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Enquadramento: A supervisão colaborativa fundamenta a permanente transformação das práticas profissionais, numa perspetiva coformativa e desenvolvimentista. Objetivo: Este estudo visa compreender as conceções dos enfermeiros sobre a supervisão colaborativa e o desenvolvimento profissional na prática de cuidados. Metodologia: Estudo empírico qualitativo, este estudo de caso integra a equipa de Enfermagem de um serviço de Medicina Interna num Centro Hospitalar da região Norte de Portugal (N = 29). Os dados foram obtidos através de análise documental, observação não participante e entrevista semiestruturada. Resultados: Os participantes consideram que colaborar é partilhar, trabalhar em equipa e ajudar o outro, existindo privilegiados momentos colaborativos na prática de cuidados. A supervisão surge como uma realidade ainda distanciada da prática e os enfermeiros tendem a uma visão verticalizada do processo supervisivo. Como contributos para o desenvolvimento profissional, os enfermeiros salientam a formação contínua, a colaboração e a inter-relação da pessoa, do meio e dos outros. Conclusão: Apesar da espontaneidade e informalidade da supervisão e da colaboração, estas práticas encontram-se intimamente relacionadas com o contínuo desenvolvimento profissional em Enfermagem., Background: Collaborative supervision explains the permanent transformation of professional practices from a coformative and developmental perspective. Objective: This study aims to identify the nurses’ conceptions of collaborative supervision and professional development in nursing care practice. Methodology: A qualitative empirical case study, including the Nursing team of an Internal Medicine unit of a Hospital Centre in Northern Portugal (N = 29). Data were obtained through document analysis, non-participant observation and semi-structured interviews. Results: Participants consider that collaborating means sharing, working in a team and helping the other, and that there are privileged collaborative moments in nursing care practice. Supervision emerges as a reality still apart from practice, and nurses tend to consider the supervisory process from a vertical perspective. As contributions to their professional development, nurses emphasise lifelong training, collaboration and the relationship between the person, the environment and the others. Conclusion: Despite the spontaneity and informality of both supervision and collaboration, these practices are closely related to the continuing professional development in nursing., Marco contextual: Supervisión colaborativa sustenta una transformación permanente de las prácticas profesionales, en una perspectiva co-formativa y de desarrollo. Objetivo: Este estudio tiene como objetivo comprender concepciones de los enfermeros acerca de supervisión colaborativa y el desarrollo profesional en la práctica asistencial. Metodología: El estudio empírico cualitativo, específicamente un estudio de caso, incluye la participación de un equipo de Enfermería de un servicio de medicina interna de un hospital de la región Norte de Portugal (N = 29). Los datos fueron obtenidos a través de análisis documental, observación no participante y entrevista semiestructurada. Resultados: Los participantes consideran que colaborar es compartir, trabajar en equipo o ayudar a los demás, existente momentos privilegiados de colaboración en la práctica asistencial. Supervisión emerge como una realidad aún lejana de la práctica y los enfermeros tienden a una visión vertical del proceso de supervisión. Como contribuciones para el desarrollo profesional, los enfermeros enfatizan la formación continua, la colaboración y la interrelación entre la persona, el medio ambiente y otros. Conclusión: Aunque de la espontaneidad e informalidad de la supervisión y colaboración, estas prácticas están estrechamente relacionadas con el desarrollo profesional continuo en la Enfermería.

Esta revisão teve por objetivo avaliar a força de evidência do indicador de desempenho português relativo ao rastreio do Câncer do Colo do Útero (CCU): (1) limites etários das mulheres da população geral que o devem realizar, a (2) periodicidade com que deve ser realizado e (3) qual o melhor exame de rastreio. Foram pesquisados os seguintes termos MeSH: vaginal smears, age groups, periodicity, methods, uterine cervical cancer. Foram excluídos os artigos que não abordavam o objetivo da investigação ou que não fossem redigidos em Inglês, Português ou Espanhol. Para interpretar os artigos selecionados foi utilizada a classificação SORT. Foram encontrados 197 artigos, dos quais seleccionados 9: 1 revisão sistemática (RS), 1 estudo clínico controlado aleatorizado, 2 estudos observacionais retrospectivos e 5 normas de orientação clínica (NOC). Os autores optaram por incluir nesta revisão mais 4 NOCs e 2 RSs por considerarem ser relevantes para a população Portuguesa, apesar de não resultarem da pesquisa efectuada. Os estudos sugerem realização do rastreio entre os 21 e 25 até aos 65 anos, com uma periodicidade trienal usando a citologia convencional. Existe ainda controvérsia no que toca aos 3 objetivos deste artigo (limites etários, frequência e método)., The scope of this review was to assess the strength of evidence of Portuguese performance indicators on Cervical Cancer screening: (1) age group of the women that should be screened for cervical cancer; (2) frequency of screening; and (3) the best method for screening. The following MeSH terms were searched: vaginal smears, age groups, periodicity, methods, uterine cervical cancer. Articles not reflecting the study objectives or not available in English, Portuguese or Spanish were excluded. The SORT classification was used to rate the articles selected.Of the 197 articles found, 9 that met all study criteria were selected for inclusion in this review. These included 1 systematic review, 1 randomized controlled clinical trial, 2 retrospective studies and 5 clinical guidelines. The authors also chose to include 4 clinical guidelines and two systematic reviews relevant to the Portuguese population even though they did not appear in the initial search of the literature. The studies suggest screening women between the ages of 21 to 25 years and 65 years of age, once every three years using conventional cytology. There is still controversy regarding the three objectives of this study (target age bracket, screening frequency and screening method).

Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde This work has been funded by ICVS/3B’s associated lab, under the internal pilot grant "Tracking cell-cell communication in neural cells by sugar labeling."

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Infections caused by bacteria from the Mycobacterium genus are among the major health threats worldwide. Mycobacterium tuberculosis is the etiological agent for tuberculosis (TB). In 2014, TB alone was responsible for 9.6 million people felling ill and 1.5 million deaths. The incidence of other mycobacteriosis that used to affect mainly immune-compromised patients (such as HIV/AIDS patients) is rising even in HIV-negative people. In several cases these mycobacteriosis are caused by mycobacteria from the Mycobacterium avium complex (e.g.: M. avium). It is crucial to better understand T cell response to mycobacterial infections and how infection by these bacteria affects T cell differentiation and immunity. Previous results from our lab showed that disseminated infection with a high virulence strain of M. avium (25291), but not with a low virulence strain (2447), lead to a progressive thymic atrophy. Here we uncover a complex mechanism responsible for M. avium-induced premature thymic atrophy during which increased levels of corticosteroids synergize with nitric oxide produced by interferon gamma (IFNγ) activated macrophages. Following these results, we further show that IFNγ reduces the percentage of T cell progenitors in the bone marrow (BM). Furthermore, IFNγ also diminishes the ability of BM precursors to reconstitute the thymus of immune-compromised mice. Besides effects extrinsic to the thymus, we observed that thymic stroma from M. avium 25291 infected mice is not able to sustain T cell differentiation, even when BM precursors from uninfected mice are provided. Finally, M. avium 25291 infected mice present increased thymocyte death dependent on IFNγ and independent of caspase 3. The role of nitric oxide is still unclear, further study is needed to uncover if this mediator of premature thymic atrophy is acting directly or indirectly on the thymus or on the BM. IFNγ is the best-described T cell-derived cytokine known to be critical for host resistance against M. tuberculosis infection. However, improved protection against TB was not achieved when increased production of IFNγ was induced, indicating a role for additional meditators yet to be uncovered. IL-21 is produced predominantly by activated CD4+ T cells and has been shown to be very important during viral chronic infections and cancer. Here we show that IL-21 signaling plays a crucial role in T cell responses during M. tuberculosis infection by augmenting CD8+ T cell priming, promoting T cell accumulation in the lungs, and enhancing T cell cytokine production. In the absence of IL-21 signaling, more CD4+ and CD8+ T cells in chronically infected mice express the T cell inhibitory molecules PD-1 and TIM-3. Finally we correlate these immune defects with increased susceptibility of IL-21RKO mice, which have increased lung bacterial burden and earlier mortality compared to WT mice. A central function of CD4+ T cells is to regulate other components of the immune system during the immune response to pathogens. Little is known about the need for CD4+ T cell help during M. tuberculosis infection. As a cytokine mainly produced by CD4+ T cells and shown to be essential for CD8+ T cell immunity to TB, IL-21 is a strong candidate as mediator of CD4+ T cell help to CD8+ T cells during the immune response to M. tuberculosis infection. Here we present the development of a new and efficient model to study CD4+ T cell help during M. tuberculosis infection. Using this model we show that helped CD8+ T cells are more protective than the helpless ones, by reducing bacterial burden and increasing survival of M. tuberculosis infected immune-compromised mice. Finally this model allowed us to compare the expression profile between helped and helpless CD8+ T cells and we present a possible gene signature to identify when CD8+ T cells are or not being helped. The findings presented in this thesis contribute to a better understanding of T cell immunity to mycobacteria infections. They show the mechanisms responsible for M.aviuminduced thymic atrophy and uncover new T cell mediated immune responses that are essential for optimal immunity to TB. With these findings we provide new insights for the prevention and treatment of mycobacterial infections., As infeções causadas por bactérias do género Mycobacterium são consideradas de grande ameaça à saúde mundial. O Mycobacterium tuberculosis é responsável pela doença denominada tuberculose (TB). Só em 2014, 9.6 milhões de pessoas ficaram doentes com TB e 1.5 milhões morreram com esta doença. Além da TB, há outras micobacterioses que no passado afectavam apenas pessoas com imunodeficiências (como por exemplo HIV/SIDA). Recentemente, a incidência destas micobacterioses tem vindo a aumentar mesmo em pessoas sem imunodeficiência reconhecida. Estas micobacterioses são causadas na maioria dos casos por bactérias pertencentes ao Complexo Mycobacterium avium como por exemplo M. avium. O estudo da resposta imunitária mediada por células T, bem como o estudo de alterações na diferenciação de células T, é de grande relevância para melhor percebermos como evitar e resolver infeções causadas por micobactérias. A infeção disseminada de ratinhos com a estirpe 25291 de M. avium provoca atrofia tímica, mas este fenómeno não é observado após infeção com a estirpe 2447. Nesta tese nós mostramos que a atrofia tímica resultante da infeção com M. avium é causada pela sinergia entre glucocorticoides circulantes com óxido nítrico produzido por macrófagos ativados por IFNγ. Na continuação destes resultados nós demonstramos que a ativação de macrófagos por IFNγ diminui a percentagem de precursores de células T na medula óssea (MO) e que o IFNγ diminui a capacidade dos precursores da MO de reconstituir o timo de ratinhos imunodeficientes. Além de alterações na MO, nós observamos que o estroma tímico de ratinhos infectados com M. avium 25291 apresenta uma capacidade diminuída de sustentar a diferenciação de células T, mesmo na presença de precursores oriundos de MO de animais não infectados. Por último, observamos um aumento de morte de timócidos em ratinhos infectados com M. avium 25291, a qual é dependente de IFNγ e independente de caspase-3. O mecanismo pelo qual o óxido nítrico é responsável pela atrofia tímica ainda está por desvendar. É necessário novos estudos para perceber se este mediador da atrofia tímica atua diretamente no timo ou na MO. O IFNγ é uma citoquina produzida por células T essencial para uma resposta imunitária eficaz à infeção por M. tuberculosis. Contudo, há pacientes que mesmo produzindo IFNγ, progridem para doença ativa ou permanecem latentes e não eliminam a bactéria. Além disso, estudos com o intuito de aumentar a produção de IFNγ não resultaram em aumento de proteção. Este facto indica a existência de outros mediadores ainda não conhecidos que desempenham papéis importantes na imunidade na TB. A IL-21 é uma citoquina produzida predominantemente por células T CD4+, e que é essencial durante a resposta imunitária contra doenças virais crónicas e cancro. Nesta tese nós mostramos que a sinalização via IL-21 é crucial para a resposta imunitária contra infeção por M. tuberculosis, aumentando o priming de células T CD8+, a sua acumulação no pulmão e a produção de citoquinas. Além disso, na ausência do receptor para IL-21, mais células T CD4+ e CD8+ expressam moléculas de inibição, nomeadamente PD-1 e TIM3, durante a fase crónica da infeção. Por último, ratinhos sem o receptor para IL-21 infectados com M. tuberculosis apresentam carga bacteriana mais alta e sobrevivem menos tempo que os ratinhos wild type. A função principal das células T CD4+ é auxiliar a resposta de outros componente do sistema imunitário. Contudo, ainda não é claro se as células T CD4+ auxiliam as células T CD8+ durante a resposta imunitária contra M. tuberculosis. O facto da IL-21 ser produzida por células T CD4+, e ser crucial para a resposta imunitária mediada por células T CD8+ durante a infeção por M. tuberculosis, faz desta citoquina um potencial candidato a mediador do auxilio provido por células T CD4+ às células T CD8+. Nesta tese nós apresentamos o desenvolvimento de um método novo para estudar o auxilio promovido pelas células T CD4+ durante a infeção por M. tuberculosis. Usando este novo método nós mostramos que as células T CD8+ auxiliadas protegem melhor que as não auxiliadas. Por fim, este método também permitiu a comparação do expressão transcripcional entre células T CD8+ auxiliadas e não auxiliadas e apresentamos aqui uma lista de genes que poderão ser usados para identificar se as células T CD8+ estão a ser auxiliadas ou não. Os resultados apresentados nesta tese contribuem para o melhor conhecimento da imunidade mediada por células T contra infeção por micobactérias assim como dos mecanismos responsáveis pela atrofia tímica na infeção por M. avium. Através da descrição de novos mecanismos de resposta imunitária mediada por células T contra infeção por M. tuberculosis abrimos novas linhas de estudo de prevenção e tratamento contra infeções micobacterianas. Pelo melhor conhecimento dos mecanismos responsáveis pela atrofia tímica em infeções crónicas podemos sugerir métodos de a prevenir.

The present research builds upon the extant literature as it assesses psychophysiological factors in relation to empathy, conflict resolution, and romantic relationship satisfaction. In this study, we examined physiological reactivity of individuals in the context of emotionally laden interactions with their romantic partners. Participants (N = 31) completed self-report measures and attended in-person data collection sessions with their romantic partners. Participants were guided through discussions of problems and strengths of their relationships in vivo with their partners while we measured participants' skin conductance level (SCL) and interbeat interval (IBI) of the heart. We hypothesized that participants' level of empathy towards their partners would be reflected by physiological arousal (as measured by SCL and IBI) and relationship satisfaction, such that higher levels of empathy would be linked to changes in physiological arousal and higher relationship satisfaction. Further, we hypothesized that differences would be found in physiological arousal (as measured by SCL and IBI) based on the type of conflict resolution strategy used by participants. Finally, we hypothesized that differences would be found in empathy towards partner and relationship satisfaction based on the type of conflict resolution strategies used by participants. Results partially supported hypotheses and were discussed in light of existing knowledge based on empirical and theoretical sources.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Plasmodium falciparum is a protozoan parasite responsible for the majority of human malaria associated mortality, particularly in sub-Saharan Africa. To control malaria, chemotherapy is a fundamental tool in the treatment and prophylaxy of P. falciparum infections. Nowadays antimalarial resistance is widespread for the majority of treatments deployed against P. falciparum. Only the artemisinin-based combination therapies (ACTs) remain effective, from which the combination artemether-lumefantrine (AL) is the most widely used. Although ACTs remain effective, resistance is also developing being of fundamental importance to understand the molecular mechanisms underlying resistance. Membrane transporter proteins have been associated with resistance phenotypes, and this dissertation aims to explore the role of the plasma membrane transporter P. falciparum multidrug resistance protein 1 (PfMRP1) with special emphasis to the AL treatment. To explore the role of PfMRP1 in AL therapy, the theme was approached in two venues: in vivo, where the transcriptional response and polymorphisms prevalence in the PfMRP1 gene (pfmrp1) were evaluated upon clinical trials with AL therapy; and in vitro, where the impact of the pfmrp1 was studied by controlling the genetic background of the parasite applying different genome editing strategies. In vivo the transcriptional data shows that the pfmrp1 is induce d in the first hours after treatment and a novel single nucleotide polymorphism (SNP) was identified on the pfmrp1. Applying different genome editing strategies, in vitro, PfMRP1 overexpression, knockout and allelic exchange of the most prevalent SNPs were attempted making use of the Bxb1 integrase system, zinc finger nucleases and CRISPR/Cas9 system. Despite advancements achieved with these strategies further work is necessary to accomplish a solid conclusion on the role of PfMRP1 in antimalarial drug resistance. Understanding the different mechanisms related with antimalarial drug resistance in P. falciparum is fundamental for the management of the current and future antimalarial therapies. Overall, the dissertation provides advancements in the comprehension of the PfMRP1 role in antimalarial resistance, in particular to the current main ACT, the AL therapy., Plasmodium falciparum é o parasita protozoário responsável pela maioria da mortalidade associada à malária, particularmente na África subsariana. A quimioterapia é fundamental no tratamento e profilaxia da infeção provocada por P. falciparum para o controlo da malária. Atualmente, resistência é prevalente para a maioria dos tratamentos utilizados contra o P. falciparum. Unicamente as terapias de combinação baseadas em artemisinina (ACTs) permanecem eficazes, de entre as quais a combinação arteméterlumefantrina (AL) é a mais utilizada. Embora estas terapias permaneçam eficazes resistência está a desenvolver sendo fundamental compreender os mecanismos moleculares que levam a estes fenómenos de resistência. Proteínas transportadoras de membrana tem sido associados aosfenótipos de resistência, e esta dissertação tem como objetivo explorar o papel do transportador da membrana citoplasmática a proteína de resistência a múltiplos fármacos do Plasmodium falciparum 1 (PfMRP1) na resistência a AL. De modo a compreender o papel do PfMRP1 na resistência a AL, o tema foi abordado de duas maneiras: in vivo, onde a resposta transcricional e a prevalência de polimorfismos no pfmrp1 foram analizadas em amostras clínicas provenientes de ensaios clínicos de arteméter-lumefantrina; e in vitro, onde o impacto do pfmrp1 foi estudado controlando o fundo genético do parasita aplicando diferentes estratégias de modificação do genoma. In vivo, a análise transcricional revelou que o gene que codifica o PfMRP1 (pfmrp1) é induzido nas primeiras horas após o tratamento e um novo polimorfismo de um único nucleótido (SNP) foi identificado no pfmrp1. Aplicando diferentes estratégias de modificação do genoma, a sobreexpressão, o nocaute e a troca alélica dos SNPs mais prevalentes do PfMRP1 foram exploradas utilizado o sistema da integrase Bxb1, nucleases de dedo de zinco e o sistema CRISPR/Cas9. Apesar de avanços alcançados com estas estratégias ainda é necessário um maior aprofundamento para alcançar uma conclusão sólida sobre o papel do PfMRP1 na resistência a fármacos. Compreender o papel dos diferentes mecanismos relacionados com a resistência a antimaláricos em P. falciparum é fundamental para a gestão das terapias antimaláricas. De modo geral, a dissertação proporciona avanços na compreensão do papel do PfMRP1 na resistência a antimalários, em particular para a principal ACT a terapia com AL.

Introduction: Mastery of history taking and physical exam skills is a key competence of medical students. Objective Structured Clinical Examinations are the gold standard to assess these competencies, but their implementation in Portugal is poorly documented. We describe the implementation and our seven years experience with a high-stakes Objective Structured Clinical Examination to assess these skills in the School of Medicine, University of Minho. Material and Methods: Our Objective Structured Clinical Examination is in place since 2010 and has been subject to continuous improvements, including the adoption of a standard setting procedure and an increase in the number of stations. Results: Grades in our exam are well distributed and discriminate among students. History taking grades are lower and have remained stable throughout the years while physical examination scores have risen. The exam is reliable, with internal consistency above 0.45 and a G-coefficient of 0.74. It is also feasible, with a total testing time of approximately 20 hours for 140 students, and the involvement of 18 standardized patients and 18 faculty assessors. More importantly, it was able to engage the students, who recognize its importance. Discussion: The most important validity criterion of our, and any Objective Structured Clinical Examination, would be predictive validity, the ability to predict the performance of students in the clinical context. Conclusion: Our approach to a high-stakes Objective Structured Clinical Examination shows that it is feasible, reliable, valid and fair and can be implemented with success in the Portuguese setting., Introdução: O domínio das aptidões de colheita de história e do exame físico é uma competência chave para os estudantes de medicina. Os Exames Clínicos Objetivos Estruturados são o padrão para avaliar estas competências, mas a sua implementação em Portugal está pouco documentada. Descrevemos a implementação e a nossa experiência de sete anos, com um Exame Clínico Objetivo Estruturado para avaliar estas aptidões na Escola de Medicina da Universidade do Minho. Material e Métodos: O nosso Exame Clínico Objetivo Estruturado existe desde 2010 e tem sido sujeito a melhorias contínuas, das quais se destacam a adoção de um procedimento de standard setting e o aumento do número de estações. Resultados: As notas no nosso exame estão bem distribuídas e discriminam entre estudantes. As notas da colheita da história são inferiores e têm permanecido estáveis ao longo do tempo, enquanto as do exame físico têm aumentado. O exame é fiável, tendo uma consistência interna acima de 0,45 e um coeficiente G de 0,74. Também é praticável, tendo um tempo total de teste de 20 horas para 140 alunos, envolvendo 18 pacientes estandardizados e 18 examinadores. Mais importante, o Exame Clínico Objetivo Estruturado foi capaz de cativar os estudantes, que reconhecem a sua importância para a sua formação. Discussão: O mais importante critério de valor do nosso, e de qualquer outro Exame Clínico Objetivo Estruturado, será o seu valor preditivo, que se traduz na faculdade de prever o desempenho dos estudantes em contexto clínico. Conclusão: A nossa abordagem para um Exame Clínico Objetivo Estruturado mostra que é praticável, fiável, válido e justo e que pode ser implementado com sucesso no contexto português, info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Supplementary material: http://www.jimmunol.org/content/suppl/2016/11/12/jimmunol.1600584.DCSupplemental, Tuberculosis causes ∼1.5 million deaths every year, thus remaining a leading cause of death from infectious diseases in the world. A growing body of evidence demonstrates that type I IFN plays a detrimental role in tuberculosis pathogenesis, likely by interfering with IFN-γ–dependent immunity. In this article, we reveal a novel mechanism by which type I IFN may confer protection against Mycobacterium tuberculosis infection in the absence of IFN-γ signaling. We show that production of type I IFN by M. tuberculosis–infected macrophages induced NO synthase 2 and inhibited arginase 1 gene expression. In vivo, absence of both type I and type II IFN receptors led to strikingly increased levels of arginase 1 gene expression and protein activity in infected lungs, characteristic of alternatively activated macrophages. This correlated with increased lung bacterial burden and pathology and decreased survival compared with mice deficient in either receptor. Increased expression of other genes associated with alternatively activated macrophages, as well as increased expression of Th2-associated cytokines and decreased TNF expression, were also observed. Thus, in the absence of IFN-γ signaling, type I IFN suppressed the switching of macrophages from a more protective classically activated phenotype to a more permissive alternatively activated phenotype. Together, our data support a model in which suppression of alternative macrophage activation by type I IFN during M. tuberculosis infection, in the absence of IFN-γ signaling, contributes to host protection., This work was supported by the Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal, cofunded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), Quadro de Referência Estratégico Nacional, through the Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (PTDC/SAU-MII/101977/2008 and PTDC/BIA-BCM/102776/2008); by the Francis Crick Institute, which receives its core funding from Cancer Research U.K. (FC001126), the U.K. Medical Research Council (FC001126), and the Wellcome Trust (FC001126); by the U.K. Medical Research Council (MR/U117565642/1); and by the European Research Council (294682-TB-PATH). This work was also supported by Research Grant 2015 from the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (to M.S.). L.M.-T. was funded by the Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BPD/77399/2011) and the European Research Council (294682-TB-PATH). The M.S. laboratory was financed by Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) funds through the COMPETE 2020-Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, and by Portuguese funds through Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal, in the framework of the Institute for Research and Innovation in Health Sciences project (POCI-01-0145-FEDER-007274). M.S. is a Fundação para a Ciência e Tecnologia Associate Investigator. E.T. is a Fundação para a Ciência e Tecnologia Auxiliary Investigator.

Although electrical neurostimulation has been proposed as an alternative treatment for drug-resistant cases of epilepsy, current procedures such as deep brain stimulation, vagus, and trigeminal nerve stimulation are effective only in a fraction of the patients. Here we demonstrate a closed loop brain-machine interface that delivers electrical stimulation to the dorsal column (DCS) of the spinal cord to suppress epileptic seizures. Rats were implanted with cortical recording microelectrodes and spinal cord stimulating electrodes, and then injected with pentylenetetrazole to induce seizures. Seizures were detected in real time from cortical local field potentials, after which DCS was applied. This method decreased seizure episode frequency by 44% and seizure duration by 38%. We argue that the therapeutic effect of DCS is related to modulation of cortical theta waves, and propose that this closed-loop interface has the potential to become an effective and semi-invasive treatment for refractory epilepsy and other neurological disorders., We are grateful for the assistance from Jim Meloy for the design and production of the multielectrode arrays as well as setup development and maintenance, Laura Oliveira, Terry Jones, and Susan Halkiotis for administrative assistance and preparation of the manuscript. This work was funded by a grant from The Hartwell Foundation., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Objective: to describe the process of adaptation and validation of the Nursing Activities Score to the Portuguese context. Method: this was a pilot study of adaptation and validation of the Nursing Activities Score with a sample consisting of 67 patients hospitalized in the intensive care units of three Portuguese hospitals. The construct validity was assessed through factor analysis procedures and the internal consistency of the items was measured through the Cronbach’s alpha coeffi cient. Results: a mean workload value of 63.04% (SD = 14.25; Median = 61.30) was obtained. Psychometric data revealed a Cronbach’s alpha of 0.71 in the total scale, indicating an acceptable accuracy. Confi rmatory factor analysis suggested an appropriate adjustment between the model and the data (χ2 (199) = 214.5, p = 0.214; CFI = 0.95; RMSA = 0.035). Conclusion: in the present study, the Portuguese version of the Nursing Activities Score was found to be a valid instrument, enabling a safe assessment of the workload of nurses., Objetivo: descrever o processo de adaptação e validação do Nursing Activities Score para o contexto português. Método: trata-se de um estudo-piloto de adaptação e validação do Nursing Activities Score, com amostra de 67 doentes internados em unidades de cuidados intensivos de três hospitais portugueses. A validade de constructo avaliou-se mediante procedimentos de análise fatorial e a consistência interna dos itens através do coefi ciente Alpha de Cronbach. Resultados: obteve-se um valor médio da carga de trabalho de 63,04% (DP = 14,25; Mediana = 61,30). Os dados psicométricos revelaram um Alpha de Cronbach de 0,71, na escala total, indicando uma fi delidade aceitável. A análise fatorial confi rmatória sugeriu um ajustamento adequado entre o modelo e os dados (χ2(199) = 214,5, p = 0,214; CFI = 0,95; RMSA = 0,035). Conclusão: neste estudo, a versão portuguesa do Nursing Activities Score revelou-se um instrumento válido, permitindo avaliar a carga de trabalho dos enfermeiros com segurança, Objetivo: describir el proceso de adaptación y validación del Nursing Activities Score al contexto portugués. Método: estudio piloto de adaptación y validación del Nursing Activities Score, con muestra de 67 pacientes internados en unidades de cuidados intensivos de tres hospitales portugueses. La validez del constructo se evaluó mediante análisis factorial y por consistencia interna de los ítems evaluados a través del coefi ciente Alpha de Cronbach. Resultados: se obtuvo un valor medio de carga de trabajo de 63,04% (SD=14,25; Mediana=61,30). Los datos psicométricos expresaron un Alpha de Cronbach de 0,71 en la escala total, indicando fi delidad aceptable. El análisis factorial confi rmatorio sugirió un ajuste adecuado entre el modelo y os datos (χ2 (199)=214,5; p=0,214; CFI=0,95; RMSA=0,035). Conclusión: en este estudio, la versión portuguesa del Nursing Activities Score demostró ser un instrumento válido, permitiendo evaluar la carga de trabajo de los enfermeros con precisión.

Em 2006 (DL 101/2006) foi criada a Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados (RNCCI). Consiste num novo nível de cuidados do Serviço Nacional de Saúde constituído por tipologias de internamento e de cuidados domiciliários. Na sua génese esteve a ambição de dar respostas efetivas face a uma série de problemas específicos, entre eles, o progressivo envelhecimento da população, o aumento da prevalência das doenças crónicas incapacitantes e a escassa cobertura de serviços de cuidados continuados integrados em território nacional. O presente relatório resulta de um estudo exploratório de perfil quantitativo com design intersujeitos e intrasujeitos. Trata-se de uma amostra não probabilística, de conveniência ou acidental, incluindo 891 pessoas dependentes e respetivos familiares cuidadores acompanhados pelos 10 prestadores de cuidados da RNCCI da área de abrangência da ECL do ACES Alto Ave - região Minho de Portugal. Foi aplicado o formulário "Perfil dos Dependentes Integrados nos Prestadores de Cuidados da RNCCI” (Petronilho, Pereira, & Magalhães, 2014), no momento da admissão e na alta clínica, com critério temporal definido de 1 ano - entre 1 de março de 2014 e 28 de fevereiro de 2015. Dos principais resultados desta investigação, conclui-se: 1) a prestação de cuidados no âmbito da RNCCI, apesar do padrão de dependência e sua evolução manifestarem-se de formas distintas entre as diferentes tipologias de cuidados, promove melhoria efetiva na condição de saúde das pessoas dependentes, com especial enfoque nos processos corporais e no nível de dependência no autocuidado; 2) há um tempo útil para promover maior independência/autonomia após um evento gerador de dependência, aspeto crucial para a definição e implementação de modelos de intervenção com efetividade; 3) o regresso ao domicílio por parte da grande maioria dos dependentes é um dado muito relevante e vai de encontro à vontade manifestada por parte da maioria das famílias portuguesas. 4) sugere-se a necessidade de uma efetiva sistematização no planeamento e continuidade de cuidados após o regresso a casa dos dependentes, nomeadamente, maior suporte da rede formal.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde., The ability of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to be transmitted from host to host is not well understood. Previous molecular epidemiology studies have shown that while some clinical strains of Mtb are able to cause infection and disease in a large number of individuals exposed to them, others are confined in their transmission, despite the ample chance for the spread of the infection. Since preventing transmission of Mtb is the key to a continued decline in tuberculosis cases, understanding the host and bacterial factors that are associated with transmissibility could be useful in developing strategies to prevent transmission. Previous work has focused on cluster size as a measurable proxy for transmissibility, and several studies have found that host risk factors are associated with clustering and cluster size. This thesis set out to explore if and what bacterial factors, such as phylogenetic lineage and genomic markers, lie behind an increased transmissibility phenotype. We describe a novel approach, called the Propensity to Propagate (PPP), with which to adjust for host risk factors when quantifying transmissibility. Using this method, we found no significant differences to propagate between four different lineages within the Netherlands, as measured by molecular-typing defined cluster sizes. When looking more specifically at infectivity (as defined by mean number of positive contacts around each patient) and number of secondary cases within two years after diagnosis of an index case sharing the same fingerprint, we found evidence of phylogenetic lineage influencing these two indicators, namely, a decreased ability to infect and a lower secondary case rate in ancient phylogenetic lineages (Mycobacterium africanum and EAI) compared to their modern counterparts (Euro-American, Beijing, and CAS). One simple approach to discovering more specific genetic regions behind transmissibility involves checking the absence/presence of mutations in the genes of interest between transmissible and nontransmissible phenotypes. In one of our studies, a multivariate logistic regression-based analysis of patient-, microorganism- and disease-related factors failed to reveal any significant association between frameshift-causing indels in Mycobacterium cyclase/LuxR-like genes (mclxs) and transmissibility. Finally, using a large, well-characterized, complete data set of typed strains to identify strains found in large clusters as a proxy for a transmission phenotype as well as related strains that have not been transmitted, we selected 100 bacterial isolates after controlling for epidemiologic and host factors that may influence transmission. After whole genome sequencing, we subjected them to evolutionary convergence analysis. We identified six bacterial DNA regions - espE, PE-PGRS33, PE-PGRS56, Rv0197, Rv2813-14c and Rv2815-16c - to be associated with Mtb transmission and validated these regions by studying the response of human white blood cells to extracts from a subset of the tuberculosis bacteria that carried or did not carry mutations in these DNA regions. We show that there are differences in the immune response – as reflected by in vitro monocyte and T-cell cytokine production, reactive oxygen species release and neutrophil apoptosis - that associate with these genetic changes. These findings not only contribute to our understanding of the interplay of bacterial factors in creating more successful strains at transmitting, but also have implications in the future of disease surveillance and curbing of transmission, by providing for instance tools with which to flag patients carrying particularly transmissible strains., A forma com que a bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é transmitida de um hospedeiro para outro não está ainda bem estudada. Estudos de epidemiologia molecular têm demonstrado que, enquanto que algumas estirpes de Mtb tendem a causar infecção e doença num grande número de indivíduos, sugerindo uma grande capacidade de transmissão entre estes, outras apresentam uma propagação restrita, independentemente de terem elevadas oportunidades de disseminação. Uma vez que a prevenção da transmissão da Mtb é fundamental para o declínio continuado da tuberculose, o estudo dos fatores bacterianos que estão associados à transmissibilidade poderá ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo da tuberculose. Trabalhos anteriores focaram-se no tamanho dos clusters como medida de transmissibilidade, e vários estudos demonstraram uma associação entre os fatores de risco do hospedeiro e o agrupamento e tamanho dos clusters. Nesta foi explorada a existência de fatores bacterianos, tais como linhagem filogenética ou marcadores genéticos, responsáveis por um fenótipo de maior ou menor transmissibilidade. Descrevemos assim uma nova abordagem, chamada propensão para propagar (PPP), com a qual é possível corrigir o viés dos factores de risco do hospedeiro na quantificação da transmissibilidade de uma estirpe. Ao aplicar este método não foi possível detectar diferenças significativas de propagação - considerando o tamanho de clusters definidos por tipagem molecular - entre quatro linhagens diferentes presentes na Holanda. Mas uma análise específica da capacidade de infetar (definida pelo número médio de contatos positivos de cada doente) e do número de casos secundários, no espaço de dois anos após o diagnóstico de um caso índice com o mesmo perfil genético, determinou que a linhagem filogenética influencia estes dois indicadores. Concretamente, as linhagens filogenéticas mais antigas (Mycobacterium africanum e EAI) apresentam uma menor capacidade de infectar e um menor número de casos secundários quando comparadas com as suas equivalentes modernas (Euro-Americano, Beijing, e CAS). Uma abordagem simples para identificar regiões genéticas específicas responsáveis pelas diferenças na transmissibilidade das estirpes envolve a análise da distribuição de mutações nos genes de interesse entre o fenótipo transmissível e o não-transmissível. Neste sentido uma análise baseada em regressão logística multivariada de fatores relacionados com o doente, o microorganismo ou a doença, não revelou qualquer associação significativa entre frameshift-causing indels (a presença de inserções ou deleções nucleotídicas causando a interrupção precoce da grelha de leitura dos genes) em genes Mycobacterium ciclase / LuxR-like (mclxs) e a transmissibilidade. Finalmente, uma grande coleção de isolados bem caracterizados e sujeitos a tipagem molecular foi usada para identificar estirpes pertencentes a clusters grandes - representativas de um fenótipo de transmissão elevada - bem como estirpes com propagação limitada. Selecionamos 100 estirpes tendo em consideração os factores epidemiológicos do hospedeiro com influência na transmissibilidade da estirpe. Após sequenciação do genoma, estas estirpes foram submetidas a uma análise de convergência evolutiva. Identificamos seis genes/regiões intergénicas - Espe, PE PGRS33, PE PGRS56, Rv0197, e Rv2815-16c Rv2813-14c - como estando associados com a transmissão de Mtb, e validamos estes resultados através da análise da resposta de leucócitos a extractos de bactérias com ou sem as mutações nos seis genes/regiões intergénicas mencionados. Demostramos que existem diferenças na resposta imunitária – em termos da produção in vitro de citoquinas pelos monócitos e células T, espécies reativas de oxigénio e apoptose de neutrófilos - associadas às alterações genéticas estudadas. As conclusões desta tese não só contribuem para a melhor compreensão da interação de fatores bacterianos no estabelecimento de linhagens com uma maior transmissibilidade, como têm implicações para o futuro da vigilância e contenção da transmissão, providenciando, por exemplo, as ferramentas necessárias para a identificação de doentes portadores de estirpes particularmente transmissíveis.

Tese de Doutoramento em Medicina, O sono é essencial à vida, e quando perturbado tem um efeito extremamente prejudicial na saúde humana. Apesar do crescente reconhecimento da importância do sono, não há muito para oferecer aos pacientes que sofrem de distúrbios do sono. Os tratamentos atuais não produzem os mesmos resultados que o sono normal satisfaz, são altamente inespecíficos e rapidamente tolerados pelos doentes. Encontrar mecanismos reguladores do sono, certamente melhorará os padrões de qualidade de vida. Neste trabalho em Drosophila, identificámos TARANIS (TARA), um gene em homólogo da família de coreguladores de transcrição Trip-Br (SERTAD), necessários para os padrões normais de sono. Através de um rastreio genético, isolámos mutantes de tara com uma redução marcada na quantidade de sono. tara codifica uma proteína do ciclo celular que contém um domínio conservado de ligação à Ciclina-A (CycA). TARA regula os níveis da proteína CycA e interage genetica e fisicamente com a CycA para promover o sono. Além disso, a diminuição dos níveis da proteína Cinase dependente da Ciclina 1 (Cdk1), um parceiro da CycA, resgata o fenótipo de sono nos mutantes de tara e CycA, enquanto o aumento da actividade de Cdk1 reproduziu os fenótipos de tara e CycA, o que sugere que a proteína Cdk1 medeia o papel de TARA e CycA na regulação do sono. Além do papel na regulação do sono, os mutantes tara apresentam um comportamento locomotor arrítmico em condições de escuridão constante (DD). Apesar dos mecanismos pelos quais a TARA regula o comportamento circadiano serem desconhecidos, mostrámos que TARA regula a velocidade do oscilador molecular circadiano e o débito neuropeptidico dos neurónios pacemaker. À semelhança dos mutantes Clock (Clk), os mutantes tara exibem um padrão de atividade noturna em condições dia/noite (LD). Além disso, a abolição da expressão de tara ou a sua sobreexpressão nos neurónios sLNvs alteram a morfologia da sua projeção dorsal. Em conjunto, estes resultados sugerem que a TARA é importante em vários passos que comunicam as oscilações moleculares para o comportamento locomotor circadiano. No presente trabalho, descrevemos uma nova via genética que controla o sono em Drosophila. Esta via genética é conservada em mamíferos e tem o potencial de regular o sono em seres humanos, por um mecanismo semelhante. Além disso, neste trabalho desvendámos outros fenótipos sob o controlo da TARA, que podem ser usados para projectar experiências futuras direccionadas à compreensão da morfologia neuronal e dos padrões diários de vigília/sono., Sleep is essential for life, and when disturbed has a deleterious effect in human health. Despite the increased awareness of the importance of sleep, not much can be offered to patients suffering from sleep disorders. The current treatments do not produce the same results as real sleep does, are highly unspecific, and quickly tolerated by patients. Finding novel sleep regulatory mechanisms will certainly improve the quality of life. In this work, we identify TARANIS (TARA), a Drosophila homolog of the Trip-Br (SERTAD) family of transcriptional coregulators, as a molecule that is required for normal sleep patterns. Through a forward-genetic screen, we isolated tara as a novel sleep gene associated with a marked reduction in sleep amount. tara encodes a conserved cell-cycle protein that contains a Cyclin A (CycA)-binding homology domain. TARA regulates CycA protein levels and genetically and physically interacts with CycA to promote sleep. Furthermore, decreased levels of Cyclin dependent kinase 1 (Cdk1), a kinase partner of CycA, rescue the short-sleeping phenotype of tara and CycA mutants, while increased Cdk1 activity mimics the tara and CycA phenotypes, suggesting that Cdk1 mediates the role of TARA and CycA in sleep regulation. In addition to the role in the regulation of sleep, tara mutants exhibit arrhythmic locomotor behavior in constant darkness (DD). However, the mechanisms through which TARA regulates circadian behavior are unknown. Here, we show that TARA regulates the speed of the molecular oscillator and the neuropeptide output of the pacemaker neurons. Similarly to Clock (Clk) mutants, tara mutants display a nocturnal pattern of activity in light:dark conditions (LD). Furthermore, tara knockdown or overexpression in sLNvs alters the morphology of their dorsal projection. Taken together, our data suggest that tara functions in multiple steps that link molecular cycling to overt circadian locomotor behavior. In these work, we describe a novel genetic pathway that controls sleep in Drosophila. This genetic pathway may be conserved in mammals and holds the potential to regulate sleep in humans as well. Furthermore, in this work we unravel other phenotypes under the control of tara, which can be used to design future experiments aimed at understanding neuronal morphology and the daily patterns of wakefulness/sleep., Fundação para a Ciência e a Tecnologia - SFRH/BD/51726/2011.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde., A fundamental hallmark of modern neuroscience lies on the realization that, similarly to what happens in other tissues of our body, the adult mammalian central nervous system is endowed with considerable regenerative potential. This regenerative capacity is reflected in cellular processes defining the so-called neural plasticity, which include rapid and dynamic axo-dendritic remodelling of post-mitotic cells, as well as the ability of restricted brain regions to persistently generate new neuronal and glial cells, a process known as neuroand gliogenesis, respectively. Together, neural plasticity confers to the mammalian brain a wide adaptive capability to redefine neuro-glial circuits, in response to every-day-life experiences and challenges. Reflecting the plastic nature of the adult brain, the hippocampus harbors different forms of neural plasticity, which have been implicated in different cognitive and emotional functions. Indeed, besides exhibiting forms of functional and structural dendritic plasticity, the hippocampus constitutes one of the two adult brain regions in which neurons are continuously generated throughout life. The importance of hippocampal neural plasticity extends beyond basal physiological contexts, as it serves as a pathological target in different neurological and psychiatric diseases. In particular, the hippocampus is considered a major gateway for the translation of the systemic stress-response into deleterious effects on neural plasticity, that are also included in the pathophysiology of diseases in which stress has a major etiological role, such as depression. In fact, not only has depression been linked to impoverished neuronal dendritic arborization and reduced cytogenesis within the hippocampus, but, also, antidepressant therapeutical efficacy has been suggested to be associated with the ability to reverse the aforementioned plastic alterations. Even so, the specific contribution of different forms of hippocampal plasticity in the onset and recovery from depression remains highly controversial. Following the initial reports claiming that hippocampal cytogenesis was fundamental to the antidepressant action, we and others have reported that the short-term improving actions of antidepressants depended on dendritic remodeling, rather than on cytogenesis. However, the longitudinal course of depression, as well as the full extent of the cytogenic process have often been neglected, since several studies have focused their analysis shortly after cytogenesis ablation, when newborn cells were yet to be fully differentiated and integrated in pre-existing circuits. In the work comprised in this thesis, we have arrested adult cytogenesis in naïve animals through the administration of the cytostatic agent methylazoxymethanol (MAM) and analyzed the long-term behavioral consequences four weeks after. Cytogenesis ablation was sufficient to induce core symptoms of depression, such as anhedonic behavior, as well as other behavioral traits known to be highly comorbid in depressive patients, namely heightened anxiety and cognitive impairments. Moreover, work with a genetic model of cytogenesis ablation, the glial acidic fibrillary protein (GFAP) - tyrosine kinase (Tk) rat, revealed a time-dependent manifestation of behavioral impairments following cytogenesis ablation. Analysis conducted immediately after ablation in GFAP-Tk animals showed that while cytogenesis suppression can elicit short-term anxiety-like behavior, no alterations were produced in hedonic behavior or cognitive performance. Contrastingly, when conducting behavioral analysis 4 weeks post-ablation, the already present anxiety traits were accompanied with anhedonic behavior, as well as cognitive deficits related with spatial reference memory, behavioral flexibility, contextual fear memory and pattern separation. Interestingly, animals with ablated cytogenesis displayed impaired electrophysiological communication between the hippocampus and the prefrontal cortex, possibly contributing to the described behavioral alterations. Besides exploring the effects of cytogenesis ablation on the precipitation of depressive-like phenotype, we sought to analyze the importance of adult cytogenesis to the long-term spontaneous and antidepressant-induced behavioral recovery. Hence, we have submitted young-adult rats to an unpredictable chronic mild stress (uCMS) protocol to induce core symptom of depressive-like behavior. During the last two weeks of uCMS, animals were treated with the antidepressants fluoxetine and imipramine, either alone or coadministered with MAM, and allowed to recover during the four subsequent weeks. The long-term behavioral profile of rats suggests that ongoing cytogenesis is essential for long-term recovery from some emotional deficits (anhedonia and anxiety-like signs) and cognitive impairments (working memory and behavioral flexibility). Furthermore, fluoxetine and imipramine antidepressants promoted the generation of new hippocampal cells that, are able to survive and successfully integrate the pre-existing circuits, counteracting the deleterious effects induced by cytogenesis arrest. Finally, and in light of evidence linking epigenetic DNA methylation with the pathophysiology of depression, we sought to explore whether the recently described pathway of DNA demethylation could be modulated by stress and antidepressant therapy and therefore participate in the pathology of the disease. We have detected decreased levels of DNA hydroxymethylation in the dorsal, but not in the ventral, hippocampus, which was correlated with decreased expression of tet3 in the same region. Strikingly, monoaminergic antidepressants were able to revert these alterations. The dichotomy dorsal vs ventral is also evident in the pattern of genomic locci differentially hydroxymethylated by stress and antidepressants that differs between the dorsal and ventral hippocampal poles., Uma característica fundamental que timbra aquilo que é a neurociência moderna relaciona-se com facto de reconhecermos que, à semelhança do que acontece noutros tecidos do nosso corpo, o sistema nervoso central é dotado de um considerável potencial regenerativo. Esta capacidade regenerativa reflete-se em processos celulares que definem a chamada plasticidade neural, dentro da qual se incluem a rápida remodelação axo-dendrítica de células pós-mitóticas, assim como a capacidade de áreas restritas do cérebro gerarem continuamente novas células neuronais e gliais, processo este conhecido por neuro- ou gliogénese, respectivamente. Em conjunto, os fenómenos neuroplásticos conferem ao cérebro mamífero uma vasta capacidade adaptativa na redefinição de circuitos neuro-gliais, em resposta às experiências e desafios do nosso quotidiano. Em particular, o hipocampo assume um papel preponderante na translação da resposta sistémica ao stress em efeitos deletérios ao nível da plasticidade neural. Assim, este comprometimento de diferentes formas de plasticidade neural integra, pois, a patofisiologia de doenças nas quais o stress é um importante factor etiológico, como é o caso da depressão. De facto, a doença depressiva não só foi associada a defeitos atróficos na estrutura dendrítica e a citogénese diminuída no hipocampo, como também a eficácia dos fármacos antidepressivos foi relacionada com a capacidade destes de reverterem aqueles défices neuroplásticos. Contudo, a contribuição específica de diferentes formas de plasticidade hippocampal para o desenvolvimento e recuperação da doença depressiva permanece altamente controversa. Após estudos pioneiros que reportaram que a citogénese hipocampal seria fundamental para a acção dos fármacos antidepressivos, nós demonstrámos que os efeitos terapêuticos a curto-prazo destas drogas dependia antes da remodelação dendrítica, em detrimento do processo citogénico. No entanto, o curso longitudinal da depressão, assim como a completa extensão do processo citogénico têm vindo a ser largamente negligenciados, uma vez que vários estudos focaram a sua análise pouco tempo após a conclusão do tratamento cito-ablativo, numa altura em que as células que seriam formadas teriam ainda que completar o seu processo de maturação e integração nos circuitos pré-existentes. No trabalho que constitui a presente tese, promovemos a ablação da citogénese adulta em animais naíve mediante a administração do agente citostático metilazoximetanol (MAM) e analisámos as consequências a longo-prazo no perfil comportamental dos animais. A ablação da citogénese revelou-se suficiente para induzir sintomas cardinais da doença depressiva, como é o caso de comportamento anedónico, assim como outros traços comportamentais descritos como comorbilidades frequentes em doentes depressivos, nomeadamente manifestações de ansiedade e défices cognitivos. A utilização de um segundo modelo genético de ablação de citogénese, ratos glial acidic fibrillary protein (GFAP)-tyrosine kinase (Tk), revelou o desenvolvimento tempo-dependente de défices comportamentais após ablação. Análises efectuadas imediatamente após ablação em animais GFAP-Tk, revelaram que a supressão da citogénese induz a exacerbação de comportamento ansioso a curto-prazo, não se tendo verificado alterações hedónicas ou na performance cognitiva. Em contraste, quando realizada a análise 4 semanas após a ablação citogénica, ao comportamento ansioso associavam-se também anedonia e défices ao nível da memória espacial, flexibilidade comportamental, memória emocional e em tarefas de pattern separation. Animais com citogénese suprimida revelaram défices na comunicação electrofisiológica entre o hipocampo e o córtex prefrontal, o que poderá contribuir para as alterações comportamentais identificadas. Para além do estudo dos efeitos da ablação da citogénese na precipitação do fenótipo depressivo, procurámos ainda analisar a importância da citogénese adulta na recuperação deste fenótipo a longo-prazo, quer espontânea, quer induzida por fármacos antidepressivos. Submetemos ratos adultos ao protocolo de stress crónico imprevisível (uCMS) afim de induzirmos sintomas cardinais da doença depressiva. Durante as últimas 2 semanas de uCMS, os animais foram tratados com os antidepressivos fluoxetina e imipramina, quer isoladamente quer em co-tratamento com metilazoximetanol (MAM) e foram deixados a recuperar durante 4 semanas. O perfil comportamental dos animais sugere que a citogénese adulta é essencial para a recuperação a longo-prazo de défices emocionais (anedonia e comportamento ansioso) e cognitivos (memória de trabalho e flexibilidade comportamental). O tratamento com fluoxetina e imipramina promoveu a geração de novas células hipocampais que se revelaram capazes de sobreviver e integrar nos circuitos pré-existentes, revertendo os efeitos deletérios provocados pela supressão citogénica. Finalmente, à luz da evidência existente que estabelece uma associação entre a metilação do DNA e patofisiologia da depressão, explorámos se a recém descrita via de desmetilação do DNA poderia ser modelada pelo stress e tratamento antidepressivo e assim participar na patologia da doença depressiva. Detectámos um decréscimo nos níveis de hidroximetilação do DNA no hipocampo dorsal, mas não no ventral, que se correlacionava com uma diminuição na expressão de tet3 na mesma região. Importa notar que antidepressivos monoaminérgicos se revelaram capazes de reverter as alterações mencionadas. A dicotomia dorsal vs ventral parece ser também aqui evidente, uma vez que o padrão de locci genómicos que se detectaram ser diferencialmente hidroximetilados pelo stress e tratamento antidepressivo diferiam entre os pólos dorsal e ventral do hipocampo., SFRH/BD/77490/2011 (FCT)

Tese de Doutoramento em Medicina., In recent years, many efforts have been made by endoscopic surgeons to further minimize surgical trauma and invasiveness of their procedures. In a surgical approach, three aspects should be taken into account: the surgical access, the extension of surgical dissection and the amount of excised tissue. The surgical access should be the smallest possible to cause the lowest operative damage. The extension of operative dissection should be the minimal required in order to avoid unnecessary trauma or morbidity related to the procedure (e.g. lymphocele after lymphadenectomy or nervous injury during genital prolapse correction). The amount of extirpated or excised tissue should be the strictly necessary. There is no need to remove extra tissue what may cause supplementary damage. Therefore, we should tailor the surgery to reach our three previous objectives for reducing the surgical aggressiveness to the minimum possible. With a current emphasis on diminishing the visibility of scars, on increasing the surgical precision and on decreasing the amount of dissection, minilaparoscopy has reemerged as an appealing option for surgeons. Thus, in our research work we aimed to test the use of minilaparoscopic instruments in some innovative gynecological surgical procedures like the image-guided sentinel lymph node (SLN) approach and the genital prolapse correction. In our experiments, we confirmed the feasibility of the minilaparoscopic surgical approach for identification, and excision of SLN by an intraperitoneal acess. Furthermore, the feasibility and reliability of an extraperitoneal minilaparoscopic approach for SLN excision using a near infrared imaging system and indocyanine green was demonstrated. These procedures might be considered a potentially better alternative to traditional laparoscopy during staging procedures for gynecological malignancies. Concerning the genital prolapse correction, we demonstrated that minilaparoscopy is a reliable and attractive approach for sacrocolpopexy as it enhances cosmetics, keeping the low morbidity associated with the classical laparoscopic approaches. Moreover, we attested the feasibility of minilaparoscopic sacrocervicopexy after supra-cervical hysterectomy with specimen removal through the posterior vaginal cul-de-sac (NOSE). In our studies, we may have offered a contribution to minimize the aggressiveness of laparoscopic surgery in gynecology., Nos últimos anos, múltiplos esforços têm vindo a ser desenvolvidos pelos cirurgiões para minimizar a invasão e o trauma cirúrgicos dos seus procedimentos. Neste contexto, na abordagem cirúrgica, três aspetos devem ser tidos em consideração: o acesso cirúrgico, a extensão da dissecção cirúrgica e a quantidade de tecido removido. A dimensão do acesso deve ser a mais reduzida possível de modo a causar o menor trauma cirúrgico. A extensão da dissecção operatória deverá ser a mínima necessária, de forma a evitar-se morbilidade adicional relacionada com o procedimento (p.e. linfocelo após linfadenectomia ou lesão nervosa após correção do prolapso genital). A quantidade de tecido excisado deverá ser apenas a adequada. Assim, a cirurgia deve ser orientada no sentido de se cumprirem os objetivos previamente expostos com o propósito final de reduzir ao mínimo possível a agressividade cirúrgica. Recentemente, a minilaparoscopia reapareceu como uma alternativa à laparoscopia convencional, dadas as potenciais vantagens cosméticas e a precisão cirúrgica associadas. O nosso trabalho de investigação teve como objetivo demonstrar a viabilidade da minilaparoscopia em alguns procedimentos ginecológicos inovadores, tais como a abordagem guiada por imagem do gânglio sentinela e a correção laparoscópica do prolapso genital. O nosso estudo evidenciou que a abordagem cirúrgica minilaparoscópica por via intraperitoneal na identificação, dissecção e excisão do gânglio sentinela é uma alternativa à abordagem laparoscópica tradicional, podendo reduzir a morbilidade decorrente dos procedimentos de estadiamento das neoplasias ginecológicas. Num estudo subsequente, foi confirmada a viabilidade e fiabilidade da abordagem minilaparoscópica por via extraperitoneal na identificação, dissecção e excisão do gânglio sentinela corado por indocianina verde, usando uma camera multiespectral de fluorescência. Na correção do prolapso genital, a minilaparoscopia demonstrou ser uma opção viável na sacrocolpopexia apresentando benefícios cosméticos, mantendo a baixa morbilidade associada à abordagem laparoscópica convencional. Finalmente, num outro estudo descrevemos uma técnica inovadora de tratamento do prolapso genital que consistiu na sacrocervicopexia após histerectomia supra-cervical usando instrumentos minilaparoscópicos, com a remoção da peça operatória através do fundo de saco vaginal posterior (NOSE). O nosso trabalho de investigação contribuiu para uma futura minimização da agressividade da cirurgia laparoscópica em ginecologia.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Depression is a complex multidimensional disorder affecting around 20% of the world population. Nevertheless, its pathophysiology is still incompletely understood. Currently available antidepressant treatments are ineffective in a significant proportion of the depressed patients and relapse rates are high, emphasizing the need for better therapeutic strategies. Depression is thought to result from the interplay between genetic predisposition and environmental factors, such as stress, a major precipitating factor for depression. Depressed individuals and chronic stress animal models of depression present impairments in several systems, including neurotransmitters, neuroimmune, endocrine systems and neurotrophic factors. Adult brain retains the capacity to adapt and re-organize neural networks in response to stimuli. This ability to change occurs in several brain regions and is called neural plasticity. Neural plasticity phenomena include synapto-dendritic changes and the generation of new cells. Neural plasticity impairments in specific brain regions are involved in the pathophysiology of depression. One of these regions is the hippocampus, which is involved in several forms of memory and in stress response. Moreover, the hippocampus comprises one of the few brain regions in the adult brain where neurogenesis occurs, the dentate gyrus (DG). Previous works showed that decreased cell genesis and dendritic morphology alterations are detected in the hippocampus of depressed individuals and animal models of depression, whereas antidepressant treatment prevents these changes. Here, we used a validated rat model of depression, the unpredictable chronic mild stress (uCMS), to explore the molecular underpinnings of neural plasticity in the hippocampal DG (hDG), in the context of depression and antidepressant treatment. For that, in a first study we performed a transcriptome analysis, in the hDG of untreated depressive-like animals and after chronic treatment with either fluoxetine, imipramine, tianeptine or agomelatine. Behavioral characterization and neuromorphological analysis in the DG revealed that all antidepressants, except agomelatine, were able to reverse the depressive-like profile and the dendritic plasticity impairments induced by uCMS. UCMS-exposure produced molecular changes that were partly reversed by antidepressants. Interestingly, agomelatine reversed less uCMS-induced changes compared to other treatments. In general, fluoxetine impacted more on neurons to reduce the expression of pro-inflammatory response genes, promoting the expression of cell metabolism-related molecules. Imipramine and tianeptine presented similar molecular profiles, promoting pathways related to cellular protection. Agomelatine produced changes in several pathways, namely on Rho-GTPase-related pathways, impacting on neurons and oligodendrocytes. In summary, antidepressants belonging to different pharmacological classes generated distinct molecular profiles that may be useful in different clinical contexts. In a second study, we aimed to assess the cell cycle mechanisms regulating hippocampal cell proliferation in the context of depression and antidepressant treatment. For that we used both in vivo - uCMS rat model -and in vitro - rat hippocampal-derived neurospheres - approaches. UCMS-exposed animals presented decreased proliferation and generation of newborn neurons that were reversed by fluoxetine. In our in vivo model, results suggest that uCMS-exposure produces a cell cycle arrest in the hDG progenitor cells that is accompanied by decreased levels of cyclins D1, E and A expression. Chronic fluoxetine treatment reversed the G1 phase arrest and increased cyclin E expression. Dexamethasone (DEX), used to mimic the elevation of glucocorticoids after chronic stress, decreased proliferation in vitro, whereas the administration of serotonin (5-HT), a neurotransmitter involved in the actions of fluoxetine, partly reversed this decrease. DEX also induced a G1-phase arrest, decreasing the expression of cyclins D1, cyclin D2 and Cdk6, while increasing p27 expression. 5-HT treatment partly reversed the G1-phase arrest and restored the expression of cyclin D1 and Cdk6. These results suggest that the anti-proliferative actions of chronic stress in the adult hDG result from a glucocorticoid-mediated G1-phase arrest in the progenitor cells that may be overcome by antidepressant treatment. Together, these findings contribute to the identification of novel molecular players and targets underlying neural plasticity phenomena in the hDG in the context of depression, unravelling unique properties of different classes of antidepressant. This knowledge may help paving the way for the implementation of more personalized treatments and open new avenues for the development of novel antidepressant strategies. Future studies will further disclose the molecular changes in this and other brain regions implicated in depression and hopefully provide clues for forthcoming translational approaches in depressive patients., A depressão é uma doença complexa que afeta cerca de 20% da população mundial. No entanto, a patofisiologia da doença é ainda pouco compreendida. Uma parte significativa dos doentes não responde aos antidepressivos existentes e os índices de recidiva são elevados, sublinhando a necessidade de melhores estratégias terapêuticas. Pensa-se que a depressão resulte da interação entre predisposição genética e fatores ambientais, como por exemplo o stress, um dos principais fatores precipitantes da depressão. Indivíduos com depressão e modelos animais de stress crónico apresentam alterações em vários sistemas, incluindo sistemas de neurotransmissores, neuroimunológicos e endócrinos e fatores neurotróficos. O cérebro adulto mantém a capacidade de se adaptar e reorganizar as redes neurais em resposta a estímulos. Estas respostas, que incluem alterações sinapto-dendríticas e geração de novas células, ocorrem em várias regiões do cérebro e designam-se globalmente por plasticidade neural. Modificações na plasticidade neural em regiões específicas estão envolvidas na patofisiologia da depressão. Uma destas regiões é o hipocampo, região responsável por várias formas de memória e envolvida na resposta ao stress. É também no hipocampo que se encontra a circunvolução dentada (DG), uma das regiões neurogénicas do cérebro adulto. Em doentes com depressão e em modelos animais verifica-se uma diminuição da geração de novas células e alterações na morfologia dendrítica no hipocampo; estas alterações são prevenidas pela administração de antidepressivos. Neste trabalho, usou-se um modelo animal de depressão, o modelo de exposição a stress crónico moderado e imprevisível (uCMS), para identificar as bases moleculares da plasticidade neural no DG hipocampal (hDG), no contexto da depressão e do tratamento com antidepressivos. Num primeiro estudo, procedeu-se à análise do transcritoma no hDG de ratos com fenótipo do tipo depressivo e após tratamento com fluoxetina, imipramina, tianeptina ou agomelatina. A caracterização comportamental e a análise neuromorfológica no hDG revelaram que todos os antidepressivos, exceto a agomelatina, revertem o perfil do tipo depressivo e os défices de plasticidade dendrítica produzidos pelo uCMS. A exposição ao uCMS promoveu alterações moleculares que foram parcialmente revertidas pelo tratamento com antidepressivos. Curiosamente, a agomelatina reverteu um menor número de alterações quando comparada com os outros antidepressivos. Em geral, a fluoxetina teve um impacto significativo em neurónios, reduzindo a expressão de genes de resposta inflamatória e promovendo a expressão de moléculas relacionadas com metabolismo celular. A imipramina e a tianeptina apresentaram um perfil molecular semelhante, promovendo vias de sinalização relacionadas com a proteção celular. A agomelatina produziu alterações em diversas vias, nomeadamente em vias relacionadas com as Rho-GTPases, em neurónios e oligodendrócitos. Em suma, antidepressivos de diferentes classes farmacológicas induzem perfis moleculares distintos que podem ser úteis em diferentes contextos clínicos. Num segundo estudo, avaliaram-se os mecanismos de ciclo celular que regulam a proliferação hipocampal no contexto da depressão e do tratamento com antidepressivos. Usaram-se duas abordagens complementares: in vivo – o modelo animal uCMS – e in vitro – neuroesferas derivadas do hipocampo de rato. Os animais uCMS apresentaram uma diminuição da proliferação e da geração de novos neurónios que foram revertidas pela fluoxetina. A exposição ao uCMS produziu uma ligeira repressão da progressão do ciclo celular na fase G1, nas células progenitoras do hDG, que foi acompanhada por uma diminuição dos níveis de expressão das ciclinas D1, E e A. O tratamento crónico com fluoxetina reverteu esta repressão promovendo a expressão da ciclina E. In vitro, o tratamento com dexametasona (DEX), para mimetizar a elevação dos glucocorticóides (GCs) induzida pela exposição prolongada a stress, promoveu uma diminuição da proliferação. Por sua vez, a administração de serotonina (5-HT), neurotransmissor envolvido na ação da fluoxetina, reverteu parcialmente estas alterações. A DEX também induziu repressão do ciclo celular na fase G1, diminuindo a expressão das ciclinas D1, D2 e da Cdk6, e aumentando a expressão do p27. O tratamento com 5-HT reverteu parcialmente esta repressão e repôs a expressão da ciclina D1 e da Cdk6. Estes resultados sugerem que as ações anti-proliferativas do stress crónico no hDG adulto resultam de uma repressão na fase G1 em células progenitoras, mediada por GCs, que pode ser revertida pelo tratamento com antidepressivos. Em conjunto, estes resultados contribuem para a identificação de novos intervenientes na regulação dos fenómenos de plasticidade neural no hDG, na depressão, revelando ainda propriedades particulares de cada antidepressivo. Este conhecimento poderá auxiliar na implementação de tratamentos mais personalizados e encetar oportunidades para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Estudos futuros permitirão desvendar as alterações moleculares nesta e outras regiões do cérebro envolvidas na depressão, esperando-se que estas possam fornecer pistas importantes que promovam o estudo da depressão em pacientes., A tese de doutoramento aqui apresentada foi desenvolvida no âmbito de uma bolsa individual de doutoramento financiada pela FCT, com a referência SFRH/BD/77454/2011.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Bovine tuberculosis (bTB) is a chronic slow-progressing zoonotic disease of livestock and wildlife caused by infection with Mycobacterium bovis or the closely related Mycobacterium caprae, both members of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). In the Iberian Peninsula bTB is maintained in a multi-host pathogen system, with M. bovis and M. caprae circulating between sympatric wild ungulates and free-ranging domestic ungulates. This epidemiological model was investigated as part of the present PhD thesis in order to elucidate the mechanisms of intra- and inter-specific transmission and the spatial epidemiology of bTB in Iberian wildlife. A systematic bibliographic review of the epidemiology of bTB in Iberian Peninsula suggests it is an endemic disease of autochthonous wild ungulates, with wild boar ( Sus scrofa) and red deer ( Cervus elaphus) acting as maintenance hosts. Bovine tuberculosis is an emergent disease in these species, with expansion from a core high-prevalence area in south-western Iberian Peninsula being fuelled by high host densities. Such high densities are due to intensive management for hunting purposes, including interventions such as removal of predators, fencing, translocation, artificial provision of food and water and even medication. We investigated MTC excretion routes and concentration of MTC in biological samples from potential routes of excretion and reported for the first time the detection of MTC excretion from 83.0 % (CI95 70.8–90.8 %) of naturally-infected wild boar and red deer. MTC DNA was amplified in all types of excretion routes (oronasal, bronchial-alveolar, fecal and urinary). MTC concentrations greater than the minimum infective doses for cattle, red deer or wild boar were estimated in excretion routes from wild boar and red deer. Also for the first time we provided evidence for the existence of a proportion of super-shedders within the naturally-infected populations of these host species (28.2 % of infected wild boar, CI95 16.6–43.8 %; and 35.7 % of infected red deer, CI95 16.3–61.2 %). These super-shedders are responsible for a disproportionately large amount of MTC excretion from infected wild ungulates. Also we defined an improved protocol for the molecular detection and estimation of the concentration of MTC and M. bovis/ caprae DNA in environmental samples and applied this protocol to assess MTC environmental contamination in areas with well-described distinct bTB prevalence in wildlife. We reported for the first time the widespread occurrence of MTC DNA in the environment in areas where bTB has a high prevalence in wildlife. Seasonal rates of detection of MTC in environmental samples can be as high as 39.6 % (CI95 27.6–53.6 %) in the spring. This contamination was detected in all types of a priori defined risk sites, where wild and domestic ungulates assemble, such as feeding and watering places. We also assessed the spatial epidemiology of wildlife bTB in Portugal based on serological and bacteriological culture surveys. As a first step we confirmed that elutes from absorbent paper is a valuable new tool for bTB serological surveys in wild boar populations. Our data allowed for the confirmation of bTB as an emerging disease in wildlife in Portugal, documenting a 47 % increase in prevalence in one area from 2005-06 to 2009-14. Also we confirmed previous data suggesting a strong spatial structure of wildlife bTB, with 2 spatial clusters identified in south- and centraleasternmost Portugal, in the periphery of the high-prevalence core area in central-southwestern Iberian Peninsula. Further we obtained 2 geographical risk models of bTB in wildlife at national and regional scales, both models generally agreeing with independent studies reporting MTC isolation from wild hosts. These results have implications for the design of control programs in wildlife, including the selective targeting of super-shedder individuals in culling actions, the identification of high-risk transmission sites as targets for the implementation of biosecurity measures and risk-based surveillance and control based on spatial risk models., A tuberculose bovina (bTB) é uma doença zoonótica crónica e de progressão lenta, que afeta animais domésticos e selvagens, sendo causada pela infeção por Mycobacterium bovis ou por Mycobacterium caprae, ambos pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC). Na Península Ibérica a bTB é mantida num sistema multi-hospedeiro, em que M. bovis e M. caprae circulam em populações simpátricas de ungulados selvagens e domésticos. Este modelo epidemiológico foi objeto de estudo na presente tese de doutoramento, tendo em vista contribuir para o conhecimento dos mecanismos de transmissão intra- e inter-específica e da epidemiologia espacial da bTB na fauna selvagem Ibérica. Uma revisão sistemática da bibliografia sobre epidemiologia da bTB na Península Ibérica sugere que esta é uma doença endémica dos ungulados selvagens autóctones, sendo o javali ( Sus scrofa) e o veado ( Cervus elaphus) hospedeiros de manutenção. A bTB é uma doença emergente nestas espécies, sendo a expansão a partir do núcleo de alta prevalência no centro-sudoeste da Península Ibérica alimentado pelas altas densidades de hospedeiros selvagens. Essas densidades são mantidas artificialmente elevadas pelo maneio intensivo para fins cinegéticos, incluindo remoção de predadores, vedação, translocação, alimentação e abeberamento artificial e mesmo medicação. Investigámos também as potenciais vias de excreção e respetivas concentrações de MTC e documentámos pela primeira vez a excreção de MTC em 83,0 % (IC95 70,8–90,8 %) dos javalis e veados naturalmente infetados. Detetámos DNA de MTC em todos os tipos de vias de excreção estudadas (oronasal, bronquio-alveolar, fecal e urinária). Nestas vias de excreção estimámos concentrações de MTC superiores à dose mínima infetante para bovinos, veados e javali. Também pela primeira vez encontrámos evidência da existência de uma proporção de animais super-excretores na população infetada (28,2 % dos javalis infetados, IC95 16,6–43,8 %; e 35,7 % dos veados infetados, IC95 16,3–61,2 %), os quais são responsáveis por uma excreção de MTC desproporcionalmente elevada. Também no âmbito desta tese descrevemos um protocolo melhorado para a deteção e estimativa da concentração de DNA de MTC e M. bovis/ caprae em amostras ambientais, e aplicámos esse protocolo para caracterizar a contaminação ambiental com estas micobactérias em zonas com diferentes prevalências de bTB na fauna selvagem. Pela primeira vez reportámos uma contaminação ambiental generalizada por MTC em zonas onde a bTB tem uma prevalência elevada em populações de ungulados selvagens. A proporção de amostras positivas alcançou os 39,6 % (IC95 27,6–53,6 %) na primavera. Esta contaminação foi detetada em todos os tipos de zonas de risco previamente identificadas, onde ungulados domésticos e selvagens se concentram, como sejam zonas de alimentação e abeberamento. Também avaliámos a epidemiologia espacial da bTB em Portugal com base em rastreios sorológicos e cultura bacteriológica. Inicialmente validámos as eluições de sangue embebido em papel absorvente como um novo método para rastreios sorológicos de bTB em javali. Os resultados confirmaram que a bTB é uma doença emergente da fauna selvagem em Portugal, documentando um aumento de 47 % da prevalência numa zona entre 2005-06 e 2009-14. Também confirmámos a ocorrência de uma marcada estruturação espacial da bTB na fauna selvagem, com 2 agregados espaciais no sul- e centro-leste de Portugal, localizados na periferia do núcleo da alta prevalência anteriormente descrito no centro-sudoeste da Península Ibérica. Produzimos 2 modelos geográficos de risco da bTB na fauna selvagem à escala nacional e regional, estando ambos em concordância com relatórios independentes do isolamento de MTC em animais selvagens. O conjunto destes resultados tem implicações para o desenho de programas de controlo da bTB na fauna selvagem, nomeadamente através da remoção seletiva de super-excretores, da identificação de locais de alto risco de transmissão indireta como alvos de medidas de biossegurança e da vigilância e controlo da doença baseada nos modelos de risco espacial desenvolvidos no âmbito desta tese., The work presented in this thesis was performed in the Microbiology and Infection Research Domain in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, Portugal (ICVS/3B’s – PT Government Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal). The financial support was given by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) by means of a PhD grant (SFRH/BD/69390/2010).

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Brachyury, the founding member of the T-box family of transcription factors, is essential for embryo development and has recently emerged as an important player in the oncogenic process. During embryo gastrulation, Brachyury is a specific marker of mesoderm formation and is required for the proper development of the primitive streak, allantois, axial elongation and its homozygous deletion is lethal. Brachyury role in the cancer biology field is recent and limited. Duplication of the Brachyury gene has been associated with the rare bone cancer, chordoma. Brachyury aberrant expression has been demonstrated in epithelial cancer, such as lung and colorectal cancer, and is implicated in several oncogenic processes, such as metastasis formation and adjuvant therapy resistance. Nevertheless, there is limited information about Brachyury role and potential clinical impact in a vast number of solid tumors. Particularly, there is no description of Brachyury in prostate cancer (PCa - epithelial tumor), gastrointestinal stromal tumors (GIST – mesodermal tumor) and in gliomas (neuro-ectodermal tumor). More importantly, little is known about the molecular basis for its role and molecular mechanisms in oncogenesis due to a paucity of information regarding its direct target genes and signaling pathways. In the present thesis we intended to contribute to the body of knowledge of Brachyury role in several solid tumors, by exploring its biological mechanisms and clinical impact. Additionally, we aimed to investigate the potential role of Brachyury in normal neuro-ectodermal tissues, specifically during brain development. We envision the existence of parallelisms in Brachyury regulatory mechanisms and biological roles in the embryo and cancer, which we wish to further explore. In PCa, we found that Brachyury acts as an oncogene and its overexpression was associated with tumor aggressiveness and therapy resistance. Brachyury is associated with several mechanism of therapy resistance, namely epithelial-to-mesenchymal transition, stemness, neuroendocrine transdifferentiation, ERG, Bcl-2 and androgen receptor (AR) expression as well as PTEN loss. Importantly, we showed that Brachyury binds to AR promoter regulating its expression. Due to Brachyury role in mesoderm specification, we analysed its oncogenic role in GISTs, a tumor of mesodermal origin. In agreement with its expression during mesoderm development, Brachyury is overexpressed in GIST and is associated with tumor aggressiveness and poor patient survival, acting as an oncogene. Conversely, Brachyury downregulation in gliomas was associated with poor patient outcome, higher aggressive phenotype and chemotherapy resistance. Brachyury reexpression (by ectopic overexpression or by retinoic acid-mediated induction) was able to decrease glioma tumoriginicity with concomitant tumor differentiation. Moreover, its expression is sufficient to promote a chemo-sensitive phenotype in non-responsive glioma cells by making them prone to respond to cell death stimulus. Therefore, in gliomas Brachyury acts as a tumor suppressor gene. Considering Brachyury novel function as a tumor suppressor gene in gliomas, we explored the role of Brachyury in normal brain development, never before assessed. We showed that Brachyury expression in the developing brain is phylogenetically conserved in chicken, mouse and human, and that its expression persists during adulthood. Importantly, we found that Brachyury plays an unexpected functional role in neuronal differentiation, whereas in mesodermal-derived tissues its expression correlates with an undifferentiated status. These results place Brachyury as a new regulator of neuronal differentiation and refute the long-held dogma of Brachyury as an exclusive mesodermal marker. Summing up, we found that Brachyury has a clinical and functional role in tumorigenesis and may be used as a biomarker for patient prognosis. We provide evidence that it can be an attractive therapeutic target in PCa and GISTs (by its inhibition - anti- Brachyury vaccine GI-6301), as well as in gliomas (by its re-expression via retinoic acid). Additionally, we provide the first description of Brachyury expression during neuronal development in multiple species, highlighting its distinct functional roles in neuronal and mesodermal tissues. Altogether, this work highlights the dual role of oncogene and tumor suppressor gene of Brachyury in human tumors, and significantly adds to our understanding on how Brachyury may contribute to embryo and cancer development., Brachyury, o membro fundador da família de factores de transcrição T-box, é essencial para o desenvolvimento embrionário e foi recentemente implicado no processo oncogénico. Durante o processo de gastrulação embrionário, Brachyury é considerado um marcador específico da mesoderme e é essencial para o desenvolvimento adequado da linha primitiva, alantóide e elongamento axial, sendo letal a ausência de ambos os alelos. O estudo de Brachyury no campo da oncobiologia é bastante recente e limitado. A duplicação deste gene está associada a um tipo tumoral ósseo raro, denominado de cordoma. A sua expressão anómala foi demonstrada em tumores de origem epitelial, nomeadamente, cancro do pulmão e colorectal, tendo sido associado com a progressão tumoral, desenvolvimento de metástases e resistência à quimioterapia. Contudo, a sua informação acerca da função e impacto clínico em tumores sólidos permanece escassa. Em particular, não existe qualquer descrição de Brachyury em cancro da próstata (tumor de origem epitelial), em tumores gastrointestinais (GISTs - tumor de origem mesodérmica) e em gliomas (tumor de origem neuro-ectodérmica). Além disso, pouco se sabe acerca das bases moleculares implicadas na oncogénese devido à falta de conhecimento acerca dos seus genes-alvo e vias de sinalização. O trabalho desenvolvido nesta dissertação pretendeu aumentar o campo de conhecimento sobre o impacto clínico e potenciais mecanismos pelos quais Brachyury participa no processo oncogénico em tumores sólidos. O papel de Brachyury em tecidos neuro-ectodérmicos normais foi também alvo de estudo, em particular durante o desenvolvimento cerebral. Em cancro da próstata, foi possível constatar que o Brachyury actua como um oncogene e a sua sobre-expressão foi associada a um aumento da agressividade tumoral e resistência à terapia. Este factor de transcrição regula vários mecanismos associados à resistência à terapia, nomeadamente, a transição epetilialmesenquimal, aumento de propriedades estaminais, transdiferenciação neuroendócrina e expressão de ERG, Bcl-2 e receptores de androgénio, assim como perda de expressão de PTEN. De salientar que Brachyury liga-se ao promotor do gene de receptor de androgénio regulando directamente a sua expressão. O papel de Brachyury também foi avaliado em tumores de origem mesodérmica – GIST. De acordo com a sua expressão no desenvolvimento mesodérmico, Brachyury mostrou-se sobre-expresso em GIST tendo a sua expressão associada com o pior prognóstico dos pacientes, atuando como um oncogene. Por outro lado, a diminuição de expressão de Brachyury em gliomas foi associada a um pior prognóstico, maior agressividade e resistência à quimioterapia.Quando Brachyury é re-expresso (por sobre-expressão ectópica ou por indução mediada por acido retinóico) foi possível verificar uma diminuição da tumorigenicidade, associada a um aumento da diferenciação tumoral em gliomas. A expressão de Brachyury foi suficiente para promover o fenótipo de quimio-sensibilidade em células gliais resistentes à quimioterapia, através de uma alteração da susceptibilidade a estímulos de morte celular. Tendo em consideração a nova função de Brachyury como um supressor tumoral em gliomas, o estudo foi estendido de forma a explorar o seu papel no desenvolvimento normal do cérebro. Foi possível observar que Brachyury é expresso no cérebro desde o desenvolvimento embrionário até à vida adulta e que isto é filogeneticamente conservado na galinha, ratinho e Humano. É importante salientar que o Brachyury desempenha um papel preponderante na diferenciação neuronal, mas em tecidos que derivam da mesoderme a sua expressão correlaciona-se com um estado de indiferenciação celular. Estes resultados permitem expôr o Brachyury como um novo regulador da diferenciação neuronal, refutando o dogma do Brachyury ser um marcador específico e exclusivo da mesoderme. Em sumário, esta dissertação mostrou que o Brachyury tem um papel clínico e funcional na tumorigénese e poderá ser usado como biomarcador de prognóstico de doentes com cancro. Poderá também ser usado como alvo terapêutico em cancro da próstata e em GISTs (através da sua inibição – vacina anti-Brachyury GI-6301), assim como em gliomas (através da sua re-expressão por ácido retinóico). Além disso, demonstrámos pela primeira vez a expressão de Brachyury durante o desenvolvimento neuronal em diversos modelos animais, evidenciando o seu papel antagónico em tecidos neuronais e mesodérmicos. Em conclusão, este estudo salienta a dupla função do Brachyury em condições normais e malignas (sendo especifico do órgão/tecido e tipo celular) adicionando um novo nível de conhecimento em como Brachyury pode contribuir para o desenvolvimento normal e no contexto oncológico., A tese de doutoramento aqui apresentada foi desenvolvida no âmbito de financiamento pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) através de uma bolsa individual de doutoramento, com a referência SFRH/BD/81369/2011 (no âmbito do QREN – POPH – Tipologia 4.1 – Formação Avançada, comparticipado pelo Fundo Social Europeu e por fundos nacionais do MCTES). Parte do trabalho aqui desenvolvido foi co-financiado pela FCT (Projecto PTDC/SAU-TOX/114549/2009 and PTDC/SAUBID/121459/2010).

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Polyglutamine (PolyQ) diseases are a family of neurodegenerative disorders characterized by the expansion of a CAG trinucleotide repeat in specific genes. This leads to the production of pathogenic proteins containing critically expanded tracts of glutamines. Although polyQ diseases are rare disorders, this group includes nine progressive, severe and fatal disorders, which in general begin in adulthood and progress over 10 to 30 years, normally implicating the full time patient care by a member of the family. Thus, the economic and social impact of these neurodegenerative diseases is quite significant. This has led several researchers worldwide to investigate the pathogenesis mechanism and therapeutic strategies for polyQ diseases. In this study, hypothesis-based and hypothesis-free approaches were used in order to study candidate therapeutic compounds for Machado-Joseph Disease (MJD) using the CMVMJD135 mouse model. Valproic acid (VPA) is an FDA-approved compound which showed therapeutic benefits in other neurodegenerative diseases, and also in C.elegans and Drosophila models of MJD, suggesting that it could be a promising compound for treatment of this disorder. Chronic pre-symptomatic VPA treatment (200mg/kg) led to mild improvements in balance and motor coordination in the CMVMJD135 mouse model, not changing the aggregation of mutant ataxin-3 (ATXN3) in affected brain regions. Although not a positive result, this pre-clinical trial still leaves an open window for other VPA dosages to be tested pre-clinically before exclusion of the compound’s therapeutic potential. In an unbiased screening of FDA/EMA-approved small molecules, citalopram was identified as a promising compound for suppression of neurological dysfunction and ATXN3 aggregation in C.elegans. Citalopram is an FDA-approved antidepressant, widely prescribed for clinical use, and therefore a good treatment opportunity. Chronic pre-symptomatic citalopram treatment at 8mg/kg led to significant balance and motor coordination improvement, rescued diminished body weight loss, suppressed ATXN3 nuclear inclusions in affected brain regions, reduced neuronal loss and astrogliosis in the CMVMJD135 mouse model. Chronic pre-symptomatic citalopram treatment with a higher dosage (13mg/kg) produced only mild effects at the behavior level and in ATXN3 aggregation phenotypes. This study also led to the characterization of new and relevant pathological features of the CMVMJD135 mouse model. Chronic citalopram post-symptomatic treatment (at an 8mg/kg dosage) in a group of CMVMJD135 mice presenting higher severity of disease led to an improvement of some the motor symptoms, albeit much less marked than for pre-symptomatic treatment. The mechanisms of action of citalopram in MJD were explored by expression analysis of candidate pathways but they remain to be clarified. In summary, this work suggests activation of serotonergic signaling as a relevant mechanism for protection against MJD pathogenesis, and suggests citalopram as a promising compound to be tested in human clinical trials in MJD., As doenças de poliglutaminas (poliQ) são uma família de doenças neurodegenerativas caracterizadas pela expansão de uma repetição do trinucleótido CAG em genes específicos. Esta expansão leva à produção de proteínas patogénicas contendo sequências altamente expandidas de glutaminas. Embora as doenças poliQ sejam doenças raras, este grupo inclui nove doenças progressivas, graves e fatais, que em geral começam na idade adulta e progridem ao longo de 10 a 30 anos, normalmente implicando a assistência ao paciente em tempo integral por um membro da família. Assim, o impacto económico e social destas doenças neurodegenerativas é bastante significativo. Isto tem levado diversos investigadores por todo o mundo a investigar o mecanismo de patogénese e estratégias terapêuticas para doenças poliQ. Neste estudo, foram utilizadas abordagens independentes de hipótese e baseadas em hipótese no estudo de compostos terapêuticos candidatos para a DMJ, utilizando o modelo de ratinho CMVMJD135. O ácido valpróico (VPA) é um composto aprovado pela FDA, que mostrou benefícios terapêuticos noutras doenças neurodegenerativas, e também em modelos de C.elegans e Drosophila melanogaster da DMJ, sugerindo que pode ser um composto promissor para o tratamento desta doença. O tratamento crónico pré-sintomático com VPA (200mg/kg) levou a melhorias moderadas no equilíbrio e coordenação motora no modelo de ratinho CMVMJD135, não alterando a agregação da ataxina-3 (ATXN3) mutante em regiões afetadas do cérebro. Embora não seja um resultado muito positivo, este ensaio pré-clínico ainda deixa em aberto a possibilidade de outras dosagens de VPA serem testadas pré-clinicamente antes da exclusão do potencial terapêutico deste composto. Num rastreio não dirigido de pequenas moléculas aprovadas pela FDA/EMA, o citalopram foi identificado como um composto promissor para a supressão da disfunção neurológica e da agregação de ATXN3 em C. elegans. O citalopram é um antidepressivo aprovado pela FDA, amplamente prescrito para uso clínico e, portanto, um bom candidato para tratamento. O tratamento crónico pré-sintomático com citalopram na dose de 8 mg/kg levou a uma melhoria bastante significativa da coordenação motora, resgatou a diminuição de peso corporal, suprimiu as inclusões nucleares de ATXN3 em regiões cerebrais afetadas, reduziu a perda neuronal e a astrogliose no ratinho CMVMJD135. O tratamento crónico pré-sintomático com citalopram numa dose mais elevada (13 mg/kg) produziu apenas efeitos moderados ao nível do fenótipo de comportamento e na agregação da ATXN3. Este estudo também conduziu à caracterização de novas características patológicas relevantes do modelo de ratinho CMVMJD135. O tratamento crónico pós-sintomático com citalopram na dose de 8mg/kg num grupo de ratinhos CMVMJD135 que apresentavam maior gravidade da doença levou à melhoria de alguns dos sintomas motores, embora muito menos marcada do que para o tratamento pré-sintomático. Os mecanismos de ação do citalopram na DMJ foram também explorados através da análise da expressão de genes de vias candidatas, precisando ainda de serem mais amplamente esclarecidos. Em resumo, este trabalho sugere a activação da sinalização serotonérgica como um mecanismo importante para a protecção contra a patogénese da DMJ, e sugere o citalopram como um composto promissor para ser testado em ensaios clínicos em humanos., This work was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and QREN – POPH through a Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/78554/2011) and ATAXIA UK Grant through the project: Pharmacologic therapy for Machado-Joseph Disease: from a C.elegans drug screen to a mouse model validation.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, The neuroimmunology field is at an exciting stage due to a set of revolutionary discoveries challenging the now old-fashioned dogma of the brain being “protected” from the peripheral immune system action. Immune components such as T lymphocytes and the cytokines they produce, once regarded as detrimental to the brain, are now considered integrant parts of the healthy nervous system since their regulated actions control immune surveillance but also modulate higher brain functions. The cytokine interferon-gamma (IFNγ), produced mainly by T lymphocytes, is a potent pro-inflammatory molecule, whose levels are altered in many neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. Though studies assessing the effects of this cytokine, when administered into the brain, have shown that it affects different cellular and synaptic mechanisms underlying behavioural dimensions, it is still unclear whether this is a collateral damage of the inflammatory response or if IFNγ indeed plays a role in the modulation of non-pathological brain function. As so, we sought to explore the role of this cytokine in the modulation of brain function in physiological conditions and also after exposure to chronic stress – a paradigm known to trigger the development of psychiatric complications and also accelerate neurodegenerative processes. In the first part of the thesis (2nd Chapter) we demonstrate that, in a healthy brain, the absence of IFNγ enhances dorsal hippocampus plasticity and associated cognitive function. At the structural level, an enlargement of the dorsal hippocampus volume contrasted with the absence of alterations observed in the ventral part, highlighting that the effects of this cytokine are more selective for cognitive behaviours. Moreover, the absence of this cytokine amplifies neuroplastic phenomena in the dorsal hippocampus, namely neurogenesis, size of neuronal dendritic arborisations and presynaptic functioning, most likely contributing for the enhanced cognitive performance. On the 3rd chapter, we demonstrate that there are gender-differences on the behavioural phenotype of IFNγ KO mice, and discuss the possible association of estrogen and the IFNγ expression in the central nervous system. In the following chapter (4th Chapter) we describe the optimisation of a chronic unpredictable stress (CUS) paradigm for use in C57BL/6 mice, a strain with higher resistance to stress. This mice model of stress-related disorders exhibits, beyond the stress-related neuroendocrine and behavioural alterations, mild changes in thymic cellular populations and relevant splenic myeloid cellular alterations, with an increased number of neutrophils as the most striking change. At last (5th Chapter), we discuss the contributory role of IFNγ for the development of the immune maladaptive response to chronic stress. By submitting mice to the optimized CUS protocol, it was observed that mRNA levels of Ifnγ are elevated in the brain, specifically in the medial prefrontal and orbitofrontal cortices. Moreover, exposure to chronic stress leads to an increase of the adrenergic innervation of the spleen as to alterations on the percentage of neutrophils and monocytes/macrophages populations in the spleen. Importantly, the absence of this cytokine blunts the stress-related changes on these cell populations in the spleen. The recognition of the proinflammatory cytokine – IFNγ, as a negative regulator of hippocampal plasticity and associated cognitive function, together with its contributory role for the stress-related immune dysfunction, suggests that this cytokine may articulate the complex network that underlies the inflammatory component of neuropsychiatric disorders., A área da neuroimunologia está a atravessar uma fase excitante devido a um conjunto de descobertas revolucionárias que desafiam o seu agora antiquado dogma que visiona o cérebro como um órgão “protegido” da ação do sistema imunitário periférico. Componentes imunitários, tal como os linfócitos T e respetivas citocinas que estes produzem, outrora vistos apenas como prejudiciais para o cérebro, são agora considerados partes integrantes do sistema nervoso, uma vez que a sua ação regulada controla a vigilância imunitária mas também a modulação de funções cerebrais superiores. O interferão gama (IFNγ), uma citocina produzida principalmente por linfócitos T, é uma molécula proinflamatória cujos níveis estão alterados em diversas doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas. Apesar de estudos demonstrarem que a administração desta citocina no cérebro afeta diferentes mecanismos celulares e sinápticos que estão na base de dimensões comportamentais, não é ainda claro se este efeito é um dano colateral da resposta inflamatória ou se o IFNγ tem de fato um papel na modulação da função do cérebro num contexto não patológico. Como tal, iremos aqui explorar o papel desta citocina na modulação de funções cerebrais em condições fisiológicas como também após exposição ao stress crónico – um paradigma que desencadeia o desenvolvimento de complicações psiquiátricas e acelera processos neurodegenerativos. Na primeira parte da presente tese (2º Capítulo) nós demonstramos que a ausência de IFNγ no cérebro saudável leva a uma melhoria da plasticidade do hipocampo dorsal e função cognitiva associada. Ao nível estrutural, um aumento do volume do hipocampo dorsal contrasta com a ausência de alterações volumétricas na parte ventral, sublinhando assim que esta citocina afeta seletivamente o comportamento cognitivo. A ausência desta citocina leva também a uma amplificação dos fenómenos neuroplásticos do hipocampo dorsal, nomeadamente da neurogénese, o tamanho da arborização dendrítica neuronal e o funcionamento pré-sináptico, contribuindo, muito provavelmente, para a melhoria da performance cognitiva. No 3º capítulo, nós demonstramos que existem diferenças entre géneros no fenótipo comportamental dos murganhos IFNγ KO, e discutimos a possível associação entre o estrogénio e a expressão de IFNγ no sistema nervoso central. No capítulo seguinte (4º Capítulo) descrevemos a otimização de um paradigma de stress crónico imprevisível (CUS) para murganhos C57BL/6, uma estirpe que apresenta uma maior resistência ao stress. Este modelo de murganho de disfunção associada ao stress apresenta para além das alterações neuroendócrinas e comportamentais relacionadas com o stress, alterações moderadas nas populações celulares do timo e importantes alterações celulares mielóides no baço, sendo o aumento de neutrófilos a alteração mais impressionante. Por último (5º Capítulo), discutimos o papel contributório desta citocina para o desenvolvimento da resposta imunitária maladaptativa ao stress crónico. Após expor murganhos ao protocolo otimizado de CUS foi observado um aumento nos níveis de mRNA de Ifnγ, mais especificamente nos córtices préfrontal medial e orbitofrontal. Para além disso, a exposição ao stress crónico leva a um aumento da inervação adrenérgica do baço assim como a alterações nas percentagens das populações de neutrófilos e monócitos/macrófagos no baço. A ausência de IFNγ preveniu as alterações induzidas pelo stress crónico nestas populações celulares do baço. O reconhecimento da citocina pró-inflamatória – IFNγ, como um regulador negativo da plasticidade hippocampal e função cognitiva associada, juntamente com o seu papel contributório para a disfunção imunitária associada com o stress sugere que esta citocina poderá articular a rede complexa que está na base da componente inflamatória das doenças neuropsiquiátricas., This work was funded by the European Commission (FP7): “SwitchBox” (Contract HEALTH-F2- 2010-259772) and co-financed by the Portuguese North Regional Operational Program (ON.2 – O Novo Norte) under the National Strategic Reference Framework (QREN), through the European Regional Development Fund (FEDER). Susana Isabel Gonçalves Monteiro was supported by a PhD fellowship from the Portuguese Science Foundation (FCT)/MEC with the reference SFRH/BD/69311/2010.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Glioblastoma (GBM) is the most common malignant tumor type of the central nervous system. The clinical outcome is particularly poor, with a median survival of approximately 15 months after diagnosis. Despite GBM being extremely heterogeneous, patients are equally treated with a standardized therapeutic approach, consisting of surgery followed by radiation and chemotherapy with temozolomide (TMZ). There are increasing evidences on the prognostic and therapeutic relevance of the developmental transcription factors HOX proteins, particularly HOXA9, in GBM. Recent studies described the aberrant overexpression of HOXA9 as a novel, independent negative prognostic factor in GBM patients. Additionally, HOX genes were identified as part of a glioma stem cell gene expression signature, with prognostic value in GBM patients treated with TMZ-based chemo-radiotherapy. However, a more comprehensive understanding of the molecular downstreamtargets and the functional consequences of HOXA9 activation on the establishment and maintenance of the malignant phenotype of glioblastoma was required. In this context, the research summarized along this thesis focuses on the mechanisms by which HOXA9 influences GBM's aggressiveness and prognosis, with a particular attention on its relationship with resistance to TMZ. While doing so, the roles of HOXA9 and its target genes in critical hallmarks of GBM are also addressed. The transcriptome of HOXA9 was investigated by whole-genome gene expression microarrays performed in GBM cell models, including long-term established and freshly-derived primary GBM cell lines. Biologic process clustering analyses revealed that HOXA9-target genes have key roles in cancer, including genes involved in cell adhesion, migration, cell cycle and DNA repair. Additionally, gene set enrichment analysis showed the HOXA9-transcriptome is reminiscent of “selfrenewal” stem cell signatures. Using in vitro assays, it was observed that HOXA9 expression decreases cell death, and increases the stemness capacity, cell viability, invasion, and resistance of GBM cells to TMZ treatment. Importantly, in vivo GBM xenograft subcutaneous and orthotopic models validated the HOXA9-mediated functions and increased resistance to TMZ. Mechanistically, HOXA9 increased the expression of BCL2 protein, an important anti-apoptotic protein, and reduced the expression of several mismatch-repair, which together dictate increased resistance to TMZ. Critically, the high resistance to TMZ was significantly reverted in HOXA9-positive GBM cells by combinatorial pharmacological treatments with a BCL2 specific inhibitor, suggesting that this combination of drugs may be further explored in clinical settings. Having identified several cellular and molecular mechanisms by which HOXA9 influences a multitude of critical hallmarks of GBM, including the oncogenic role of HOXA9 transforming nontumorigenic immortalized astrocytes into tumorigenic cells, it was then explored in detail the functional and clinical relevance of CDH3 gene (encoding P-cadherin), one of the identified downstream targets of HOXA9, for which nothing has been described in the context of gliomas. CDH3 was previously described as a direct target of HOXA9 in epithelial ovarian cancer, and has known roles in cell adhesion, invasion and migration. Here, it was found that the expression of HOXA9 was associated with CDH3 expression. These results suggested that HOXA9 regulates CDH3 and, consequently, HOXA9 could exert part of its functional effects via P-cadherin in GBM. Pcadherin was identified as important player in critical functional roles in GBM, affecting stemness, cell viability, migration and cell adhesion in vitro. Importantly, these findings were further supported by in vivo subcutaneous models, in which P-cadherin was associated with higher tumor volumes. Testing a small set of human glioma samples, it was found preliminary evidences that P-cadherin is associated with higher grades of gliomas, and its expression is higher in recurrence lesions and areas of neovascularization. Importantly, the results showed that CDH3 may be a novel prognostic biomarker with clinical value for GBM patients. Overall, the work summarized in this thesis significantly contributed to understanding the consequences of HOXA9 activation in GBM, identifying several mechanisms by which this transcription factor influences aggressiveness and poor prognosis in GBM patients. A new relevant HOXA9 downstream target was identified, P-cadherin, whose role was totally unknown in GBM and may have a crucial role in the aggressiveness of these tumors. It was also described the role of HOXA9 in glioma initiation and in resistance to current therapy. These findings may offer new therapeutic opportunities, taking into account the expression HOXA9, which could lead to a new classification of patients into subgroups of non-responsive GBM to TMZ, avoiding side effects and decreasing the direct costs related to current treatment. Moreover, these results warrant further investigation in GBM treatment using anti-apoptotic inhibitors and new therapies based in P-cadherin high expression. Additionally, further investigations are required to clarify the specific contributions of HOXA9 in the origin of this highly lethal tumor., Os glioblastomas (GBMs) são os tumores cerebrais mais frequentes e malignos do sistema nervoso central. O quadro clínico dos pacientes com GBM é particularmente crítico e imprevisível, apresentando estes uma mediana de sobrevivência baixa, de aproximadamente 15 meses. Contudo, e apesar da natureza heterogénea dos GBM, atualmente estes pacientes dispõem apenas de uma modalidade terapêutica, baseada em cirurgia, combinada com adjuvante radio e quimioterapia com Temozolamida (TMZ). Evidências crescentes, têm colocado as proteínas HOX, particularmente a HOXA9, que são factores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento embrionário, com implicações no prognóstico e terapia destes tumores. Estudos recentes, descreveram que a sobre-expressão do HOXA9 está associada, independentemente de outros factores, com um pior prognóstico em pacientes com GBM. Adicionalmente, os genes HOX foram identificados como sendo parte de uma assinatura de expressão genética de células estaminais de glioma, e com valor prognóstico em pacientes com GBM submetidos a um tratamento combinado rádio e quimioterapia com TMZ. Contudo, mais estudos são necessários para uma melhor compreensão das consequências funcionais e dos alvos moleculares a jusante da ativação no HOXA9, no estabelecimento e manutenção do fenótipo maligno em GBM. Por conseguinte, a investigação sumariada ao longo desta tese, teve como principal objetivo averiguar os mecanismos pelos quais a expressão do gene HOXA9 induz agressividade, influência o prognóstico dos pacientes com GBM e a resistência à TMZ. Adicionalmente, o papel desempenhado pelos seus alvos moleculares em características cruciais de GBM foi igualmente abordado. Assim, foi analisado o transcriptoma do HOXA9 em várias linhas celulares de GBM, definitivas e primárias, através de microarrays de expressão genómica. A análise da expressão dos transcritos do HOXA9 revelou que estes se associavam a um conjunto de processos biológicos relacionados com vias oncogénicas, tais como, a adesão celular, a migração, o ciclo celular e a reparação do ADN. Adicionalmente, estes transcritos estavam, também, associados à capacidade de autorrenovação e a características de células estaminais. Estudos com modelos in vitro, após manipulação genética da expressão do HOXA9 em células de GBM, mostraram uma diminuição da morte celular, um aumento da capacidade estaminal, da viabilidade celular, da invasão e da resistência à TMZ. Estudos in vivo, usando modelos murino de xenotransplante, ortotópicos e subcutâneos, demonstraram que a expressão do HOXA9 aumenta a resistência à TMZ. Observou-se, ainda, que os mecanismos pelos quais o HOXA9 leva a esta resistência podem dever-se ao aumento da expressão da proteína BCL2, uma importante proteína anti-apoptótica, e à redução da expressão de várias proteínas da via de reparação de danos de ADN ( “DNA mismatch-repair pathway”). Esta resistência mediada pela expressão da BCL2, foi revertida usando um inibidor específico para esta proteína em combinação com a TMZ, em células HOXA9 positivas. Após a identificação dos mecanismos moleculares e celulares pelos quais a expressão do HOXA9 influencia diversas características dos GBM, incluindo o seu potencial oncogénico, observado pela transformação maligna de astrócitos imortalizados e não-tumorigénicos, foi avaliada detalhadamente a relevância funcional e clínica do gene CDH3 (que codifica a P-caderina), identificado como um alvo do HOXA9 e, do qual nada se sabia em gliomas. O gene CDH3 foi anteriormente descrito como sendo um alvo direto do HOXA9 em cancro epitelial do ovário e com relevância funcional ao nível da adesão celular, invasão e migração. Neste trabalho, foi descrito que a expressão do HOXA9 está associada com a expressão do gene CDH3. Estes resultados sugerem que o HOXA9 regula o gene CDH3 e, consequentemente, o HOXA9 pode exercer parte dos seu efeitos funcionais, em GBM, via P-caderina. Descreveu-se que a P-caderina tem uma relevância funcional em modelos in vitro de GBM, afectando a capacidade estaminal, a viabilidade, a migração e a adesão celular. Adicionalmente, estes resultados foram suportados por resultados in vivo, em modelos subcutâneos de murino, nos quais a expressão de P-caderina levou a um maior volume tumoral. Num pequeno conjunto de gliomas humanos, a elevada expressão da P-caderina foi associada com gliomas de alto grau, recorrência e regiões de neovascularização. Além disso, observou-se que a expressão do gene CDH3 pode ser um novo putativo bio-marcador de prognóstico com valor clínico em pacientes com GBM. Em suma, o trabalho descrito ao longo desta tese, contribuiu significativamente para a compreensão das consequências da ativação do HOXA9 em GBM, identificando-se vários mecanismos pelos quais este induz agressividade e pior prognóstico nos pacientes de GBM. Foi identificado um novo alvo do HOXA9 com relevância em GBM, a P-caderina, que parece induzir agressividade nestes tumores. Foi descrita, ainda, a importância do HOXA9 na iniciação dos gliomas e na resistência à TMZ. Desta forma, estes resultados podem ter fortes implicações nas decisões terapêuticas, podendo conduzir a uma nova classificação de subgrupos de GBM, nãoresponsivos à TMZ, reduzindo, assim, os efeitos secundários e os altos custos associados ao tratamento. Além disso, estes dados devem ser complementados com novas investigações terapêuticas usando quer inibidores anti-apoptóticos, quer novas abordagens terapêuticas tendo por base o novo putativo alvo terapêutico identificado, a P-caderina. Adicionalmente, são necessárias investigações para clarificar a contribuição do HOXA9 na origem destes tumores altamente letais., A tese de doutoramento aqui apresentada foi desenvolvida no âmbito de uma bolsa individual de doutoramento financiada pela FCT, com a referência SFRH/BD/81042/2011.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Monocytes are circulating blood leukocytes that arise from the bone marrow and are responsible for a wide array of homeostatic functions upon recruitment to different tissues. These phagocytes are able to mount an anti-microbial response, they are responsible for the production of a large array of cytokines and, importantly, they represent a pool of myeloid precursors that ultimately may originate tissue macrophages and dendritic cells. Recently, several reports have shed light on the relation between metabolism and immune function, which has been vastly explored in groundbreaking research on the field of immunometabolism. The development of a specific immune response relies on the accurate utilization of certain nutrients, thus determining distinct metabolic phenotypes and consequently distinct effector functions. Although several reports state the importance of the metabolic environment for the correct function of macrophages, little is known about the impact of amino acids during monocyte differentiation. We are interested in studying the metabolic requirements of human CD14+ monocytes derived from peripheral blood mononuclear cells during differentiation in macrophage populations. The analysis of amino acid catabolism/anabolism by these populations, using high performance liquid chromatography, revealed distinct metabolic needs, depending on the differentiation profile. In order to assess the contribution of non-essential amino acids during differentiation, we cultivated the purified monocytes in conditioned media, where we selectively depleted L-aspartate. Moreover, the role of L-aspartate as a modulator of monocyte differentiation was assessed for several functional characteristics of macrophages such as phenotypical markers and other effector functions by flow cytometry. We observed that the differential availability of this amino acid during monocyte-to-macrophage differentiation impacts their final fate regarding function, thus showing a role for amino acid metabolism in the modulation of macrophage response., Os monócitos são leucócitos circulantes originários da medula óssea responsáveis por várias funções homeostáticas após recrutamento para diferentes tecidos. Estes fagócitos são capazes de desenvolver uma resposta anti-microbiana, produzir diversas citoquinas pró-inflamatórias e representam uma reserva de precursores mieloides, que podem eventualmente originar macrófagos tecidulares e células dendríticas. Recentemente, diversos trabalhos expuseram a relação entre o metabolismo e as funções imunes, um conceito que tem vindo a ser aprofundado na área do imunometabolismo. O desenvolvimento de uma resposta imune específica depende da correta utilização de certos nutrientes, o que por sua vez dita a existência de diferentes fenótipos metabólicos e, consequentemente, funções efetoras distintas. Apesar de diversos estudos demonstrarem a importância do microambiente metabólico para o desenvolvimento de uma função adequada dos macrófagos, pouco se sabe acerca do papel dos aminoácidos durante a diferenciação de monócitos. Este trabalho tem como objetivo estudar os requisitos metabólicos de monócitos humanos CD14+, derivados de células mononucleares do sangue periférico, durante a sua diferenciação em populações macrofágicas. A análise do catabolismo/anabolismo de aminoácidos, através de cromatografia liquída de alta performance, revelou diferentes necessidades metabólicas, consoante o perfil de diferenciação induzido nos macrófagos. De forma a entender a contribuição dos aminoácidos não essenciais durante este processo, os monócitos foram purificados e cultivados em meios condicionados em que o L-aspartato foi seletivamente depletado. O papel deste aminoácido como modulador da diferenciação de monócitos foi avaliado através do estudo de várias características funcionais dos macrófagos, como os marcadores fenotípicos e outras funções efetoras, que foram avaliados por citometria de fluxo. Neste estudo foi possível observar que a biodisponibilidade deste aminoácido durante a diferenciação dos monócitos em macrófagos tem um impacto no seu perfil final, nomeadamente em termos de função, o que demonstra um novo papel do metabolismo de aminoácidos na modulação da resposta dos macrófagos.

Extracts, infusions, or other types of preparations from medicinal plants have been used for the treatment of various diseases, in what is commonly designated as "folk medicine". In recent years, science has prove that some plant extracts, fractions or specific compounds may have an important role as drug sources with relevant properties. Over the last years the incorporation of natural products, particularly plant based products, in cosmeceuticals has also increased. In this work, particular emphasis will be given to antimicrobial and wound healing properties of specific plants/compounds incorporated in some cosmeceuticals. New approaches, including nanotechnology, will be addressed. Based on specific plant extracts and oils it was possible to develop some particular cosmeceuticals used clinicaly. These formulations were applied into adult volunteers (more then 150) with skin disorders, namely skin burns, recalcitrant wounds, and psoriasis. The synergy of the properties of the plant extracts and oils, in specific treatment situations, resulted in very positive results. In all cases, after repeated applications, notorious improvements or complete treatment were observed, without side effects. The action of the formulations revealed to be associated to a high degree of skin hydration, cellular skin regeneration, and antimicrobial activity. The results demonstrated, at least, a similar effectiveness when comparing to the conventional treatments., This work is supported by national funds from FCT - Portuguese Foundation for Science and Technology, under the projects PTDC/AGR­ALI/105169/2008 and PEst­OE/AGR/UI4033/2014., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Exposure to chronic stressful conditions is suggested to increase susceptibility to brain pathology as it is associated with neuroplastic deficits as well as impaired cognition and mood. Specifically, structural/functional changes of hippocampal formation are shown to contribute to the pathophysiology of different stress-related disorders, e.g. depression, with particular focus on the dentate gyrus (DG), a region of the hippocampus where stress is shown to suppress neurogenesis in the adult brain. Yet, the underlying cellular mechanisms of the stress-driven neurogenic deficits are poorly understood. Our previous studies show that chronic stress triggers hyperphosphorylation and malfunction of the cytoskeletal protein Tau that leads to neuronal atrophy and memory deficits. In addition, Tau hyperphosphorylation has been causally related to neuronal malfunction and diminished neurogenesis in Alzheimer’s disease. Based on the above findings, we hereby aim to clarify the role of Tau on stressdriven suppression of neurogenesis in adult hippocampal neurogenic niche. For that purpose, we have exposed male Tau knockout animals (Tau-KO) and their wildtype littermates (WT) to nine weeks of a chronic unpredictable stress paradigm and evaluated proliferation, differentiation and survival of newlyborn cells in the adult DG as well as their significance in hippocampus-dependent function using molecular, cellular and behavioral analysis. We found that, while chronic stress decreased proliferating cells in the DG of WT animals, this effect on the above population was not found in Tau-KO animals. Moreover, neuroblasts and newly-born neurons were also found to be reduced in stressed WT, but not in Tau-KO animals, suggesting an essential mediation of Tau in the damage of cell proliferation and neuronal differentiation induced by chronic stress. In contrast, newly-born astrocytes were decreased in both WTs and Tau-KOs after stress exposure, indicating that Tau is not necessary for stress-induced reduction in the DG astrocytic pool. Furthermore, chronic stress reduced cascades known to regulate cell survival and proliferation in the DG such as PI3K/GSK3β /β -catenin pathway followed by concomitant reduction in mTOR signaling in WT, but not Tau-KO. The above findings highlight Tau as a crucial mediator of stress-driven neurogenic deficits in adult hippocampus adding to our mechanistic understanding of the cellular cascades that may convey the pathogenic role of chronic stress in the brain and its plasticity., A exposição ao stress cronico aumenta a susceptibilidade para patologias ligadas ao cérebro e esta associada com alterações de neuroplasticidade e défices cognitivos. O stress-induz alterações estruturais/funcionais no hipocampo contribuindo para o aparecimento de doenças como a depressão, tendo particular foco no giro denteado do hipocampo onde o stress é conhecido como um agente que reduz a neurogénese no cérebro adulto. No entanto, os mecanismos celulares subjacentes ao stressinduz alterações na neurogénese são pouco compreendidos. Os nossos estudos anteriores mostraram que o stress crónico leva a uma hiperfosforilação e a um incorrecto funcionamento da proteína Tau conduzindo a atrofia neuronal e défices de memória. Além disso, a hiperfosforilação da Tau foi relacionada como causa para o mau funcionamento neuronal e diminuição da neurogénese na doença de Alzheimer. Baseado nisto, neste trabalho pretendemos clarificar o papel da Tau no stress-induz redução da neurogénese num nicho neurogénico adulto- o hipocampo. Com esse objectivo, submeteram-se ratinhos macho Tau knockout (Tau-KO) e os suas respectivas ninhadas controle (WT) durante nove semanas ao paradigma de stress crónico imprevisível e avaliou-se a proliferação, diferenciação e sobrevivência das novas células formadas no giro denteado adulto assim como o seu papel em tarefas dependentes do hipocampo usando técnicas de análise molecular, celular e comportamental. Os nossos resultados indicaram que enquanto o stress cronico reduz a proliferação das células no giro denteado dos animais WT, não sendo estes efeitos observados nesta mesma população de células nos animais Tau-KO. Além disso, os neuroblastos e os novos neurónios estão também reduzidos nos animais WT, mas não nos animais Tau-KO, sugerindo um papel mediador da Tau nas alterações da proliferação celular e na diferenciação neuronal induzida pelo stress crónico. Pelo contrário, os novos astrócitos estavam diminuídos em ambos os grupos WT e Tau-KO após exposição a stress, indicando que a proteína Tau não é necessária para o stress-induz redução de astrócitos. Mais ainda, o stress cronico reduz cascatas de sinalização conhecidas por regular a sobrevivência e proliferação celular como PI3K/GSK3β /β -catenin pathway seguido pela concomitante redução na sinalização mTOR nos animais WT, mas não nos Tau-KO, no giro denteado. Estas conclusões destacam o papel crucial da Tau como mediadora do stress-induz défices na neurogénese no hipocampo adulto adicionando conhecimento ao mecanismo das cascatas celulares que podem estar associadas ao papel patológico do stress cronico no cérebro e na sua plasticidade.

Introduction Buruli ulcer (BU) is a severe necrotizing human skin disease caused by Mycobacterium ulcerans. Clinically, presentation is a sum of these diverse pathogenic hits subjected to critical immune-regulatory mechanisms. Among them, autophagy has been demonstrated as a cellular process of critical importance. Since microtubules and dynein are affected by mycolactone, the critical pathogenic exotoxin produced by M. ulcerans, cytoskeleton-related changes might potentially impair the autophagic process and impact the risk and progression of infection. Objective Genetic variants in the autophagy-related genes NOD2, PARK2 and ATG16L1 has been associated with susceptibility to mycobacterial diseases. Here, we investigated their association with BU risk, its severe phenotypes and its progression to an ulcerative form. Methods Genetic variants were genotyped using KASPar chemistry in 208 BU patients (70.2% with an ulcerative form and 28% in severe WHO category 3 phenotype) and 300 healthy endemic controls. Results The rs1333955 SNP in PARK2 was significantly associated with increased susceptibility to BU [odds ratio (OR), 1.43; P = 0.05]. In addition, both the rs9302752 and rs2066842 SNPs in NOD2 gee significantly increased the predisposition of patients to develop category 3 (OR, 2.23; P = 0.02; and OR 12.7; P = 0.03, respectively, whereas the rs2241880 SNP in ATG16L1 was found to significantly protect patients from presenting the ulcer phenotype (OR, 0.35; P = 0.02). Conclusion Our findings indicate that specific genetic variants in autophagy-related genes influence susceptibility to the development of BU and its progression to severe phenotypes., Author Summary Buruli ulcer (BU) is a neglected tropical disease caused by Mycobacterium ulcerans. Because the exact trigger is still under investigation, current treatment options rely mostly on the surgical excision of the affected site. There is therefore a pressing demand for improved risk prediction and tailored treatment as well as for new drug targets. By resorting to the largest case-control study reported to date, we show that genetic variation in the autophagy-related genes NOD2, PARK2 and ATG16L1 influence the risk and course of BU disease. Thus, our results provide crucial insights into the role of autophagy in the pathogenesis of BU.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Major depressive disorder (MDD) is a multidimensional psychiatric disease, considered by the World Health Organization as one of the leading causes of disability. Despite the importance of this disease in modern societies and the large investment of resources already made in its study, the processes underlying its pathophysiology remain poorly understood. Several hypotheses have been proposed to clarify the neurobiological mechanisms underlying this psychiatric disorder, being the link between adult hippocampal neurogenesis and MDD a central topic in the past decades. Previous studies have identified AP2γ as a key regulator of adult hippocampal neurogenesis in mice, being expressed in a subpopulation of adult transient amplifying progenitors, and acting as a regulator of basal progenitors, promoting proliferation and glutamatergic neuronal differentiation. Thus, we wanted to further explore the impact of AP2γ in brain neurophysiology and behavior during development and at adult stages, dissecting also its mechanisms both in healthy and depressive states. With this study, we were able to understand the impact of AP2γ in post-natal development and during juvenile age, through the AP2γ constitutive knockout (KO) model. In the developmental milestones assessment we did not find any major impairment in the behavioral performance of AP2γ KO mice, since all parameters analyzed, including the ones where we found differences, were within the typical range for appearance of the developmental milestones. However, in the juvenile behavior assessment and in the hippocampal glutamatergic neurogenesis process, impairments were found, since AP2γ KO mice showed anxious-like behavior and decreased proliferation of immature neurons. To study the impact of modulating the transcription factor AP2γ in depression we exposed both constitutive and conditional KO animal models to a chronic stress protocol, which efficiently induced core depressive-like symptoms. Through the conditional AP2γ KO mice, we were able to elucidate the impact of deleting AP2γ on behavior and neurogenesis in depressive-like conditions specifically in adult age, without the interference of potential functions of the gene during early development that may appear in the constitutive AP2γ model. Through a multidimensional behavioral analysis, we observed that both models presented similar results in the three most affected behavioral dimensions in depression, namely anxiety, mood and cognition. Regarding anxiety and mood no major differences were found between genotypes in both animal models. Moreover, AP2γ KO mice presented cognitive deficits in basal conditions, but when exposed to chronic mild stress no detrimental effects of deletion of the gene were observed. In this work, we also identified, through a broad analysis of the dentate gyrus neurogenic niche, alterations of epigenetic regulators in the AP2γ constitutive KO mice after uCMS exposure. The reported results not only support the involvement of AP2γ in the transcriptional network that modulates the juvenile and adult neurogenic process, but also highlight the potential of this molecule as a future therapeutical tool in neuropsychiatric disorders, in which neurogenesis is impaired., O transtorno depressivo persistente é uma doença psiquiátrica multidimensional, considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma das principais causas de incapacidade. Apesar da importância desta doença na sociedade moderna, e do largo investimento de recursos já feitos no seu estudo, os processos subjacentes à sua patofisiologia continuam pouco percebidos. Várias hipóteses foram propostas para clarificar os mecanismos neurobiológicos implícitos nesta doença psiquiátrica, tendo sido o vínculo entre a neurogénese hipocampal adulta e a depressão um tópico central nas décadas passadas. Estudos anteriores identificaram o AP2γ como um regulador chave da neurogénese hipocampal adulta em ratinhos, sendo expresso numa subpopulação de células progenitoras de rápida amplificação adultas, e atuando como regulador de progenitores basais, promovendo a proliferação e a diferenciação neuronal glutamatérgica. Deste modo, propusemos continuar a explorar o impacto do AP2γ na neurofisiologia cerebral e no comportamento, durante a fase de desenvolvimento e na idade adulta, procurando entender também os seus mecanismos tanto no estado saudável como em depressão. Com este trabalho, fomos capazes de entender o impacto do AP2γ no desenvolvimento pós-natal e em idade juvenil, a partir do modelo animal de deleção constitutiva do AP2γ. Na avaliação dos marcos de desenvolvimento, não encontramos nenhuma alteração no desempenho comportamental nos animais com deleção de AP2γ, visto que todos os parâmetros analisados, incluindo os que encontramos alguma diferença, se encontravam dentro dos intervalos típicos de aparecimento dos marcos de desenvolvimento. Contudo, na avaliação do comportamento juvenil e no processo de neurogénese glutamatérgica hipocampal observamos défices, visto que os animais com deleção de AP2γ apresentaram comportamento ansioso e uma diminuição da proliferação de neurónios imaturos. Para estudar o impacto da modulação do fator de transcrição AP2γ em depressão expusemos tanto o modelo animal com deleção constitutiva bem como o modelo animal condicional do gene a um protocolo de stress crónico, o qual eficientemente induziu sintomas primários de depressão. Através do modelo animal condicional do AP2γ, conseguimos compreender o impacto da deleção do AP2γ na modulação do comportamento e neurogénese em condições depressivas especificamente em idade adulta, sem interferência das potenciais funções do gene durante o período de desenvolvimento dos animais, que poderão surgir no modelo animal constitutivo do AP2γ. Através, de uma análise comportamental multidimensional, observamos que ambos os modelos apresentaram resultados similares nas dimensões comportamentais mais afetadas na depressão, nomeadamente a ansiedade, o humor e a cognição. Relativamente à ansiedade e ao humor não encontramos grandes diferenças entre genótipos em ambos os modelos animais. Além disso, os modelos animais de deleção do AP2γ apresentaram défices cognitivos em condições basais, mas após exposição ao stress crónico não foram observados os efeitos prejudiciais da deleção do gene. Neste trabalho, também identificamos, através de uma análise abrangente do nicho neurogénico girus denteado, um reguladores epigenéticos alterados no animal constitutivo do AP2γ. Os resultados apresentados não só suportam o envolvimento do AP2γ na rede transcripcional responsável pela modulação do processo neurogénico juvenil e adulto, como também destacam o potencial desta molécula em abordagens terapêuticas futuras em doenças neuropsiquiátricas, nas quais a neurogénese se encontra afetada.

Background: A research agenda can help to stimulate and guide research. The International Primary Care Respiratory Group (IPCRG) published a Research Needs Statement (RNS) in 2010 in which 145 research questions were identified. In 2012, priorities for respiratory research were established, based on these questions. To date, there has been no statement on primary care respiratory research needs in Portugal. The aim of the study was to develop a national consensus on research priorities in respiratory diseases in primary care in Portugal and to assess the applicability of the priorities for respiratory research set by the IPCRG. Method: We conducted a Delphi study by electronic mail with a panel of experts on respiratory disease from primary and secondary care in Portugal. In the first round, the research needs in respiratory disease in Portugal were identified. In the second round, 196 research questions in six disease areas, derived from the first round and from the IPCRG Respiratory needs statement, were prioritised on a five-point Likert-type scale. In the third round, the questions were prioritized again with feed-back provided on the median scores for each item in the second round. Consensus was considered to have been reached when 80 % of the participants gave a score of 4 or 5 out of five on a given item. Results: The 40 experts identified 121 respiratory research questions in Round 1 and expressed their views on 196 questions in Rounds 2 and 3. Twelve research questions (6 %) reached consensus. There were five questions in the asthma domain on early diagnosis, pulmonary function tests, the use of inhalers, and adherence to treatment. There were four questions in the chronic obstructive pulmonary disease domain on vaccinations, on routine monitoring and evaluation of treatment, on diagnosis, and on adherence to treatments. There was one question in the smoking domain on the effects of brief counselling. There were two questions on respiratory tract infections on the treatment of children and on the prescription of antibiotics. An additional 23 research questions (12 %) achieved consensus between 75 and 79 %. Conclusion: The results reflect the Portuguese reality in response the international agenda for research on respiratory diseases published by the IPCRG. They can support the development of future respiratory disease research in Portugal., Financial support for this work was provided by FEDER funds through the Operational Programme Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT - Foundation for Science and Technology under the project POCI-01-0145-FEDER-007038; and by the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by Norte Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF). PMT is partially supported by a grant from the International Primary Care Respiratory Group.

SPINT2 is a tumor suppressor gene that inhibits proteases implicated in cancer progression, like HGFA, hepsin and matriptase. Loss of SPINT2 expression in tumors has been associated with gene promoter hypermethylation; however, little is known about the mechanisms of SPINT2 deregulation in prostate cancer (PCa). We aimed to analyze SPINT2 expression levels and understand the possible regulation by SPINT2 promoter hypermethylation in PCa. In a cohort of 57 cases including non-neoplastic and PCa tissues, SPINT2 expression and promoter methylation was analyzed by immunohistochemistry and methylation-specific PCR, respectively. Methylation status of the SPINT2 promoter was also evaluated by bisulfite sequencing and 5-aza-2’-deoxycytidine treatment. Oncomine and TCGA databases were used to perform in silico PCa analysis of SPINT2 mRNA and methylation levels. A reduction in SPINT2 expression levels from nonneoplastic to PCa tissues was observed; however, none of the cases exhibited SPINT2 promoter methylation. Both bisulfite sequencing and 5-aza demonstrated that SPINT2 promoter is not methylated in PCa cells. Bioinformatics approaches did not show downregulation of SPINT2 at the mRNA level and, in corroboration with our results, SPINT2 promoter region is reported to be unmethylated. Our study suggests an involvement of SPINT2 in PCa tumorigenesis, probably in association with a post-translational regulation of SPINT2., The authors disclosed receipt of the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: This study was supported by the ICVS internal research funds of participating authors and by FCT project, ref. PTDC/SAUONC/115513/2009. F.P. received fellowship from the FCT, ref. SFRH/BD/81369/2011 and M.VP from the ON.2 SR&TD Integrated Program (N-01-01-01-24-01-07), ref. UMINHO/ BPD/36/2013.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Pain arises as a vital defense mechanism, essential for survival. Unfortunately, it can become a disease and lose its biological value when prolonged in time, as in chronic disorders. Arthritis, a chronic inflammatory disease highly prevalent in the elderly, is characterized by progressive degradation of joints and persistent pain. Recent advances in brain imaging techniques allowed pinpointing specific brain areas whose activity is altered in arthritic patients. Amongst these areas, the prefrontal cortex (PFC) was reported to be functionally altered in arthritis. In addition, a previous work from our lab showed the infralimbic cortex (IL), a subarea of the PFC, plays a facilitatory role in the descending modulation of nociception after activation of its type-5 metabotropic glutamate receptors (mGluR5) in experimental monoarthritis. As mGluR5 are expressed in neurons and astrocytes, to better understand which cell type might be mediating IL mGluR5-induced pronociception in healthy and monoarthritic animals, we selectively ablated IL astrocyte function using a gliotoxin (L-α-aminoadipate). Nociception was then evaluated before and after IL mGluR5 activation/inhibition during peripheral thermal noxious stimulation. In addition, to evaluate the role of the rostroventromedial medulla (RVM) as a potential downstream spinal-projecting effector of IL mGluR5-induced pronociception, the activity of its ON- and OFF-like cells was also assessed. Our results suggest IL astrocytic mGluR5 are involved in nociceptive facilitation in experimental monoarthritis but not in healthy animals. Interestingly, RVM cells traditionally associated with nociceptive facilitation/inhibition are not involved in IL mGluR5-induced pronociception although a potential contribution of RVM NEUTRAL-cells cannot be discarded. Future studies should focus on the mechanisms between astrocytes and neurons that facilitate nociception in experimental monoarthritis., A dor é um mecanismo de defesa essencial para a sobrevivência. Infelizmente, pode perder o seu valor biológico quando se prolonga no tempo, tornando-se ela própria numa doença crónica. A artrite, uma doença crónica inflamatória com elevada prevalência em idades mais avançadas. É caracterizada pela degradação progressiva das articulações e por dor persistente. Os avanços nas técnicas de imagiologia cerebral permitiram, nos últimos anos, a identificação de áreas específicas do cérebro que sofrem alterações na sua atividade em doentes com artrite. Entre estas áreas encontra-se o córtex pré-frontal (PFC), onde foram detetadas alterações funcionais na sua atividade em pacientes com artrite. Recentemente, um estudo do nosso laboratório demonstrou que o córtex infralímbico (IL), uma sub-região do PFC, desempenha um papel facilitador na modulação descendente da nocicepção após a ativação dos recetores metabotrópicos de glutamato do tipo 5 (mGluR5) em ratos com monoartrite experimental. Dado que os mGluR5 são expressos em neurónios e astrócitos, e para perceber qual o tipo de célula que pode estar a mediar o efeito pronociceptivo dos mGluR5 no IL em ratos saudáveis e com monoartrite, a função astrocítica no IL foi selectivamente ablada com recurso a uma gliotoxina (L-α-aminoadipato). A nocicepção foi avaliada antes e depois da ativação ou inibição dos mGluR5 no IL através da aplicação periférica de estimulação térmica nóxica. Adicionalmente, para avaliar o papel do bolbo rostral ventromedial (RVM) como um potencial efetor da pronocicepção induzida pelos mGluR5 no IL, a atividade das suas células do tipo ON e OFF foi avaliada. Os nossos resultados sugerem que a função dos mGluR5 nos astrócitos do IL está envolvida na facilitação descendente da nocicepção em monoartrite experimental. Curiosamente, as células do RVM tradicionalmente associadas à facilitação/inibição nociceptiva não estão envolvidas na pronocicepção induzida pelos mGluR5 no IL, no entanto, um potencial contributo das células NEUTRAS do RVM não deve ser descartado. Seria interessante em trabalhos posteriores estudar os mecanismos de interação entre astrócitos e neurónios que levam à facilitação da nocicepção em ratos com monoartrite experimental.

Dissertação de mestrado Ciências da Saúde, Damage to the spinal cord can result in irreversible impairments and complete loss of motor, sensory and autonomic functions. Riluzole and magnesium have been widely investigated as neuroprotective agents in animal models of spinal cord injury. As these drugs protect the injured spinal cord through different mechanisms we aimed to investigate if their neuroprotective efficacy could be cumulative. An in vivo experiment was set using female Wistar Han rats that underwent a thoracic spinal cord contusion (T8) using a weight drop method. An hour after injury, animals were randomly distributed to receive: 1) saline, 2) riluzole (2.50 mg/kg), 3) magnesium chloride (24.18 mg/kg) in a polyethylene glycol formulation, or 4) a combined treatment (riluzole and magnesium). Subsequent treatments were given in four intraperitoneal injections (spaced 12 h apart). The Basso, Beattie, and Bresnahan locomotor rating scale, an activity box test, and a swimming test were used to evaluate behavioral recovery for periods up to four weeks. Histological analysis of the spinal cords was performed to measure the extent and volume of the lesion, axonal preservation, serotonergic and glutamatergic fiber sparing, motor neuron survival, and inflammation. The results demonstrated that only the riluzole treatment significantly improved behavioral recovery, promoted tissue sparing, reduced lesion volume, while increasing serotonergic fiber sparing and axonal preservation in the caudal portion of the spinal cord. The combined treatment, although simultaneously targeting ionic and excitotoxic-related mechanisms, did not further improve behavioral and histological outcome, when compared with riluzole given alone., Danos infligidos na medula espinal podem resultar em deficiências irreversíveis e perda total de funções motoras, sensoriais e autonómicas. Os fármacos riluzole e magnésio têm sido amplamente investigados como agentes neuroprotetores em modelos animais de lesão vertebro-medular. Dado que estes fármacos protegem a medula lesionada através de mecanismos diferentes, um estudo foi desenvolvido com o objetivo de determinar se a sua eficácia neuroprotetora poderia ser cumulativa. Um ensaio in vivo foi definido utilizando ratos fêmeas Wistar Han submetidos a uma contusão torácica da medula espinal (T8). Uma hora após a lesão, os animais foram distribuídos aleatoriamente para receber: 1) solução salina, 2) riluzole (2,50 mg / kg), 3) cloreto de magnésio (24,18 mg / kg) numa formulação de polietilenoglicol, ou 4) um tratamento combinado (riluzole e magnésio). Os tratamentos subsequentes foram dados em quatro injeções intraperitoneais (com espaçamento de 12 horas). Foram utilizados a escala de classificação locomotora Basso, Beattie e Bresnahan, um teste de campo aberto (open-field) e um teste de natação, para avaliar a recuperação comportamental/motora dos animais durante um período de quatro semanas. Foi também realizada uma análise histológica das medulas espinais de forma a medir a extensão do volume da lesão, preservação das fibras axonais, serotonérgicas e glutamatérgicas, sobrevivência de neurónios motores e inflamação. Os resultados mostraram que apenas o tratamento com riluzole melhorou significativamente a recuperação funcional, preservou tecidos e concomitantemente obteve volumes de lesão reduzidos, assim como aumentou a preservação das fibras serotonérgicas e axonais na parte caudal da medula espinal. O tratamento combinado, embora visando simultaneamente dois mecanismos relacionados com desequilíbrios iónicos e excitotoxicidade, não resultou em melhorias funcionais e histológicas, quando comparado com a administração isolada de riluzole.

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Neurogenesis is the complex process of generating new neurons from their progenitor cells. It occurs both in developmental stages and in adulthood (in the latter case mainly in two brain areas, the subventricular zone (SVZ) and the subgranular zone). Neural stem cells (NSCs) and their progeny are regulated by a proper balance of intrinsic and extrinsic factors. One source of extrinsic factors is the choroid plexuses (CPs), located inside the cerebral ventricles. CPs play active roles in barrier function, secretion and as major regulator of the cerebrospinal fluid (CSF) composition. The SVZ neurogenic niche and the lateral ventricles are in close proximity and NSCs project their apical process into the lateral ventricles being under direct influence of CSF signaling. Thereby, it is plausible to assume that CP, through the modulation of CSF composition, can impact neurogenesis at embryonic and adult SVZ. Thus, the aim of this master thesis was to provide new insights on how molecules secreted by the CP affect the SVZ neurogenic niche. For this purpose, we selected two candidate proteins to study their hypothetic effect in SVZ cells: amphiregulin (AREG) and insulin growth factor binding protein 2 (IGFBP2), both known to be secreted by the CP towards the CSF. For this we used two in vitro techniques, a clonal assay and a differentiation assay, allowing us to study the impact of these proteins in proliferation and differentiation of human neuro progenitor cells. We also evaluated the effects of each protein in the SVZ of adult rats in terms of proliferation, cell cycle index and formation of new immature neurons. Moreover, as an additional aim, we intended to analyze the CP in key milestones of development to determine the temporal changes in the CP transcriptome and then correlate it with developmental changes known to occur in the SVZ cell population. For the transcriptome analysis, we extracted RNA from CP of animals in postnatal day 1, 4, 7, 10 and 60 and sequenced it by RNA-Seq. Our results indicate that AREG increases cell proliferation associated with a superior number of cells reentering the cell cycle and increases the number of newborn neurons. Regarding the experiments performed with IGFBP2 they indicate that this protein can increase proliferation rate and the number of cells reentering the cell cycle. This is accompanied with an augment in the number of newly born neuroblasts. In summary, the data presented here provides novel insights for two factors, secreted by the CP, that are playing a role in the modulation of SVZ neurogenic niche., A neurogénese é um processo complexo que leva à formação de novos neurónios a partir de células progenitoras. Este processo acontece tanto em estadios de desenvolvimento embrionário como no estado adulto (neste caso ocorre maioritariamente em duas áreas do cérebro, a região subventricular e a região subgranular). As células neuronais estaminais e a sua descendência são reguladas pelo balanço adequado de fatores intrínsecos e extrínsecos. Uma das fontes de fatores extrínsecos é o plexo coroide, localizado no interior dos ventrículos cerebrais. O plexo coroide tem um papel ativo em funções de barreira e secreção, bem como na modulação da composição do liquido cefalo-raquidiano (LCR). O nicho neurogénico da região subventricular e os ventrículos laterais são estruturas próximas e as células neuronais estaminais projetam o seu processo apical para o ventrículo lateral, estando desta forma sob a influência direta da sinalização do LCR. Assim, é plausível assumir que o plexo coróide, através da modulação da composição do LCR, consegue modular a neurogénese na região subventricular tanto no estado embrionário como no adulto. Desta forma, nesta tese de mestrado foi objetivo explorar de que forma moléculas secretadas pelo plexo coroide afetam o nicho neurogénico da região subventricular. Para tal, selecionámos duas proteínas para estudar o seu potencial impacto nas células da região subventricular: a anfiregulina (AREG) e a proteína de ligação 2 ao fator de crescimento insulina (IGFBP2), ambas secretadas pelo plexo coróide para o LCR. Para este estudo aplicamos duas técnicas in vitro, um ensaio clonal e um ensaio de diferenciação, que nos permitiram avaliar o efeito das proteínas na proliferação e diferenciação de células neuronais progenitoras humanas. Avaliamos também, in vivo, o efeito de cada proteína na região subventricular de ratos adultos em termos de proliferação, índice do ciclo celular e formação de novos neurónios imaturos. Como outro objetivo do trabalho propusemo-nos ainda a analisar as alterações temporais do transcriptoma do plexo coróide em alturas específicas do desenvolvimento, para posteriormente as correlacionar com alterações que ocorrem na população de células da SVZ. Para a análise do transcriptoma, extraímos RNA do CP de animais no dia pós-natal 1, 4, 7, 10 e 60 e sequenciámo-lo por RNA-Seq. Os nossos resultados indicam que a AREG aumenta a proliferação celular, com um aumento no numero de células a reentrarem no ciclo celular, aumentando também o número de novos neurónios imaturos. Resultados similares foram observados quando testámos os efeitos da IGFBP2, uma vez que observámos um aumento da proliferação acompanhado de um número superior de células a reentrarem no ciclo celular e no número de novos neuroblastos. Em suma, os dados apresentados aqui demonstram o papel desempenhado por dois fatores secretados pelo plexo coróide na modulação do nicho neurogénico da região subventricular., This work has been funded by the Bial Foundation under the grant number 217/12

Epidermal growth factor (EGF) and its receptor play critical roles in non-small cell lung cancer (NSCLC) carcinogenesis. A functional polymorphism in the EGF gene has been linked to increased cancer susceptibility. This study aimed to evaluate the role of the EGF +61A/G polymorphism as risk factors in NSCLC patients. For the present case-control study, we analyzed 112 NSCLC and 126 cancer-free controls from Portugal. Following DNA isolation from peripheral blood, EGF +61A/G polymorphism was assessed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Univariate and multivariate logistic regression analyses were used to calculate odds ratio (OR) and 95 % confidence intervals (95 % CI). False-positive report probability was also assessed. The EGF +61 genotypes frequencies in NSCLC were AA (23.2 %), AG (51.8 %), and GG (25 %) and in controls, AA (40.5 %), AG (41.3 %), and GG (18.3 %). When compared to the reference genotype (EGF +61A/A), we found a statistically significant association between EGF +61 A/G (OR = 2.142, 95 % CI 1.170-3.924) and EGF +61G/G (OR = 2.398, 95 % CI 1.157-4.968) genotypes and susceptibility to development of NSCLC. Furthermore, stratification by sex revealed a trend to increased risk of males carrying +61A/G genotype for developing NSCLC (OR = 2.044, 95 % CI 0.998-4.188) when compared to A/A genotype. Our data suggest an increased risk to develop NSCLC in Portuguese population carrying the EGF +61A/G and +61G/G genotypes., The authors acknowledge all colleagues from SãoJoão Hospital (HSJ), Porto, Portugal (specially Professor Agostinho Marques, Dr. Idalina Araújo, Dr. Alice Barbosa, Dr. António Morais, nd Dr. Adriana Magalhães) and São Marcos Hospital, Braga, Portugal who directly or indirectly contributed for this work; all Day Hospital Nurses of HSJ (specially Nurse Fátima Figueiredo); Professor Henrique Queiroga, University of Porto, Porto, Portugal, for his critical contribu-tion; and Mr. Fernando Ferreira, HSJ Day Hospital Service, for this logistic contribution. We would like also to thank the Immuno hemotherapy Department of Hospital São Marcos, Braga, Portugal and Clínica Laboratorial Dr. Edgar Botelho Moniz, Santo Tirso, Portugal for their helpful assistance in the management of controls. This work was supported by ICVS internal research funds to Dr. Rui Manuel Reis.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Machado-Joseph Disease (MJD) belongs to the group of nine Polyglutamine (PolyQ) diseases, which are characterized by the appearance of misfolded protein species, protein aggregates, neuronal dysfunction and ultimately cell death, of which is triggered by the presence of an expanded CAG repeat in the respective disease-causing genes. Along with the pathogenic motif, all these disease-associated proteins are widely expressed but the diseases only affect specific subsets of neurons. So far there is no effective treatment available for these disorders. Because the pathogenic mechanism(s) underlying MJD are poorly understood, which might be hampering the progression of effective therapeutical targets, this work focused on the search for new therapies based on hypotheses, that additionally allow the study of molecular mechanism(s) of disease. For this, we used the CMVMJD135 mouse model, which recapitulates the human disease both at the phenotypic and neuropathologic levels. We tested the efficacy of several compounds acting on different aspects of cellular function: (i) molecular chaperone load, (Hsp90 inhibitor - 17-dimethyl aminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride - 17-DMAG); (ii) autophagy (lithium chloride and a combination of lithium chloride – LiCl - and temsirolimus - CCI-779); (iii) Endoplasmic reticulum (ER) stress response, (taroursodeoxycholic acid - TUDCA), also known to have multiple actions in the cells, and (iv) the energy status in the cell (creatine). Chronic treatment of CMVMJD mice with 17-DMAG resulted in a delay in progression of the motor coordination deficits and a reduction in neuropathology. While we observed limited induction of heat-shock proteins with treatment, we found evidence that 17-DMAG could be acting through autophagy, as levels of LC3-II and beclin-1 were induced in the brain of treated animals. This resulted in decreased levels of the mutant ataxin-3 (ATXN3) and reduced intranuclear aggregation of this protein. To further test autophagy induction as potential therapeutic approach for MJD, we tested LiCl alone and a combination of LiCl with CCI-779 (m-TOR independent and dependent inducers, respectively). In spite of activating autophagy, as suggested by the increased levels of Beclin-1, Atg7, and LC3- II, and a reduction in the p62 protein levels, lithium had no overall beneficial effects in MJD model concerning motor performance. Furthermore, the combined therapy using LiCl and CCI-779 proved to be deleterious to both WT and transgenic animals, failing to rescue their neurological symptoms in the first and exerting in neurotoxic effects in the latter. TUDCA is an orally bioavailable and BBB permeable bile acid with known neuroprotective action, through its anti-amyloidogenic and chemical chaperone activities and its ability to modulate apoptotic pathways. In addition, TUDCA is FDA-approved for chronic use in humans to treat liver disorders, but has also been shown to be beneficial in several models of different neurodegenerative diseases. In the CMVMJD135 model, TUDCA delayed the onset of disease and improved the motor phenotype, including balance, motor coordination and gait parameters, and ameliorated neurological reflexes, exploratory movement deficits and muscular strength problems. Although TUDCA treatment did not reduce the ATXN3 aggregate load in the brain, it normalized the RNA levels of TNF-α, Il1β and Il10 in the brainstem and reduced the astrogliosis in the substantia nigra and brainstem. These results demonstrated the therapeutic efficacy of TUDCA supplementation for MJD, most likely mediated by its anti-inflammatory properties, making this compound an attractive for the treatment of neurodegenerative diseases, including MJD.Lastly, we tested the efficacy of creatine, another naturally-occurring compound known to balance energy status in the cell. Creatine-supplemented diet led to an overall improvement in the motor phenotype of CMVMJD135 mice, namely improved motor coordination, limb strength and gait quality, and amelioration of some neurological parameters such as tremors and abnormal reflexes. Remarkably, chronic creatine treatment delayed the onset of several symptoms and, in some cases, completely abolished their appearance, supporting creatine supplementation as a useful strategy to slow the progression of MJD. In summary in this work we validated a new MJD mouse model for use in preclinical trials as a powerful tool to study simultaneously pathogenic mechanisms associated with the disease and to develop novel therapeutic strategies. Furthermore, we found that Hsp90 inhibitors, TUDCA and creatine are relevant therapeutic candidates for MJD, some of which could be advanced to clinical trials in MJD patients., A doença de Machado Joseph (DMJ) pertence ao grupo de nove doenças poliglutaminas em que o gene causador da doença possui uma expansão anómala do codão CAG. A presença desta expansão conduz ao aparecimento de espécies proteicas com conformação incorreta, agregados proteicos, disfunção neuronal e consequentemente, morte celular. Para além da expansão, todos os genes associados a este grupo de doenças possuem expressão ubíqua apesar de só afetarem subconjuntos específicos de neurónios. Atualmente, não existe tratamento eficaz para a DMJ. Uma das razões pelas quais há um atraso no desenvolvimento de alvos terapêuticos está relacionada com o conhecimento incompleto do(s) mecanismo(s) de patogénese associados à DMJ. Assim sendo, o objetivo deste estudo centrou-se na procura de novas terapias, usando uma abordagem baseada em hipóteses, que pode também permitir o estudo dos mecanismo(s) moleculares da doença. Para tal, foi usado o modelo de ratinho CMVMJD135 que recapitula a doença humana a vários níveis, nomeadamente fenotípico e neuropatológico. Testámos a eficácia de diversos compostos com alvos terapêuticos relacionados com diferentes funções celulares: (i) níveis de chaperones moleculares (inibidor de Hsp90 – 17-dimetil aminoetillamino 17- demetoxigeldanamicina - 17-DMAG); (ii) autofagia (cloreto de lítio e combinação de cloreto de lítico –LiCL e temsirolimus - CCI-779); (iii) resposta ao stress do retículo endoplasmático (ácido tauroursodesoxicólico – TUDCA), com múltiplas acções celulares, e (iv) estado energético celular (creatina). O tratamento crónico com 17-DMAG no ratinho CMVMJD135 resultou num atraso da progressão da descoordenação motora e redução da neuropatologia. Apesar de ter sido observada uma indução limitada das chaperonas moleculares, este tratamento poderá ter atuado a nível da autofagia na medida em que houve indução dos níveis de LC3-II e beclina-1 no cérebro de animais tratados. Esta indução resultou na diminuição dos níveis de ataxina-3 (ATXN3) e uma redução da agregação intranuclear desta proteína. Para testar mais aprofundadamente a indução da autofagia como potencial terapia para a DMJ, foi testado LiCl isoladamente e em combinação com CCI-779 (atuando de forma independente e dependente da sinalização mTOR, respectivamente). Apesar da ativação da autofagia, sugerida pelos níveis aumentados de beclina-1, Atg7, LC3-II e redução dos níveis proteicos de p62, o tratamento do modelo DMJ com lítio foi de uma forma geral ineficaz ao nível do desempenho motor. Além disso, a terapia combinada de LiCl e CCI-779 revelou-se prejudicial em ambos os ratinhos WT e transgénicos, falhando na recuperação de sintomas neurológicos e sendo neurotóxico. O TUDCA é um ácido biliar com administração oral e permeável à BBB com funções neuroprotectoras conhecidas, através da sua capacidade anti-amiloidogénica, actividade de chaperona química e de modulação de vias apoptóticas. Adicionalmente, o TUDCA é um composto aprovado pela FDA para administração crónica no tratamento de doenças hepáticas, sendo também benéfico em diversos modelos de doenças neurodegenerativas. No modelo CMVMJD135, o tratamento com TUDCA atrasou o início da doença e melhorou o fenótipo motor incluindo equilíbrio, coordenação motora, e parâmetros da marcha, reduziu os reflexos neurológicos anómalos, melhorou os défices no movimento exploratório e força muscular. Apesar de o tratamento com este composto não ter reduzido os níveis de agregação da proteína ATXN3, foi eficaz na redução dos níveis de expressão de TNF-α, Il1β e Il10, tendo também reduzido a astrogliose no tronco cerebral e substantia nigra. Estes resultados demonstram a eficácia terapêutica da suplementação com TUDCA na DMJ, muito provavelmente através das suas capacidades anti-inflamatórias, o que torna este composto atrativo no tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a DMJ. Por fim foi testada a creatina, outro composto natural reconhecido pela eficácia em restabelecer o equilíbrio energético na célula. A dieta suplementada com creatina conduziu a uma melhoria geral no fenótipo motor do ratinho CMVMJD135; nomeadamente, melhorou a coordenação motora, força nos membros e qualidade da marcha. Também teve impacto positivo em parâmetros neurológicos como os tremores e reflexos anormais. Surpreendentemente, o tratamento crónico com creatina atrasou o início do aparecimento de diversos sintomas e até aboliu a presença de alguns, o que reinforça a suplementação com creatina como uma estratégica eficaz no atraso na progressão de DMJ. Em conclusão, este estudo validou o novo modelo DMJ de ratinho para ensaios pré-clínicos como uma ferramenta valiosa para estudar simultaneamente mecanismos patogénicos associado à doença e para desenvolver novas estratégias terapêuticas. Além disso foi demonstrado que inibidores da Hsp90, TUDCA e creatina são candidatos terapêuticos relevantes para a DMJ, alguns dos quais com possibilidade de avançarem para ensaios clínicos em doentes., Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) SFRH/BD/78388/2011

Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, Ensaios clínicos e experimentais sugerem o stress como fator de risco para a doença de Alzheimer (DA), uma vez que o stress crónico e níveis elevados de hormonas de stress, glucocorticoides (GC), induzem hiperfosforilação da Tau, uma das principais características da DA. Embora estudos prévios tenham demonstrado que o stress e os GC alteram os níveis de diversas chaperonas, produzindo alterações na homeostasia da proteína Tau, os mecanismos que regulam a patologia da Tau induzida pelo stress, bem como o seu efeito nos deficits cognitivos e emocionais, são ainda desconhecidos. Vários estudos sugerem que as histonas desacetilases (HDACs) são importantes componentes epigenéticos na DA, mostrando que a expressão da HDAC6 aumenta significativamente no hipocampo de pacientes e modelos animais da doença. Entre outros, a HDAC6 está envolvida nas vias de sinalização dos recetores de GC, bem como na indução de grânulos de stress (GS), densos agregados citoplasmáticos compostos por proteínas e ARNs formados quando a célula é exposta a stress. Recentemente, demonstrou-se que os GS promovem a agregação neurotóxica da Tau na DA. Posto isto, esta dissertação de mestrado monitoriza o potencial envolvimento da HDAC6 e dos GS nos efeitos nefastos do stress na agregação da Tau e deficits comportamentais associados. Recorrendo a murganhos transgénicos e modelos celulares da DA expressando a proteína humana Tau com a mutação P301L, este estudo demonstra que a exposição prolongada ao stress induz patologia da Tau no hipocampo das fêmeas, aumentando o nível desta proteína e dos GS; o hipocampo dos machos demonstra uma clara resiliência aos efeitos do stress. Adicionalmente, os nossos estudos in vitro confirmam a indução de GS e subsequente acumulação da Tau após tratamento com um GC sintético, dexametasona, sugerindo que a indução dos GS depende dos GC. Além disto, o uso de Tubacina, um inibidor seletivo da HDAC6, atenuou a formação de GS e a acumulação de Tau induzidos pelo tratamento com GC, sugerindo um papel importante da HDAC6 na agregação patológica da Tau induzida pelo stress e GC. Em suma, estes resultados providenciam novos conhecimentos acerca dos mecanismos subjacentes ao papel neurodegenerativo do stress para o desenvolvimento da DA, destacando a HDAC6 e os GS como componentes essenciais na patologia induzida pelo stress., Clinical and experimental evidences suggest environmental stress as a risk factor for Alzheimer’s disease (AD), as chronic stress and stress hormones, glucocorticoids (GC), trigger abnormal Tau hyperphosphorylation and aggregation, one of the main pathomechanisms of the disease. Although previous studies have shown that stress and GC influence the levels of molecular chaperones, disturbing Tau proteostasis, the underlying mechanisms of the stress-induced Tau pathology, and its significance for the related cognitive and emotional deficits remain unknown. Several studies suggest that histone deacetylases (HDACs) are important epigenetic components of AD etiopathogenesis, reporting increased expression of HDAC6 in the hippocampus of AD patients and animal models. Among others, HDAC6 is involved in GC receptor signaling, as well as in the induction of stress granules (SG), dense cytosolic aggregations composed of proteins and RNAs that appear when the cell is under stress. Recently, SG were reported to promote neurotoxic Tau aggregation in AD brain. Therefore, this Master thesis monitors the potential involvement of HDAC6 and SG in the detrimental impact of stress on Tau aggregation and related behavioral deficits. Using AD transgenic animal and cellular models expressing mutant P301L human Tau, this study shows that prolonged stress triggers Tau pathology in female hippocampus, increasing the levels of Tau aggregates and SG, while male hippocampus exhibits a clear resilience to stress. Furthermore, our in vitro studies confirm the induction of several SG markers and subsequent Tau accumulation by the treatment with a synthetic GC, Dexamethasone, suggesting that the stress-driven induction of SG is GC-dependent. In addition, treatment with Tubacin, a selective HDAC6 inhibitor, attenuated the increased formation of SG and the accumulation of Tau induced by GC, suggesting a potential role for HDAC6 in stress/GC-triggered pathological Tau aggregation. Altogether, these results provide novel evidence about the molecular underpinnings of the neurodegenerative role of stress towards the development of AD pathology, highlighting HDAC6 and SG as essential cellular partners in stressinduced brain pathology.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde., Healthy aging is a dynamic and inevitable process characterized by cognitive declines and inter-individual variability. Even though these declines seem to be inevitable or hard to revert, some individuals are known decline slower than others, both functionally and cognitively. Alterations in brain structure and function, cognitive changes and other factors such as lifestyle, occupation or education are known to interact with each other and mutually contribute for the heterogeneity observed along the aging process. Although, the neuroscience research community has put a lot of effort in understanding the structural and functional changes that take place in the human brain along aging, most studies have precluded the fact that the human brain is complex network (connectome) with interactions between different brain regions/structures and where both passive and reactive processes take place. The main goal of the present thesis was to provide new insights on how the human brain network ages and try to identify biomarkers of overall good cognitive healthy aging. Results indicate that older individuals with overall good cognitive performance present lower levels of macro and micro-structural indicators of white matter (WM) lesioning/degeneration than poor performers while WM volumetry does not account for inter-individual variability in performance. At the functional level, overall good cognitive performance is associated with increased local and global network segregation and integration revealing that both specialization of clusters in particular functions as well as efficient information flow through the entire brain network play important roles in cognition. We also revealed for the first time the brain networks whose functional connectivity (FC) levels are associated with important contributors for inter-individual variability in cognitive performance, namely education level and cognitive reserve (CR). These factors were associated with local and global changes in network characteristics and we have demonstrated that CR is associated with higher global efficiency of the FC-derived brain connectome. Finally we demonstrated through a longitudinal analysis that aging is associated with both decreases and increases in FC. Local network alterations that occur in aging have a negative impact mostly in frontal regions accompanied by local rearrangements possibly reflecting compensatory mechanisms that ultimately lead to no alterations in global network properties. Furthermore we revealed that changes in local clustering of the putamen and hippocampus are biomarkers of longitudinal trajectories of learning and recall, respectively. Concluding, we revealed that better cognitive performance in aging reflects both preserved brain structure as well as more efficient and segregated brain networks with education and CR playing important roles in brain network function in aging. Aging itself produces rearrangements in brain network properties, possibly reflecting both detrimental effects and compensatory mechanisms, and changes in local network properties associate with changes in cognition. This also suggests that network approaches are useful tools to assess brain function providing new biomarkers of successful aging., O envelhecimento saudável é um processo dinâmico e inevitável caracterizado por declínios cognitivos e variabilidade inter-indivíduos. Apesar destes declínios parecerem ser inevitáveis ou difíceis de reverter, alguns indivíduos apresentam maiores declínios do que outros, quer funcionalmente quer cognitivamente. Sabe-se que alterações na estrutura/função cerebral, alterações cognitivas e outros factores como o estilo de vida, a ocupação ou o nível educacional, são fatores conhecidos que interagirem e contribuem mutuamente para a heterogeneidade observada ao longo do envelhecimento. Apesar da comunidade científica de neurociências ter colocado um amplo esforço na tentativa de perceber quais as alterações estruturais e funcionais que acompanham o envelhecimento, a maioria dos estudos negligencia o fato do cérebro ser uma rede complexa (conetoma) com interações entre diferentes estruturas/regiões cerebrais onde vários processos ativos e reativos acontecem. O principal objetivo da presente tese consiste em fornecer novos dados sobre como a rede cerebral humana envelhece na tentativa de identificar novos bio-marcadores de boa cognição geral no envelhecimento saudável. Os resultados indicam que as pessoas mais velhas com boa performance cognitiva geral apresentam menores níveis de indicadores micro- e macro-estruturais de lesão/degeneração de substância branca (SB) do que indivíduos com má performance cognitiva geral e que a volumetria de SB não parece explicar a variabilidade inter-indivíduos. Ao nível funcional, boa performance cognitiva geral está associada com maior segregação local e integração, revelando que quer a especialização de grupos de regiões em determinadas funções quer um fluxo de informação mais eficientes ao longo de toda a rede cerebral são fatores importantes para a cognição. Nesta tese revelámos pela primeira vez quais as redes cerebrais cujos níveis de conetividade funcional (CF) se associam com fatores que contribuem fortemente para a variabilidade cognitiva inter-indivídual, nomeadamente o nível educacional e a reserva cognitiva (RC). Estes fatores estão associados com alterações topológicas locais e globais e demonstrámos ainda que a RC está associada com uma maior eficiência global da do conetoma cerebral obtido a partir de CF. Por fim, demonstrámos através de uma abordagem longitudinal que o envelhecimento se encontra associado a decréscimos e aumentos de CF. Alterações locais na rede que acontecem ao longo do envelhecimento afectam negativamente regiões frontais que são acompanhadas por rearranjos topológicos locais, possivelmente refletindo mecanismos compensatórios e que levam a que as propriedades globais da rede não sejam afectadas. Revelámos ainda que alterações no clustering local do putâmen e do hipocampo são bio-marcadores das trajetórias longitudinais nos níveis de aprendizagem e de memória, respetivamente. Em conclusão, foi demonstrado que melhor cognição geral no envelhecimento reflete uma estrutura cerebral preservada bem como uma rede cerebral mais eficiente e especializada, sendo a educação e o RC fatores importantes para a função da rede cerebral no envelhecimento. O envelhecimento, por si, produz rearranjos nas propriedades da rede cerebral, possivelmente refletindo efeitos prejudiciais e compensatórios, e alterações nas propriedades locais da rede cerebral estão associadas com alterações na performance cognitiva. Isto sugere ainda que abordagens de redes são ferramentas úteis no estudo da função cerebral, providenciando novos biomarcadores de envelhecimento saudável.

Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, Impulsivity is a multifactorial construct which is manifested in actions and choices that are prematurely expressed or poorly conceived and that often result in undesirable outcomes. Impulsivity is part of the behavioral repertoire of healthy individuals but abnormal manifestations can occur in neuropsychiatric disorders as addiction and attention deficit and hyperactivity disorder. At the level of preclinical research several behavioral paradigms have been developed to assess various dimensions of impulsive behavior, including the 5-choice serial reaction time task and the delay-discounting, for impulsive actions and choices, respectively. Recently a new paradigm, the variable delay-to-signal (VDS), was developed and validated by the group. It provides a fast assessment of both impulsive actions and choices, which makes it appealing for the characterization of large samples of individuals. This thesis intended to take advantage of the VDS characteristics to perform a large scale and integrated analyzes of impulsivity manifestations in rats. Information relative to VDS performance of 188 male and female rats with different ages was collected and analyzed. It was observed that both action and choice impulsivity decreased with aging. Curiously, choice impulsivity peaked in young adults and not in adolescent animals, as frequently reported. Sex–related differences were greatly dependent on the age group and form of impulsive behavior. In general, young adult males presented increased impulsive choices and females increased impulsive actions. In adulthood, females presented more impulsiveness in both actions and choices but these differences disappear in old adult animals. Interesting, the estrous cycle seems to play an important role in females’ impulsivity as impulsive choices increase in the proestrous phase. In the second part of this thesis the role of accumbal dopaminergic neurons in impulsivity was studied. In a pilot study, 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was injected in the left (6-OHDA-L) and right (6 – OHDA-R) accumbens (core division), to selectively deplete dopaminergic neurons. Six weeks later, the VDS was performed followed by other behavioral paradigms for motor and mood-related behaviors to evaluate possible additional effects of the lesions. It was observed that 6-OHDA-L, but not 6-OHDA-R animals, presented higher impulsive choices and a significantly superior amount of exploration time in the central area of the open field, possibly associated with poorer risk assessment. No other behavioral differences were observed. In conclusion, the selected approach involving a large and heterogeneous sample of rats proved to be very effective unveiling complex interplays between age and sex in the manifestation of both action and choice impulsivity. Such outcome was critically associated with the versatility of the VDS paradigm. Previously published information in other behavioral paradigms regarding heightened impulsivity in young animals was confirmed and refined and sex-specific variations in impulsive behavior across rats’ lifespan were demonstrated. Additionally, the pilot study that followed provided an interesting proof-of-concept regarding accumbal dopaminergic role in impulsivity and further established the VDS as a tool to study the neurobiology of impulsive behavior., A impulsividade é um conceito multifactorial que se manifesta em acções e escolhas que são expressas prematuramente ou concebidas de forma imprudente e que frequentemente levam a resultados indesejáveis. A impulsividade faz parte do comportamento de indivíduos saudáveis mas pode expressar-se anomalamente em distúrbios neuropsiquiátricos como vício e perturbação de hiperactividade e défice de atenção. Ao nível da investigação pré-clínica vários paradigmas comportamentais têm sido desenvolvidos para medir as várias dimensões do comportamento impulsivo, incluindo o “5-choice serial reaction time task” e o “delay-discounting” para acções e escolhas impulsivas, respectivamente. Recentemente, um novo paradigma foi desenvolvido e validado pelo grupo, o “variable delay-to-signal” (VDS). Este paradigma permite a medição, de forma rápida, de acções e escolhas impulsivas, o que o torna ideal para caracterizar grandes amostras de indivíduos. Esta tese teve como objectivo beneficiar das características do VDS para realizar uma análise integrada e a larga escala dos comportamentos impulsivos em ratos. Dados relativos à performance no VDS de 188 ratos (machos e fêmeas) de diferentes idades foram recolhidos e analisados. Foi observado que quer as acções quer as escolhas impulsivas diminuem com a idade. Curiosamente, a impulsividade de escolha foi mais amplificada em ratos jovens adultos e não em adolescentes, como é frequentemente reportado. Diferenças associadas ao sexo são dependentes da idade e do tipo de comportamento impulsivo. Em geral, jovens adultos machos apresentam maior impulsividade de escolha e as fêmeas maior impulsividade de acção. Na idade adulta, as fêmeas apresentam maior impulsividade de escolha e acção, mas em animais velhos adultos estas diferenças não se verificam. Nas fêmeas, o ciclo estral parece representar um papel importante nas escolhas impulsivas, visto que estas estão aumentadas na fase proestrus do ciclo. Na segunda parte da tese, a função dos neurónios dopaminérgicos do Núcleo accumbens (Nac) em impulsividade foram estudados. Num estudo piloto injectou-se 6-hydroxidopamina (6-OHDA) no lado direito (6-OHDA-D) ou esquerdo (6-OHDA-E) do Nac (divisão core), de forma a destruir selectivamente os neurónios dopaminérgicos. Seis semanas após a lesão realizou-se o VDS para medir impulsividade. Outros paradigmas comportamentais associados ao humor e comportamento motor foram realizados, de forma a avaliar possíveis efeitos adicionais da lesão. Os animais 6-OHDA-E, contrário aos 6-OHDA-R, apresentaram um aumento das escolhas impulsivas e maior tempo de exploração da área central do “open-field”, possivelmente associado a uma avaliação de risco deficiente. Nas outras medidas comportamentais não foram verificadas diferenças. Em conclusão, a abordagem seleccionada foi eficiente a demonstrar interacções complexas entre os efeitos da idade e do sexo na manifestação de comportamentos impulsivos. Os nossos resultados permitem confirmar e melhorar os resultados já demonstrados por outros estudos sobre o aumento da impulsividade em jovens adultose demonstram variações específicas associadas ao sexo em comportamentos impulsivos ao longo do envelhecimento. Adicionalmente, o estudo piloto realizado originou evidências muito fortes sobre o papel da dopamina do Nac na impulsividade e foi possível estabelecer o VDS como uma ferramenta para o estudo da neurobiologia do comportamento impulsivo.

Dissertação de Mestrado em Ciências da Saúde, Lesões Vertebra-Medulares (LVMs) são uma condição clinica que geralmente causam paraplesia e tetraplesia. As suas consequencias devastadores estão relacionadas com elevadas respostas inflamatórias e com a formação de uma cicatriz glial, que inibem processos endógenos de regeneração axonal. Devido à sua complexidade, terapias eficazes ainda não foram implementadas na clinica. Neste sentido, as Células Estaminais Perivasculares do Cordão Umbilical Humano (CEPVCUH) foram recentemente sugeridas como uma potential terapia para as LVMs, uma vez que são capazes de promover, através do seu secretoma, o reparo endógeno da medula espinhal, bem como de controlar o seu processo inflamatório. Assim sendo, o objectivo da presente tese foi de estabelecer uma ligação entre o secretoma, na forma de meio condicionado (CM) das CEPVCUHs, e das fracções destas, com possiveis aplicações para o reparo de LVMs. Primeiramente, avaliamos o potencial neurogenico do CEPVUH-CM e as fracção maior (F>5kDa) e menor do que 5kDa (F5kDa e CEPVUH-F5kDa têm potential neurogénico superior que a F5kDa, como a F5kDa tem na sua constituição moleculas capazes de induzir o crescimento de neurites, de promover neuroprotecção e neuro-diferentiação; tais resultados explicam os resultados da mesma, quer in vitro, quer in vivo. No geral, os resultados apresentados nesta tese indicam que as CEPVUHs têm potencial para o desenvolvimento de futuras ténicas para tratar LVMs, e que as fracções do secretoma destas células demonstram um potential distinto em termos de neurogénese, neuritogénese e neuroprotecção., Spinal Cord Injury (SCI) is a major clinical problem that commonly causes paraplegia and tetraplegia. Its devastating consequences are related to high inflammatory responses and the formation of a glial scar, which is highly inhibitory towards axonal regeneration. Due to such complexity, effective therapies are yet to be implemented. Recently, the use of Human Umbilical Cord Perivascular Cells (hUCPVCs) has been suggested as a potential therapy for SCI, as they promote spinal cord’s endogenous repair and control inflammation through their secretome. In the present thesis, we aimed to establish a link between hUCPVCs’ conditioned media (CM) composition, and the different fractions within it, with possible applications towards spinal cord’s repair. Firstly, we evaluated the neurogenic potential of hUCPVCs-CM, and its fractions above and bellow 5kDa (F>5kDa and F5kDa and hUCPVC-F5kDa hold higher neurogenic potential than the F5kDa showed higher neuritogenic potential than the other conditions either in the presence or absence of Nerve Growth Factor (NGF). Additionally, our in vivo experiments showed that although both the F>5kDa and F5kDa holds molecules capable of inducing neurite outgrowth, neuroprotection and neuronal differentiation, which explain its results in vitro and in vivo. Altogether, the results presented in this thesis indicate that hUCPVC-CM holds potential for the development of future therapeutic techniques, and that its fractions display different therapeutic potentials in neurogenesis, neuritogenesis and neuroprotection.

BACKGROUND: The zoonosis bovine tuberculosis (TB) is known to be responsible for a considerable proportion of extrapulmonary TB. In Mozambique, bovine TB is a recognised problem in cattle, but little has been done to evaluate how Mycobacterium bovis has contributed to human TB. We here explore the public health risk for bovine TB in Maputo, by characterizing the isolates from tuberculous lymphadenitis (TBLN) cases, a common manifestation of bovine TB in humans, in the Pathology Service of Maputo Central Hospital, in Mozambique, during one year. RESULTS: Among 110 patients suspected of having TBLN, 49 had a positive culture result. Of those, 48 (98 %) were positive for Mycobacterium tuberculosis complex and one for nontuberculous mycobacteria. Of the 45 isolates analysed by spoligotyping and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number Tandem Repeat (MIRU-VNTR), all were M. tuberculosis. No M. bovis was found. Cervical TBLN, corresponding to 39 (86.7 %) cases, was the main cause of TBLN and 66.7 % of those where from HIV positive patients. We found that TBLN in Maputo was caused by a variety of M. tuberculosis strains. The most prevalent lineage was the EAI (n?=?19; 43.2 %). Particular common spoligotypes were SIT 48 (EAI1_SOM sublineage), SIT 42 (LAM 9), SIT 1 (Beijing) and SIT53 (T1), similar to findings among pulmonary cases. CONCLUSIONS: M. tuberculosis was the main etiological agent of TBLN in Maputo. M. tuberculosis genotypes were similar to the ones causing pulmonary TB, suggesting that in Maputo, cases of TBLN arise from the same source as pulmonary TB, rather than from an external zoonotic source. Further research is needed on other forms of extrapulmonary TB and in rural areas where there is high prevalence of bovine TB in cattle, to evaluate the risk of transmission of M. bovis from cattle to humans., Swedish International Development Cooperation Agency / Department for Research Cooperation (Sida/SAREC) through Eduardo Mondlane University and Karolinska Institutet Research and Training (KIRT) collaboration

Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, Patients with Spinal Cord Injury (SCI) still face physical, psychological and economic problems, since current treatments are unsatisfactory regarding regenerative therapies that translate into a complete and functional recovery. Numerous strategies have been arising for the treatment of this pathology, but single therapy approaches demonstrated to be insufficient for the successful repair of SCI. Therefore, combinatorial approaches that act in a synergistic arrangement, may help to overcome this problem, as a combination of techniques will avoids the limitations of using a single individual technique. Thus, in the present study, it was evaluated the efficacy of three natural hydrogels: Gellan-Gum (functionalized with a fibronectin peptide), Collagen and NVR-Gel in promoting neuritogenesis, using an in vitro model of axonal regeneration based on Dorsal Root Ganglia explants (DRGs). Secondly, it was assessed the effects of combining the three hydrogels with Adipose tissue-MSCs (ASCs) and the effects on the regenerative properties of their secretome, using cocultures of ASCs with the DRGs explants, on the different hydrogels. Then, a biomolecular approach using GDNF (Glial cell-derived Neurotrophic Factor) covalently attached to iron oxide nanoparticles (NPs) was tested, to determine their effect on axonal growth and length, using the same in vitro model. Lastly, it was evaluated the combined use of the NPs with the ASCs and the hydrogels, to assess the sustainability of this tissue engineering approach for SCI. This work demonstrated that the use of hydrogels supports both axonal growth and ASCs survival, providing a permissive matrix for the regrowth of new axons and enhances the known regenerative potential of the Mesenchymal like Stem Cells isolated from the adipose tissue (ASCs). The results also reveal the importance of having biological cues, such as ECM molecules, to promote a more effective and pronounce effect on both the ASCs and DRGs cultures. Moreover, the interaction of the ASCs with the collagen affected positively the ASCs’ viability, morphology and secretome, besides promoting the highest axonal growth of the three matrices, indicating that this is a strong strategy for SCI applications. Concerning the biomolecular approach, results demonstrated an improvement by both GDNF-NPs and soluble GDNF, confirming the positive effects of using neurotrophic support. However, it was observed that the NPs had a deleterious effects on the ASCs paracrine actions, a fact that should be further investigated before their combined use. This thesis established that ASCs-Collagen interaction is sufficient to significantly improve the axonal growth, and that sometimes “less is more”, as the same group induced a higher neuritogenesis than the combinatorial approach with the NPs. A deeper understanding of the different interactions might give new insights for tissue engineering approaches, and perhaps getting one step closer to a successful and functional recovery from SCI., Pacientes com Lesões Vertebro-Medulares (LVM) ainda enfrentam problemas físicos, psicológicos e económicos, uma vez que os tratamentos atuais são insatisfatórios no que toca a terapias regenerativas que levem a uma recuperação completa e funcional. Várias estratégias têm surgido para o tratamento desta patologia, no entanto, terapias individuais mostraram-se insuficientes em reparar com sucesso as LVM. Por essa razão, abordagens combinatórias que atuam de forma sinergistica, ajudam a superar este problema, uma vez que uma combinação de técnicas melhora ou evita as limitações da utilização de uma técnica individual. Assim sendo, neste estudo foi avaliada a eficácia de três hidrogéis naturais: Gellan-Gum (funcionalizado com um peptídeo de fibronectina), colágenio e NVR-Gel na promoção de neuritogénese, usando um modelo in vitro de crescimento axonal baseado em explantes de Gânglios da Raiz Dorsal (DRGs). Em segundo lugar, foi avaliado os efeitos combinados dos hidrogéis com as células mesenquimais do tecido adiposo (ASCs), e os efeitos nas propriedades regenerativas do seu secretoma, usando co-culturas de ASCs com os explantes de DRGs, sobre os diferentes hidrogéis. Em seguida, foi testada uma abordagem biomecular, em que o GDNF (Factor Neurotrófico derivado de Células Gliais) foi covalentemente ligado a nanoparticulas (NPs) de óxido de ferro, para determinar o seu efeito no crescimento e comprimento axonal, usando o mesmo modelo in vitro. Por último, foi avaliado o uso combinado das NPs com as ASCs nos hidrogéis, para avaliar a sustentabilidade desta abordagem de engenharia de tecidos para reparar LVM. Este trabalho demonstrou que o uso de hidrogéis auxila o crescimento axonal e a sobrevivência das ASCs, fornece uma matriz que é permissiva para o crescimento de novos axónios e aumenta o conhecido potencial regenerativo das células estaminais mesenquimais. Os resultados também revelam a importância de ter pistas biológicas, tais como moléculas da matriz extracelular, para promover um efeito mais eficaz e pronunciado tanto nas culturas de ASCs como nas de DRGs. Além disso, a interação das ASC com o colágenio afetou positivamente a viabilidade das ASCs, a sua morfologia e o seu secretoma, além de promover o maior crescimento axonal das três matrizes, indicando que esta é uma forte estratégia para aplicações em LVM. Em relação à abordagem biomolecular, os resultados demonstraram uma melhoria do GDNF tanto nas NPs como na forma solúvel, confirmando os efeitos positivos de utilizar suporte neurotrófico. No entanto, observouse que as NPs tiveram efeitos prejudiciais nas ações parácrinas das ASCs, algo que deve ser investigado antes da sua utilização combinada. Esta tese estabeleceu que a interação ASC-colágenio é suficiente para melhorar significativamente o crescimento axonal, e que às vezes "menos é mais", visto que este último grupo induziu uma maior neuritogénese do que a abordagem combinatória com as NPs. Uma compreensão mais profunda das diferentes interações pode dar novas perspectivas para abordagens de engenharia de tecidos, e talvez ficar um passo mais perto de uma recuperação bem sucedida e funcional das LVM.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Animal models play a central role in biomedical sciences having an important role in the progress of knowledge regarding the pathophysiology of neuropsychiatric disorders, as well as in the development of treatment strategies and testing new drugs for human application. One of the more prevalent neuropsychiatric disorders, causing serious medical and social problems, is depression. The full aetiology of this multidimensional and heterogeneous disorder, as well as its neurobiology, are not yet understood, and the diagnosis of depression in itself is based on multiple symptoms or psychopathological phenomena that together characterize a depressive state. Furthermore, the efficacy of antidepressive treatments is not always similar for different patients and the neurobiological mechanisms of action of commonly used antidepressant drugs are also not yet fully understood. The need to further investigate the psychopathology of the disorder and the mechanisms underlying the actions of antidepressant drugs and treatments, and the recognition that there are many fundamental physiological and behavioural responses that have been evolutionarily conserved between species, depending on similar neural structures and circuits, has resulted in scientists developing and validating several approaches to study depression. These include mimicking the disorder in animal model systems and using several tests to screen for the “symptoms” or depressive-like behaviours. Still, these models and tests present several limitations and their poor predictive power has been argued to be one of the reasons for the lack of efficacy of antidepressant drugs in humans. In face of the drawbacks and limitations presented by test paradigms in use in the field of behavioural neuroscience, and recognizing the need to improve those paradigms for the progress in the knowledge of the pathophysiology and therapeutics of mood disorders, we developed and validated a new paradigm for testing and analysing behavioural data – the “PhenoWorld” (PhW). This new paradigm is a refined housing setup, where groups of 6 rats with implanted RFID transponders live in an ethological enriched setting and have their feeding, locomotor activity, resting and social behavior automatically monitored. In a first study, we assessed the face and predictive validity of our new paradigm using a battery of emotional and cognitive standard tests in order to characterize the behavioral phenotype of animals living in the PhW and in standard conditions (in groups of 6 and 2 rats), after exposure to an unpredictable chronic mild stress (uCMS), and after exposure to uCMS and antidepressant (fluoxetine) treatment. We have shown that animals living in the PhW displayed similar, but more striking, behavioral differences when exposed to uCMS, such as increased behavioral despair shown in the forced swimming test, resting/sleep behaviour disturbances and reduced social interactions, compared to standard housed animals. Moreover, several PhW-cage behaviors, such as spontaneous will to feed or to exercise in running wheels, proved to be sensitive indicators of depressive-like behavior. In a second study, we assessed neuronal plasticity as a consequence of living in the PhW in a group of 6 animals, by comparing the structure of the prefrontal cortex (PFC) and the nucleus accumbens (NAc), two brain areas involved in the circuitry regulating motivation and reward, of PhW animals compared to those housed in standard conditions in social groups of 6 (STD6) and 2 rats (STD2). Findings indicated that rats living in the PhW displayed increased medial PFC layer II volumes, increased branching and length, as well as increased spine densities and spine numbers per neuron, in medial PFC pyramidal neurons. In the NAc, significant increases were only found for the length of NAc shell medium spiny neurons. The results proved the construct validity of the PhW and revealed that living in a naturalistic complex environment, closer to ‘real life experience’, impacts on the structure of brain regions implicated in complex multidimensional disorders. Finally, we addressed the animal welfare comparing the three housing conditions: PhW, STD6 and STD2. In this study, home-cage behaviour analysis showed that PhW animals have a clearer circadian pattern of sleep and social interactions. By promoting a good basic health and functioning, and the performance of natural behaviours with controllability but still keeping some physical and social challenges, the PhW stimulates positive affective states and higher motivation in rats. Even though understanding animal welfare has always some degree of subjectivity, these are evidences pointing for an increased welfare of animals living in the PhW. In conclusion, after validating the PhW to study a multidimensional mood disorder, we believe this new paradigm and naturalistic housing setting allows to address real systems neuroscience and can be very useful in future animal studies of other complex emotional and cognitive disorders., Os modelos animais têm um papel preponderante nas ciências biomédicas contribuindo para o progresso no conhecimento da patofisiologia das doenças neuropsiquiátricas e para o desenvolvimento de estratégias de tratamento, bem como para testar novos medicamentos em ensaios pré-clínicos. Uma das doenças psiquiátricas mais prevalentes, caracteristicamente multidimensional e heterogénea e que causa graves problemas médicos e sociais, é a depressão. Nem a etiologia, nem a neurobiologia desta doença são ainda completamente conhecidas e o diagnóstico de depressão é feito com base em múltiplos sintomas ou fenómenos psicopatológicos que no seu conjunto caracterizam o estado depressivo. A eficácia dos tratamentos antidepressivos não é semelhante para todos os pacientes, e os mecanismos neurobiológicas de ação dos tratamentos e fármacos antidepressivos não são ainda totalmente conhecidos. A necessidade de continuar a investigar a psicopatologia da depressão e os mecanismos pelos quais os antidepressivos exercem os seus efeitos, bem como o reconhecimento de que existem muitas respostas fisiológicas e comportamentais evolucionariamente conservadas entre espécies, levou os cientistas a desenvolver e validar estratégias de estudo da depressão mimetizando a doença em modelos animais e usando diversos testes para avaliar comportamentos tipo depressivos ou “sintomas”. No entanto, os testes animais desenvolvidos apresentam diversas limitações e um poder preditivo baixo, contribuindo para a baixa eficácia dos fármacos antidepressivos em humanos. Tendo em conta todas as limitações apresentadas e reconhecendo a necessidade de melhorar os paradigmas de comportamento animal usados em neurociências no sentido de promover o progresso no conhecimento da patofisiologia e terapêutica das doenças emocionais, desenvolvemos e validamos um novo paradigma para testar e analisar dados comportamentais de ratos – o “PhenpoWorld” (PhW). Este novo paradigma providencia um sistema de alojamento melhorado onde grupos de 6 ratos, com um microship emissor de radiofrequência implantado subcutaneamente, vivem num ambiente etologicamente mais rico e onde têm os seus comportamentos alimentares, atividade locomotora, e comportamento social automaticamente monitorizado. No primeiro estudo realizado, avaliamos as validades aparente e preditiva do novo paradigma utilizando uma bateria de testes de comportamento emocional e cognitivo de forma a caracterizar o fenótipo dos animais a viver no PhW ou em gaiolas convencionais (em grupos de 6 ou de 2 ratos), após exposição crónica a stress ( uCMS) ou após exposição a uCMS e tratamento com fluoxetina. Os resultados obtidos mostraram que os animais que vivem no PhW apresentam diferenças comportamentais semelhantes, mas mais vincadas, quando expostos a stress, tais como distúrbios do padrão de sono/descanso e redução da frequência de interações sociais. Além disso, verificamos que vários comportamentos apenas possíveis no PhW (vontade espontânea de atravessar portas automáticas para ir comer e ir fazer exercício nas rodas) são indicadores sensíveis de comportamento tipo depressivo. No segundo estudo, avaliamos a plasticidade neuronal como consequência de viver no PhW num grupo de 6 animais, comparando a estrutura do córtex pré-frontal ( PFC) e do nuccleus accumbens ( NAc), duas áreas do cérebro envolvidas nos circuitos que regulam motivação e recompensa, entre esses animais e animais alojados em gaiolas convencionais em grupos de 6 (STD6) e de 2 ratos (STD2). Os resultados revelaram, por exemplo, que os ratos que vivem no PhW apresentam um aumento do volume da camada II do PFC medial, e um aumento da complexidade das dendrites e do nº de espinhas por neurónio nos neurónios piramidais da camada II-III do PFC medial. No NAc, apenas verificamos aumentos significativos no comprimento das dendrites dos neurónios espinhosos médios da subdivisão NAc shell. Estes resultados refletem a validade construtiva do PhW e revelam que viver nesse ambiente naturalístico complexo, mais parecido com a vida real, tem impacto nas áreas do cérebro implicadas nas doenças multidimensionais complexas. Finalmente, avaliamos o bem-estar animal comparando as três condições de alojamento (PhW, STD6 e STD2) e mostramos que os padrões circadianos de sono e das interações sociais são mais marcados no PhW. A promoção da saúde, e o estímulo de comportamentos naturais com controlabilidade mas mantendo alguns desafios físicos e sociais contribuem para um estado afetivo positivo dos animais no PhW e para a sua elevada motivação e são indicadores de elevado bem-estar animal. Em conclusão, após validação do PhW no estudo de um modelo de depressão, acreditamos que este novo paradigma e gaiola naturalista permita futuros estudos no âmbito das neurociências de sistemas tornando-se muito útil em estudos animais de outras doenças emocionais e cognitivas complexas.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Lung development is a complex process that involves a coordinated orchestration of several signalling pathways and mechanisms in order to growth normally. Pulmonary hypoplasia emerges as a result of foetal abnormal lung development and consequently it leads to high rates of morbidity and mortality. The understanding of normal and abnormal foetal lung growth has became clinical relevant because it can offer new perspectives in the treatment of lung diseases. Regardless the recent advances in the knowledge of lung development, there are still a lot of mechanisms that need to be elucidated and investigated. The main aim of this PhD dissertation was to investigate new physiological regulators of foetal lung growth in order to find a prenatal therapy to revert foetal lung hypoplasia in Congenital Diaphragmatic Hernia (CDH) context. Moreover, two already well-known and studied signalling pathways (retinoic acid and neuroendocrine factors) were further investigated and an important link between them was discovered/established. Using molecular/histological techniques and gain-loss of function studies with nitrofen rat model and human samples we tried to achieve our goals. In this PhD thesis, it was demonstrated that ephrins B1, -B2 and eph B4 receptor were expressed during all foetal lung developmental stages. Moreover ephrin B1 and eph B4 receptor mainly presented mesenchymal expressions whereas ephrin B2 presented an epithelial expression. Ephrin B1 and –B2 administration contributed to increase foetal lung branching, but the observed increase has not significant biological meaning. Another interesting finding was the importance of microRNAs in human CDH. MicroRNA 10a and microRNA 200b are up-regulated in CDH human lungs when compared to normal lungs and they are also changed in the tracheal fluid of CDH babies that respond or did not respond to FETO. In FETO responders, after removing the plug, tracheal fluid presented higher expression of miR-10a and miR-200 family when compared to non-responders. Moreover, in responders the expression of those microRNAs increased significantly after removing the plug when compared to the expression observed at the moment of plug insertion. In line with the second aim mentioned above, we decided to look into two already known and apparently unrelated signalling pathways and discover a link between them because both of them are altered in CDH (retinoic acid was down-regulated and neuroendocrine factors were up-regulated). We found that neuroendocrine factors act as regulators of lung growth, sensitizing the lungs to the action of retinoic acid through RAR α and RAR γ up-regulation. To conclude, in this thesis, we showed that ephrins seem to be strong candidates to act as morphogens or being involved in vascular regulation instead of being a promisor mechanism to regulate lung growth. Additionally, we discovered that microRNAs are an important tool as a prognostic biomarker for CDH new-borns outcome. Moreover, we established a novel physiological link showing that neuroendocrine factors and retinoic acid signalling pathways interact with each other during foetal lung growth regulation. With this work, new insights into normal and abnormal foetal lung development were brought, discovering novel mechanisms to further explore as potential therapeutic targets into CDH field., O desenvolvimento pulmonar é um processo complexo que envolve a combinação e funcionamento coordenados de várias vias e mecanismos de sinalização, a fim do crescimento pulmonar normal. A hipoplasia pulmonar surge como resultado do desenvolvimento anormal do pulmão fetal estando associada a elevadas taxas de morbilidade e mortalidade. A compreensão do crescimento do pulmão fetal normal e anormal, tornou-se clinicamente relevante pelo facto de poder oferecer novas perspetivas no tratamento de doenças pulmonares. Independentemente dos recentes avanços no conhecimento do desenvolvimento pulmonar, ainda há muito que é preciso fazer, ser elucidado e investigado. O objetivo principal desta dissertação de doutoramento foi investigar novos reguladores fisiológicos de crescimento do pulmão fetal, a fim de encontrar uma terapia pré-natal para reverter a hipoplasia pulmonar fetal no contexto da Hérnia Diafragmática Congénita (HDC). Por outro lado, foi descoberto e estabelecido um elo de ligação entre duas vias de sinalização (via do ácido retinóico e fatores neuroendócrinos) já bem conhecidas e estudadas como sendo importantes ao longo do desenvolvimento pulmonar fetal. Foram utilizadas técnicas moleculares/histológicas e estudos de ganho-perda de função com o modelo do nitrofeno em rato e com amostras humanas. Nesta tese de doutoramento, foi demonstrado que as efrinas B1,-B2 e o recetor eph B4 são expressos durante todas as fases de desenvolvimento pulmonar fetal. Além disso, a efrina B1 e o recetor eph B4 expressaram-se essencialmente no mesenquima enquanto que a efrina B2 apresentou ter uma expressão epitelial. A administração de efrina B1 e –B2 em culturas de explantes pulmonares, contribuiu para aumentar a ramificação pulmonar fetal, embora o aumento observado não tenha significado biológico relevante. Outro achado interessante ao longo deste trabalho de Doutoramento, foi a importância dos microRNAs na fisiopatologia da HDC em humanos. O microRNA 10a e o microRNA 200b estão aumentados em pulmões humanos com HDC quando comparados com pulmões normais e a sua expressão está também alterada no fluido traqueal em crianças que sobrevivem ou morrem à oclusão fetal da traqueia (FETO). Nos pacientes que sobrevivem depois do FETO, após se remover o balão da traqueia, o fluido traqueal apresentou uma maior expressão de miR-10a e da família do miR-200 quando comparados com os não sobreviventes. Por outro lado, nos sobreviventes, a expressão desses microRNAs aumentou significativamente após a remoção do balão quando comparada com a expressão observada no momento da inserção do balão na traqueia. Em linha com o segundo objetivo acima mencionado, decidimos revesitar duas vias de sinalização já conhecidas e aparentemente não relacionadas, e descobrir uma ligação entre elas, pelo facto de ambas estarem alteradas na HDC (défice de ácido retinóico e aumento dos fatores neuroendócrinos nomeadamente da bombesina e da grelina). Descobrimos que os fatores neuroendócrinos atuam como reguladores do crescimento pulmonar, sensibilizando os pulmões para a ação do ácido retinóico através do aumento da expressão dos seus recetores (RAR α e RAR γ). Para concluir, nesta tese, mostramos que as efrinas parecem ser fortes candidatos para atuar como morfogéneos ou como fatores importantes na regulação vascular ao invés de serem um mecanismo importante de regulação do crescimento pulmonar. Por outro lado, descobrimos que os microRNAs são uma ferramenta importante que poderá vir a ser utilizada como um biomarcador de prognóstico em crianças com HDC. Adicionalmente, estabelecemos uma nova ligação fisiológica mostrando que os fatores neuroendócrinos e a via de sinalização do ácido retinóico interagem entre elas durante a regulação do crescimento fetal pulmonar. Com este trabalho, hipotetizámos novas abordagens sobre o desenvolvimento/regulação do pulmão fetal normal e anormal, descobrindo-se novos mecanismos para continuar a explorar como potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da HDC.

Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at: http://dx.doi.org/10.1016/j.electacta.2015.09.169., D-dimer, an important biomarker in emergency medicine, was determined by applying a label-free electrochemical capacitive approach with an antibody-based selective biosensor consisting of an electroactive self-assembled monolayer mounted on a commercially available gold electrode. Electrochemical measurements were performed by an impedance-derived approach (based on observing the complex capacitance diagrams from where electrochemical capacitance can be obtained as transducer signal) from which it was possible to obtain low limits of detection of 50 fmol L-1 in buffer (PBS) and 7 pmol L-1 in undiluted human serum (performed without any kind of sample pre-treatment), with good coefficient of determination (r2 = 0.99) in a clinically relevant D-dimer concentration range (from 1 to 1,000 ng mL-1). These electro analytical/chemistry results pave the way to the creation of low-cost and reliable point-of-care electrochemical approach for the quantitative bedside determination of D-dimer in clinical samples, thus speeding up the diagnosis of potentially lethal, nonetheless treatable, clinical conditions like pulmonary embolism., This work was financially supported by the São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2012-22820-7) and National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) grants. AS acknowledges CNPq for his Ph.D. studentship (141058/2013-7), SMM acknowledges FAPESP for her research grant (2014/030398) and LMG acknowledges the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for his post-doctoral fellowship (SFRH/BPD/76544/2011).

The fate of infected macrophages is a critical aspect of immunity to mycobacteria. By depriving the pathogen of its intracellular niche, apoptotic death of the infected macrophage has been shown to be an important mechanism to control bacterial growth. Here, we show that IL-17 inhibits apoptosis of Mycobacterium bovis BCG- or Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages thus hampering their ability to control bacterial growth. Mechanistically, we show that IL-17 inhibits p53, and impacts on the intrinsic apoptotic pathway, by increasing the Bcl2 and decreasing Bax expression, decreasing cytochrome c release from the mitochondria, and inhibiting caspase-3 activation. The same effect of IL-17 was observed in infected macrophages upon blockade of p53 nuclear translocation. These results reveal a previously unappreciated role for the IL-17/p53 axis in the regulation of mycobacteria-induced apoptosis and can have important implications in a broad spectrum of diseases where apoptosis of the infected cell is an important host defense mechanism., Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Project grants: PTDC/SAU-MII/101977/2008 (to AGC), PTDC/BIA-BCM/102776/2008 (to MS) and HMSP-ICT/0024/2010 (to RA) and co-funded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), through the Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER). Personal Grants: SFRH/BPD/33036/2006 to AC; SFRH/BD/33573/2009

Enquadramento: O Acidente Vascular Cerebral (AVC) acarreta múltiplas alterações no quotidiano do doente e seus familiares mas a reabilitação é considerada uma oportunidade. A Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados (RNCCI) facilita a reabilitação e a educação para a saúde possibilita a mudança de atitude necessária para a reabilitação. Objetivos: Conhecer e divulgar as perceções de doentes com AVC e enfermeiros relativamente às práticas de Educação para a Saúde na RNCCI. Metodologia: Qualitativa, com entrevista semi-estruturada, a 8 doentes e a 17 enfermeiros. A técnica escolhida foi a análise de conteúdo das entrevistas. Partimos de categorias definidas a priori, e emergiram outras categorias. Resultados: Os doentes atribuíram aos enfermeiros a maior parte da responsabilidade pela reabilitação. Os enfermeiros relacionaram os aspetos psicológicos e a importância do envolvimento da família com a adesão do doente ao regime terapêutico. Conclusão: Os doentes demonstram que se encontram no modelo biomédico, por outro lado os enfermeiros apontam o modelo biopsicossocial como orientador das suas práticas de Educação para a Saúde na rede., Theoretical framework: Stroke causes multiple changes in the daily lives of patients and their families, but rehabilitation emerges an opportunity. The RNCCI (National Network of Integrated Continuous Care; Rede Nacional de Cuidados Continuados Integrados) facilitates rehabilitation, and health education enables the necessary change of attitude for rehabilitation. Objectives: To identify and disclose nurses' and stroke patients' perceptions of the Health Education practices in the RNCCI. Methodology: A qualitative study was conducted. Semi-structured interviews were performed to 8 patients and 17 nurses. The technique used was the content analysis of interviews. Based on previously established categories, other categories emerged. Results: Patients assigned nurses most of the responsibility for the rehabilitation process. Nurses associated the psychological aspects and the importance of family involvement with the patients' adherence to the therapeutic regimen. Conclusion: While patients seem to be in the biomedical model, nurses point to the biopsychosocial model as a guide to their health education practices in the network., Marco contextual: El accidente cerebrovascular provoca múltiples cambios en la vida cotidiana de los pacientes y sus familias, pero la rehabilitación se considera una oportunidad. La Red Nacional de Atención Integral (RNCCI por sus siglas en portugués) facilita la rehabilitación y la educación para la salud permite el cambio de actitud necesario para la rehabilitación. Objetivos: Conocer y divulgar las percepciones de los pacientes con accidente cerebrovascular y de los enfermeros con respecto a las prácticas de educación para la salud en la RNCCI. Metodología: Cualitativa con entrevistas semiestructuradas a 8 pacientes y 17 enfermeros. La técnica elegida fue el análisis de contenido de las entrevistas. Partimos de categorías definidas a priori y surgieron otras categorías. Resultados: Los pacientes atribuyeron a los enfermeros la mayor parte de la responsabilidad en el proceso de rehabilitación. Los enfermeros relacionaron los aspectos psicológicos y la importancia de la participación de la familia con la adhesión del paciente al régimen terapéutico. Conclusión: Por un lado, los pacientes demuestran que se encuentran en el modelo biomédico. Por otro lado, los enfermeros señalan el modelo biopsicosocial como orientador de sus prácticas de educación para la salud en la red.

Inter-individual heterogeneity is evident in aging; education level is known to contribute for this heterogeneity. Using a cross-sectional study design and network inference applied to resting-state fMRI data, we show that aging was associated with decreased functional connectivity in a large cortical network. On the other hand, education level, as measured by years of formal education, produced an opposite effect on the long-term. These results demonstrate the increased brain efficiency in individuals with higher education level that may mitigate the impact of age on brain functional connectivity., This work was funded by the European Commission (FP7): “SwitchBox” (Contract HEALTH-F2-2010-259772) and co-financed by the Portuguese North Regional Operational Program (ON.2 – O Novo Norte) under the National Strategic Reference Framework (QREN), through the European Regional Development Fund (FEDER). José M. Soares, Paulo Marques, and Nadine C. Santos are supported by fellowships of the project “SwitchBox”; Ricardo Magalhães is supported by a fellowship from the project FCT ANR/NEU-OSD/0258/2012 funded by FCT/MEC (www.fct.pt) and by ON.2 – ONOVONORTE – North Portugal Regional Operational Programme 2007/2013, of the National Strategic Reference Framework (NSRF) 2007/2013, through FEDER.

Granulomas are the hallmark of mycobacterial disease. Here, we demonstrate that both the cell recruitment and the increased glucose consumption in granulomatous infiltrates during Mycobacterium avium infection are highly dependent on interferon-y (IFN-y). Mycobacterium avium-infected mice lacking IFN-y signalling failed to developed significant inflammatory infiltrations and lacked the characteristic uptake of the glucose analogue fluorine-18-fluorodeoxyglucose (FDG). To assess the role of macrophages in glucose uptake we infected mice with a selective impairment of IFN-y signalling in the macrophage lineage (MIIG mice). Although only a partial reduction of the granulomatous areas was observed in infected MIIG mice, the insensitivity of macrophages to IFN-y reduced the accumulation of FDG. In vivo, ex vivo and in vitro assays showed that macrophage activated by IFN-y displayed increased rates of glucose uptake and in vitro studies showed also that they had increased lactate production and increased expression of key glycolytic enzymes. Overall, our results show that the activation of macrophages by IFN-y is responsible for the Warburg effect observed in organs infected with M. avium., Funded by project ‘NORTE-07-0124-FEDER-000002-Host-Pathogen Interactions’ co-funded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2—O Novo Norte), under the Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), through the Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) and by Fundação para a Ciência e Tecnologia.

Tese de Doutoramento em Medicina, INTRODUÇÃO E OBJETIVOS: A videocápsula endoscópica permitiu avanços significativos no diagnóstico da patologia do intestino delgado, embora ainda existam limitações inerentes ao procedimento. Na doença de Crohn, com atingimento do intestino delgado, a enteroscopia por cápsula (EC) poderá desempenhar um papel importante não só no diagnóstico, mas também na objetivação da atividade inflamatória, podendo ainda repercutir-se na estratégia terapêutica. Pretendeu-se com este trabalho melhorar as potencialidades da EC na doença de Crohn do intestino delgado, com consequente repercussão na clínica (diagnóstica e terapêutica). MATERIAL E MÉTODOS: Utilizou-se uma população hospitalar de 82 doentes submetidos a EC, para tentar reduzir o número de enteroscopias incompletas após administração de um gastrocinético (domperidona), sempre que a permanência da cápsula no estômago fosse superior a 1 hora, controlada por real time viewer. Foi medido o tempo de trânsito intestinal, utilizando-se como grupo de controlo 307 doentes submetidos ao procedimento antes da adoção do real time viewer. Avaliou-se se a cromoendoscopia virtual, incorporada no software de leitura da videocápsula endoscópica, pode melhorar o delinear das lesões do intestino delgado, frequentes na doença de Crohn (úlceras, erosões, edema e atrofia vilositária), comparando-a com a leitura em modo convencional (luz branca). Foram selecionadas 100 imagens, visualizadas por quatro observadores, e comparados, para cada imagem, os modos Flexible Spectral Imaging Color Enhancement (FICE) e Blue Filter (BF), com o modo convencional, atribuindo um score objetivo. A concordância interobservadores foi avaliada utilizando o coeficiente de correlação interclasses. Procurou-se efetuar a validação do Score de Lewis. Este pretende objetivar e maximizar a concordância interobservador referente à medição da atividade inflamatória da doença de Crohn do intestino delgado avaliada através de enteroscopia por cápsula. Apesar da sua utilização após a incorporação no sofware de leitura da cápsula endoscópica Pillcam® (Given®, Rapid Reader®), tornava-se necessária a sua validação, ainda não efetuada. Com esse objetivo foram selecionadas 50 EC, em doentes com doença de Crohn, que foram distribuídas aleatoriamente por três examinadores. A cada exame foi atribuído um código e efetuada uma observação final por um único observador, que lhe atribuiu o score final e foi avaliado o grau de concordância interobservador. Pretendeu-se avaliar o impacto terapêutico que a EC pode ter nos doentes com doença de Crohn do intestino delgado. Avaliaram-se, numa população de 40 doentes submetidos a EC com diagnóstico de doença de Crohn, as alterações terapêuticas efetuadas até um período de 3 meses após a realização do procedimento, bem como a relação existente entre a severidade da atividade inflamatória observada na EC e essas mesmas alterações terapêuticas. RESULTADOS: No grupo monitorizado com o real time viewer e submetido seletivamente à administração de domperidona, a cápsula permaneceu menos tempo no estômago e reduziu significativamente as enteroscopias incompletas (3,7% vs. 15,6%). O tempo de trânsito intestinal não foi significativamente afetado. A aplicação da cromoendoscopia permitiu verificar que o FICE 1 se superioriza aos demais na melhoria do delinear das lesões, com uma sensibilidade de 65% e concordância interobservador de 86,7%. O Score de Lewis foi validado para a utilização na prática clínica, tendo-se verificado na sua determinação uma forte concordância interobservador. O impacto da enteroscopia por cápsula traduziu-se pelo diagnóstico, em 66% dos doentes, de lesões proximais do intestino delgado anteriormente não observadas por outros métodos de diagnóstico. Três meses após o procedimento, uma proporção significativa de doentes tinha iniciado terapêutica com tiopurinas e/ou biológicos, quando comparado com o período pré-enteroscopia por cápsula (30% vs. 4%), mais frequentemente naqueles com lesões severas do intestino delgado proximal. CONCLUSÕES: A utilização do real time viewer e a administração seletiva de domperidona permite reduzir o número de enteroscopias incompletas, sem afetar o tempo de trânsito intestinal ou a capacidade diagnóstica. A cromoendoscopia virtual pode melhorar o delinear de lesões frequentes na doença de Crohn (úlceras, erosões, edema e atrofia vilositária), com elevada concordância interobservador, mais marcada no FICE 1. O Score de Lewis foi validado e pode ser usado no contexto do diagnóstico, estadiamento, follow-up e estratégia terapêutica de doentes com doença de Crohn isolada do intestino delgado. A EC permite observar lesões previamente não diagnosticadas e contribuir para a alteração da estratégia terapêutica ao desencadear a introdução de medicação imunomoduladora e/ou biológica., INTRODUCTION AND AIMS: Video capsule endoscopy carried a significant improvement in the diagnosis of small bowel diseases, although some limitations of the technique remain to be overcome. In Crohn’s Disease, commonly affecting the small bowel, small bowel capsule endoscopy (SBCE) may have an important role on diagnosis and assessment of inflammatory activity, with potential implications on the therapeutic strategy. The aim of this work was to improve the capabilities and potentialities of SBCE in the evaluation of small bowel Crohn’s Disease, with an expected resulting influence on clinical practice regarding the diagnostic and therapeutic approach of Crohn’s Disease. MATERIALS AND METHODS: A hospital-based population of 82 patients submitted to SBCE was evaluated, aiming to reduce the proportion of incomplete examinations by using a gastrokinetic (domperidone) in the case of delayed gastric passage of the capsule (over one hour), assessed with the real time viewer. The small bowel transit time was compared with a control group of 307 patients who had been submitted to SBCE prior to the introduction of real time viewer procedure. The ability of virtual chromoendoscopy, which is incorporated in the video capsule endoscopy reading software, to improve the delineation of small bowel lesions which are frequent in Crohn’s Disease (ulcers, erosions, oedema and villous atrophy) was evaluated by comparative analysis with the conventional white light mode. One hundred images of lesions were selected and evaluated by using the Flexible Spectral Imaging Color Enhancement (FICE) and Blue Filter (BF), by 4 independent readers; each lesion was compared with standard white light view, and attributed an objective score to classify the relative quality of its delineation. Interclass correlation coefficient was determined as a measure of interobserver agreement. One of the aims of this work was to validate the Lewis Score. This endoscopic scoring index for SBCE is expected to allow for an objective assessment with improved interobserver agreement when evaluating inflammatory activity of small bowel Crohn’s Disease. Despite the incorporation of the Lewis Score in the reading software of PillCam® capsule endoscopy (Given®, Rapid Reader®), it was lacking formal validation. With this purpose, fifty patients with Crohn’s Disease previously submitted to SBCE were selected, and the videos were randomly assigned to 3 investigators. The Lewis scores were calculated and compared to those of an independent investigator, in order to determine interobserver agreement. The therapeutic impact of SBCE in patients with small bowel Crohn’s Disease was also evaluated. In a population of 40 patients with a diagnosis of Crohn’s Disease submitted to SBCE, the therapeutic modifications performed within three months following the procedure and its association with the severity of inflammatory lesions were assessed. RESULTS: In the group of patients which were monitored with the real time viewer and selectively administered domperidone, the mean gastric transit time of the capsule was shorter, and the rate of incomplete enteroscopies was significantly reduced (3,7% vs. 15,6%), while the small bowel transit time of the capsule was not significantly affected. The use of virtual chromoendoscopy showed that FICE 1 is superior to the other virtual chromoendoscopy settings regarding the improvement of delineation of small bowel lesions, with a sensitivity of 65% and interobserver agreement of 86,7%. The Lewis Score was validated for use in clinical practice, proving a high interobserver agreement. The therapeutic impact of SBCE was mainly due to the finding of proximal small bowel lesions, previously missed by other imaging modalities, which occurred in 66% of patients. Three months after the procedure, a significant proportion of patients had been started on thiopurines and/or biologics, when compared with the period before the SBCE (30% vs. 4%), mainly those with proximally located moderate to severe lesions. CONCLUSIONS: The routine use of the real time viewer and selective administration of domperidone allows to minimize the number of incomplete enteroscopies, without affecting the small bowel transit time or the diagnostic yield of SBCE. Virtual chromoendoscopy can improve the delineation of lesions that often occur in Crohn’s Disease (ulcers, erosions, oedema and villous atrophy), with high interobserver agreement, particularly when using FICE 1. The Lewis Score was validated and can be used in the setting of diagnosis, staging, follow-up and therapeutic planning of patients with isolated small bowel Crohn’s Disease. SBCE enables the detection of previously unrecognized small bowel lesions, which may contribute for the definition of the therapeutic strategy by triggering the initiation of immunomodulator and/or biological therapy.

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde, Increased life expectancy contributed to a marked increase in aging-associated maladies. Among those, we can find dementias, which are often accompanied by neurodegeneration and behavioral alterations, and may culminate in a loss of independence and autonomy. Alzheimer's disease (AD) represents the most prevalent form of age-associated dementia and is characterized by severe memory loss and cognitive deficits. This neurodegenerative disease exists as either a less common, early-onset, autosomal dominant familial form and a more prevalent, late-onset, sporadic form. Yet, both types of AD are characterized by common brain pathological hallmarks, namely the presence of extracellular senile plaques, which are highly enriched in different forms of aggregated amyloid beta (Aβ) peptides, and of intracellular neurofibrillary tangles, that result from the aggregation of hyperphosphorylated Tau protein. The discoveries made in the past two decades shed some light on the mechanisms that trigger neuroinflammation, cellular dysfunction and brain pathology, as well as their role as mediators of behavioral alterations, in AD. However, certain aspects of the disease are still poorly understood and are, sometimes, controversial. This thesis emerged with the objective of using different models to explore the role of novel and promising cellular and molecular targets in the context of aging and AD. Initially, we focused on the role of the protein lipocalin 2 (LCN2), which is closely involved in the innate immune response and in iron metabolism, two different mechanisms that can equally modulate the amyloidogenic pathway and Aβ toxicity in AD. Herein, we show that LCN2 is overproduced both in vitro and in vivo by specific brain cell types, namely choroid plexus (CP) epithelial cells and astrocytes, in response to Aβ1-42 peptides. Importantly, we show that the overexpression of iron metabolism and innate-like proinflammatory genes, as well as the marked astrogliosis, observed in response to the toxic levels of Aβ1-42, are ablated in the absence of LCN2. These results point to a role of LCN2 in the modulation of Aβ-induced toxicity and prompt for further investigation regarding the impact of LCN2 on brain pathology and behavior impairment in AD. Next, taking into account the important function of the brain barriers in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis in health and in disease, we analyzed the response at the level of the blood-cerebrospinal fluid (CSF) barrier, formed by the CP cells, in AD. For that, we took advantage of an AD transgenic mouse model, the PDGFB-APPSwInd (J20) mice, which overexpress the human gene for amyloid precursor protein (APP) with two mutations that favor its amyloidogenic processing and an increased formation of Aβ peptides. Specifically, we analyzed the response in the CP of J20 mice and of age matched wild-type (WT) littermate controls at 3, 5-6 and 11-12 months. By microarray analysis, we found that aging influences different gene pathways in the CP of 11-12 months-old mice, such as the ones involved in the regulation of the cellular circadian cycle, transport of nutrients and lipid metabolism. These alterations support the idea that there is a clear dysfunction of the CP with aging, which impacts on the production of CSF and on the integrity of the blood-CSF barrier. Strikingly, we found an early overexpression of genes implicated in the type I interferon (IFN) response and a decreased expression of the gene encoding for IFN-γ, the major type II IFN cytokine, at later ages, in the CP of J20 mice when compared to age-matched WT mice. Trying to figure out the extent of these changes, we also investigated the response in the brain parenchyma, namely in the dorsal hippocampus (dHPC), and in the periphery, particularly in the liver. Interestingly, the manifestation of deficits in spatial reference-memory by J20 mice, at 3 months, and by WT mice, at 11-12 months, was accompanied by an increased expression of type I IFN genes in the dHPC. Noticeably, we observed a significant correlation between the levels of IFN-α in the CSF and the performance in a memory-dependent task. Regarding the responses in the brain and in the periphery, we found a similar pattern of type II IFN gene expression in the CP and in the liver of J20 mice. However, with aging, there was an overexpression of type I IFN genes and a decrease in the number of perivascular Aβ-loaded macrophages in the liver of J20 mice. These observations suggest that changes in the levels of different types of IFNs may influence the deposition and/or clearance of Aβ, as well as memory and cognition. Altogether, the work presented here highlights some important functions and effects of different types of inflammatory molecules, such as LCN2 and IFNs, in the context of neurodegeneration and of behavioral alterations in AD, opening new doors for future research in the field., O aumento da esperança média de vida contribuiu para um aumento acentuado das doenças associadas ao envelhecimento. Entre essas, podemos encontrar as demências, que são muitas vezes acompanhadas por neurodegeneração e alterações comportamentais, e poderão culminar numa perda de independência e autonomia. A Doença de Alzheimer (DA) representa a forma mais prevalente de demência associada ao envelhecimento, e é caracterizada por perda de memória e défices cognitivos acentuados. Esta doença neurodegenerativa pode manifestar-se numa forma autossómica dominante menos comum, de início precoce, ou numa forma esporádica mais comum, de início tardio. No entanto, ambas as formas de DA são caracterizadas por marcas patológicas cerebrais comuns, nomeadamente a presença de placas senis extracelulares, ricas em péptidos beta-amiloide (Aβ) em diferentes estados de agregação, e emaranhados neurofibrilares intracelulares, resultantes da agregação da proteína Tau hiperfosforilada. As descobertas realizadas nas últimas duas décadas contribuiram para uma melhor compreensão dos mecanismos que desencadeiam neuroinflamação, disfunção celular e patologia cerebral, assim como o seu papel como mediadores de alterações comportamentais, na DA. No entanto, alguns pormenores acerca da doença não são ainda completamente claros, sendo até, por vezes, controversos. Esta tese surgiu com o objetivo de utilizar modelos diferentes para explorar o papel de alvos celulares e moleculares novos e promissores no contexto do envelhecimento e da DA. Inicialmente, focámo-nos no papel da proteína lipocalina 2 (LCN2), que está intimamente envolvida na resposta imune inata e no metabolismo do ferro, dois mecanismos diferentes que estão envolvidos na modulação da via amiloidogénica e da toxicidade da Aβ na DA. Neste trabalho, mostramos que a LCN2 é produzida em maior quantidade, tanto in vitro como in vivo, por certos tipos de células cerebrais, nomeadamente por células epiteliais do plexo coroide (CP) e astrócitos, em resposta a péptidos Aβ1-42. É importante salientar que os níveis de expressão de genes do metabolismo do ferro e da resposta pró-inflamatória inata, assim como a astrogliose acentuada, observados em resposta a níveis tóxicos de Aβ1-42, estão reduzidos na ausência de LCN2. Estes resultados apontam para um papel da LCN2 na modulação da toxicidade induzida por péptidos Aβ e para a necessidade de aprofundar a investigação acerca do impacto da LCN2 na patologia cerebral e défices comportamentais na DA. De seguida, tendo em conta a importante função das barreiras do cérebro na manutenção da homeostasia do sistema nervoso central (SNC) na saúde e na doença, analisámos a resposta ao nível da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR), formado pela células do CP, na DA. Nesse sentido, utilizámos um modelo da DA, os ratinhos transgénicos PDGFB-APPSwInd (J20), que sobreexpressam o gene humano que codifica a proteína precursora da amiloide (APP) com duas mutações que favorecem o seu processamento pela via amiloidogénica e um aumento da formação de péptidos Aβ. Especificamente, analisámos a resposta no CP de ratinhos J20 e do tipo selvagem (WT), da mesma idade e ninhada, aos 3, 5-6 e 11-12 meses. Através da análise por microarray, descobrimos que o envelhecimento influencia genes de vias diferentes no CP de ratinhos com 11- 12 meses de idade, nomeadamente as que estão envolvidas na regulação do ciclo circadiano celular, transporte de nutrientes e metabolismo de lípidos. Estas alterações apoiam a ideia de que há uma clara disfunção do CP com o envelhecimento, e que esta tem um impacto sobre a produção de LCR e sobre a integridade da barreira sangue-LCR. Surpreendentemente, descobrimos uma sobre-expressão precoce de genes envolvidos na resposta de interferão (IFN) do tipo I e uma diminuição da expressão do gene que codifica IFN-γ, a principal citocina de IFN tipo II, em idades posteriores, no CP de ratinhos J20 em comparação com ratinhos WT da mesma idade. Numa tentativa de descobrir a extensão destas alterações, também investigámos a resposta no parênquima cerebral, nomeadamente no hipocampo dorsal (dHPC), e na periferia, particularmente no fígado. Curiosamente, a manifestação de défices de memória por ratinhos J20, aos 3 meses, e por ratinhos WT, aos 11-12 meses, foi acompanhada por um aumento da expressão de genes de IFN tipo I no dHPC. Notavelmente, observámos uma correlação significativa entre os níveis de IFN-α no LCR e o desempenho numa tarefa dependente da memória. Relativamente às respostas no cérebro e na periferia, encontrámos um padrão semelhante de expressão de genes de IFN tipo II no CP e no fígado de ratinhos J20. No entanto, com o envelhecimento, houve uma sobre-expressão de genes de IFN tipo I e uma diminuição no número de macrófagos perivasculares positivos para Aβ no fígado de ratinhos J20. Estas observações sugerem que alterações nos níveis de diferentes tipos de IFNs podem influenciar a deposição e/ou a excreção de Aβ, bem como a memória e cognição. No seu todo, o trabalho aqui apresentado destaca importantes funções e efeitos de diferentes moléculas inflamatórias, como a LCN2 e os IFNs, no contexto da neurodegeneração e das alterações comportamentais na DA, abrindo novas portas para futura investigação na área.