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Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais During pregnancy was observed a control in trophoblastic cell proliferation and apoptosis. However, alterations of apoptosis during pregnancy are associated with abnormal placental morphology and function. Toxoplasma gondii is able to modulate trophoblastic cell apoptosis and this modulation is associated with the strain type of the parasite. Therefore the aim of this study was measure the production of cytokines by trophoblastic cells (BeWo cell line), infected with a highly virulent RH strain or a moderately virulent ME49 strain of T. gondii. Also, were analyzed the apoptosis index and death receptor Fas/CD95 expression in trophoblastic cells after infection with both strain types of T. gondii and treated with different cytokines. For this, cells were infected with RH or ME49 strain at 5 parasites: cell ratio, for 2 and 24 hours, the supernatants were collected and the cytokines production was measured. Besides that, cells were treated with pro and anti-inflammatory cytokines, infected with both strain types of T. gondii and were analyzed for apoptosis index by immunohistochemistry and for Fas/CD95 expression by flow cytometry. Besides that western blotting for the detection of the proteins ERK1/2 and survivin (IAP) were done. In both times of infection analyzed ME49-infected BeWo cells exhibited a predominantly pro-inflammatory response profile, whereas cells infected with RH strain showed a higher production of anti-inflammatory cytokines. Besides that, were observed that the incidence of apoptosis is related with strain types that cells were infected and with the cytokine that cells were treated. Moreover, Fas/CD95 expression was higher in cells infected with ME49 strain, whereas the phosphorylation of ERK1/2 was higher in cells infected with RH strain. These results indicate that in BeWo cells the incidence of apoptosis in associated to strain type of the parasite as a potential evasion mechanism for the T. gondii survival. Durante a gestação existe um equilibrado controle dos processos de proliferação de células trofoblásticas e apoptose. Um desequilíbrio entre estes dois eventos pode promover alterações funcionais no desenvolvimento placentário e comprometer o sucesso gestacional. A infecção por Toxoplasma gondii é capaz de modular a apoptose de células trofoblásticas e essa modulação é dependente da virulência da cepa de T. gondii. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar a apoptose de células trofoblásticas BeWo, determinar a produção de citocinas por estas células infectadas com a cepa de alta virulência RH ou com moderada virulência ME49 de T. gondii. Além disso, analisamos a expressão do receptor de morte Fas/CD95 em células BeWo após a infecção pelas duas cepas de T. gondii e tratamentos com citocinas pró e antiinflamatórias. Para isso, células foram infectadas com a cepa RH ou ME49, na proporção de cinco parasitos por célula, por 2 e 24 horas, e os sobrenadantes coletados para determinação da produção de citocinas. Além disso, as células foram tratadas com diferentes citocinas, infectadas com as cepas de T. gondii e analisadas quanto ao índice de apoptose por imunohistoquímica, e a expressão do Fas/CD95 por citometria de fluxo. Western blotting foi realizado para detecção das proteínas intracelulares ERK1/2 e survivina (IAP). Nos dois tempos de infecção analisados, células infectadas com a cepa ME49 secretaram, predominantemente, um perfil de citocinas pró-inflamatórias, enquanto em células infectadas com a cepa RH a secreção de citocinas anti-inflamatórias foi maior. A incidência da apoptose em células BeWo está associada tanto com a cepa do parasito, como ao tratamento das citocinas. A expressão do Fas/CD95 foi maior em células infectadas com a cepa ME49, enquanto a fosforilação da proteína ERK1/2 foi maior em células infectadas com a cepa RH. Esses resultados indicam que, em células BeWo, a incidência de apoptose está associada com o tipo de cepa do parasito e, provavelmente, relaciona-se com um mecanismo de evasão de T. gondii. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Introdução e Objetivos: A toxoplasmose é uma doença com grande impacto na saúde pública apesar de ainda ser negligenciada no Brasil. A doença é potencialmente grave quando há transmissão congênita. O diagnóstico da toxoplasmose durante a gestação é complexo e o tratamento da doença em gestantes não é totalmente eficaz. Dessa forma, a atenção primária à saúde é importante, pois garante a prevenção da infecção em gestantes e, consequentemente, contribui para a não ocorrência da transmissão congênita. O presente trabalho objetivou realizar um levantamento sobre o conhecimento da toxoplasmose por gestantes atendidas nas Unidades Básicas de Saúde do município de Jataí/GO. Métodos: promover ações educativas sobre a doença e formas de prevenção. As ações foram realizadas por acadêmicos do curso de Medicina da UFJ. Resultados: observou-se que faltam informações sobre a doença e formas de se prevenção, sendo que 86% delas não sabiam todas as formas de transmissão da toxoplasmose. Ficou evidente também a que as gestantes relatam não receber instruções sobre a doença durante o acompanhamento pré-natal. Conclusão: ficou evidente que essas ações na atenção primária são extremamente valiosas para a prevenção de doenças como a toxoplasmose e contribui para a formação de acadêmicos do curso de medicina.

Introdução: O aumento da incidência de HIV nas pessoas idosas é alarmante, e vem se disseminado de forma crescente, sendo um problema de saúde pública. É necessário, portanto refletir sobre o atendimento aos idosos, buscando estratégias para o atendimento dessa população com ações de promoção e educação em saúde que deem visibilidade e visem a instrução dessa faixa etária. Objetivos: Apresentar uma revisão bibliográfica sobre a ocorrência de HIV/AIDS em pessoas da terceira idade. Métodos: Para isso utilizou-se pesquisa nas plataformas Pubmed e Scielo e na página virtual do Ministério da Saúde do Brasil de revisões e dados bibliográficos com os termos “HIV/AIDS”, “HIV e terceira idade”, “AIDS e terceira idade”. Resultados: A sexualidade na velhice é um tema considerado tabu não só pela população, mas pelos próprios profissionais da saúde, que atendem apenas visão biologista do envelhecimento. A falta de informação atrelada a redescoberta do sexo, medicações para impotência e reposição hormonal e a associação do preservativo apenas como método anticoncepcional, acaba deixando essa população desinformada e suscetíveis a doenças sexualmente transmissíveis como HIV. Tal vulnerabilidade vem se mostrando cada vez mais problemática, quando analisamos dados do Ministério da Saúde vemos um aumento preocupante do número de casos nos últimos anos de HIV na terceira idade. Conclusão: Considerando que a contaminação de HIV tem se disseminado entre os idosos de forma crescente, e que os meios de prevenção e transmissão, constituem aspectos importantes dessa patologia, faz necessário uma maior mobilização em educação e saúde voltada para essa população.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Transplacental transmission causes one of the most severe forms of infection with protozoan parasite Toxoplasma gondii. The ability of the parasite to survive intracellularly largely depends on the blocking of different proapoptotic signaling cascade of its host cell. However, alterations in the incidence of apoptosis, during pregnancy, are associated with abnormal placental morphology and function. Thus, were analyzed the incidence of apoptosis and cell proliferation in trophoblastic cell (BeWo line) infected with a high virulent RH and low virulent ME49 strains of T. gondii. For this, immunohistochemistry to determine the apoptosis and cell proliferation index was done. Besides that, was detected active caspase 3 in infected and non-infected cells. Cells infected with RH strain showed an apoptosis index lower than the control, whereas cells infected with ME49 strain this index was higher than non-infected cells. Moreover, were detected active caspase 3 in cells infected with both RH and ME49 strain and in non-infected cell, in all analyzed times of infection. Besides that, the cell proliferation indexes were higher in cells infected with ME49 strain than the index observed in control and RH strain-infected cells. These results suggest that the high virulent strain RH of T. gondii demonstrated a possible mechanism of delay or inhibits the apoptotic process, as an evasion strategy and a mechanism of the parasite to maintenance in the host cell. In contrast, cells infected with ME49 strain presented higher apoptosis index, indicating that this strain have an opposite mechanism and induces apoptosis of the host cell, which can be associated with a protector mechanism of this low virulent strain of T. gondii. So, we concluded that RH and ME49 strain have opposing behaviors in the incidence of apoptosis and cellular proliferation in trophoblastic cells. A transmissão transplacentária de Toxoplasma gondii causa uma das formas mais graves da infecção pelo protozoário. A habilidade do parasito em sobreviver no interior da célula hospedeira depende da capacidade do mesmo de manipular diversas vias intracelulares, entre elas, a apoptose e a proliferação celular. T. gondii é capaz de bloquear a apoptose da célula hospedeira através da interação com vias de sinalização anti-apoptótica da célula. Entretanto a desregulação na incidência de apoptose, durante a gestação, está associada com alterações na morfologia e nos processos fisiológicos da placenta. Dessa forma, realizou-se reações imunohistoquímica para analisar a incidência de apoptose e proliferação celular em células trofoblásticas (linhagem BeWo) infectadas com a cepa de alta virulência RH e de baixa virulência ME49, de T. gondii. Analisou-se também em células infectadas e não infectadas a presença de caspase 3 ativa. Células infectadas com a cepa RH apresentaram índices de apoptose menores do que o controle, enquanto que, em células infectadas com a cepa ME49 o índice de apoptose foi maior do que o observado em células não infectadas. Além disso, detectou-se caspase 3 ativa tanto em células infectadas com ambas as cepas, quanto nas não infectadas, nos três tempos de infecção analisados. Os índices de proliferação celular foram maiores em células infectadas com a cepa ME49 do que os observados no controle e em células infectadas com a cepa RH. Esses resultados sugerem que cepas de alta virulência, como a RH, possuem possível mecanismo de retardar ou inibir a apoptose, como uma estratégia de evasão e de manutenção do interior da célula hospedeira. Ao contrário, células infectadas com a cepa de baixa virulência ME49 apresentaram maiores índices de apoptose indicando que essa cepa apresenta um papel oposto na interferência do processo apoptótico da célula hospedeira, e atua induzindo a morte celular, o que pode estar associado com um possível mecanismo atenuador da infecção. Dessa forma, nós concluímos que as cepas RH e ME49 possuem comportamentos opostos na incidência de apoptose e proliferação celular de células trofoblásticas. Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O diagnóstico precoce da toxoplasmose congênita (TC) representa um desafio importante em saúde pública. A busca de indicadores laboratoriais complementares para um diagnóstico precoce e mais sensível da infecção congênita tem sido considerada relevante para contribuir na tomada de decisão clínica e início imediato do tratamento, que reduz complicações posteriores. Aliado a isso, vários estudos tem abordado diferentes tipos de resposta imunológica, para melhor compreensão de como o organismo infectado responde a presença de T. gondii. Com isso, o presente trabalho teve dois objetivos: (i) realizar uma análise integrativa de parâmetros imunológicos na identificação de biomarcadores complementares para o diagnóstico precoce da TC em lactentes; e (ii) avaliar o impacto do tratamento etiológico precoce no perfil de biomarcadores celulares e moleculares na TC. Usando pequenos volumes de amostras de sangue total, o desempenho de mediadores solúveis no soro, fenótipos ex vivo de leucócitos circulantes e perfis de citocinas intracelulares após estímulos in vitro de curto prazo foram avaliados como plataformas de biomarcadores passo a passo simples ou combinadas. Os resultados mostraram que os níveis séricos de CXCL9 e as frequências de células T CD4+ CD25+ circulantes e células T CD4+ IFN-+ específicas de T. gondii, mensuradas no período de 30-45 dias após o nascimento apresentaram alta acurácia para distinguir lactentes infectados com T. gondii de controles saudáveis de mesma idade. Digno de nota foi o desempenho aprimorado (acurácia = 96%) obtido usando uma análise combinada passo a passo de células T CD4+ CD25+ e CXCL9. Além disso, a alta acurácia global (AUC = 0,9) com sensibilidade elevada (Se = 98%) também foi alcançada usando a frequência total de células T específicas de T. gondii produtoras de IFN- in vitro (∑ IFN-+ CD4+ e CD8+) como biomarcador de TC. Além disso, a análise in vitro de células T CD4+ IL5+ específicas de T. gondii e células NK IFN-+ exibiram uma alta acurácia para o prognóstico precoce de lesão ocular em lactentes com TC. Juntos, esses achados apoiam a relevância do emprego dos elementos da resposta imune celular como biomarcadores com potencial para endossar o diagnóstico precoce e o prognóstico da TC, contribuindo assim para um manejo clínico preciso e intervenção terapêutica eficaz. Em relação ao segundo objetivo, abordou-se a alteração da resposta imune de crianças com toxoplasmose congênita (TC) quanto à evolução da infecção e intervenção terapêutica. Lactentes com TC apresentaram alta contagem de monócitos, células T CD3- CD16-CD56High, CD3+ CD56+ e CD4+ um ano após o início do tratamento (TOXO1-yearAT). Números menores de células T CD3-CD16-CD56+ e TCRγδ+ foram especificamenteobservados em lactentes com lesões retinocoroidais (L (+)). Quando os lactentes foram classificados de acordo com o estado basal da lesão, a expansão das células T CD3-CD16- CD56High e CD4+ foi observada em L (+) que incluíam pacientes com lesões ativas, ativas/ cicatrizadas ou cicatrizadas. Lactentes que tiveram lesões ativas ou ativas/cicatrizadas apresentaram níveis maiores de monócitos, células T CD3-CD16+CD56+, CD3+CD56+, CD8+DR+ e TCRγδ+ e aqueles com lesões ativas/cicatrizadas ou cicatrizadas na classificação basal apresentaram aumento nos monócitos CD14+CD64+. Além disso, todos em L(+) aumentaram as células T CD4+ IFN-γ+ e IL-10+ enquanto L (-) aumentaram células NK produtoras de TNF, IFN-γ e IL-4, após estimulação com antígeno específico. Alterações persistentes em leucócitos em TOXO1-yearAT sugerem sequelas de longo prazo no sistema imunológico de lactentes com TC. Embora o tratamento tenha um impacto benéfico na mudança da lesão retinocoroidal para um estado cicatricial, a implementação de um programa de rastreamento pré-natal ativo para prevenir a transmissão da TC é necessária para minimizar o impacto a longo prazo dessa infecção no sistema imunológico. Em resumo, nossos dados obtidos mostram que o perfil de resposta imune que ocorre em lactentes com TC pode ser útil para a busca de novos biomarcadores diagnósticos e prognósticos e para o monitoramento pós-terapêutico dos pacientes tratados. The early diagnosis of congenital toxoplasmosis (CT) represents an important public health challenge. The search for complementary laboratory indicators for an early and more sensitive diagnosis of congenital infection has been considered relevant to contribute to clinical decision-making and immediate initiation of treatment, which reduces further complications. In addition, several studies have addressed different types of immune response, for a better understanding of how the infected organism responds to the presence of T. gondii. Thus, the present work had two objectives: (i) to perform an integrative analysis of immunological parameters in the identification of complementary biomarkers for the early diagnosis of CT in infants; and (ii) assess the impact of early etiological treatment on the profile of cellular and molecular biomarkers in CT. Using small volumes of whole blood samples, the performance of serum soluble mediators, ex vivo phenotypes of circulating leukocytes and intracellular cytokine profiles upon short-term in vitro stimuli were evaluated as single or combined stepwise biomarker platforms. Results showed that ex vivo serum levels of CXCL9, and the frequencies of circulating CD4+CD25+ T-cells and T. gondii-specific IFN-γ+CD4+ T-cells measured 30-45 days after birth presented high accuracy to distinguish T. gondii-infected infants from healthy age-matched controls (Global Accuracy/AUC = 0.9; 0.9 and 0.8, respectively). Of note was the enhanced performance (Accuracy = 96%) achieved by using a combined stepwise analysis of CD4+CD25+ T-cells and CXCL9. In addition, high global accuracy (AUC = 0.9) with elevated sensitivity (Se = 98%) was also reached by using the total frequency of in vitro IFN-γ-producing T. gondii-specific T-cells (∑ IFN-γ+ CD4+ & CD8+) as a biomarker of congenital toxoplasmosis. Furthermore, the analysis of in vitro T. gondii-specific IL5+CD4+ T-cells and IFN-γ+ NK-cells displayed a high accuracy for early prognosis of ocular lesion in infant with CT (Global Accuracy/AUC = 0.8 and 0.9, respectively). Together, these findings support the relevance of employing the elements of the cell-mediated immune response as biomarkers with potential to endorse early diagnosis and prognosis of congenital ocular toxoplasmosis to contribute for a precise clinical management and effective therapeutic intervention. Regarding the second objective, changes in immune response of children with congenital toxoplasmosis (CT) regarding infection evolution and therapeutic intervention was addressed. Infants with CT presented increased counts of monocytes, CD3-CD16-CD56High, CD3+CD56+ and CD4+ T-cells 1-year after treatment onset (TOXO1-yearAT). Smaller numbers of CD3-CD16-CD56+ and TCRγδ+ T-cells were specifically observed in infants with retinochoroidal lesions (L(+)). When infants were classified based onthe baseline status, expansion of CD3-CD16-CD56High and CD4+ T-cells were observed in L(+) who had active, active/cicatricial or cicatricial lesions. Infants who had active or active/cicatricial lesions display augmented numbers of monocytes, CD3-CD16+CD56+, CD3+CD56+, CD8+DR+ and TCRγδ+ T-cells and those with active/cicatricial or cicatricial at baseline displayed increase in CD14+CD64+ monocytes. Moreover, all L(+) had increased IFN-γ+ and IL-10+ CD4+ T-cells, while L(-) had increased ratios of TNF+, IFN-γ+ and IL-4+ NK-cells upon antigen-specific stimulation. Persistent alterations in leukocytes in TOXO1- yearAT suggest long-term sequels in the immune system of infants with CT. Although treatment had a beneficial impact in shifting the retinochoroidal lesion to a cicatricial state, the implementation of an active prenatal screening program to prevent CT transmission is necessary to minimize the long-term impact of this infection in the immune system. In summary, our data suggest that the immune response profile that occurs in newborns and infants with CT may be useful for the search for new diagnostic and prognostic biomarkers, and for post-therapeutic monitoring of treated patients. Tese (Doutorado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The interaction between human extravillous trophoblast cells and macrophages has an important role in the implantation and placentation during a successful pregnancy. However any dysfunction in this communication is associated with pregnancy complications. The aim of this study was investigate the influence of Toxoplasma gondii in the occurrence of apoptosis triggered by macrophages in HTR-8/SVneo cells. For this purpose, HTR-8/SVneo cells were treated or not with the supernatant from uninfected or infected macrophages and then infected or not by T. gondii. Cytokine secretion and soluble FasL were analyzed by ELISA, apoptosis index and expression of Fas/CD95 were determined by flow cytometry and intracellular parasite proliferation was analyzed by enzymatic assay. IL-6 secretion by HTR-8/SVneo cells was synergistically increased with both stimulus, supernatant from macrophages and T. gondii infection. The apoptosis index of infected HTR-8/SVneo cells was decreased in the presence or absence of supernatant from infected macrophage. On the other hand, the apoptosis of infected HTR-8/SVneo cells increased when these cells were treated with supernatant from uninfected macrophages. Also, a low expression of Fas/CD95 and a high soluble FasL release were observed in these conditions. Finally, we did not verify any change in the proliferation of T. gondii. However, there is downmodulation of apoptosis in HTR-8/SVneo cells by the parasite which probably relates to favoring its establishment in the host cell, while the functional activities of macrophages toward restoring these death rates cell, to keep gestational events of invasion and placentation appropriate. All together, these results contribute to better understanding of the mechanisms of cellular communication existing between the extravillous trophoblastic cells and macrophages, and demonstrate that infection with T. gondii can interfere with this interaction through modulation of cell death by apoptosis. A interação entre células trofoblásticas extravilosas humanas e macrófagos tem importante papel tanto na implantação quanto na placentação no curso de uma gestação de sucesso. No entanto, alterações nesta comunicação, causada ou não por agentes patogênicos, podem causar problemas gestacionais. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar a influência de Toxoplasma gondii na ocorrência da apoptose induzida por macrófagos em células trofoblásticas extravilosas humanas. Para este propósito, células trofoblásticas extravilosas da linhagem HTR-8/SVneo foram tratadas ou não com sobrenadante de macrófagos e/ou posteriormente infectadas por T. gondii. A secreção de citocinas e a liberação de FasL solúvel foram verificadas pelo ELISA, o índice de apoptose e a expressão de Fas/CD95 foram determinadas por meio do citômetro de fluxo, e a proliferação intracelular do parasito foi analisada pelo ensaio enzimático. Nossos resultados mostraram que a produção de IL-6 por células HTR-8/SVneo foi sinergicamente aumentada na presença de ambos estímulos: sobrenadante de macrófagos e infecção por T. gondii. O índice de apoptose de células HTR-8/SVneo infectadas diminuiu na presença ou ausência do sobrenadante de macrófagos infectados. Por outro lado, a apoptose de células HTR-8/SVneo infectadas aumentou quando essas células foram tratadas com o sobrenadante de macrófagos não infectados. Além disso, a baixa expressão de Fas/CD95 e a alta liberação de FasL solúvel foram observadas nessas condições. Finalmente, não foi verificada nenhuma mudança na proliferação de T. gondii nas diferentes situações experimentais. No entanto, observa-se uma regulação negativa da apoptose em células HTR-8/SVneo pelo parasito que provavelmente relaciona-se com o favorecimento de seu estabelecimento na célula hospedeira, enquanto as atividades funcionais dos macrófagos foram no sentido de restaurar esses índices de morte celular, para manter os eventos gestacionais de invasão e placentação adequados. Assim, nossos resultados contribuíram para melhor entendimento dos mecanismos de comunicação celular existente entre as células trofoblásticas extravilosas e macrófagos, além de demonstrar que a infecção por T. gondii pode interferir nessa interação por meio da modulação da morte celular por apoptose. Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório capaz de infectar uma grande variedade de células. Este parasito apresenta uma grande habilidade de explorar diversas moléculas presentes na superfície das células e ultrapassar diferentes barreiras biológicas, e finalmente alcançar os tecidos considerados imunologicamente privilegiados, como a placenta. Embora esse órgão represente uma formidável barreira contra a infecção por T. gondii, a transmissão deste para o feto pode ocorrer em alguns casos. Entretanto, os mecanismos envolvidos na transmissão do parasito pela placenta ainda são mal compreendidos. Assim, o presente trabalho teve dois objetivos gerais: (i) avaliar o papel de ICAM-1 na passagem transplacentária de T. gondii em modelos animais murinos C57BL/6 WT e ICAM-1 knockouts (ICAM-1-/-); e (ii) caracterizar células trofoblásticas mesenquimais humanas (TSCT) para avaliar se elas recapitulam a sensibilidade de células trofoblásticas primárias humanas frente a infecção por T. gondii, bem como avaliar a expressão diferencial de genes entre células citotrofoblásticas (TSCYT) e sinciciotroblásticas (TSSYN) após a infecção. Para responder ao primeiro objetivo, fêmeas WT e ICAM-1-/- foram acasaladas e após a detecção do início da gestação, os animais foram infectados com 5 cistos da cepa ME-49 de T. gondii e divididos em diferentes grupos de acordo com o dia de infecção e eutanásia (8dg/8di, 14dg/7di, 19dg/12di e 19dg/8di). Fêmeas prenhes não infectadas foram usadas como controles (8dg/ni, 14dg/ni, 19dg/ni). Em todos os animais foram avaliados o número de sítios de implantação, e de reabsorção. Além do mais, foi coletado o soro para análise de citocinas por CBA; os órgãos maternos, incluindo cornos uterinos, e embriões/fetos e placentas foram coletados para avaliação do parasitismo por qPCR. Os resultados mostraram que fêmeas ICAM-1-/- infectadas no início da gestação (8dg/8di) e no final do terço médio de gestação (19dg/8di) tiveram maior comprometimento do sucesso gestacional se comparado às fêmeas WT. Em relação ao parasitismo, fêmeas ICAM-1-/- 8dg/8di e 14dg/7di apresentaram maior taxa de infecção por T. gondii no corno uterino gravídico e na placenta, respectivamente, ao comparar com fêmeas WT. Por outro lado, não foram verificadas diferenças significativas na carga parasitária no baço e fígado entre as fêmeas ICAM-1-/- e WT nos grupos 8dg/8di e entre os tecidos fetais dos animais ICAM-1-/- e WT nos grupos 14dg/7di. Adicionalmente, a dosagem de citocinas mostrou que IFN-γ, TNF- α, IL-6 e IL-10 foram moduladas pela infecção dependendo do tempo gestacional. Para a realização do segundo capítulo, células TSCYT foram cultivadas em cultura e diferenciadas em TSSYN e infectadas ou mock infectadas (apenas meio) com T. gondii. Em seguida, foi avaliada a porcentagem de diferenciação em células TSSYN, bem como a taxa de infecção entre as células TSCYT e TSSYN por meio ensaio de RT-qPCR. O sobrenadante foi coletado para dosagem da quimiocina CCL22. Em seguida, células infectadas e mock infectadas foram coletadas e submetidas à análise pelo sequenciamento de RNA. Os dados mostraram que TSSYN foram altamente refratárias à adesão e replicação de T. gondii quando comparado com as células TSCYT. Além do mais, os resultados mostraram que ambas as células não foram capazes de produzir CCL22 em reposta à infecção pelo parasito. Também, os dados de RNA-seq mostraram diferenças no transcriptoma entre TSSYN e TSCYT após a infecção com T. gondii, evidenciando que vias relacionadas ao metabolismo e ao ciclo celular foram reguladas negativamente em células TSSYN em comparação com TSCYT. Finalmente, o perfil transcricional de T. gondii identificou diferenças significativas na expressão de genes em parasitos que infectaram/ou estavam associados às células TSSYN em relação às células TSCYT, evidenciando alterações nos genes envolvidos na replicação do DNA e no metabolismo, principalmente nas vias relacionadas com a síntese de ácidos graxos. Em conjunto, nossos dados indicaram que células TSCT representam um promissor modelo no estudo das interações T. gondii/placenta, além disso, os resultados sugerem que a resistência das células TSSYN pode estar associada ao baixo metabolismo celular e baixa produção de nutrientes por tais células, conferindo um ambiente estressante para o desenvolvimento do parasito. Toxoplasma gondii is an intracellular protozoan parasite that is able to infect a wide variety of cells. This parasite has a great ability to explore various molecules present on the surface of cells and overcome different biological barriers, and finally reach the tissues considered immunologically privileged, such as placenta. Although this organ represents a formidable barrier against a T. gondii infection, its transmission to the fetus can occur. However, the mechanisms involved in the transmission of the parasite through the placenta are still poorly understood. Therefore, the present work had two major goals: (i) evaluate the role of ICAM-1 in the transplacental passage of T. gondii in murine animal models C57BL/6 WT and ICAM-1 knockouts (ICAM-1-/-); and (ii) characterize human mesenchymal trophoblastic cells (TSCT) to assess whether they recapitulate the sensitivity of primary human trophoblastic cells by T. gondii infection, as well as to evaluate the differential gene expression between cytotrophoblastic (TSCYT) and synciciotroblastic cells (TSSYN) after the infection. To answer the first objective, WT and ICAM-1-/- mice were mated and after detecting the first day of pregnancy, the animals were infected with 5 cysts of ME-49 strain of T. gondii and divided in different groups according to the day of infection and euthanasia (8dg / 8di, 14dg / 7di, 19dg / 12di and 19dg / 8di). Uninfected pregnant females were used as controls (8dg/ni, 14dg/ni, 19dg/ni). The number of implantation and resorption sites was evaluated. In addition, serum was collected for cytokine analysis; maternal organs, including uterine horns, and embryos/fetus and placentas were collected to assess the parasitism by qPCR. The results showed that ICAM-1-/- females infected at the beginning of pregnancy (8dg/8di) and at the end of the middle third of pregnancy (19dg/8di) had a greater impairment of gestational success compared to the WT females. Regarding to the parasitism, ICAM-1-/- 8dg/8di and 14dg/7di presented higher rates of infection in uterine horns and in the placenta, respectively, compared to WT. On the other hand, no significant differences were seen in the parasitism in the spleen and liver between ICAM-1-/- and WT in the 8dg/8di groups, and between fetal tissues of ICAM-1-/- and WT animals in the group 14dg/7di. Additionally, the cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-10 were modulated by infection depending on the gestational time. For the second chapter, TSCYT cells were cultured and differentiated into TSSYN and infected or mock infected (only medium) with T. gondii. Then, the percentage of differentiation in TSSYN cells was evaluated, as well as the infection rate between TSCYT and TSSYN cells through the RT-qPCR assay. The supernatant from the different experimental conditions was collected to measure the chemokine CCL22. Then, infected and mock infected cells were collected and subjected to analysis by RNA sequencing. The data showed that TSSYN were highly refractory to the adhesion and replication of T. gondii when compared with TSCYT cells. Furthermore, the results suggested that both cells are not able to produce CCL22 in response to the parasite infection. Evaluating the RNA-seq data, we observe a huge difference in the transcriptome between TSSYN and TSCYT after the infection by T. gondii, showing that pathways related to metabolism and the cell cycle are negatively regulated in TSSYN cells compared to TSCYT. Finally, the transcriptional profile of T. gondii identified differences in gene expression in the parasites that infected/or were associated with TSSYN cells in relation to TSCYT cells, showing differences in genes involved in DNA replication and metabolism pathways, especially those related to the biosynthesis of fatty acids. Together, our data indicate that TSCT cells represent a promising model in the study of T. gondii/placenta interactions; moreover, we suggest that the resistance of TSSYN cells may be associated with low cell metabolism and low nutrient production by such cells, providing a stressful environment for the development of the parasite. Tese (Doutorado)

Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório, causador da toxoplasmose. A infecção pelo parasito pode apresentar-se assintomática, contudo, manifestações clínicas podem ocorrer, principalmente em indivíduos imunocomprometidos e em fetos devido à transmissão congênita. Em gestantes, a infecção pode causar abortos, prematuridade e/ou anomalias fetais. Na interface materno-fetal vários tipos de células e moléculas contribuem para o desenvolvimento fetal, regulação do sistema imune e defesa contra microorganismos. Galectina-3 (Gal-3) é uma lectina ligante de resíduos β-galactosídeos- expressa em células do microambiente placentário, incluindo células trofoblásticas. Esta lectina está envolvida em vários processos biológicos, dentre eles, regulação do crescimento, diferenciação e migração celular, apoptose, modulação da atividade de células do sistema imune, reconhecimento de patógenos e controle de infecções por parasitos intracelulares, como T. gondii. Contudo, ainda pouco é compreendido sobre o papel da Gal-3 na infecção por T. gondii no microambiente placentário. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo geral investigar o efeito da Gal-3 na infecção de células trofoblásticas da linhagem BeWo por T. gondii. Para isso, neste estudo, foram utilizadas células BeWo cuja expressão de Gal-3 foi silenciada por meio da utilização de RNA de interferência (RNAi) (BeWo Gal-3 KD; KD: knockdown) e células não – silenciadas (BeWo Gal-3); posteriormente, foram determinados (i) as taxas de proliferação intracelular, adesão e invasão do parasito; (ii) produção de citocinas e de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células BeWo Gal-3 e BeWo Gal-3 KD. Os resultados obtidos mostraram que Gal-3: (i) controla a proliferação intracelular de T. gondii; (ii) diminui a adesão de T. gondii; (iii) diminui a invasão de T. gondii; (iv) aumenta a produção da citocina IL-6 independentemente da infecção por T. gondii; (v) não interfere sobre a produção de ROS em células BeWo. Assim, Gal-3 parece ter um papel pró-inflamatório em células BeWo o que pode explicar o menor parasitismo observado nas células que expressam Gal-3. Esse foi o primeiro trabalho a mostrar a influência de Gal-3 no controle de T. gondii em células trofoblásticas. Toxoplasma gondii is na intracellular parasite that causes toxoplasmosis. Infection by the parasite may be asymptomatic, however, clinical manifestations may occur, especially in immunocompromised individuals and in fetuses due to congenital transmission. In pregnant women, the infection can cause miscarriages, prematurity and / or fetal abnormalities. At the maternal-fetal interface, several types of cells and molecules contribute to fetal development, regulation of the immune system and defense against microorganisms. Galectin-3 (Gal-3) is a β-galactoside residue-binding lectin expressed in cells of placental microenvironment, including trophoblastic cells. This lectin is involved in several biological processes, including growth regulation, cell differentiation and migration, apoptosis, modulation of immune cell activity, pathogen recognition and infection control by intracellular parasites, such as T. gondii. However, little is known about the role of Gal-3 in the placental microenvironment during T. gondii infection. Thus, this work aimed to investigate the effect of Gal-3 on T. gondii infection in BeWo trophoblastic cells. For this, Gal-3 expression was sileced in BeWo cells by interference RNA (RNAi) (BeWo Gal-3 KD; KD: knockdown) or not (non-silenced cells (BeWo Gal-3)); subsequently, (i) intracellular proliferation, adhesion and invasion of the parasite; (ii) production of cytokines and reactive oxygen species (ROS) were determined in BeWo Gal-3 and BeWo Gal-3 KD cells. The results obtained showed that Gal-3: (i) controls the intracellular proliferation of T. gondii; (ii) decreases the adhesion of T. gondii; (iii) decreases the invasion of T. gondii; (iv) increases the production of the cytokine IL-6 regardless T. gondii infection; (v) does not interfere on ROS production in BeWo cells. Thus, Gal-3 appears to have a pro-inflammatory role in BeWo cells, which may be related to the lower parasitism observed in cells that express Gal-3. This was the first study to show the influence of Gal-3 on T. gondii control in trophoblastic cells. Tese (Doutorado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais Durante a gestação, o organismo materno é submetido à uma série de alterações imunológicas, necessárias para a manutenção do feto. Esta tolerância fetal é dependente das relações celulares que ocorrem na interface materno-fetal. Dessa forma, células trofoblásticas interagem com as células imunes, dentre elas os monócitos, e isto é determinante para o sucesso gestacional. Entretanto, como consequência deste processo de imunomodulação, o organismo materno se torna mais susceptível às infecções causadas por patógenos, como Toxoplasma gondii, e estes microrganismos interferem diretamente nas relações que se estabelecem entre essas células, podendo causar complicações gestacionais. Os mecanismos de morte celular que acometem as populações celulares presentes na interface materno-fetal são um dos fatores envolvidos na manutenção da gestação e, por isso, este estudo teve como objetivo avaliar a influência de células trofoblásticas (linhagem BeWo) e infecção por T. gondii na modulação dos mecanismos de morte celular em monócitos (linhagem THP-1). Para isso, células THP-1 foram estimuladas ou não com sobrenadante de células BeWo (infectadas ou não-infectadas com T. gondii) e posteriormente foram infectadas ou não com T. gondii. Foram analisados em células THP-1: os índices de morte celular e apoptose, a expressão de receptor de morte (Fas/CD95) e de proteínas intracelulares associadas à morte nestas células (survivina, ERK1/2 fosforilada, p38, JNK, caspase 3 ativa), secreção de Fas ligante (FasL) e a influência de alguns fatores solúveis secretados por células BeWo que têm a capacidade de interferir nestes mecanismos de morte celular em células THP-1. Os resultados demonstraram que ambos os sobrenadantes de células BeWo aumentaram o índice de morte celular em células THP- 1 não-infectadas, mas apenas o sobrenadante de células BeWo infectadas alterou este índice de morte em células THP-1 infectadas, reduzindo-o. Além disso, células THP-1, 11 quando infectadas, apresentaram índice de morte celular maior do que células THP-1 não-infectadas. Ambos os sobrenadantes de células BeWo induziram aumento na expressão de fosfatidilserina em células THP-1 não-infectadas e células THP-1, quando infectadas, expressaram menos fosfatidilserina do que células THP-1 não-infectadas. Fator de inimigração de macrófago (MIF) e fator transformador de crescimento (TGF)- P1, secretados por células BeWo, atuaram na indução de morte celular em células THP- 1 não-infectadas, enquanto que, apenas TGF-P1 interferiu na morte de células THP-1 infectadas, inibindo-a. Além disso, estes dois fatores solúveis mostraram-se capazes de diminuir a expressão de fosfatidilserina em células THP-1 não-infectadas, mas apenas TGF-pi alterou esta expressão em células THP-1 infectadas. Células THP-1 infectadas expressaram mais Fas/CD95 do que células THP-1 não-infectadas. Em células THP-1 não-infectadas, a expressão de Fas/CD95 foi maior quando estas células foram estimuladas com os diferentes sobrenadantes de células BeWo e em células THP-1 infectadas este fenômeno só se repetiu quando elas foram estimuladas com o sobrenadante de células BeWo infectadas. A secreção de FasL foi maior em células THP-1 infectadas, mas em células BeWo, a infecção não alterou a secreção deste ligante. As proteínas intracelulares, ERK1/2 fosforilada e caspase 3 ativa, foram menos expressas em células THP-1 infectadas e ambos os sobrenadantes de células BeWo induziram a diminuição da expressão de caspase 3 ativa em células THP-1, infectadas e não-infectadas. Assim, nossos resultados mostraram que células trofoblásticas BeWo modulam os mecanismos de morte celular em células THP-1 e estas alterações podem estar associadas à manutenção e sucesso da gestação. Além disso, a infecção por T. gondii também altera estas interações celulares que ocorrem na interface materno-fetal. During pregnancy, maternal organism is submitted to immunological alterations, which are necessary to fetus maintenance. This fetal tolerance depends on the cell interactions that occur at maternal-fetal interface. Therefore, trophoblast cells interact with immune cells, as monocytes, and it is determinant for gestational success. However, in consequence of this immunomodulation process, the maternal organism becomes more susceptible to infections by pathogens, such as Toxoplasma gondii, which interfere directly in the crosstalk between trophoblast cells and monocytes, causing pregnancy complications. Mechanisms of cell death that occurs in cell populations present at maternal-fetal interface are involved in the gestational development and, in this way, this study aimed to evaluate the influence o trophoblast cell (BeWo line) and T. gondii infection in the modulation of death mechanisms in monocytes (THP-1 line). For this, THP-1 cells were stimulated or not with supernatants of BeWo cells (infected or uninfected with T. gondii) and then infected with T. gondii. In THP-1 cells were analyzed: the index of cell death and apoptosis, the expression of death receptor (Fas/CD95) and intracellular proteins associated to death in these cells (survivin, phosphorylated ERK1/2, p38, JNK, active caspase 3), human Fas ligand (FasL) secretion and the influence of soluble factors secreted with BeWo cells, which have the capacity to interfere in these mechanisms of THP-1 cell death. The results showed that supernatants of BeWo cells induced the increase of the index of cell death in uninfected THP-1 cells, but only supernatant of infected BeWo cells altered this index in infected THP-1 cells, reducing it. Moreover, infected THP-1 cells presented cell death index higher than uninfected THP-1 cells. Both supernatants of BeWo cells induced increased in the expression of phosphatidylserine in uninfected THP-1 cells and infected THP-1 cells expressed less phosphatidylserine than uninfected THP-1 cells. Macrophage 13 migration inhibitory factor (MIF) and transforming growth factor beta 1 (TGF-pi), both secreted by BeWo cells, actuated in the induction of cell death in uninfected THP-1 cells, but only TGF-pi, interfered in the cell death of infected THP-1 cells, inhibiting it. Furthermore, both of these soluble factors were able to decrease the expression of phosphatidylserine in uninfected THP-1 cells, but only TGF-pi altered this expression in infected THP-1 cells. The expression of Fas/CD95 was higher in infected THP-1 cells than uninfected THP-1 cells. In uninfected THP-1 cells, Fas/CD95 expression was higher when these cells were stimulated with supernatants of BeWo cells and in infected THP-1 cells, this phenomenon was repeated in those that were stimulated with supernatant of infected BeWo cells. The secretion of FasL was higher in infected THP-1 cells, but in BeWo cells, the infection did not altered the secretion of this ligand. Both intracellular proteins analyzed, phophorylated ERK1/2 and active caspase 3 were less expressed in infected THP-1 cells and both supernatants of BeWo cells, induced decreased of active caspase 3 expression in uninfected and infected THP-1 cells. These results showed that BeWo trophoblast cells modulate mechanisms of cell death in THP- 1 cells and these alterations can be associated with the maintenance and success of pregnancy. Furthermore, T. gondii infection also interferes in these cell interactions which occur in the maternal-fetal interface. Tese (Doutorado)

O sucesso da gestação é dependente da produção de muitas citocinas. Algumas destas citocinas contribuem para a migração de células trofoblásticas extravilosas, como o fator de inibição da migração de macrófagos (MIF), importante durante esse processo. MIF é uma citocina potente e está envolvida na patogênese de diferentes infecções, incluindo a toxoplasmose. Assim, investigamos o papel de MIF em células trofoblásticas extravilosas, linhagem HTR8/SVneo, após infecção por Toxoplasma gondii. As células foram infectadas com taquizoítas da linhagem RH (2F1) de T. gondii e tratadas com MIF recombinante (rhMIF) ou inibidor de MIF (ISO-1). A viabilidade celular foi avaliada por ensaio de MTT, a proliferação intracelular de T. gondii pelo ensaio de β-galactosidase colorimétrica, a expressão de CD44 e fosforilação de ERK1/2 por Western blott e a migração celular pelo ensaio de scratch. Os sobrenadantes foram coletados para análise de produção de MIF por ELISA. As células foram utilizadas para a expressão do co-receptor CD44 e análise da fosforilação de ERK1/2. A viabilidade celular não foi alterada nas células infectadas e/ou tratadas com rhMIF ou ISO-1. As células tratadas com rhMIF apresentaram elevada carga parasitária e maior expressão da fosforilação da ERK1/2. Além disso, a infecção aumentou a produção de MIF extracelular pelas células HTR8/SVneo. Em relação ao ensaio de migração celular, as células tratadas com ISO-1 diminuiram a migração comparadas com as células tratadas com rhMIF. Assim, a infecção por T. gondii modula a produção de MIF, a expressão da fosforilação de ERK1/2. Além disso, MIF foi importante na migração de células HTR8/SVneo, garantindo sua permanência na célula hospedeira. The successful of pregnancy depend about production of many cytokine by extravillous trophoblastic cells migration and the macrophage migration inhibitory (MIF) is important in this process. MIF is a potent cytokine, implicated in several pathological conditions and it is involved in pathogenesis of infections, including toxoplasmosis. Therefore, we investigated the role of MIF in infected HTR8/SVneo cells. The cells were infected with RH strain (2F1) tachyzoites of T. gondii and treated with recombinant MIF (rhMIF) or MIF inhibitor (ISO-1). The cell viability was analyzed by MTT assay, T. gondii intracellular proliferation by colorimetric beta-galactosidase assay, CD44 expression and ERK1/2 phosphorylation by Western blotting and cell migration by scratch assay. The supernatants were collected for MIF production analysis by ELISA. The cells were used to CD44 co-receptor and ERK1/2 phosphorylation analysis. Cellular viability was not changed in infected and/or treated with rhMIF or ISO-1. Cells treated with rhMIF showed high parasite burden, presence of ERK1/2 phosphorylation. In addition, the infection increased extracellular MIF production by HTR8/SVneo cells. In cellular migration assay, ISO-1 treated cells decrease migration compared with rhMIF treated cells. In conclusion, T. gondii infection caused modulation of MIF production and ERK1/2 phosphorylation. Furthermore, MIF was important in the migration of HTR8/SVneo cells, ensuring its permanence in the host cell. Dissertação (Mestrado)

A interação entre os trofoblastos extravilosos humanos e as células endoteliais desempenha um importante papel nos processos de implantação embrionária e placentação. Alterações nos padrões de comunicação entre estas duas populações celulares estão associadas com complicações gestacionais, neste contexto, a infecção por Toxoplasma gondii pode ser um problema em potencial para essa relação. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar os fenômenos de invasão, migração e morte celular de células trofoblásticas extravilosas (linhagem HTR-8/SVneo) sob a influência de células endoteliais venosas (linhagem HUVEC) infectadas por T. gondii. As células HTR-8/SVneo foram co-cultivadas com as células HUVEC infectadas ou não por T. gondii, no sentido de avaliar a produção de citocinas detectadas pelo método de ELISA, bem como funções biológicas das células trofoblásticas extravilosas. A capacidade invasiva das células trofoblásticas foi analisada diante a utilização de insertos de transwell previamente cobertos com Matrigel, a capacidade migratória dessas células foi verificado pelo ensaio de scratch e o índice de morte celular foi mensurado através do método de citometria de fluxo. A interação entre as células HTR-8/SVneo e HUVEC induziram a secreção de IL-6 e IL-8 pelas células trofoblásticas. Já a secreção de MIF foi diminuída pelas células HTR-8/SVneo após a co-cultura com as células HUVEC não infectadas, e maiores níveis dessa citocina foram observados após a co-cultura com células HUVEC infectadas. O estímulo da co-cultura com células HUVEC não infectadas reduziu a capacidade invasiva e aumentou a migração de células HTR-8/SVneo. De forma contrária, as condições de células HUVEC infectadas aumentaram a capacidade invasiva, reduziram a migração e induziram o índice de morte celular das células trofoblásticas. O tratamento com ISO-1, inibidor altamente específico de MIF, alterou os eventos relacionados com a capacidade invasiva e morte celular das células HTR-8/SVneo quando comparados com cada condição respectiva sem o tratamento com inibidor de MIF. A comunicação entre as células trofoblásticas extravilosas e células endoteliais venosas foi modificada pela infecção por T. gondii e a indução da produção de MIF pelas células HTR-8/SVneo juntamente com a alteração dos índices de morte celular, podem ter sido alguns dos fatores responsáveis pela variação das funções trofoblásticas relacionadas à capacidade invasiva e migratória das células trofoblásticas extravilosas. The interaction between human extravillous trophoblast and human endothelial cells has an important role in embryonic implantation and placentation. Changes in communication patterns between these two cell populations are associated with pregnancy complications, in this context, Toxoplasma gondii infection can be a potential problem in this crosstalk. Therefore, the aim of this study was to evaluate the occurrence of invasion, migration and cell death of extravillous trophoblast cells (HTR-8/SVneo cell line) under influence of infected human venous endothelial cell (HUVEC) by T. gondii. HTR-8/SVneo cells were co-cultured with T. gondii-infected or uninfected HUVECs in order to analyze cytokine production by ELISA as well biological functions of extravillous trophoblast cells. The invasive capacity of trophoblastic cells was analyzed using transwell inserts previously covered with Matrigel, the migratory capacity of these cells was verified by scratch method and the cell death index was measured by the flow cytometry. HTR-8/SVneo cells and HUVECs interaction induced secretion of IL-6 and IL-8 by trophoblastic cells. MIF secretion was downregulated by HTR-8/SVneo cells after co-culture with uninfected HUVECs, but upregulated MIF levels were detected after co-culture with infected HUVECs. Stimuli of uninfected HUVECs co-culture reduced invasive capacity and increased migration of HTR-8/SVneo cells. Otherwise, infected HUVECs condition enhanced invasive capability, reduced migration, induced cell death index of trophoblastic cells. The treatment with ISO-1, highly specific MIF inhibitor, altered the events related to invasive capacity and cell death of HTR-8/SVneo when compared to each conditions without treatment with MIF inhibitor. The extravillous trophoblast-venous endothelial cells crosstalk was changed by T. gondii infection and induction of MIF production by HTR-8/SVneo cells together with changes in cell death index, might be some of the factors responsible for alteration in trophoblastic functions related to migratory and invasive capacity of extravillous trophoblastic cells. Tese (Doutorado)

A toxoplasmose, causada pelo protozoário intracelular obrigatório Toxoplasma gondii, é uma doença cosmopolita que atinge um terço da população mundial. Tipicamente a infecção pelo T. gondii é assintomática em indivíduos imunocompetentes, no entanto, várias manifestações clínicas podem acometer, sobretudo indivíduos imunocomprometidos e infectados congenitamente, levando a consequências fatais, o que torna essa doença um importante problema de saúde pública. Embora existam medicamentos para o tratamento da toxoplasmose, estes apresentam eficácia limitada e graves efeitos colaterais, tornando essencial a busca de novas terapias, com melhor perfil de segurança. Neste contexto, o objetivo do estudo foi avaliar in vitro o potencial anti-toxoplásmico do extrato etanólico, frações acetato de etila e aquosa, óleo essencial e do α-bisabolol isolado de Siparuna guianensis. Foi realizado teste de viabilidade celular utilizando fibroblastos murinos NIH/3T3, pelo método colorimétrico de MTT. A atividade anti-toxoplásmica foi avaliada por meio do ensaio da β-galactosidase em duas condições experimentais diferentes, utilizando parasitos da cepa RH-2F1 de T. gondii. As amostras foram testadas em diferentes concentrações variando de 15 a 500 μg/mL, sendo utilizado como controle negativo meio RPMI e como controle positivo a enrofloxacina. Verificou-se que o extrato etanólico e a fração acetato de etila apresentaram atividade citotóxica frente aos fibroblastos nas maiores concentrações analisadas (250 e 500 μg/mL) e o óleo essencial na concentração de 500 μg/mL. Para as demais concentrações, nenhuma apresentou efeito citotóxico significativo, sugerindo que a planta seja bem tolerada pelo organismo. Na avaliação da proliferação intracelular do parasito quando o tratamento foi realizado após a infecção celular, observou-se que os compostos da S. guianensis controlaram parcialmente o parasitismo, sendo que apenas a fração acetato de etila demonstrou capacidade toxoplasmicida relevante, apresentando valor de IC 50 de 77,21 μg/mL. Em contraste, a fração aquosa e o óleo essencial, apresentaram nenhum efeito tóxico contra o parasito, indicando que estes não são uma boa alternativa terapêutica. Verificou-se que o efeito inibitório do parasitismo foi mais significativo no pré- tratamento dos parasitos antes da infecção celular, evidenciando um efeito direto sobre o parasito. Em conclusão, os resultados indicam utilização favorável da S. guianensis, especialmente da fração acetato de etila como terapia alternativa da toxoplasmose, devido a sua baixa citotoxidade, sua ação direta contra o parasito, além do seu efeito concentração-dependente, porém estudos futuros utilizando modelos de infecção parasitária in vivo e identificação dos princípios ativos da planta são necessários. Toxoplasmosis, a result of the obligate intracellular protozoan Toxoplasma gondii, is a cosmopolitan disease that affects the character of the world population. Typically T. gondii infection is asymptomatic in immunocompetent examples, however, several manifestations could be more severe, immunocompromised and infected congenitally, leading to fatal consequences, the major public health problem. The treatment of toxoplasmosis is the treatment of toxoplasmosis, the effects of toxoplasmosis, such as stuff based on the density lipids, making essential profile for security. This study evaluates in vitro the anti-toxoplasmic potential of the ethanolic extract, ethyl acetate and aquatic fractions, essential oil and bisabolol isolated from Siparuna guianensis. Cell viability tests using NIH/3T3 murine fibroblasts were performed by the MTT colorimetric method. Anti-toxoplasmatics were evaluated using the β-galactosidase assay in two experimental conditions using T. gondii strain RH-2F1. Samples were tested in different variables of 15 to 500 μg/mL, while the testosterone assayed in the test ranged from 15 to 500 μg/mL. It was verified that ethanolic extract and a fraction of euphyl acetate of cytometic activity against the fibroblasts in the highest concentrations analyzed (250 and 500 μg/mL) and the essential oil in the concentration of 500 μg/mL. For the other calories, some have a significant cytotoxic effect, suggesting that the plant is well tolerated by the body. In the intracellular proliferation of the parasite when the treatment was carried out after the cellular activation, the control of the progesterone control and the parasitism was observed, being that only a fraction of standard of acetate demonstrated capacity of relevant toxoplasmosis, presenting IC 50 value of 77,21 μg/ml. In contrast, the aqueous fraction and theessential effect, the thermal effect against the parasite, are not a therapeutic alternative. It was verified that the inhibitory effect of the parasitism was more significant in the pre-treatment of the parasites before the cellular infection, evidencing a direct effect on the parasite. According to protocol specifications, in order to allow the use of data, according to their implications, in vivo parasitic infection models and identification of the major plant components are required. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Na placentação inicial, as células de citotrofoblasto proliferam e diferencia-se por fusão celular para formar uma camada multinucleada, o sinciciotrofoblasto e também formam o trofoblasto extraviloso que invade a mucosa uterina, fenômeno essencial para uma gestação de sucesso. No curso da gestação, a infecção causada por Toxoplasma gondii pode desencadear manifestações graves e potencialmente afetar o desenvolvimento fetal.. Diferenças na susceptibilidade de células trofoblásticas à infecção por T. gondii devem ser avaliadas para subsidiar o estabelecimento de novas abordagens terapêuticas capazes de interferir no controle da infecção fetal sem comprometer o sucesso da gestação. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a susceptibilidade de citotrofoblasto, sinciciotrofoblasto e células de trofoblasto extraviloso à infecção por T. gondii e possíveis mecanismos celulares envolvidos neste fenômeno. As células BeWo foram utilizadas como modelo de células de citotrofoblasto e sinciciotrofoblasto (após processo de sincicialização usando Forskolin e PMA), enquanto as células HTR-8/SVneo serviram como modelo de células de trofoblasto extraviloso. As células foram cultivadas sobre lamínulas redondas em placas de 6 poços e infectadas por taquizoitos de T. gondii (cepa RH) por 24 horas adicionais. Em paralelo, os três tipos de células foram tratados com inibidor de quinase regulada por sinais extracelulares (ERK)1/2 (PD98059) durante 3 horas e infectados por T. gondii por adicionais 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados para avaliar o perfil das citocinas e as células para analisar quanto ao índice de infecção, número total de parasitos e fosforilação de quinases reguladas por sinais extracelulares (MAPKs). Como resultado, as células HTR-8/SVneo apresentaram maior susceptibilidade à infecção por T. gondii quando comparadas às células de sinciciotrofoblasto e citotrofoblasto, enquanto que o sinciciotrofoblasto foi o tipo de célula mais resistente à infecção parasitária. Além disso, células de citotrofoblasto e sinciciotrofoblasto produziram significativamente mais IL-6 do que as células HTR-8/SVneo. Por outro lado, as células HTR-8/SVneo apresentaram maior fosforilação de ERK1/2 do que as demais células trofoblásticas. A inibição de ERK1/2 reduziu a infecção por T. gondii e aumentou a produção de IL-6 em células HTR-8/SVneo. Assim, é possível sugerir que as células HTR-8/SVneo foram mais suscetíveis à infecção por T. gondii provavelmente porque essas células apresentaram maior fosforilação ERK1/2 e menores níveis de IL-6 em comparação com outras células trofoblásticas, sugerindo que esses mediadores podem ser importantes para favorecer a infecção parasitária neste tipo de população celular placentária. During initial placentation, cytotrophoblast cells proliferate and differentiate by cellular fusion to form a multinucleated layer, the syncytiotrophoblast, and also form the extravilous trophoblast that invades the uterine mucosa, an essential phenomenon for successful gestation. In the course of gestation, infection caused by Toxoplasma gondii can trigger serious manifestations and potentially affect fetal development. . Differences in the susceptibility of trophoblastic cells to T. gondii infection should be evaluated to support the establishment of new therapeutic approaches capable of interfering in the control of fetal infection without compromising the success of pregnancy. This study aimed to evaluate the susceptibility of cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and extravillous trophoblast cells to T. gondii infection and possible mechanisms involved in this process. BeWo line cells were used as model of cytotrophoblast (before syncytialization process) and syncytiotrophoblast cells (after syncytialization process by using forskolin and PMA), whereas human HTR-8/SVneo cells served as model of extravillous trophoblast cells, according to previous studies. Cells were cultured in coverslips into 6-well plates and infected by T. gondii tachyzoites (RH strain) for additional 24 hours. In parallel, the three cell types were treated with extracellular signals regulated kinases (ERK) 1/2 inhibitor (PD98059) for 3 hours and infected by T. gondii for additional 24 hours. The supernatants were collected to measure cytokine profile, and the cells analyzed for infection index, total number of parasites and mitogen activated protein kinases (MAPKs) phosphorylation. HTR-8/SVneo cells showed the highest susceptibility to T. gondii infection when compared to syncytiotrophoblast and cytotrophoblast cells, whereas syncytiotrophoblast was the cell type more resistant to the parasite infection. In addition, cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells produced significantly more IL-6 than HTR-8/SVneo cells. On the other hand, HTR-8/SVneo cells showed higher ERK1/2 phosphorylation than cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells. ERK1/2 inhibition reduced T. gondii infection and increased IL-6 production in HTR-8/SVneo cells. Thus, it is possible to suggest that HTR-8/SVneo cells are more susceptible to T. gondii infection likely because these cells presented higher ERK1/2 phosphorylation and lower IL-6 levels compared to other cells, suggesting that these mediators can be important to favor the parasite infection in this type of trophoblastic population. Tese (Doutorado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O tratamento clássico para a toxoplasmose congênita é baseado na combinação de sulfadiazina e pirimetamina mais ácido folínico. Devido aos efeitos teratogênicos e a supressão da medula óssea causados pela pirimetamina, o estabelecimento de novos alvos terapêuticos é indispensável para minimizar os efeitos indesejáveis e melhorar o controle da infecção por T. gondii. Estudos prévios demonstraram que enrofloxacina e toltrazuril são capazes de controlar o parasitismo em infecções por Neospora caninum e Toxoplasma gondii. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de enrofloxacina e toltrazuril no controle da proliferação de Toxoplasma gondii em células trofoblásticas humanas (linhagem BeWo) e em explantes de vilos placentários humanos de terceiro trimestre. Células BeWo e vilos foram tratados com diferentes concentrações de enrofloxacina, toltrazuril, sulfadiazina, pirimetamina ou associação (sulfadiazina + pirimetamina) com o objetivo de avaliar a viabilidade pelo ensaio de MTT ou LDH, respectivamente. Em seguida, células BeWo foram infectadas com as cepas RH (clone 2F1) ou ME-49 de T. gondii, enquanto que os vilos foram infectados somente com a cepa RH. Em seguida, células e vilos foram tratados ou não com os mesmos medicamentos e a proliferação intracelular do parasito foi analisada pelo ensaio da β-galactosidase (para a cepa RH) ou coloração com azul de toluidina (para a cepa ME-49) e o perfil de citocinas foi analisado. Enrofloxacina e toltrazuril não alteraram a viabilidade nas células BeWo e nos vilos quando administrados nas menores concentrações. Além do mais, as drogas diminuíram a proliferação intracelular de T. gondii independentemente da cepa utilizada em células BeWo e em explantes de vilos quando comparado as condições infectadas e não tratadas. Em células BeWo infectadas por RH, enrofloxacina induziu altos níveis de IL-6 e não modificou significativamente a produção de MIF, enquanto que ambas as citocinas IL-6 e MIF foram produzidas por células BeWo infectadas com a cepa ME-49 e tratadas com enrofloxacina e toltrazuril. Adicionalmente, em vilos placentários, enrofloxacina induziu alta produção de MIF. Assim, podemos concluir que enrofloxacina e toltrazuril foram capazes de controlar o parasitismo em células BeWo e em explantes de vilos placentários humanos. Provavelmente este controle do parasitismo mediado por estas drogas ocorra por modulação da resposta imune nas células BeWo e tecidos placentários, mas não exclui a possibilidade de ação direta no parasito, entretanto futuros experimentos devem ser conduzidos para verificar esta hipótese. The classical treatment for congenital toxoplasmosis is based on combination of sulfadiazine and pyrimethamine plus folinic acid. Due to teratogenic effects and bone marrow suppression caused by pyrimethamine, the establishment of new therapeutic targets is indispensable to minimize the undesirable effects and improve the control of the infection. Previous studies demonstrated that enrofloxacin and toltrazuril were able to control the infection triggered by Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Therefore, the aim of this present study was evaluate the efficacy of enrofloxacin and toltrazuril in the control of T. gondii proliferation in human trophoblast cells (BeWo lineage) and in human villous explants from third trimester. BeWo cells and villous were treated with several concentrations of enrofloxacin, toltrazuril, sulfadiazine, pyrimethamine or association (sulfadiazine + pyrimethamine) in other to verify their viability by MTT or LDH assay, respectively. Next, BeWo cells were infected with T. gondii RH (2F1 clone) or ME49 strain, whereas villous were infected only with RH strain (2F1 clone), after, both cells and villous were treated or not with the same antibiotics and analyzed to T. gondii intracellular proliferation by beta-galactosidase assay (for RH strain) or blue toluidine staining (for ME49 strain). ELISA was performed in the supernatant to evaluate the cytokine profile. Enrofloxacin and toltrazuril did not change strongly the viability in cells and villous. Furthermore, the drugs decreased the parasite intracellular proliferation regardless T. gondii strain in BeWo cells and villous explants when compared to untreated and infected conditions. In BeWo cells infected by RH, enrofloxacin induced high levels of IL-6 low levels of MIF, while both cytokines were upregulated by enrofloxacin and toltrazuril in BeWo cells infected by ME49 strain. Additionally, in villous explantes, enrofloxacin induced high MIF production. Thus, enrofloxacin and toltrazuril were able to control the parasitism in BeWo cells and villous explants, and probably it occurs by modulation of immune response in these cells or tissues and direct action on parasite, but future experiments are necessary to verify this hypothesis. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Toxoplasma gondii é um protozoário parasito intracelular obrigatório que infecta uma ampla variedade de vertebrados de sangue quente, incluindo seres humanos. Muitos estudos demonstram que a ciclooxygenase-2 (COX-2) é um potente modulador da resposta imune em vários tipos de infecção. No entanto, o papel da ciclooxygenase ainda não é claro durante uma infecção causada por T. gondii. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi verificar o papel funcional da COX-2 em roedores Calomys callosus infectados por T. gondii, um excelente modelo experimental in vivo tradicionalmente utilizado para estudar a toxoplasmose. Para este fim, fêmeas de C. callosus foram infectadas com cinquenta cistos de T. gondii (cepa ME49), tratadas com inibidores da ciclooxygenase Meloxicam (inibidor de COX-1 e COX-2) e Celecoxibe (inibidor seletivo de COX-2), e avaliadas a cada 48 horas para a verificação da alteração de peso corporal e morbidade durante 40 dias consecutivos. Como controle, os animais foram infectados e não tratados com inibidores da ciclooxygenase. Depois de 40 dias de infecção, os cérebros foram coletados e processados para imuno-histoquímica ou PCR em tempo real para detecção de T. gondii, enquanto o soro dos animais foi avaliado para detecção de citocinas. Além disso, macrófagos peritoneais de C. callosusnão infectados ou infectados com a cepa RH de T. gondii foram tratados com Meloxicam ou Celecoxibe a fim de avaliar a proliferação intracelular do parasito por ensaio de beta-galactosidase, produção de citocinas por ELISA e produção de nitrito por meio do método de Griess, após 24 h de infecção. Os resultados mostraram que a morbidade dos animais foi alterada após a infecção por T. gondii, independentementedo tratamento. Em relação à alteração de peso corporal, animais tratados com Celecoxibe apresentaram uma perda de peso menor quando comparados com seu respectivo controle. A imuno-histoquímica e PCR em tempo real realizados no tecido cerebral mostraram uma redução significativa de cistos teciduais em animais tratados com ambos os inibidores, quando comparados com animais infectados e não tratados. Além disso, observou-se que ambos os tratamentos com os inibidores foram capazes de controlar a proliferação intracelular de T. gondii em macrófagos peritoneais. No soro de C.callosus, os dados do ELISA mostraram que animais tratados com Meloxicam apresentaram uma tendência para maior produção de MIF quando comparados ao controle. Já no sobrenadante de macrófagos peritoneais, houve um aumento na produção de TNF-α e uma redução de IL-6, e o ensaio de Griess demonstrou que ambos os tratamentos induziram uma alta produção denitrito. Todos estes resultados indicam que as ciclooxygenases são capazes de aumentar a susceptibilidade a infecção por T. gondii, uma vez que a inibição destes mediadores induz o controle significativo da infecção. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a COX-1 e COX-2 são importantes para aumentar o processo infeccioso por T. gondii no cérebro e macrófagos peritoneais de C.callosus. Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan parasite that infects a wide range of warm-blooded vertebrates, including humans. Many studies show that the ciclooxygenase-2 (COX-2) is a potent modulator of immune response in multiple types of infection. However, the role of cyclooxygenase during an infection by T. gondii is still not clear. Therefore, the aim of this study was to investigate the functional role of COX-2 in Calomys callosus rodents infected with T. gondii, an excellent in vivo experimental model traditionally used for studying toxoplasmosis. For this purpose, C. callosus females were infected with fifty cysts of T. gondii (ME49 strain), treated with ciclooxygenase inhibitors as Meloxicam, COX-1 and COX-2 inhibitor, and Celecoxib, COX-2 selective inhibitor, and evaluated every 48 hours to check the body weight change and morbidity for 40 consecutive days. As a control, the animals were infected and not treated with ciclooxygenase inhibitors. After 40 days of infection was performed collection and processing of the brains for immunohistochemistry or real-time PCR for the detection of T. gondii, while evaluating the serum of animals for the detection of cytokines by ELISA. Furthermore, the peritoneal macrophages of C. callosus, uninfected or infected with T. gondii RH strain, were treated with Meloxicam or Celecoxib in order to evaluate the parasite intracellular proliferation by beta-galactosidase assay, and the supernatant was collected for cytokine detection by ELISA and production of nitrite by Griess method, after 24h of infection. The results showed that the morbidity of the animals changed after infection by T. gondii, regardless of both treatments. Regarding the change in body weight, animals treated with Celecoxib had a smaller loss of weight when compared to their respective control. Immunohistochemistry and real-time PCR performed on brain tissue showed a significant reduction of tissue cysts in animals treated with both inhibitors when compared to infected and untreated animals. Besides, it was observed that both treatments with the inhibitors were able to control the T. gondii intracellular proliferation in peritoneal macrophages. On the serum of C. callosus, the ELISA data shows that animals treated with Meloxicam showed a tendency to increase the MIF production when compared to the PBS control. In the supernatant of peritoneal macrophages, there was an increase in TNF-α production and IL-6 reduction, and Griess assay showed that both treatments induced a high production of nitrite. All these results indicate that cyclooxygenases are capable of favoring infection by T. gondii, since inhibition of these mediators induced significant control of infection. In conclusion, our results show that COX-1 and COX-2 are important to facilitate the T. gondii infection in the brain and peritoneal macrophages of C. callosus. Dissertação (Mestrado)