αKG does not modulate mcpK expression. Since αKG is present in plant root exudates it was investigated whether the deletion of mcpK altered maize root colonization. However, no significant changes with respect to the wild type strain were observed. The existence of a chemoreceptor specific for αKG may be due to its central metabolic role as well as to its function as signaling molecule. This work expands the range of known chemoreceptor types and underlines the important physiological role of chemotaxis toward tricarboxylic acid cycle intermediates. [EN], FEDER funds and Fondo Social Europeo through grants from the Junta de Andalucía (grant CVI-7335) and the Spanish Ministry for Economy and Competitiveness (grant BIO2013-42297). MM was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness Postdoctoral Research Program, Juan de la Cierva (JCI-2012-11815).

Los efectores (T3E) del sistema de secreción tipo III (T3SS) son factores de virulencia esenciales en la interacción de bacterias fitopatógenas con sus hospedadores, debido a que: (i) promueven la penetración y permanencia del patógeno en el tejido del hospedador, (ii) interfieren con las respuestas de defensa de las plantas y (iii) facilitan el acceso a los nutrientes, promoviendo la proliferación y el crecimiento del patógeno (Gohre and Robatzek, 2008). La secuenciación y análisis de los genomas de diferentes cepas pertenecientes al complejo Pseudomonas syringae, ha permitido identificar el catálogo de T3E hipotéticos de cada una de ellas, así como clasificarlos en más de 60 familias génicas que constituyen el pangenoma de este relevante complejo de bacterias fitopatógenas (http://www.pseudomonassyringae.org/) (Baltrus et al., 2011; Lindeberg et al., 2012). Aunque la función concreta de la mayoría de los T3E identificados hasta la fecha en la interferencia con los mecanismos de defensa de la planta es aún desconocida, durante los últimos años se han producido grandes avances en el conocimiento del papel de los T3E del complejo P. syringae durante la interacción con plantas herbáceas. Estudios recientes, han establecido a Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 como una cepa modelo en el estudio de la interacción de este complejo bacteriano con plantas leñosas (Ramos et al., 2012). El análisis bioinformático del borrador del genoma de esta cepa identificó 33 posibles T3E (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010; Ramos et al., 2012), cuya translocación a través del T3SS se demostró para 7 de ellos (AvrRpm2, HopA1, HopAA1, HopAZ1, HopBK1, HopBL1 y HopBL2) durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral (Matas et al., 2014). Además, la secuenciación de los tres plásmidos de esta cepa reveló que los genes codificantes de los T3E HopAF1 y HopAO1 se localizan en los plásmidos pPsv48A y pPsv48B, respectivamente, codificándose en el cromosoma un homólogo de HopAF1 (HopAF1-2). Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo principal que se planteó en esta Tesis Doctoral fue el análisis funcional de los T3E de NCPPB 3335, prestando mayor atención a las familias HopAF y HopAO. Para llevar a cabo este objetivo general, se plantearon los siguientes abordajes: 1) estudiar la distribución de los efectores de las familias HopAF y HopAO en los patovares de P. savastanoi y P. syringae, 2) analizar la translocación a través del T3SS de NCPPB 3335 y el papel en virulencia de los efectores de las familias HopAF y HopAO y, 3) analizar la interacción con los sistemas de defensa de la planta de los siete efectores de NCPPB 3335 cuya translocación a través del sistema de secreción tipo III ha sido demostrada, así como de los pertenecientes a las familias HopAF y HopAO. El análisis bioinformático y filogenético de las familias HopAF y HopAO permitió identificar que ambas se encuentran ampliamente distribuidas dentro del complejo P. syringae, si bien, P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 codifica dos genes de la familia hopAO (hopAO1 y hopAO2) y tres genes de la familia hopAF (dos copias del gen hopAF1 y una del gen hopAF1-2). La filogenia de esta última familia reveló que el alelo hopAF1 se codifica mayoritariamente en cepas patógenas de plantas leñosas. Análisis de translocación y transcripcionales validaron a los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 como nuevos T3E del secretoma del T3SS de NCPPB 3335. Por otra parte, en este trabajo hemos demostrado que tanto los T3E AvrRpm2, HopBK1, HopBL1, HopBL2, HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2, así como los efectores truncados HopAA1 y HopAZ1, interfieren con la respuesta de defensa primaria (PTI) de Nicotiana tabacum. Además, presentamos evidencias de que HopAZ1, HopBL1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 también inhiben la inmunidad mediada por efectores (ETI) en este mismo hospedador. Por otro lado, y utilizando fusiones traduccionales a la proteína verde fluorescente (GFP), hemos podido comprobar que los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 se localizan en la membrana plasmática de las células de Nicotiana benthamiana, así como que HopAO2 también se localiza en vesículas del aparato de Golgi. Con el fin de averiguar el papel de los T3E HopAF1 y HopAO1 en la virulencia de NCPPB 3335 se construyeron mutantes simples de los mismos. La deleción del gen hopAF1 del plásmido pPsv48A en NCPPB 3335 tuvo como consecuencia una ligera reducción en el tamaño de los tumores inducidos por este patógeno en plantas de olivo lignificadas, mientras que la deleción del gen hopAO1 conllevó una clara disminución de la virulencia del mismo. Los resultados incluidos en esta Tesis Doctoral, convierten a NCPPB 3335 en la cuarta cepa del complejo P. syringae cuyo secretoma del T3SS incluye un mayor número de T3E demostrados, y en la primera cepa aislada de un hospedador leñoso.

Programa Oficial de Doutoramento en Ciencias da Saúde. 5007V01, [Resumen] El patógenos oportunista Acinetobacter baumannii es uno de los seis microorganismos multirresistentes que más preocupa en hospitales de todo el mundo. Esto es debido a su capacidad para persistir en ambientes extremos, ya que es capaz de sobrevivir en el ambiente hospitalario, y a su versatilidad genética, ya que tiene la capacidad para desarrollar mecanismos de resistencia a antibióticos y desinfectantes. Múltiples brotes hospitalarios producidos por cepas de A. baumannii multirresistentes han sido descritos en todos los continentes. El presente trabajo aborda el estudio de uno de los brotes más importantes de la historia producido por varias cepas de A. baumannii multirresistentes, que surgió en el Hospital 12 de Octubre de Madrid, durante los años 2006‐2008 y que afectó a 377 pacientes. La presente tesis doctoral está dividida en cuatro capítulos: En el capítulo 1 se presenta el estudio la epidemiología clínica y molecular de un brote hospitalario causado por varias cepas de A. baumannii multirresistentes portadoras de la β‐ lactamasa OXA‐24. En el capítulo 2 se describe el estudio del posible mecanismo de diseminación de la β‐ lactamasa OXA‐24 entre las distintas cepas de un mismo brote hospitalario. Además, se describió por primera vez una cepa de A. calcoaceticus productora de la β‐lactamasa OXA‐24. En el capítulo 3 se describe el genoma completo del clon mayoritario del brote hospitalario, la cepa de A. baumannii AbH12O‐A2 (código de acceso a GenBank: CP009534.1) Finalmente, en el capítulo 4, se describe la implicación de un sistema de dos componentes, el sistema AbFhaB/AbFhaC, perteneciente al sistema de secreción tipo V, en adherencia a células epiteliales humanas y en virulencia., [Resumo] O patóxeno oportunista Acinetobacter baumannii é un dos seis microorganismos multirresistentes que máis preocupa nos hospitais de todo o mundo. Isto débese á súa capacidade para persistir en ambientes extremos, xa que ten a capacidade de sobrevivir no ambiente hospitalario, e á súa versatilidade xenética, xa que ten a capacidade para desenrolar mecanismos de resistencia a antibióticos e desinfectantes. Múltiples brotes hospitalarios producíronse por cepas de A. baumannii multirresistentes ao longo de tódolos continentes. A presente tese de doutoramento trata do estudo dun dos brotes máis longos da historia producido por varias cepas de A. baumannii multirresistentes, no Hospital 12 de Octubre de Madrid durante os anos 2006‐2008 e que afectou a 377 doentes. A presente tese doutoral divídese en catro capítulos: No capítulo 1, preséntase o estudo da epidemioloxía clínica e molecular dun brote hospitalario causado por varias cepas de A. baumannii multirresistentes portadoras da β‐ lactamasa OXA‐24. No capítulo 2, preséntase o estudo do posible mecanismo de diseminación da β‐ lactamasa OXA‐24 entre ás distintas cepas dun mesmo brote hospitalario. Ademáis, describiuse por primeira vez unha cepa de A. calcoaceticus productora desta β‐lactamasa OXA‐ 24. No capítulo 3, descríbese o xenoma completo do clon maioritario do brote hospitalario, a cepa de A. baumannii AbH12O‐A2 (código de acceso ao GenBank: CP009534.1) E, finalmente, no capítulo 4, descríbese a implicación dun sistema de dúas compoñentes, o sistema AbFhaB/AbFhaC, pertencente ao sistema de secreción tipo V, en adherencia a células epiteliais humanas e en virulencia., [Abstract] Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen belonging to the six multirresistant organisms of greatest concern in hospitals worldwide. This fact is due to its ability to persist in adverse environments being able to survive in the hospital settings, and to its genetic versatility, being able to develop resistance mechanisms to antibiotics and disinfectants. Multiple hospital outbreaks caused by multidrug‐resistant strains of A. baumannii have been described in all continents. This work is focused in the study of the largest outbreak produced by various multidrug‐resistant A. baumannii strains, which has emerged in the Hospital 12 de Octubre, Madrid, Spain, affecting 377 patients during the years 2006‐2008. The present work is divided into four chapters: In chapter 1, we studied the clinical and molecular epidemiology of the above mentioned hospital outbreak caused by various multidrug‐resistant A. baumannii strains harboring the β‐lactamase OXA‐24. In chapter 2, we described the possible spread mechanism for the β‐lactamase OXA‐24 among different strains during the hospital outbreak. Furthermore, the first A. calcoaceticus strain producing the β‐lactamase OXA‐24 was described. In chapter 3, we described the complete genome of the A. baumannii AbH12O‐A2 strain (GenBank accession code: CP009534.1), the main clone found in during the hospital outbreak. Finally, in Chapter 4, we studied the involvement of a two component system, AbFhaB/AbFhaC, belonging to the type V secretion system, in adherence to human epithelial cells and virulence.

[Resumen] La multirresistencia bacteriana constituye una amenaza para la humanidad debido a la falta de opciones terapéuticas; el desarrollo de vacunas para prevenir las enfermedades bacterianas es una prioridad en salud pública y veterinaria. Las vacunas vivas son eficientes, induciendo una respuesta inmunitaria humoral y celular. Sin embargo, pocas están licenciadas debido a la inexistencia de mecanismos universales de atenuación de la virulencia. La síntesis de D-glutamato es un mecanismo conservado en las bacterias y esencial para la formación del peptidoglicano. Aquí se describe una plataforma tecnológica para la obtención de vacunas bacterianas vivas auxótrofas para D-glutamato, que se aplicó con éxito contra los patógenos multirresistentes Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Cuando administradas in vivo, las cepas vacunales mostraron atenuación de la virulencia y un crecimiento autolimitado, sin causar enfermedad. Además, desencadenaron la producción de anticuerpos con reactividades específicas y cruzadas y la liberación de citoquinas. Estas vacunas demostraron una eficacia protectora en ratones de 80-100% frente a clones multirresistentes, virulentos y de alto riesgo, como A. baumannii AbH12O-A2, Ab307-0294, P. aeruginosa PA14 y S. aureus USA300LAC. Esta estrategia innovadora puede solucionar las dificultades de atenuación de la virulencia bacteriana, representando una nueva generación de vacunas eficaces y seguras., [Abstract] Multidrug resistance in bacteria is a major threat to humanity due to the lack of therapeutic options; thus, vaccine development is a priority for global human and animal health. Bacterial live vaccines induce antibody- and cell-mediated immunity and result in efficient immunizations, however, only few are licensed and there is no universal strategy for attenuation. D-glutamate synthesis is a universal key step in bacterial cell wall formation. Here we present a strategic platform for generating effective bacterial whole-cell vaccines auxotrophic for D-glutamate. This strategy was successfully applied to generate three independent vaccines against the major multidrug-resistant pathogens, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. These vaccine strains showed virulence attenuation and self-limited growth in vivo without risk of disease. Immunization with these whole-cell vaccines elicited high levels of specific and cross-reactive antibodies and stimulated cytokine secretion. Furthermore, immune responses correlated with 80-100% mice protection against the genetically unrelated, multidrug-resistant, virulent and high-risk clones A. baumannii AbH12O-A2, Ab307-0294, P. aeruginosa PA14, and S. aureus USA300LAC using an acute lethal infection model. This innovative approach overcomes the classical difficulties so far encountered in obtaining virulence attenuation and represents a new generation of effective, safe and universal bacterial vaccines for the future., [Resumo] A multirresistencia bacteriana é unha ameaza para a humanidade debido á falta de opcións terapéuticas; o desenvolvemento de vacinas para prever as enfermidades bacterianas é unha prioridade na saúde pública e veterinaria. As vacinas vivas son eficientes, inducindo respostas inmunes de tipo humoral e celular. Con todo, só unhas poucas están licenciadas debido a inexistencia de mecanismos universais de atenuación da virulencia. A síntese de D-glutamato é un mecanismo conservado nas bacterias e é esencial para a formación do peptidoglicano. Aquí se describe unha plataforma tecnolóxica para a produción de vacinas bacterianas vivas auxótrofas para D-glutamato, o cal foi aplicado con éxito contra os patóxenos multirresistentes Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Cando foron administradas in vivo, as cepas das vacinas presentaron atenuación da virulencia e un crecemento auto-limitado, sen causar enfermidade. Ademais, desencadearon a produción de anticorpos específicos e con reactividades cruzadas e a liberación de citocinas. Estas vacinas demostraron unha eficacia protectora nos ratos de 80-100% contra clons multirresistentes, virulentos e de alto risco, como A. baumannii AbH12O-A2, Ab307- 0294, P. aeruginosa PA14 y S. aureus USA300LAC. Esta estratexia innovadora pode resolver os problemas de atenuación da virulencia bacteriana, representando unha nova xeración de vacinas eficaces e seguras.

Inorganic phosphate (Pi) is a central signaling molecule that modulates virulence in various pathogens. In Pseudomonas aeruginosa, low Pi concentrations induce transcriptional alterations that increase virulence. Also, under low Pi levels, P. aeruginosa exhibits Pi chemotaxis—a process mediated by the two non-paralogous receptors CtpH and CtpL. Here we show that the two receptors operate via different mechanisms. We demonstrate that the ligand binding domain (LBD) of CtpH but not CtpL binds Pi directly. We identify the periplasmic ligand binding protein PstS as the protein that binds in its Pi loaded state to CtpL, resulting in receptor stimulation. PstS forms part of the Pi transporter and has thus a double function in Pi transport and chemotaxis. The affinity of Pi for CtpH was modest whereas that for PstS very high, which may explain why CtpH and CtpL mediate chemotaxis to high and low Pi concentrations, respectively. The pstS/ctpH double mutant was almost devoid of Pi taxis, indicating that PstS is the only CtpL Pi-shuttle. Chemotaxis mechanisms based on indirect ligand recognition were unambiguously identified in enterobacteria. The discovery of a similar mechanism in a different bacterial order, involving a different chemoreceptor type and chemoeffector suggests that such systems are widespread. [EN], We acknowledge financial support from FEDER funds and Fondo Social Europeo through grants from the Junta de Andalucía (grant CVI-7335 to T.K.) and the Spanish Ministry for Economy and Competitiveness (grants BIO2013-42297 to T.K.). Work at the University of Murcia was funded by grant CTQ-2012-33717 from Ministerio de Economía y Competitividad, co-financed by the European Union (FEDER), a grant from Grupos de Excelencia de la Region de Murcia 04531/GERM/06, and a FPI-MICINN fellowship to A.I.D. A.O. acknowledges a CSIC JAE-Doc contract co-funded by the European Social Fund.

13 páginas, 5 figuras, 3 tablas, material suplementario en NAR online, We have recently proposed that the trimeric staphylococcal phage encoded dUTPases (Duts) are signaling molecules that act analogously to eukaryotic G-proteins, using dUTP as a second messenger. To perform this regulatory role, the Duts require their characteristic extra motif VI, present in all the staphylococcal phage coded trimeric Duts, as well as the strongly conserved Dut motif V. Recently, however, an alternative model involving Duts in the transfer of the staphylococcal islands (SaPIs) has been suggested, questioning the implication of motifs V and VI. Here, using state-of the-art techniques, we have revisited the proposed models. Our results confirm that the mechanism by which the Duts derepress the SaPI cycle depends on dUTP and involves both motifs V and VI, as we have previously proposed. Surprisingly, the conserved Dut motif IV is also implicated in SaPI derepression. However, and in agreement with the proposed alternative model, the dUTP inhibits rather than inducing the process, as we had initially proposed. In summary, our results clarify, validate and establish the mechanism by which the Duts perform regulatory functions., Ministerio de Economia y Competitividad (Spain) [BIO2013-42619-P to A.M.]; Medical Research Council (UK) [MR/M003876/1]; ERC-ADG-2014 Dut-signal (from EU) [Proposal no 670932 to J.R.P]; CSIC JAE-Doc Postdoctoral contract (Programa «Junta para la Ampliación de Estudios»), European Social Fund (to E.M.); FPU13/02880 (to J.R.C.), FPI BES-2014-068617 Predoctoral Fellowships (to C.A.). Diamond Light Source block allocation group (BAG) Proposal [MX10121]; Spanish Synchrotron Radiation Facility ALBA Proposal [2014060897]; European Community's Seventh Framework Programme [FP7/2007-2013]; BioStruct-X [283570]. Funding for open access charge: Ministerio de Economia y Competitividad (Spain) [BIO2013-42619-P to A.M.]; Medical Research Council (UK) [MR/M003876/1]; ERC-ADG-2014 Dut-signal (from EU) [Proposal no 670932 to J.R.P].

[spa] El género Salmonella, está compuesto de bacterias Gram-negativas, no esporuladas, en forma de bacilo. Salmonella tiene importante relevancia a nivel de salud pública ya que es uno de los principales patógenos entéricos tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. En los casos de gastroenteritis notificados en España, Salmonella se posiciona en segundo lugar, después de Campylobacter. En este trabajo se utilizó como organismo modelo de estudio S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), que en humanos causa salmonelosis, gastroenteritis caracterizada por diarrea inflamatoria, originada normalmente tras la ingestión de alimentos o agua contaminados. Los genes de virulencia de S. Typhimurium están localizados mayoritariamente dentro de islas de patogenicidad (SPI). Los genes codificados en la SPI-1 promueben la invasión de células eucariotas, la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 está mediada por HiIA codificada en el gen, hilA, presente en la misma SPI-1. HiIA activa la expresión de los genes que codifican para la síntesis de un sistema de secreción de tipo 3 (T3SS) encargado de secretar e inyectar proteínas efectoras dentro de la célula hospedadora. La expresión de hilA se encuentra bajo el control de unl bucle de regulación, comprendido por las proteínas HiID, HiIC y RtsA. HiID es el regulador predominante de este sistema, mientras que HiIC y RtsA se encargan de amplificar la señal de activación. Por su parte, los genes que contiene la SPI-2, están implicados en causar infecciones sistémicas y la proliferación intracelular de la bacteria. Los factores Gre son factores que regulan la elongación de la transcripción génica en procariotas. Son conocidos por promover la actividad endorribonucleotídica de la ARN polimerasa (ARNpol) cuando ésta se encuentra en un estado de pausa por retroceso causado durante la elongación de la transcripción. A pesar de que los factores Gre han sido bien caracterizados en otras enterobacterias como Escherichia coli, en Salmonella no existen estudios que describan el papel de los factores Gre en la fisiología celular. Así, el objetivo principal de esta tesis doctoral fue estudiar el papel de los factores Gre en la fisiología y patogenicidad de Salmonella. En este estudio describimos que los factores Gre forman parte de la compleja red reguladora de la expresión de los genes de la SPI-1 y SPI-2 de Salmonella. Los resultados obtenidos indican que los factores Gre de Salmonella son esenciales para la correcta expresión de las proteínas efectoras codificadas dentro de la SPI-1 (SipA, SipC y SipD) y fuera de ella (SopE), y que también juegan un papel importante en la motilidad de la célula bacteriana, fenotipos predominantes en la patogenicidad. Se pudo determinar que la regulación de la expresión de los genes de la SPI-1 y la SPI-2 por parte de los factores Gre, es a través de la regulación transcripcional del gen hilD. La regulación mediada por los factores Gre requiere de la región 3'UTR del gen hilD. Además demostramos que la actividad antipausa de la transcripción de los factores Gre es necesaria para la correcta expresi formación de biofilm en Salmonella. Esta regulación al parecer también es ejercida en una región UTR, en este caso en la región 5’UTR del gen csgD, y es independiente de la temperatura. En análisis transcriptómicos mediante la técnica de microarrays, se observó que los factores Gre de Salmonella estarían implicados en la correcta expresión de muchos de los genes adquiridos horizontalmente (HGT) como son los genes presentes en las islas de patogenicidad, plásmidos y fagos. También se observó que existe un elevado número de genes distribuidos en diferentes categorías funcionales, que son corregulados por los factores Gre en conjunto con la proteína DksA, proteína que incrementa la fidelidad de la transcripción al disminuir la tasa de incorporación incorrecta de nucleótidos. Estos resultados indican que el patrón general de expresión génica de Salmonella es el resultado de una compleja interacción entre los factores Gre y la proteína DksA, que implica el control mutuo, competición por la unión a la ARNpol, y la acción similar u opuesta sobre la actividad de la ARNpol. Con los resultados presentados en esta tesis doctoral se puede concluir que los factores Gre forman parte de la compleja red de regulación de los genes de virulencia de Salmonella.ón de hilD., [eng] Gre factors regulate gene transcription elongation in prokaryotes. In Escherichia coli they promote cleavage of the nascent RNA transcript within the elongation complex when the RNA polymerase is paused by a backtracking. Although the Gre factors have been characterized in other enterobacteria, in Salmonella there are not studies about their role in cellular physiology. The main objective of this thesis was to study the role of Gre factors in physiology and pathogenicity of Salmonella. In this study we describe Gre factors that are part of the complex regulatory network of gene expression of Salmonella pathogenicity island-1 (SPI-1) and SPI-2. The results indicate that Gre factors are pivotal in the control of predominant phenotypes in pathogenicity. They are essential for the correct expression of effector proteins encoded within (SipA, SipC and SipD) and outside SPI-1 (SopE), and they also play an important role in motility of the bacterial cell. It was determined that the regulation of gene expression of SPI-1 and SPI-2 by Gre factors is through transcriptional regulation of hilD gene. Regulation mediated by Gre factors requires hilD 3'UTR region. We demonstrated that Gre antipausa activity during transcription is necessary for the correct expression of hilD. It was also observed that Gre factors play an important role in transcriptional expression of csgD, main regulator of biofilm formation in Salmonella. This regulation is also apparently exerted through the 5'UTR region of the csgD gene, and is temperature- independent. In transcriptome analysis using Microarray, it was observed that Gre factors are implicated in the correct expression of many horizontally transferred genes (HGT) such as genes present in pathogenicity islands, plasmids and phages. It was also noted that there is a large number of genes distributed into different functional categories, which are co-regulated by Gre factors together with DksA protein, a protein that increases the accuracy of the transcript to decrease the rate of nucleotide missincorporation. These results indicate that the overall pattern of gene expression of Salmonella is the result of a complex interaction between Gre factors and DksA protein, involving the mutual control, competition for binding to ARNpol, and similar or opposite action on ARNpol activity. We can conclude that Gre factors are part of complex regulatory network of virulence genes of Salmonella.

Recientemente se ha reconocido la patogenicidad de Aeromonas en cuadros gastrointestinales del hombre y de los animales (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010). Se han publicado nuevos estudios que amplían el conocimiento de su taxonomía, los factores asociados a su virulencia, así como también, la frecuencia de su resistencia a los antibióticos, especialmente en las especies causantes de infecciones graves como Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae y Aeromonas veronii subsp. sobria (Albarral 2013; Ghenghesh et al., 2014; Fatima et al., 2013). Se han aislado causando procesos infecciosos graves como bacteriemias, heridas, endocarditis, meningitis y neumonías (Tequianez et al., 2005; Rodríguez et al., 2005; Fátima et al., 2013; Grim et al., 2013). Existen diferentes factores de virulencia, principalmente citotoxinas, enterotoxinas, hemolisinas, proteasas, gelatinasas, ADNasas y otros que pueden determinar su patogenicidad (Ghenghesh et al., 2014; Grim et al., 2013). En el medio ambiente, Aeromonas es muy ubicua y está ligada al ambiente acuático. Los datos epidemiológicos sugieren fuertemente que muchas de las infecciones son adquiridas a través del consumo de agua y/o alimentos contaminados (Chopra y Houston, 1999; Janda et al., 2010; Carvalho et al., 2012), aunque por el momento no se han descrito los linajes predominantes en ambos ecosistemas. La Hipótesis de esta Tesis Doctoral fue que los aislados de Aeromonas de muestras clínicas humanas que producen cuadros invasivos, poseen factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad distintos a las muestras medioambientales, y además corresponden a linajes genéticos diferentes. Nuestro Objetivo General fue caracterizar fenotípica y genotípicamente una colección de cepas de Aeromonas de distintos orígenes en relación con su patogenicidad. Para llevar a cabo este estudio se realizó en primer lugar un estudio retrospectivo de la prevalencia y su evolución en el tiempo (1996-2014) de Aeromonas en muestras clínicas del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid. También se creó una colección de 40 cepas de diferentes orígenes [ambientales del Río Loa, Antofagasta en Chile (n=6), aguas residuales de Túnez (n=5), diarrea (n=19), bacteriemia (n=9), y neumonía (n=1)] y se les realizó diferentes análisis fenotípicos, bioquímicos y moleculares. En todas las cepas se determinó la sensibilidad a antibióticos, la presencia de factores de virulencia y su diversidad clonal mediante electroforesis en campo de pulso. Posteriormente, 15 cepas seleccionadas fueron tipadas mediante MultiLocus Sequence Typing (MLST) y en ellas también se estudió la variabilidad de la estructura de su lipopolisacárido. Finalmente en 6 cepas se analizó su adherencia a la línea celular Caco-2 y su capacidad de invasión. Los resultados mostraron que A. hydrophila (84%) es la especie más prevalente en nuestras muestras clínicas seguida por A. caviae (12%). El número de muestras con Aeromonas se ha duplicado desde 1996 hasta 2014, siendo las heces la muestra mayoritaria con diferencia. Dentro de nuestra colección de 40 cepas, no se evidenció resistencia a los antibióticos y las cepas clínicas portaban mayor número de genes de virulencia, en comparación que las ambientales. Los estudios de campo pulsado mostraron una gran diversidad genética y las 15 tipadas mediante MLST se correspondieron con STs no descritas. La estructura del LPS fue cepa-dependiente, correspondiéndose las estructuras más complejas con las cepas de origen clínico. A pesar de su origen invasivo, nuestras cepas no presentan capacidad para invadir e internalizarse dentro de las células Caco2 diferenciadas a mucosa intestinal. Finalmente, y a modo de conclusión general, podemos que al igual que ocurre en otros microorganismos, la virulencia y patogenicidad debe ser demostrada a nivel de cada cepa, ya que no se puede generalizar dentro de una misma especie, y que el estado inmunológico del huésped también juega un relevante papel en la infección por Aeromonas., In the last years, several studies demonstrating the pathogenicity of the Aeromonas genera, their taxonomic updates, their virulence factors and their antimicrobial resistance profile. Aeromonas are very ubiquitous in the environment and it is linked to aquatic ecosystems. The epidemiology strongly suggests that infections are a consequence of the contact with contaminated water and/or food. In spite of this, the predominant lineages linked to human infections have not been described. Our Hypothesis was that clinical human strains possess different virulence factors than those from environmental origin, and corresponds with different genetic lineages. The Aim was to characterize an Aeromonas collection from different origins. First, we realized a retrospective study between 1996-2014 of the Aeromonas clinical strains collected at the University Hospital Ramon and Cajal. Second, we collected 40 strains of different origins [Rio Loa, Antofagasta in Chile (n=6), waste water of Tunis (n=5), diarrhoea (n=19), bacteraemia (n=9), and pneumonia (n=1)]. All strains were identify and we determine their virulence factors, their antibiotics susceptibility and their genetic diversity by PFGE. Furthermore, 15 selected strains were typed by MLST and also analyzed the lipopolysaccharide. Finally, the adherence/invasion ability of 6 strains to Caco-2 was evaluated. The results showed that A. hydrophila (84 %) is the more prevalent specie in our clinical samples followed for A. caviae (12 %). Their frequency has doubled from 1996 to 2014, being the faeces the most frequent sample. Inside our collection of 40 strains, antibiotic resistance was not observed and the clinical strains carried more virulence genes than the environmental ones. The PFGE studies showed a great genetic diversity and the 15 MLST-typed strains corresponded with not previously described STs. The lipopolysaccharide structure was strain dependent, and the most complex structures correspond to clinical isolates. Our strains were unable to invade the Caco2 cells differentiated to mucous intestinal. Finally, and as general conclusion, the virulence and pathogencity might be studied to level for each strain individually, since it is not possible to generalize inside the same species. In addition, the immunological condition of the patients also might play a relevant role in the Aeromonas infection.

Summary Phage-inducible chromosomal islands (PICIs) represent a novel and universal class of mobile genetic elements, which have broad impact on bacterial virulence. In spite of their relevance, how the Gram-negative PICIs hijack the phage machinery for their own specific packaging and how they block phage reproduction remains to be determined. Using genetic and structural analyses, we solve the mystery here by showing that the Gram-negative PICIs encode a protein that simultaneously performs these processes. This protein, which we have named Rpp (for redirecting phage packaging), interacts with the phage terminase small subunit, forming a heterocomplex. This complex is unable to recognize the phage DNA, blocking phage packaging, but specifically binds to the PICI genome, promoting PICI packaging. Our studies reveal the mechanism of action that allows PICI dissemination in nature, introducing a new paradigm in the understanding of the biology of pathogenicity islands and therefore of bacterial pathogen evolution., Graphical Abstract, Highlights • PICI Rpp protein promotes PICI transfer while blocking phage reproduction • Rpp forms a heterocomplex with helper phage TerS • Crystal structures of Rpp alone or complexed with TerS were determined • TerS complexed with Rpp switches specificity from the phage DNA to the PICI genome, Fillol-Salom et al. report that Gram-negative PICIs employ the Rpp protein to block helper phage reproduction. Rpp binds to helper phage TerS, and the Rpp-TerS heterocomplex enables PICIs to hijack the phage machinery for their own packaging. These findings reveal a mechanism used by Gram-negative PICIs to spread in nature.

Pseudomonas putida are ubiquitous inhabitants of soils and clinical isolates of this species have been seldom described. Clinical isolates show significant variability in their ability to cause damage to hosts because some of them are able to modulate the host’s immune response. In the current study, comparisons between the genomes of different clinical and environmental strains of P. putida were done to identify genetic clusters shared by clinical isolates that are not present in environmental isolates. We show that in clinical strains specific genes are mostly present on transposons, and that this set of genes exhibit high identity with genes found in pathogens and opportunistic pathogens. The set of genes prevalent in P. putida clinical isolates, and absent in environmental isolates, are related with survival under oxidative stress conditions, resistance against biocides, amino acid metabolism and toxin/antitoxin (TA) systems. This set of functions have influence in colonization and survival within human tissues, since they avoid host immune response or enhance stress resistance. An in depth bioinformatic analysis was also carried out to identify genetic clusters that are exclusive to each of the clinical isolates and that correlate with phenotypical differences between them, a secretion system type III-like was found in one of these clinical strains, a determinant of pathogenicity in Gram-negative bacteria., Work in the authors’ laboratories was supported by ERANET Pathogenomics programme through the ADHERS project (Ref: BIO2008-04419-E) and Fondos FEDER from the European Union through project BIO2010-17227 of the Ministry of Economy and Competitivity of Spain. Bio-Iliberis R&D provided support

Pseudomonas syringae is a model bacterial pathogen that penetrates the leaf to reach the plant apoplast, where it replicates causing disease. In order to do that, the pathogen must interfere and suppress a two-tiered plant defense response: PTI (PAMP-Triggered Immunity, or basal resistance) and ETI (Effector-Triggered Immunity). P. syringae uses a type III secretion system to directly deliver effector proteins inside the plant cell cytosol, many of which are known to suppress PTI, some of which are known to trigger ETI, and a handful of which are known to suppress ETI. Bacterial infection can also trigger a systemic plant defense response that protects the plant against additional pathogen attacks known as SAR (Systemic Acquired Resistance). We are particularly interested in the molecular and cellular mechanisms involved in effector-mediated defense evasion by P. syringae, in particular those involved in the suppression of ETI and SAR, and/or mediation of hormone signaling. Here we present data describing effector-mediated interference with plant immunity, by means of acetylation of a key positive regulator of local and systemic responses. Our work identifies a novel plant target for effector function, and characterizes its function. This work illustrates how analyzing the means by which a given effector interferes with its target can provide novel information regarding eukaryotic molecular mechanisms. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. MINECO BIO2015-64391R y FEDER

Microbe associated molecular pattern (MAMP) receptors in plants recognize MAMPs and activate basal defences; however a complete understanding of the molecular and physiological mechanisms conferring immunity remains elusive. Pathogens suppress active defence in plants through the combined action of effector proteins. This talk presents results showing the chloroplast as a key component of early immune responses. MAMP perception triggers the rapid, large-scale suppression of nuclear encoded chloroplast-targeted genes (NECGs). Virulent Pseudomonas syringae effectors reprogramme NECG expression in Arabidopsis, target the chloroplast and inhibit photosynthetic CO2 assimilation through disruption of photosystem II. This activity prevents a chloroplastic reactive oxygen burst. These physiological changes precede bacterial multiplication and coincide with pathogen-induced abscisic acid (ABA) accumulation. MAMP pretreatment protects chloroplasts from effector manipulation, whereas application of ABA or the inhibitor of photosynthetic electron transport, DCMU, abolishes the MAMP-induced chloroplastic reactive oxygen burst, and enhances growth of a P. syringae hrpA mutant that fails to secrete effectors. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Two main types of noncoding small RNA molecules have been found in plants: microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs). They differ in their biogenesis and mode of action, but share similar sizes (20-24 nt). Their precursors are processed by Dicer-Like RNase III (dcl) proteins present in Arabidopsis thaliana, and in their mature form can act as negative regulators of gene expression, being involved in a vast array of plant processes, including plant development, genomic integrity or response to stress. Small-RNA mediated regulation can occurs at transcriptional level (TGS) or at post-transcriptional level (PTGS). In recent years, the role of gene silencing in the regulation of expression of genes related to plant defence responses against bacterial pathogens is becoming clearer. Comparisons carried out in our lab between the expression profiles of different mutants affected in gene silencing, and plants challenged with Pseudomonas syringae pathovar tomato DC3000, led us to identify a set of uncharacterized R genes, belonging to the TIR-NBS-LRR gene family, differentially expressed in these conditions. Through the use of bioinformatics tools, we found a miRNA* of 22 nt putatively responsible for down-regulating expression of these R genes through the generation of siRNAs. We have also found that the corresponding pri-miRNA is down-regulated after PAMP-perception in a SA-dependent manner. We also demonstrate that plants with altered levels of miRNA* (knockdown lines or overexpression lines) exhibit altered PTI-associated phenotypes, suggesting a role for this miRNA* in this defence response against bacteria. In addition we identify one of the target genes as a negative regulator of defence response against Pseudomonas syringae. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. MINECO, FEDER

The marine fish pathogen Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) is responsible for important disease outbreaks affecting several fish species including flatfish Solea senegalensis (Kaup). Phdp is able to avoid host defences by invasion and intracellular survival in non-phagocytic cells, mainly epithelial cells. Virulence factors reported in Phdp include restricting complement-mediated activity, apoptosis of phagocytes caused by exotoxins secretion, iron acquisition mechanisms such as siderophores that enable the pathogen to obtain iron from transferrin and ability to bind haemin and antioxidant enzymatic activities capable to counteract superoxide radicals (Do Vale et al., 2005; Andreoni and Magnano, 2014). Commonly, genes expressed during pathogen infection are important for pathogenicity. In vivo-induced antigen technology (IVIAT) (Handfield et al., 2000) has been used to identify in vivo-induced genes using pooled sera from fish that have experienced photobacteriosis. Materials and methods Sera were obtained from surviving S. senegalensis specimens after sublethal infection with Phdp (Lg41/01) and subsequently pooled and adsorbed against in vitro grown Phdp Lg41/01 and Escherichia coli BL21 (DE3) cells and lysates according to Handfield et al. (2000). The efficiency of sera adsorption was evaluated based on the immunoreactivity after each adsorption step with whole and lysed Phdp cells grown in vitro. A genomic expression library of Phdp Lg41/01 was generated in E. coli BL21 (DE3) using pET-30 expression system (Novagen, San Diego, CA, USA). The expression library was probed with adsorbed and non-absorbed sera using immunoblot technique. Reactive clones of in vivo-induced and in vitro antigens were obtained, purified and their inserted DNA sequenced (Macrogen Europe, Amsterdam, The Netherlands). Nucleotide sequences were compared against the NCBI protein database using BLASTx. Results A progressive reduction in sera immunoreactivity against in vitro grown Phdp cells was detected after the adsorption rounds, especially after the first adsorption step. Thus, following adsorption steps substantially removed antibodies against in vitro expressed antigens and resulted in relative enrichment in antibodies recognizing in vivo expressed antigens. The library from Phdp Lg14/01 constructed in E. coli BL21 (DE3) consisted of approximately 6500 recombinants. A total of 117 clones were selected for their reactivity with pooled adsorbed and non-adsorbed sera from convalescent S. senegalensis specimens after a first round of screening. In a second screening, 14 out of 117 candidate clones showed positive reaction, among which two clones were clearly positive and two gave weak reaction against adsorbed sera. Predicted proteins codified by inserted sequences have intracellular and membrane cell location and are involved in virulence, synthesis of intermediary products, energy metabolism and gene replication. Inosine-5’-monophosphate dehydrogenase (IMPDH) and alkyl hydroperoxide reductase (AhpC) have been identified as in vivo induced antigens expressed during S. senegalensis infection with Phdp. Iron/manganese superoxide dismutase (Fe/Mn-SOD) and alanyl-tRNA synthetase (AlaRS) proteins have also been identified, though with weak signal. Discussion and conclusion Identification of immunogenic bacterial proteins during Phdp infection is essential for understanding bacterial pathogenesis and development of effective vaccines. AhpC peroxidase activity has a protective role by reducing hydrogen peroxide, peroxynitrite and organic hydroperoxides. Immunization with AhpC conferred protection against Helicobacter pylori infection (O’Riordan et al., 2012). IMPDH catalyzes the conversion of products essential in de novo synthesis of guanine nucleotides. Adequate levels of purine nucleotides are critical for cell proliferation, nucleic acid replication, cell signaling and as a biochemical energy source. This gene is an important therapeutic target against bacterial diseases (Shu and Nair,2008). In conclusion, different genes expressed during Phdp infection in S. senegalensis have been identified. Among them, IMPDH and AhpC have been identified as in vivo induced antigens expressed during S. senegalensis infection with Phdp. Thus, they are likely to play a role in the virulence of Phdp. The antigenic character of these proteins makes them potential targets for the development of new vaccines. References Andreoni, F., and Magnani, M., 2014. Photobacteriosis: Prevention and Diagnosis. Journal of Immunology Research, 2014: 1-7. Do Vale, A., Silva, M.T., dos Santos, N.M., Nascimento, D.S., Reis Rodrigues, P., Costa Ramos, C., Ellis, A.E., and Azevedo, J.E., 2005. AIP56, a novel plasmid-encoded virulence factor of Photobacterium damselae subsp. piscicida with apoptogenic activity against sea bass macrophages and neutrophils. Molecular Microbiology, 58: 1025-1038. Handfield, M., Brady, L.J., Progulske-Fox, A., and Hillman, J.D., 2000. IVIAT: a novel method to identify microbial genes expressed specifically during human infections. Trends in Microbiology, 8: 336-339. O’Riordan A.A., Morales V.A., Mulligan L., Faheem N., Windle H.J., and Kelleher D.P., 2012. Alkyl hydroperoxide reductase: a candidate Helicobacter pylori vaccine. Vaccine, 30:3876-3884. Shu, Q., and Nair, V., 2008. Inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) as a target in drug discovery. Medicinal Research Reviews, 28:219-232. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Programa Oficial de Doutoramento en Química Ambiental e Fundamental. 5031V01, [Resumo] A continuación preséntase o resumo de cada un dos capítulos que fan parte desta tese doutoral. Capítulo I: Nesta sección descríbese a importancia da acuicultura a nivel mundial e as enfermidades causadas polas bacterias patóxenas que producen grandes perdas económicas a esta industria. Do mesmo modo, abórdase o tratamento destas enfermidades e a posibilidade de usar os mecanismos de captación de ferro para desenvolver novas vacinas e antimicrobiáns. Por último, preséntanse as estratexias para a expresión heteróloga de proteínas de membrana, a súa purificación e cristalización. Capítulo II: Realizouse a clonaxe, a expresión e purificación de FrpA, proteína receptora da piscibactina, sideróforo de Photobacterium damselae subsp. piscicida. A proteína obtida utilizouse en ensaios de vacinación lográndose protección nos peixes tratados. Ademáis, mediante cristalografía de Raios X realizouse unha aproximación á estrutura tridimensional de FrpA. Por outra parte, preparáronse intermedios avanzados que permitiron progresar na síntese total da piscibactina. Capítulo III: Estudáronse os sideróforos producidos por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. En primeiro lugar illáronse, purificáronse e caracterizáronse as amonabactinas Amo P 693 e Amo P 750. Posteriormente, mediante espectrometría de masas, identificáronse os complexos de Fe(III) e Ga(III) das amonabactinas Amo T 732, Amo T 789, Amo P 693 e Amo P 750. Por outra parte, realizouse a clonaxe, a expresión e purificación de FstA, proteína receptora de sideróforos desta bacteria., [Resumen] A continuación se presenta el resumen de cada uno de los capítulos que hacen parte de esta tesis doctoral. Capítulo I: En esta sección se describe la importancia de la acuicultura a nivel mundial y las enfermedades causadas por bacterias patógenas que producen grandes pérdidas económicas a esta industria. Del mismo modo, se aborda el tratamiento de estas enfermedades y la posibilidad de usar los mecanismos de captación de hierro para desarrollar nuevas vacunas y antimicrobianos. Por último se presentan las estrategias para la expresión heteróloga de proteínas de membrana, su purificación y cristalización. Capítulo II: Se realizó el clonaje, la expresión y purificación de rFrpA, proteína receptora de la piscibactina, sideróforo de Photobacterium damselae subsp. piscicida. La proteína obtenida se utilizó en ensayos de vacunación lográndose protección en los peces tratados. Además, mediante cristalografía de rayos X se realizó una aproximación a la estructura tridimensional de rFrpA. Por otra parte, se prepararon intermedios avanzados que permitieron progresar en la síntesis total de la piscibactina. Capítulo III: Se estudiaron los sideróforos producidos por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. En primer lugar se aislaron, purificaron y caracterizaron las amonabactinas Amo P 693 y Amo P 750. Posteriormente, mediante espectrometría de masas, se identificaron los complejos de Fe(III) y Ga(III) de las amonabactinas Amo T 732, Amo T 789, Amo P 693 y Amo P 750. Por otra parte, se realizó el clonaje, la expresión y purificación de rFstA, proteína receptora de sideróforos de esta bacteria., [Abstract] The summary of each chapter of this doctoral thesis is presented below. Chapter I: This section contains a description of the importance of aquaculture in the world and the diseases caused by pathogenic bacteria which produce great economic losses to this industry. Similarly, it shows some ways to treat these diseases and the possibility of using the bacterial iron uptake systems to develop new vaccines and antimicrobials. Finally, some strategies for the heterologous expression of membrane proteins, their purification and their crystallization are presented. Chapter II: We made the cloning, expression and purification of rFrpA, a receptor protein of piscibactin, which is a siderophore from Photobacterium damselae subsp. piscicida. The obtained protein was used in vaccination trials, achieving protection in treated fish. Furthermore, using X-ray crystallography we proposed a tridimensional structure for rFrpA. On the other hand, we prepared advanced synthetic intermediates which allowed us to make progress in the total synthesis of piscibactin. Chapter III: We studied the siderophores produced by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Firstly, we isolated, purified, and characterized the amonabactins Amo P 693 and Amo P 750. Secondly, we identified the Fe(III) and Ga(III) complexes of amonabactins Amo T 732, Amo T 789, Amo P 693, and Amo P750, using mass spectrometry. Moreover, we made the cloning, expression and purification of rFstA, receptor protein of siderophores of this bacterium.

[ES] El agua es un recurso indispensable para la vida y, ante los problemas de escasez, la depuración y reutilización de aguas residuales es una de las principales soluciones. Los procesos de depuración de aguas residuales no son capaces de garantizar la total eliminación de ciertos microorganismos patógenos que suponen un grave riesgo para la salud humana, como Helicobacter pylori causantes de úlcera y cáncer gástrico, o Legionella pneumophila causante de neumonías severas. Los procesos habituales de tratamiento terciario para la desinfección son suficientes para eliminar estas bacterias, pero la presencia en las aguas de amebas de vida libre puede suponer un reservorio y una forma de protección para estos microorganismos por su resistencia a los tratamientos de desinfección habituales (cloración o radiación ultra violeta) a los que son sometidas las aguas tratadas. En este Trabajo Fin de Máster se evaluó la presencia de amebas de vida libre como indicador de la efectividad del proceso de depuración, de los tratamientos terciarios de desinfección habituales en las EDAR, y de la cloración en las aguas potables para eliminar estos patógenos. Para ello se han estudiado diferentes muestras de aguas residuales tratadas y aguas de abastecimiento, se ha investigado la presencia de amebas de vida libre y su relación con el tratamiento biológico. Para la identificación de H. pylori y L. pneumophila en el interior de las FLA, se utilizó el método rápido de identificación de bacterias viables patógenas de transmisión hídrica DVC-FISH., [CA] L'aigua és un recurs indispensable per a la vida i, davant dels problemes d'escassetat, la depuració i reutilització d'aigües residuals és una de les principals solucions. Els processos de depuració d'aigües residuals no són capaços de garantir la total eliminació de certs microorganismes patògens que suposen un greu risc per a la salut humana, com Helicobacter pylori causants d'úlcera i càncer gàstric, o Legionella pneumophila causant de pneumònies severes. Els processos habituals de tractament terciari per a la desinfecció són suficients per a eliminar estos bacteris, però la presència en les aigües d'amebes de vida lliure pot suposar un reservori i una forma de protecció per a estos microorganismes per la seua resistència als tractaments de desinfecció habituals (cloració o radiació ultra violeta) als que són sotmeses les aigües tractades. En este Treball Fi de Màster es va avaluar la presència d'amebes de vida lliure com a indicador de l'efectivitat del procés de depuració, dels tractaments terciaris de desinfecció habituals en les EDAR, i de la cloració en les aigües potables per a eliminar estos patògens. Per a això s'han estudiat diferents mostres d'aigües residuals tractades i aigües d'abastiment, s'ha investigat la presència d'amebes de vida lliure i la seua relació amb el tractament biològic. Per a la identificació de H. pylori i L. pneumophila en l'interior de les FLA, es va utilitzar el mètode ràpid d'identificació de bacteris viables patògenes de transmissió hídrica DVC-FISH., [EN] The water is an essential resource for life on planet Earth. And when it comes about shortage problems, re-use of treated water becomes one of the main solutions. The conventional wasted water treatment process is not capable of guarantee the complete removal of certain pathogens which could be a serious risk for human health. Such as Helicobacter pylori that causes ulcer and gastric cancer, or Legionella pneumophila which causes severe pneumonia. The actual treatment for disinfection could remove bacterial load, but the presence in the water of Free Living Amoeba may be a reservoir and a protection way for this microorganisms due to the resistance to usual disinfection treatments, such as chloration and ultraviolet radiation. In this thesis it was evaluated the presence of free Living Amoebas as depuration process effectiveness indicator, also for the chloration treatment. In order to this, different wasted water and supply water samples were studied. The presence of Free Living Amoebas and their relation with the biological treatment was investigated. DVC-FISH method was used for the FLA's inner H. pylori and L. pneumophila identification.

The Supplementary Material for this article can be found online at: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2015.00871, Pseudomonas putida strains are ubiquitous in soil and water but have also been reported as opportunistic human pathogens capable of causing nosocomial infections. In this study we describe the multilocus sequence typing of four P. putida strains (HB13667, HB8234, HB4184, and HB3267) isolated from in-patients at the Besançon Hospital (France). The four isolates (in particular HB3267) were resistant to a number of antibiotics. The pathogenicity and virulence potential of the strains was tested ex vivo and in vivo using different biological models: human tissue culture, mammalian tissues, and insect larvae. Our results showed a significant variability in the ability of the four strains to damage the host; HB13667 did not exhibit any pathogenic traits, HB4184 caused damage only ex vivo in human tissue cultures, and HB8234 had a deleterious effect in tissue culture and in vivo on rat skin, but not in insect larvae. Interestingly, strain HB3267 caused damage in all the model systems studied. The putative evolution of these strains in medical environments is discussed., Work in this study was supported by the ERANET Pathogenomics Program through the ADHERS-Signature Project (reference: BIO2008-04419-E)

[Resumen] La presente memoria está estructurada en cuatro capítulos: Capítulo I. Se describe la importancia de la acuicultura y cómo solucionar uno de sus mayores problemas: las enfermedades infecciosas originadas por diversas bacterias patógenas. También se resalta la importancia de la determinación de la configuración relativa, siendo el análisis configuracional basado en las constantes de acoplamiento, conocido como el método de Murata, una de las estrategias más importantes en compuestos acíclicos o con sistemas flexibles. Capítulo II. Se realizó la síntesis de una serie de análogos de acinetobactina, sideróforo aislado de la bacteria A. salmonicida subsp. salmonicida, responsable de la forunculosis en peces, con el propósito de establecer algunas relaciones estructura-actividad siderófora para este tipo de compuestos. Los resultados obtenidos en los bioensayos de los análogos sintetizados mostraron que la presencia del grupo metilo en el anillo de isoxazolidinona es esencial para el reconocimiento molecular por la proteína receptora de acinetobactina y que la estereoquímica de los centros asimétricos no influye en el reconocimiento molecular de la misma. Capítulo III. Se consiguió la primera síntesis total de prepiscibactina, un posible intermedio en la biosíntesis de piscibactina, sideróforo aislado de la bacteria P. damselae subsp. piscicida, responsable de la pasteurelosis en peces. El producto sintético permitió no sólo confirmar la estructura y la estereoquímica relativa propuesta para prepiscibactina, sino también establecer su configuración absoluta (9R,10S,12R,13S). Además, teniendo en cuenta la similitud estructural parcial entre prepiscibactina y piscibactina, se realizó una aproximación a la síntesis de piscibactina. Capítulo IV.Se llevó a cabo la síntesis de sistemas acíclicos oxigenados y nitrogenados 1,2 y 1,3-disustituidos con el fin de corroborar la nueva metodología del análisis configuracional basado en las constantes de acoplamiento a temperatura variable (VT-JCBA) para resolver aquellos sistemas en los que el método de Murata no permite determinar su estereoquímica relativa., [Resumo] A presente memoria está estruturada en catro capítulos: Capítulo I. Descríbese a importancia da acuicultura e cómo solucionar un dos seus maiores problemas: as enfermidades infecciosas orixinadas por diversas bacterias patóxenas. Tamén resáltase a importancia da determinación da configuración relativa, sendo a análise configuracional baseada nas constantes de acoplamento, coñecido como o método de Murata, unha das estratexias máis importantes en compostos acíclicos ou con sistemas flexibles. Capítulo II. Realizouse a síntese dunha serie de análogos de acinetobactina, sideróforo illado da bacteria A. salmonicida subsp. Salmonicida responsable da forunculose en peixes, co propósito de avaliar como as variacións estruturais inflúen na súa actividade siderófora. Os resultados obtidos nos bioensaios mostraron que a presenza do grupo metilo no anel de isoxazolidinona é esencial para o recoñecemento molecular pola proteína receptora de acinetobactina e que a estereoquímica dos centros asimétricos non inflúe no recoñecemento molecular da mesma. Capitulo III. Conseguiuse a primeira síntese total de prepiscibactina, un posible intermedio na biosíntese de piscibactina, illado da bacteria P. damselae subsp. Piscicida responsable da pasteurelose en peixes. O produto sintético permitiu confirmala estrutura proposta para prepiscibactina e establecer unha configuración absoluta (9R,10S,12R,13S), que fora predita mediante cálculos computacionais e experimentos NOE. Ademais, tendo en conta a similitude estrutural parcial entre prepiscibactina e piscibactina, realizouse unha aproximación á síntese de piscibactina. Capítulo IV. Levouse a cabo a síntese de sistemas acíclicos osixenados e nitroxenados 1,2 e 1,3-disustituidos co fin de corroborar a nova metodoloxía da análise configuracional baseada nas constantes de acoplamento a temperatura variable (VT-JCBA) para resolver aqueles sistemas nos que o método de Murata non permite determinala súa estereoquímica relativa., [Abstract] This memory is divided in four chapters: Chapter I. We describe the importance of aquaculture and how to solve one of their biggest problems: infectious diseases caused by various pathogenic bacteria. The importance of determining the relative configuration is also highlighted, it is the study of homo/heteronuclear coupling constants (Murata’s method) one of the most important strategies. Chapter II. In order to compare the influence of structure of acinetobactin on the siderophore activity, siderophore isolated from the bacterium A. salmonicida subsp. salmonicida, several analogues were prepared. The evaluation of the siderophore activity of them indicate that the presence of the methyl group at isoxazolidinone ring is required for using the FstB receptor as the route of entry and there is a lack of stereoisomeric influence on the siderophore activity. Chapter III. We have accomplished the first total synthesis of prepiscibactin, a possible intermediate in the biosynthesis of piscibactin, the siderophore responsible for the iron uptake of the bacterium P. damselae subsp. piscicida. The synthetic product confirmed the proposed structure for prepiscibactin and established the absolute configuration (9R,10S,12R,13S), that confirmed the previous relative stereochemistry proposed on the basis of NOE and computational methods. The knowledge acquired in the synthesis of prepiscibactin, allowed us a synthetic approach of piscibactin. Chapter IV. We synthesized 1,2 and 1,3-substituted acyclic systems to confirm the methodology that involves the measurement of coupling constants and its variation with temperature change (VT-JCBA) to elucidate those systems whose stereochemistry cannot be deduced applying the original Murata methodology.

En Microbiología de los Alimentos destacan dos campos de interés: la protección de los consumidores frente a enfermedades transmitidas por alimentos y la prevención de alteraciones de los productos por estos agentes. La familia Enterobacteriaceae constituye uno de los principales ejemplos de bacterias vehiculadas por alimentos, de la que forman parte las especies Escherichia coli y Cronobacter sakazakii. La creación de modelos predictivos y el estudio de su comportamiento constituyen herramientas con las que satisfacer las necesidades actuales de seguridad alimentaria. El presente estudio se ha dividido en tres secciones con objetivos diferenciados: i) Estudiar de la variabilidad de los parámetros de crecimiento y estado fisiológico de cepas de E. coli: Se realizó el estudio impedanciométrico y estadístico de diferentes cepas de E. coli a una serie de temperaturas en infusión de cerebro y corazón (BHI) y leche, con lo que se obtuvieron los parámetros de crecimiento y su variabilidad. Se observó escasa variabilidad y leves diferencias significativas en los parámetros de crecimiento de las cepas. ii) Estudiar del comportamiento de C. sakazakii CECT 858 en leche maternizada reconstituida (LMR) a las temperaturas y manipulaciones de este producto más aplicadas a nivel doméstico: Se estudió el comportamiento de la bacteria en LMR y caldo de soja triptona (TSB) a temperatura de refrigeración (4°C), ambiente (24°C de media) y de congelación (-20°C); así como su afectación por microondas. Los cultivos no crecieron en refrigeración, mientras que a temperatura ambiente mostraron una elevada capacidad de crecimiento. En congelación se observó una reducción de la concentración pese a la elevada desviación estándar presentada. Por último, las microondas mostraron un efecto prácticamente nulo sobre la población bacteriana. iii) Estudiar el efecto de la inoculación de diversos sobrenadantes libres de células en el crecimiento de cultivos de C. sakazakii CECT 858 y su relación con el quorum sensing: Cultivos de C. sakazakii fueron inoculados con sobrenadantes libres de células extraídos de diferentes fases del crecimiento bacteriano y de diferente concentración. Se realizó el seguimiento de las poblaciones bacterianas a lo largo del tiempo. Se observó mayor alteración del crecimiento con la inoculación de sobrenadantes concentrados, especialmente con el de fase estacionaria. Se puede afirmar, por tanto, que i) la elaboración de modelos de crecimiento específicos para medios de cultivo y alimentos es necesaria para la correcta toma de decisiones sobre la gestión de riesgos microbianos, ii) se corrobora la importancia del empleo de medidas asépticas y temperaturas apropiadas en la preparación, uso y almacenamiento de la leche maternizada y iii) los resultados obtenidos podrían avalar que los mismos sean atribuidos al efecto del fenómeno del quorum sensing., Departamento de Pediatría e Inmunología, Ginecología y Obstetricia, Nutrición y Bromatología, Psiquiatría e Historia de la Ciencia

El Ministerio del Ambiente Ecuador (MAE) dentro del Programa Nacional para la Gestión Integral de Desechos Sólidos – PNGIDS ECUADOR, crea la iniciativa de implementar una política ambiental y normar la calidad de los abonos orgánicos en los 221 Gobiernos autónomos Descentralizados (GAD´s) del país. Actualmente 55 GAD`s han implementado proyectos en la elaboración de abonos orgánicos aprovechando el 60% de los residuos sólidos orgánicos que generan en cada ciudad. Por lo que fue necesario realizar una identificación microbiológica de la presencia o ausencia de Salmonella sp., Shigella sp., Escherichia Coli., bacterias patógenas al ser humano, análisis fisicoquímico y prueba de fitoxicidad de los tres abonos orgánicos del producto final Humus, Takakura y Bioabono del GAD de la provincia de Loja y comparar con la Norma EPA 503 Biosolidos. Los resultados obtenidos al determinar los niveles de patógenos fueron: En los abonos orgánicos humus, Takakura y bioabono se reporta ausencia de Salmonella sp., y Shigella sp.Existe presencia de coliformes fecales (

Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena de gran interés tanto académico como económico, ya que afecta a gran variedad de cultivos hortícolas y ornamentales. Durante la interacción entre P. syringae y la planta se producen fenómenos de evasión de defensa cuyo estudio es el objetivo principal de esta tesis. Las poblaciones bacterianas han sido consideradas durante mucho tiempo clonales, y como tales, genética y fenotípicamente idénticas. Sin embargo, trabajos realizados durante las últimas décadas han demostrado que en condiciones de estrés, como las que se encuentra una bacteria fitopatógena en su hospedador, se pueden formar distintas subpoblaciones bacterianas (biestabilidad). Estos cambios se han asociado en bacterias patógenas de animales a modificaciones epigenéticas que causan heterogeneidad fenotípica reversible sin alterar el genotipo (Casadesús y Low, 2013). Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena, cuya virulencia es dependiente del Sistema de Secreción Tipo III (T3SS). Durante la tesis, se ha analizado la expresión de tres genes del T3SS: un gen que codifica para una proteína estructural (hrcU), un regulador general del sistema (hrpL) y un efector (hopAB1). Hemos demostrado que la expresión de los tres genes es heterogénea cuando la bacteria crece en medio mínimo (HIM), y esta heterogeneidad se convierte en bistabilidad para el caso del efector hopAB1 durante la fase de crecimiento exponencial. En el interior de la planta, la bistabilidad de hopAB1 se intensifica, y la expresión del regulador hrpL se vuelve bistable. Además, la bistabilidad se revierte en pocas horas, indicando un origen no genético del proceso. La separación de poblaciones bacterianas basada en la expresión de hopAB1 y la posterior inoculación en planta demuestra que dichas diferencias en expresión tienen un efecto en la virulencia de la bacteria. Durante la interacción planta-patógeno, las plantas detectan a los microorganismos mediante receptores de membrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Este reconocimiento lleva a la planta a activar una respuesta de defensa generalista llamada PTI (PAMP-Triggered Immunity). Pseudomonas syringae, mediante su T3SS, puede translocar proteínas llamadas efectores al interior de la célula vegetal. Algunos de estos efectores suprimen la respuesta PTI, permitiendo a la bacteria crecer y colonizar. Sin embargo, la planta ha desarrollado receptores intracelulares capaces de reconocer algunos de estos efectores, desencadenando respuestas fuertes y específicas (ETI, Effector-Triggered Immunity), que dispara la muerte celular local (HR, Hypersensitive Response) y la activación de una respuesta sistémica en la planta (SAR, Systemic Acquired Resistance). El efector HopZ1a suprime PTI, ETI y SAR (Macho et al., 2010; Lewis et al., 2014). HopZ1a se autoacetila en la lisina 289 (Lee et al., 2012), aunque este residuo no es esencial para la actividad del efector (Rufian et al., 2015; Ma et al., 2015). Aunque se han propuesto varias dianas moleculares de HopZ1a dentro de la planta, ninguna guarda una relación directa con la supresión de defensa descrita previamente. Una de estas dianas, ZED1, es una pseudoquinasa cuya única función es la detección de la actividad de HopZ1a para activar una respuesta de defensa (Lewis et al., 2013). Además, otros efectores de la familia YopJ/HopZ acetilan MAPK quinasas en sus hospedadores. En Arabidopsis existen 10 MAPK quinasas, una de las cuales, ZIP1, está implicada en la activación de defensas basales. Este fenotipo nos llevó a proponer a ZIP1 como la diana mediante la cual HopZ1a suprime defensas. Hemos demostrado que la supresión de defensas de HopZ1a es dependiente de ZIP1, y que ambas proteínas interaccionan tanto in vitro como in planta. Además, HopZ1a acetila a ZIP1 en una lisina esencial para su función, y no descrita previamente.

Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena de gran interés tanto académico como económico, ya que afecta a gran variedad de cultivos hortícolas y ornamentales. Durante la interacción entre P. syringae y la planta se producen fenómenos de evasión de defensa cuyo estudio es el objetivo principal de esta tesis. Las poblaciones bacterianas han sido consideradas durante mucho tiempo clonales, y como tales, genética y fenotípicamente idénticas. Sin embargo, trabajos realizados durante las últimas décadas han demostrado que en condiciones de estrés, como las que se encuentra una bacteria fitopatógena en su hospedador, se pueden formar distintas subpoblaciones bacterianas (biestabilidad). Estos cambios se han asociado en bacterias patógenas de animales a modificaciones epigenéticas que causan heterogeneidad fenotípica reversible sin alterar el genotipo (Casadesús y Low, 2013). Pseudomonas syringae es una bacteria fitopatógena, cuya virulencia es dependiente del Sistema de Secreción Tipo III (T3SS). Durante la tesis, se ha analizado la expresión de tres genes del T3SS: un gen que codifica para una proteína estructural (hrcU), un regulador general del sistema (hrpL) y un efector (hopAB1). Hemos demostrado que la expresión de los tres genes es heterogénea cuando la bacteria crece en medio mínimo (HIM), y esta heterogeneidad se convierte en bistabilidad para el caso del efector hopAB1 durante la fase de crecimiento exponencial. En el interior de la planta, la bistabilidad de hopAB1 se intensifica, y la expresión del regulador hrpL se vuelve bistable. Además, la bistabilidad se revierte en pocas horas, indicando un origen no genético del proceso. La separación de poblaciones bacterianas basada en la expresión de hopAB1 y la posterior inoculación en planta demuestra que dichas diferencias en expresión tienen un efecto en la virulencia de la bacteria. Durante la interacción planta-patógeno, las plantas detectan a los microorganismos mediante receptores de membrana que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs). Este reconocimiento lleva a la planta a activar una respuesta de defensa generalista llamada PTI (PAMP-Triggered Immunity). Pseudomonas syringae, mediante su T3SS, puede translocar proteínas llamadas efectores al interior de la célula vegetal. Algunos de estos efectores suprimen la respuesta PTI, permitiendo a la bacteria crecer y colonizar. Sin embargo, la planta ha desarrollado receptores intracelulares capaces de reconocer algunos de estos efectores, desencadenando respuestas fuertes y específicas (ETI, Effector-Triggered Immunity), que dispara la muerte celular local (HR, Hypersensitive Response) y la activación de una respuesta sistémica en la planta (SAR, Systemic Acquired Resistance). El efector HopZ1a suprime PTI, ETI y SAR (Macho et al., 2010; Lewis et al., 2014). HopZ1a se autoacetila en la lisina 289 (Lee et al., 2012), aunque este residuo no es esencial para la actividad del efector (Rufian et al., 2015; Ma et al., 2015). Aunque se han propuesto varias dianas moleculares de HopZ1a dentro de la planta, ninguna guarda una relación directa con la supresión de defensa descrita previamente. Una de estas dianas, ZED1, es una pseudoquinasa cuya única función es la detección de la actividad de HopZ1a para activar una respuesta de defensa (Lewis et al., 2013). Además, otros efectores de la familia YopJ/HopZ acetilan MAPK quinasas en sus hospedadores. En Arabidopsis existen 10 MAPK quinasas, una de las cuales, ZIP1, está implicada en la activación de defensas basales. Este fenotipo nos llevó a proponer a ZIP1 como la diana mediante la cual HopZ1a suprime defensas. Hemos demostrado que la supresión de defensas de HopZ1a es dependiente de ZIP1, y que ambas proteínas interaccionan tanto in vitro como in planta. Además, HopZ1a acetila a ZIP1 en una lisina esencial para su función, y no descrita previamente. 2018-10-13

This paper had as objective the isolation of different bacteria, which cause mastitis and, simultaneously, make emphasis on the differentiation of Mycoplasma species, taken from stored milk samples and individual cows. The animals and the milk were provided by farms from the Boyaca ́s high altitude plateau. The process was carried out through a convenience probabilistic sampling and also a descriptive, longitudinal and retrospective research, during 2010 and 2012. The researches took into account 30 technically managed milking farms, each with approximately 50 milking cows. Streptococcus agalactiae was isolated from 9.1%, being the most detected pathogen. The mean Staphylococcus aureusisolates was of 6.6%. Mycoplasma bovis was not found in any sample during the three year period of the research, while M californicum was recovered from 14 samples (1.5%) during this time lapse and M. alcalescens was detected in 31 samples (3%). Acholeplasma spp. was isolated from 19 samples (1.4%). This research corresponds to first report of Mycoplasma spp. Isolation from milk samples at the Altiplano Boyacense Colombia. El objetivo del presente trabajo fue el aislamiento de las dife-rentes bacterias causantes de mastitis, haciendo énfasis en la diferenciación de las especies de Mycoplasmas, de las muestras de leche de tanque y de vacas individuales, proce-dentes de fincas lecheras del Altiplano Boyacense. Mediante un muestreo probabilístico de conveniencia y por medio de un estudio descriptivo longitudinal retrospectivo, entre 2010 y 2012, se estudiaron 30 fincas, especializadas en la produc-ción de leche, con promedios de 50 animales en lactancia, por finca. Streptococcus agalactiae, se aisló en el 9,1% y se convirtió en el principal patógeno aislado. Staphylococcus aureus fue aislado, en promedio, en el 6,6%. Mycoplasma bovis, no se encontró en ninguna muestra, a través de los tres años. M. californicum, se recuperó a partir de 14 mues-tras, en los tres años (1,5%); M. alcalescens, de 31 muestras (3%), en los tres años y Acholeplasma spp., se aisló de 19 muestras (1,4%). Este trabajo es el primer reporte de aisla-miento de Mycoplasma spp., a partir de muestras de leche en Colombia, en el Altiplano Boyacense. Incluye referencias bibliográficas

Objective: To determine the presence of bacterial human pathogens in irrigation water of the savannah of Bogota high watershed. Materials and methods: Samples were collected from 8 municipalities, 8 of which were randomly selected for a number of tests including detection of total coliforms via filtration membrane, Most Probable Number (MPN) for fecal coliforms; isolation on selective media and biochemical identification using the BD-BBL CRYSTAL system. Results: Direct or diffuse fecal contamination approached 41.7% of selected samples while aquatic-terrestrial normal flora the remaining 58.3%. According to the percentage of E.coli and count of total coliforms, the analyzed water is not suitable for agricultural use and represents a risk for human health. Determinar la presencia de bacterias patógenas para el humano en aguas de riego en la cuenca alta de la Sabana de Bogotá, Colombia. Materiales y métodos: Se recolectaron 21 muestras en 8 municipios, 8 fueron seleccionadas de forma aleatoria para la determinación de coliformes totales mediante filtración por membrana, número más probable (NMP) para coliformes fecales, aislamiento en medios selectivos e identificación bioquímica con el sistema BDBBL CRYSTAL. Resultados: Se encontró contaminación fecal directa y/o difusa en el 41.7% de muestras y en el 58.3% restante flora normal acuático-terrestre. El porcentaje de E.coli hallado y el recuento de coliformes totales indican que el agua analizada no es apta para el uso agrícola y representa riesgo para la salud.

The aim of this study was to determine the presence and frequency of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in three levels of the poultry chain production in Costa Rica. The levels studied were farms, slaughterhouse/processing plant, and retails of the Great Metropolitan Area of Costa Rica. For detection and isolation of Campylobacter sp., 84 samples from the poultry chain (24 chicken meat samples at retail, 20 carcass rinses and 40 caecum contents taken at slaughterhouse), obtained in November 2012, following the ISO 10272-1:2006 protocol, USDA modified (United States Department of Agriculture). From the 84 samples analyzed, 36 (42.8%) were positive for C. jejuni, and one (1.2%) for C. coli. The quantity of positive samples per sample type, according to Polimerase Chain Reaction (PCR), was: for caecal content, 16 (n=40), for carcass, 8 (n=20) and retail, 12 (n=24). Sixteen of the twenty farms sampled were positive. A high frequency of Campylobacter spp. at all sample points of the production chain was determined, which could be associated with modification of parameters related to food safety in each link. Rapid cooling measures and the use of chlorine in the cooling water at the process plant collaborate to decrease the frequency of Campylobacter positive samples. El objetivo de este estudio fue determinar la presencia y la frecuencia de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli, en la cadena de producción avícola en Costa Rica. Se evaluaron granjas, planta de proceso y puntos de venta del Gran Área Metropolitana. Para la detección y aislamiento de Campylobacter sp. se analizaron 84 muestras provenientes de la cadena avícola (24 muestras de carne de pollo tomadas en punto de venta, 20 enjuagues de carcasa y 40 de ciegos tomados en planta de beneficio), obtenidas en noviembre de 2012, siguiendo el protocolo ISO 10272-1:2006 modificado por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA, por sus siglas en inglés). De las 84 muestras analizadas, 36 (42,8%) resultaron positivas para C. jejuni, y una (1,2%) para C. coli. La cantidad de muestras positivas según la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR), por tipo de muestra fue: para contenido cecal, 16 (n=40), para carcasas, 8 (n=20) y para punto de venta 12 (n=24). Dieciséis de las veinte granjas muestreadas fueron positivas. Hubo una alta frecuencia de Campylobacter en todos los puntos de la cadena muestreados, lo que podría estar asociado a modificaciones de parámetros relacionados con inocuidad en cada eslabón. El enfriamiento rápido y el uso de cloro en el agua en la planta de proceso, disminuyó la frecuencia de muestras positivas de Campylobacter spp.

Determinar la presencia de bacterias patógenas para el humano en aguas de riego en la cuenca alta de la Sabana de Bogotá, Colombia. Materiales y métodos: Se recolectaron 21 muestras en 8 municipios, 8 fueron seleccionadas de forma aleatoria para la determinación de coliformes totales mediante filtración por membrana, número más probable (NMP) para coliformes fecales, aislamiento en medios selectivos e identificación bioquímica con el sistema BDBBL CRYSTAL. Resultados: Se encontró contaminación fecal directa y/o difusa en el 41.7% de muestras y en el 58.3% restante flora normal acuático-terrestre. El porcentaje de E.coli hallado y el recuento de coliformes totales indican que el agua analizada no es apta para el uso agrícola y representa riesgo para la salud.

Bactérias endofíticas habitam tecidos vegetais sadios colonizando-os ativamente exercendo atividades benéficas para o hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presença de bactérias endofiticas Gram negativas potencialmente patogênicas em hortaliças oriundas de cultivos orgânicos (alface, acelga, manjericão, espinafre, coentro e couve) adquiridas em supermercados. Após assepsia das folhas de aspecto sadio, pequenos fragmentos de aproximadamente 1 cm2 foram colocados na superfície de ágar LB. As colônias bacterianas obtidas após o crecimiento ao redor dos fragmentos de folhas, foram isoladas em meio McConkey. Depois, foram escolhidas várias distintas colônias fermentadoras e não fermentadoras de lactose e identificadas por provas bioquímicas. De 46 colônias identificadas, 27 (58,6%) corresponderam à família Enterobacteriaceae; 14 (30,4%), ao gênero Acinetobacter e 5 (10,9%) ao gênero Pseudomonas. Verificou-se a existência de um considerável número de bactérias endofíticas patogênicas incluindo Salmonella, Yersinia, Shigella entre outras. Sabe-se dos riscos da utilização de estercos animais na adubação de solos para culturas orgânicas. Geralmente dá-se relevância à higiene de hortaliças e frutas em relação à microbiota epífita contaminante, mas raramente é considerada a população microbiana endofítica eventualmente patogênica para humanos, fato que pode explicar surtos para os quais não é possível detectar a fonte de contaminação. Las bacterias endófitas habitan tejidos vegetales colonizándolos activamente, ejerciendo funciones beneficiosas para el huésped. El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de bacterias endófitas gramnegativas potencialmente patógenas en hortalizas provenientes de cultivos orgánicos (lechuga, acelga, espinaca, coliflor, albahaca y cilantro) adquiridas en supermercados. Después de desinfectar hojas de aspecto sano, fragmentos de aproximadamente 1 cm2 fueron colocados sobre agar LB. A partir del desarrollo bacteriano alrededor de los fragmentos se procedió al aislamiento en medio McConkey. Se escogieron varias colonias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa y se identificaron mediante pruebas bioquímicas. De 46 colonias identificadas, 27 (58,6%) correspondieron a enterobacterias, 14 (30,4%) al género Acinetobacter y 5 (10,9%) al género Pseudomonas. Se verificó un relevante número de bacterias endófitas patógenas incluyendo Salmonella, Yersinia, y Shigella entre otras. Es conocido el riesgo del empleo de estiércol animal como abono de suelos para cultivos orgánicos. Generalmente se da importancia a la higiene de hortalizas y frutas en relación a la microbiota epífita contaminante, pero raramente es considerada la población microbiana endófita patógena para los humanos, hecho que puede explicar brotes en los que no es posible detectar el origen de la contaminación. Endophytic bacteria live in vegetable tissues colonizing them actively and exerting beneficial functions for the host. The objective of this study was to investigate the presence of Gram negative endophytic bacteria in vegetables from organic cultures (lettuce, chard, spinach, basil, cauliflower, coriander) purchased at food markets. After disinfecting leaves with a healthy aspect, fragments of approximately 1 cm2 were placed on LB agar. After the development of bacteria around the fragments, they were isolated in McConkey agar. Several lactose fermenting and non fermenting colonies were chosen and identified by biochemical assays. Of 46 identified colonies, 27 (58.6%) corresponded to enterobacteria, 14 (30.4%) to the Acinetobacter genus and 5 (10.9%) to the Pseudomonas genus. A relevant number of endophytic pathogen bacteria, including Salmonella, Yersinia and Shigela, among others, was verified. The risk of using animal manure as compost for organic cultures is well known. Generally, the hygiene of vegetables and fruits is given importance in relation with contaminant epiphytic microbiota, but the endophytic microbial population pathogenic for humans is rarely considered, fact which can explain outbreaks where it is not possible to detect the origin of the contamination.

El objetivo del presente estudio fue estimar la prevalencia de bacterias patógenas de mastitis en muestras de leche de tanque en tambos ubicados en la cuenca lechera central Argentina. Además, se evaluó el desempeño de tres medios de cultivo, dos estándar (Baird Parker y agar sangre) y uno comercial (Compact Dry “Nissui”), para realizar el recuento, aislamiento e identifi cación de Sta-phylococcus aureus. Entre las muestras con aislamiento de patógenos mayores, la prevalencia de S. aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis y Streptococcus dysgalactiae fue del 50%, 5,45%, 31.82% y 12.72% respectivamente. Ninguna muestra fue positiva para Mycoplasma spp. Al comparar los medios para aislamiento de S. aureus se observó una concordancia moderada a baja entre Baird Parker (BP) y Agar Sangre (AS), mayor que la observada entre Baird Parker y Compact Dry “Nissui” (CSA). Al comparar el porcentaje de recuperación, ninguna de las dos técnicas AS y CSA difi rió de BP la cual fue intermedia a las otras dos, obteniéndose recuentos más bajos en AS que en CSA. Estos resultados evidencian que aún persisten elevadas prevalencias de los principales agentes patógenos de mastitis y su control es importante para mejorar la calidad microbiológica de la leche cruda. Los tres medios ensayados fueron adecuados para la detección de S. aureus en leche de tanque The objective of this study was to determine the prevalence of major mastitis pathogens in bulk tank milk from dairy herds located in the central dairy area of Argentina. In addition, performance of three culture media, two standard (Baird Parker and blood agar) and one commercial (Dry Compact “Nissui”) for Staphylococcus aureus detection and enumeration was evaluated. Prevalence of S. aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis and Streptococcus dysgalactiae was 50%, 5.45%, 31.82 and 12.72, respectively, while Mycoplasma spp. was not detected. Regarding culture media performance, accordance between Baird Parker and blood agar was moderate to low, although higher than the one observed between Baird Parker and Compact Dry “Nissui”. Colony recovery percent on blood agar or Compact Dry “Nissui” did not differ from Baird Parker, being higher on Compact Dry “Nissui” and lower on blood agar. These results stress the need to control major mastitis contagious pathogens in the central dairy area. All culture media evaluated were found suitable for detection and enumeration of S. aureus in bulk tank milk EEA Rafaela Fil: Neder, Veronica Elizabeth. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina Fil: Signorini, Marcelo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Cuatrin, Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina Fil: Gianre, Vilma Rita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina. Fil: Calvinho, Luis Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina

En este artículo se describe la síntesis y caracterización de un nuevo complejo de paladio(II), [Pd(Ph2PzTSC)2], con el ligante 1,3-difenilpirazol-4-carboxaldehído tiosemicarbazona (Ph2PzTSC) como una estrategia para mejorar la actividad antimicrobiana del complejo formado. La coordinación del ion metálico y el efecto sinérgico entre estos, conduce a mejorar la actividad biológica del complejo. El ligante se coordina al ion metálico de modo bidentado a través del átomo de nitrógeno del azometino y del azufre en forma de tiol, por la desprotonación del grupo NH-C=S. La actividad antimicrobiana de estos compuestos fueevaluada frente a bacterias Gram-negativas(Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa) yGram-positivas(Staphylococcus aureus, Bacillus thuringensis) y dos levaduras (Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae). Cuando fueron comparados los resultados de la actividad antimicrobiana con la actividad del ligante libre, se observó que la coordinación del Pd(II) mejoró la actividad. This article describes the synthesis and characterization of a new complex, [Pd(Ph2PzTSC)2], formed between palladium(II) and 1,3-diphenylpyrazole-4-carboxaldehyde thiosemicarba-zone ligand as a strategy for antimicrobial activity improve-ment the synthesized complex. The metal coordination leads to an improvement of ligand pharmacological activities and synergistic effects involving both metal ion as the ligand. The bidentate ligand is coordinated to metal ion through the azomethine nitrogen atoms and the sulphur in the form of thiol by deprotonation of the NH-C=S group. The antimicro-bial activity of these new compounds was evaluated against gram-negative (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniaeand Pseudomonas aeruginosa) and gram-positive (Staphy-lococcus aureus and Bacillus thuringiensis) bacteria and two yeasts strains (Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae). A comparison between the antimicrobial activity of the complex and that of the free ligand revealed that the coordination of Pd(II) improved the activity. Incluye referencias bibliográficas

For nearly 3 decades, listeriologists and immunologists have used mainly three strains of the same serovar (1/2a) to analyze the virulence of the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. The genomes of two of these strains, EGD-e and 10403S, were released in 2001 and 2008, respectively. Here we report the genome sequence of the third reference strain, EGD, and extensive genomic and phenotypic comparisons of the three strains. Strikingly, EGD-e is genetically highly distinct from EGD (29,016 single nucleotide polymorphisms [SNPs]) and 10403S (30,296 SNPs), and is more related to serovar 1/2c than 1/2a strains. We also found that while EGD and 10403S strains are genetically very close (317 SNPs), EGD has a point mutation in the transcriptional regulator PrfA (PrfA*), leading to constitutive expression of several major virulence genes. We generated an EGD-e PrfA*mutant and showed that EGD behaves like this strain in vitro, with slower growth in broth and higher invasiveness in human cells than those of EGD-e and 10403S. In contrast, bacterial counts in blood, liver, and spleen during infection in mice revealed that EGD and 10403S are less virulent than EGD-e, which is itself less virulent than EGD-e PrfA*. Thus, constitutive expression of PrfA-regulated virulence genes does not appear to provide a significant advantage to the EGD strain during infection in vivo, highlighting the fact that in vitro invasion assays are not sufficient for evaluating the pathogenic potential of L. monocytogenes strains. Together, our results pave the way for deciphering unexplained differences or discrepancies in experiments using different L. monocytogenes strains. © 2014 Bécavin et al., European Research Council (advanced grant 233348), the French Agence Nationale de la Recherche (grants BACNET 10-BINF-02-01, IBEID ANR-10-LABX-62-01, and ERA-NET ANR-2010-PATH), the Institut Pasteur, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, and the Institut National de la Recherche Agronomique. A.K

El áfido verde del duraznero, Myzus persicae, se asocia con la bacteria endosimbiótica Buchnera aphidicola que se localiza en el hemocele del áfido. B. aphidicola suplementa la dieta del áfido, aunque podría cumplir otros roles en la interacción planta-áfido. Las respuestas de las plantas a la infestación por M. persicae, muestran mayores similitudes con las respuestas a una infección bacteriana que al ataque de insectos masticadores, por ejemplo en la inducción de procesos relacionados a la senescencia. La hipótesis propuesta en este trabajo es que en la interacción plantaáfido están involucrados efectores, los cuales podrían ser sintetizados por el áfido o por su endosimbionte primario, B. aphidicola. Por esta razón en ésta Tesis se evaluó la participación de B. aphidicola y de la senescencia foliar inducida en la interacción planta-áfido, integrando estudios que involucran distintos aspectos de la interacción entre plantas, áfidos y el endosimbionte primario. Para estudiar el comportamiento alimenticio de los áfidos se utilizó la técnica de gráfico de penetración eléctrica (EPG), y para evaluar la expresión de genes se utilizó RT-qPCR. Se encontró que la inducción de senescencia foliar incrementó el tiempo de ingestión de savia y mejoró el desarrollo ninfal de los áfidos. Además se encontró que la interrupción de la simbiosis con B. aphidicola, afecta el comportamiento alimenticio y la expresión de genes de las glándulas salivales del áfido, siendo el efecto más evidente en una interacción planta áfido compatible que en una interacción incompatible. Además, la interrupción de la simbiosis con B. aphidicola cambió la expresión de genes marcadores de las dos principales vías de defensa en Arabidopsis thaliana. Estos resultados confirman la participación de B. aphidicola y de procesos similares a la senescencia foliar, en la interacción planta-áfido.

Tesis Univ. Granada. Departamento de Ecología