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Fowls are the main reservoirs of the highly important food-originating pathogen called Campylobacter spp. and broilers’ meat and byproducts are the main vehicles of this microorganism. Increasing of Campylobacter spp. resistant strains to fluorquinolones, an antimicrobial class often employed in poultry farming and in human medicine has become a great concern to poultry breeders. In fact, several studies evaluated increasing bacterial resistance against these antimicrobial agents. The role of CmeABC efflux system has been underscored among the resistance mechanisms in Campylobacter spp. to fluorquinolones. This study investigated the occurrence of CmeABC efflux pump in 81 and 78 enrofloxacin resistant strains of Campylobacter jejuni and C. coli respectively, isolated from broilers collected from six abattoirs situated at São José do Vale do Rio Preto/RJ poultry center and from two commercial abattoirs situated at Metropolitan Region of Rio de Janeiro, from 2013 to 2016. The resistance to enrofloxacin was assessed by agar dilution to determine minimum inhibitory concentration (MIC). The CmeABC efflux system was investigated through the detection of genes genes cmeA, cmeB and cmeC by PCR. The activity of CmeABC efflux pump was investigated in 20 strains by using the efflux pump inhibitor Phenylalanine-Arginine β-Naphthylamide (PAβN). The three genes cmeA, cmeB and cmeC were detected in 94.3% of the strains (C. jejuni = 80 and C. coli = 70), whereas the system was absent or incomplete in 5.7% of strains (C. jejuni = 1 and C. coli = 8). MIC varied between 0.5μg/ml and 64μg/ml, and 88.7% of strains were enrofloxacin resistant and 11.3% featuring intermediate resistance. The inhibition of the efflux pump by PAβN reduced the MIC to enrofloxacin up to eight times in fifteen strains (75%). These results indicate that this system is frequent and active in Campylobacter spp. Resistant strains in the presence of enrofloxacin. RESUMO: As aves são os principais reservatórios de Campylobacter spp., importante patógeno de origem alimentar e a carne de frango e produtos derivados são os principais veículos desse microrganismo. O aumento de cepas de Campylobacter spp. resistentes às fluorquinolonas, uma classe antimicrobiana frequentemente empregada na avicultura e na medicina humana, tornou-se uma grande preocupação para os produtores de aves e vários estudos avaliaram o aumento da resistência bacteriana a esses antimicrobianos. O papel do sistema de efluxo CmeABC tem sido enfatizado entre os mecanismos de resistência em Campylobacter spp. à fluorquinolonas. O presente estudo investigou a ocorrência da bomba de efluxo CmeABC em 81 cepas de Campylobacter jejuni e 78 cepas de Campylobacter coli resistentes à enrofloxacina, isoladas de frangos de corte coletados em seis abatedouros situados no polo avícola de São José do Rio Preto/RJ e de dois abatedouros comerciais situados na Região Metropolitana do Rio de Janeiro, de 2013 a 2016. A resistência à enrofloxacina foi avaliada pelo método de diluição em ágar para determinar a concentração inibitória mínima (CIM). O sistema de efluxo CmeABC foi investigado através da detecção dos genes cmeA, cmeB e cmeC por PCR. A atividade da bomba de efluxo CmeABC foi investigada em 20 cepas utilizando o inibidor da bomba de efluxo Phenylalanine-Arginine β-Naftilamida (PAβN). Os três genes cmeA, cmeB e cmeC foram detectados em 94,3% das cepas (C. jejuni = 80 e C. coli = 70), enquanto o sistema estava ausente ou incompleto em 5,7% das cepas (C. jejuni = 1 e C coli = 8). A CIM variou entre 0,5μg/ml e 64μg/ml e 88,7% das cepas foram resistentes à enrofloxacina, enquanto 11,3% apresentaram resistência intermediária. A inibição da bomba de efluxo pelo PAβN reduziu a CIM da enrofloxacina até oito vezes em quinze cepas (75%). Estes resultados indicam que este sistema é frequente e ativo em cepas resistentes de Campylobacter spp. na presença de enrofloxacina.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-04-16T14:40:02Z No. of bitstreams: 1 FernandaNomiyamaFigueiredoDissertacao2018.pdf: 2178476 bytes, checksum: 23f38c14567d00ff189eaef20f904495 (MD5) Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-04-16T14:40:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FernandaNomiyamaFigueiredoDissertacao2018.pdf: 2178476 bytes, checksum: 23f38c14567d00ff189eaef20f904495 (MD5) Made available in DSpace on 2018-04-16T14:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FernandaNomiyamaFigueiredoDissertacao2018.pdf: 2178476 bytes, checksum: 23f38c14567d00ff189eaef20f904495 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 Klebsiella pneumoniae is one of the main bacterial agents that may cause infections related to health care assistance. K. pneumoniae frequently carries the resistance gene K. pneumoniae carbapenemase (KPC). Currently, tigecycline can be considered one of the last therapeutic options for KPC, but reports of tigecycline-resistant KPC isolates are on the rise, being indicated as most common mechanism the increased AcrAB-TolC efflux pump system expression. However, molecular tigecycline resistance mechanisms associated to AcrAB-TolC still remains obscure. Thus, the main goal of this study was to verify if tigecycline resistance can be related to the presence of mutations in the regulatory genes of AcrAB-TolC, AcrR and RamR. Therefore, 32 K. pneumoniae isolates were used, identification and antibiogram performed using Vitek 2 systems. The minimum inhibitory concentrations were confirmed using E-test. Primers were designed in order to verify mutations within AcrR and RamR genes. PCR analysis showed that the mutations found within these genes were transversions (94% for AcrR and 90% for RamR) and transitions (6% for AcrR and 10% for RamR). Nevertheless among the mutations, no distinction between tigecycline susceptible and resistant isolates was found. Some of the transversions caused change in the amino acid encoding 6 in AcrR and 15 in RamR. Presence of these types of mutations evaluation can be seen as the first bacterial resistance study step, as it may be caused by oxidative damage for bacterial DNA, frequently caused by antibiotic selective pressure. Tigecycline resistance found in this study`s clinical isolates may be associated to alterations in another genes that can trigger mechanisms associated to this antibiotic. Klebsiella pneumoniae consiste em um dos principais agentes bacterianos causadores de infec????es relacionadas ?? assist??ncia ?? sa??de (IRAS). K. pneumoniae carrega frequentemente o gene de resist??ncia K. pneumoniae carbapenemase (KPC). Atualmente, a tigeciclina pode ser considerada uma das ??ltimas op????es terap??uticas para KPC, mas os relatos de isolados de KPC resistentes a tigecilina est??o em ascens??o, sendo a hiperexpress??o da bomba de efluxo AcrAB-TolC indicado como mecanismo mais comum. No entanto, os mecanismos moleculares de resist??ncia ?? tigeciclina associada ao AcrAB-TolC permanecem obscuros. Desta forma o objetivo deste trabalho foi verificar se a resist??ncia a tigeciclina pode estar relacionada ?? presen??a de muta????es nos genes ArcR e RamR, reguladores de AcrAB-TolC. Para tanto, 32 isolados de K. pneumoniae foram utilizados, sendo a identifica????o e o antibiograma feitos utilizando o sistema Vitek 2. A confirma????o das concentra????es inibit??rias m??nimas (CIMs) foram realizadas por E-test. Iniciadores foram desenhados para verifica????o de muta????es nos genes (AcrR e RamR). As an??lises por PCR mostraram que as muta????es encontradas nos genes AcrR e RamR foram substitui????es por transvers??o (94% e 90% para AcrR e RamR respectivamente) e transi????o (6% e 10% para AcrR e RamR respectivamente), por??m n??o foi identificada distin????o da presen??a de muta????es entre isolados sens??veis e resistentes a tigeciclina. Algumas tranvers??es ocasionaram mudan??a na codifica????o do amino??cido, sendo 6 em AcrR e 15 em RamR. A avalia????o da presen??a desses tipos de muta????es consiste em um primeiro passo para o estudo da resist??ncia bacteriana, j?? que pode ser causada por dano oxidativo ao DNA bacteriano, frequentemente ocasionado por press??o seletiva dos antibi??ticos. A resist??ncia a tigeciclina encontrada nos isolados cl??nicos do presente estudo, provavelmente pode estar associada a altera????es em outros genes desencadeadores de mecanismos de resist??ncia a tigeciclina.

The study was carried out to screen and analyze the genetic characteristics of antimicrobial resistance in Campylobacter spp. from poultry sources. A total of 141 strains of Campylobacter isolated from samples of broilers of slaughterhouses in southern Brazil was identified by phenotypic and genotypic methods. Campylobacter isolates were evaluated for its antimicrobial susceptibility and the presence of resistance genes. The strains were investigated for antimicrobial susceptibility against two agents (ampicillin and tetracycline) by disk diffusion method. PCR assay was used to confirm the specie and the presence of ampicillin (blaOXA-61), tetracycline tet(O), and the energy-dependent multi-drug efflux pump (cmeB) genes. Campylobacter jejuni was the most ubiquitous; its presence was determined in 140 samples out of 141 (99.3%), whereas Campylobacter coli was found only in one of the contaminated samples (0.70%). The results obtained showed 65% and 35.5% of Campylobacter isolates resistant to β-lactams and tetracyclines, respectively. The cmeB gene responsible for multidrug resistance was detected in 26 isolates out 141 strains (18.5%). Moreover, 36 out of 141 Campylobacter strains (25.6%) were found to be resistant to at least two different antimicrobia resistance markers (β-lactams and tetracyclines). Resumo O presente estudo foi realizado para examinar e analisar as características genéticas de resistência antimicrobiana de Campylobacter spp. a partir de fontes avícolas. Um total de 141 amostras de Campylobacter isolados em matadouros-frigoríficos de aves do estado do Rio Grande do Sul, Brasil, foi identificado por métodos fenotípicos e genotípicos. Foi analisada a susceptibilidade antimicrobiana e a presença de genes de resistência. As cepas foram testadas para detectar sensibilidade frente a dois antimicrobianos (ampicilina e tetraciclina) pelo método de difusão em disco. A seguir, usando a reação em cadeia da polimerase foi confirmada a espécie e a presença dos genes de resistência à ampicilina (blaOXA-61) e tetraciclina tet(O), assim como a detecção da bomba de efluxo (cmeB). Campylobacter jejuni foi a espécie mais isolada, sua presença foi determinada em 140 amostras (99,3%), e Campylobacter coli foi encontrada em uma única amostra (0,70%). Os resultados obtidos mostraram 65% e 35,5% de Campylobacter isolados resistentes a β-lactâmicos e tetraciclinas, respectivamente. O gene cmeB responsável pela resistência a múltiplos antimicrobianos foi detectado em 26 amostras (18,5%). Neste contexto, 36 das 141 amostras (25,6%) foram consideradas resistentes a dois grupos diferentes de antimicrobianos (β-lactâmicos e tetraciclinas).

This study aimed to determine the antimicrobial susceptibility profile and to assess the presence of mechanisms of antimicrobial resistance in Staphylococcus spp. (n=36) isolated from mastitis in sheep’s Chapecó-SC. The potential for biofilm production was determined by phenotypic tests of Congo Red Agar, DAPI and Gentian Violet and by PCR for the detection of icaD gene. To evaluate the antimicrobial resistance testing was performed disk diffusion and detection of resistance genes blaZ, mecA, ermA, ermB and ermC and msrA also performed by PCR.The pump test was conducted by efuxo crop growth Muller Hinton agar containing ethidium bromide. The results showed that 1 (2,78%), 36 (100%) and 10 (27,78%) isolates were considered to produce a biofilm on Congo Red Agar test, Gentian Violet and DAPI, respectively, while the gene icaD was observed in only 2 (5.55%) isolates. The lowest percentage of sensitivity was observed for ampicillin (58.33%) and penicillin (58.33%). All strains tested were negative for the mecA, ermA, ermB and ermC genes. However, the isolates were positive for other resistance genes, being the blaZ and the msrA, with percentages of positivity of 58.33% and 11.11% respectively. Only one sample was positive for efflux pump test.O presente trabalho teve como objetivos determinar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos e avaliar a presença de mecanismos de resistência antimicrobiana em Staphylococcus spp. (n=36) isolados de mastite em ovelhas do município de Chapecó-SC. O potencial para produção de biofilme foi determinado pelos testes fenotípicos de Agar Vermelho Congo, DAPI e Violeta de Genciana e por teste molecular pela técnica de PCR para a detecção do gene icaD. Para determinar o perfil de resistência aos antimicrobianos, foi realizado o teste de difusão em disco e detecção dos genes de resistência blaZ, mecA, erm (A, B e C) e msrA. O teste da bomba de efuxo foi realizado através do crescimento das culturas em Agar Muller Hinton contendo brometo de etídio. Os resultados mostraram que 1 (2,78%), 36 (100%) e 10 (27,78%) isolados foram considerados produtores de biofilme pelos testes de Agar Vermelho Congo, DAPI e Violeta de Genciana, respectivamente, enquanto que o gene icaD foi observado em apenas 2 (5,55%) isolados. O menor percentual de sensibilidade foi observado para ampicilina (58,33%) e penicilina (58,33%). Os isolados avaliados foram positivos para os genes de resistência blaZ (58,33%) e msrA (11,11%). Nenhum isolado apresentou os genes de resistência erm (A, B, C) e apenas uma amostra foi positiva para o teste da bomba de efluxo.

Submitted by Tatiana Maria Starck Fogaça de Aguiar Coletti (tatistarckcoletti@gmail.com) on 2016-12-22T16:53:41Z No. of bitstreams: 1 Tese de Doutorado Tatiana Coletti.pdf: 2460452 bytes, checksum: 7f2d7c92917a2cfc90b5106eb57b3d8d (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-04T16:58:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 coletti_tmsfa_dr_arafcf_par.pdf: 1704840 bytes, checksum: 8f1a3faf4181ce6e1394d3c04db4a736 (MD5) Made available in DSpace on 2017-01-04T16:58:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 coletti_tmsfa_dr_arafcf_par.pdf: 1704840 bytes, checksum: 8f1a3faf4181ce6e1394d3c04db4a736 (MD5) Previous issue date: 2016-11-18 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A necessidade de superar a resistência dos micro-organismos frente aos fármacos disponíveis, a fim de se chegar ao sucesso terapêutico leva a uma constante exploração de novas abordagens para este fim. Os sistemas de efluxo multidrogas tem sido um profundo obstáculo para uma terapêutica bem-sucedida utilizando-se antimicrobianos existentes hoje no mercado. A descoberta de bloqueadores desses sistemas complementa estudos envolvendo terapias nãoconvencionais, como a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (Antimicrobial Photodynamic Therapy - aPDT). Este estudo teve como objetivo avaliar a aPDT mediada pelo azul de metileno (AM) associada com inibidores de bomba de efluxo em diferentes espécies microbianas. Para isso, foram utilizados como inibidor o verapamil, em biofilmes de Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e verapamil e farnesol para Candida albicans. A determinação da combinação ideal de Inibidor/AM foi feita através do cruzamento de diferentes concentrações dos compostos, de tal forma que todas as combinações possíveis fossem avaliadas, nas concentrações previamente determinadas através da concentração inibitória mínima. O metabolismo celular para todas as condições experimentais foi avaliado por meio do ensaio de redução do XTT. As combinações onde foram verificadas a redução de 80% no metabolismo foram plaqueadas e a contagem de células (UFC/ml) determinada. Os resultados obtidos permitiram observar que para E. coli, foram necessárias uma dose maior de luz (44 J/cm2) e uma menor concentração de verapamil (215 µg/mL) para que houvesse uma redução de 3,4 log10 (UFC/mL), comparado a S. aureus, que necessitou de uma dose de luz menor (22 J/cm2), e uma maior concentração de verapamil (312 µg/mL), com uma redução de 3,65 log10 (UFC/mL). A concentração de AM foi a mesma para estes resultados. Em C. albicans, foi visto que o verapamil apresentou uma menor redução de células viáveis do biofilme, comparado ao farnesol. A combinação de verapamil/AM que apresentou a maior redução foi 215/400 µg/mL (2,82 log10 (UFC/mL), e para o farnesol 22/200 µg/mL (3,82 log10 (UFC/mL), com a mesma dose de luz de 44 J/cm2. De forma resumida, a aPDT mediada por AM, associada com um inibidor de bomba de efluxo, exibiu uma maior redução no biofilme microbiano, comparado ao grupo em que o inibidor não estava presente.

As bactérias do gênero Aeromonas spp. são considerados como patógenos oportunistas carreadores de múltiplos fatores de virulência. O fenômeno da resistência aos antimicrobianos e metais pesados constitui outro problema, podendo ocorrer por diferentes fatores, dentre eles o uso indiscriminado de agentes antimicrobianos, poluição ambiental e a presença de mecanismos de resistência, como bombas de efluxo, sendo que muitos destes podem ser transmitidos por elementos genéticos móveis como os plasmídeos. O objetivo desse artigo é fazer uma revisão bibliográfica sobre os fatores de virulência, resistência a antimicrobianos e metais pesados, bem como os mecanismos que podem intervir nessa resistência e sua transferência entre bactérias do gênero Aeromonas. Os estudos dos fatores envolvidos no mecanismo de surgimento da resistência, aliado aos estudos de biologia molecular, fornecem subsídios para elaboração de métodos de controle e profilaxia dessas enfermidades de impacto aos organismos aquáticos, seres humanos e meio ambiente. Bacteria from Aeromonas spp. genus are considered as opportunistic pathogens that can carry many virulence factors. The resistance phenomenon to antimicrobial drugs and heavy metals is another problem and may occurs by several factors, as the indiscriminate usage, environmental pollution and the presence of resistance determinants as efflux pumps, being many of them transmitted by genetic mobile elements as plasmid. The purpose of this article is to review about the virulence factors, antimicrobial and heavy metal resistance, as well as the mechanisms that can help its transfer among Aeromonas genus bacteria. Studies of the resistance mechanisms associated to molecular biology could produce information about control and prophylaxis methods to this disease of impact on aquatic organisms, man and environment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Antimicrobial resistance is considered a serious public health problem worldwide and complicates the treatment of infections caused by resistant microorganisms. The carbapenems are antimicrobial agents considered the last resource for treatment of severe infections caused by Klebsiella pneumoniae and the resistance to β-lactams can result in the accumulation of different resistance mechanisms (carbapenemases, efflux pump and loss of porins). This study aimed to evaluate multiple resistance mechanisms in 27 clinical isolates of K. pneumoniae resistant to carbapenems coming from the University Hospital of Santa Maria-RS from July 2013 to August 2014. These isolates were evaluated the susceptibility profiles through broth microdilution against ciprofloxacin, imipenem, ertapenem, meropenem, cefepime, ceftazidime and cefoxitin. Carbapenemase detection was performed through phenotypic tests with combined disc test with phenylboronic acid (AFB) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and Blue-Carba test. In addition, genotypic tests to detect genes enconding carbapenemase were performed. Efflux pump was evaluated by broth microdilution together with efflux pump inhibitor and loss of porins were evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). High levels of resistance verified by the minimum inhibitory concentration (MIC) 50 and 90 for ciprofloxacin (64 and 128μg/mL), imipenem (32 to >128μg/mL), ertapenem (>128 and >128μg/mL), meropenem (128 and >128 μg/mL), cefepime (>128 and >128 μg/mL), ceftazidime (64 and 128μg/mL) and cefoxitin (128 and >128 μg/mL), respectively. In the resistance through carbapenemases production, 89% of the clinical isolates showed blaKPC gene and no clinical isolated showed genes encoding the metallo- β-lactamases. It was observed that the Blue-Carba test and combined disc test with AFB showed 100% concordance, while the combined disc test with EDTA showed high number of false positive (48%) when compared with genotypic test. Four isolates showed phenotypic profile consistent with the presence of efflux pump and all clinical isolates had lost one or both porins, being that in three isolated, this was the only resistance mechanism found. In 14% of the isolates can observe simultaneously observe the presence of three resistance mechanisms. Consequently, it is of fundamental scientific interest that studies are conducted in order to investigate and understand the mechanisms involved in resistance to carbapenems in order to assist strategies of prevention and infection control. A resistência aos antimicrobianos é considerada um grave problema de saúde pública em âmbito mundial e dificulta o tratamento de infecções causadas por microrganismos resistentes. Os carbapenêmicos são os antibacterianos considerados último recurso para o tratamento de infecções graves causadas por Klebsiella pneumoniae e a resistência a esse grupo de β-lactâmicos pode resultar da acumulação de diferentes mecanismos de resistência (carbapenemases, bomba de efluxo e perdas de porinas). Este trabalho teve como objetivo avaliar os múltiplos mecanismos de resistência de 27 isolados clínicos de K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos oriundos do Hospital Universitário de Santa Maria-RS no período de julho de 2013 a agosto de 2014. Foram avaliados os perfis de suscetibilidade desses isolados através de microdiluição em caldo frente aos antimicrobianos ciprofloxacino, imipenem, ertapenem, meropenem, cefepima, ceftazidima e cefoxetina. A detecção de carbapenemases foi realizada através de testes fenotípicos com a utilização do disco de antimicrobiano associado com os inibidores ácido fenilborônico (AFB) e ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e através do teste Blue-Carba. Também foram realizados testes genotípicos para detectar os genes que codificam as carbapenemases. Bombas de efluxo foram avaliadas através de microdiluição em caldo juntamente com inibidor de bomba de efluxo e a perda de porinas foi avaliada pela eletroforese em gel de sulfato de dodecilo de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE). Altos níveis de resistência foram verificados nesses isolados pela concentração inibitória mínima (CIM) 50 e 90 para ciprofloxacino (64 e 128μg/mL), imipenem (32 e >128μg/mL), ertapenem (>128 e >128μg/mL), meropenem (128 e >128 μg/mL), cefepima (>128 e >128μg/mL), ceftazidima (64 e 128μg/mL) e cefoxitina (128 e >128 μg/mL), respectivamente. Na resistência através da produção de carbapenemases, 89% dos isolados apresentaram o gene blaKPC e nenhum isolado apresentou genes que codificam as metalo-β-lactamases. Foi observado que os testes Blue-Carba e disco combinado com AFB apresentaram 100% de concordância, enquanto o teste de disco combinado com EDTA apresentou elevado número de falso-positivos (48%) quando comparados com o teste genotípico. Quatro isolados apresentaram perfil fenotípico compatível com a presença de bomba de efluxo e todos os isolados apresentaram perda de uma ou ambas porinas, sendo que em três isolados, esse foi o único mecanismo de resistência encontrado. Em 14% dos isolados pode-se observar concomitantemente a presença dos três mecanismos de resistência. Devido ao exposto, é de fundamental interesse científico que estudos sejam realizados para investigar e compreender os mecanismos envolvidos na resistência aos carbapenêmicos, a fim de auxiliar em estratégias de prevenção e controle de infecção.

Foi investigada a ocorrência de genes de resistência a quinolonas (qnrA, qnrB e qnrS), a presença de mutações em gyrA, gyrB e parC, a expressão de bombas de efluxo (acrB e acrF) e mutações no gene ramR, como também foi avaliado alterações ultraestruturais provocadas pela polimixina B, meropenem e pela associação entre polimixina B e meropenem em isolados de Klebsiella pneumoniae portadores de blaKPC-2 provenientes de infecção e colonização, em pacientes de hospitais de Recife-PE, Brasil. Trinta isolados de K. pneumoniae foram selecionados para este estudo, destes, seis isolados foram selecionados para seqüenciamento de DNA e dois foram selecionados para detecção de alterações ultraestruturais. A detecção dos genes qnr, acrB e acrF foram realizadas por PCR seguidas por sequenciamento de DNA. As mutações em ramR e nas QRDRs de gyrA, gyrB e parC foram detectadas por sequenciamento, a expressão das bombas de efluxo foi determinada por RT-PCR e as alterações ultraestruturais foram detectadas por microscopia eletrônica de transmissão e varredura. Dos isolados analisados, 73,3% (n=22) apresentaram o gene qnrB, sendo detectadas por seqüenciamento as variantes qnrB1 e qnrB12. Esse é o primeiro relato publicado da presença de genes qnrB1 e qnrB12 com blaKPC-2 em K. pneumoniae, como também o primeiro relato mundial da presença do gene qnrB12 em K. pneumoniae. Foram observadas mutações em gyrA S83 em dois isolados e mutação em ramR em um isolado. Todos os isolados apresentaram genes para as bombas de efluxo acrB e acrF. A RT-PCR realizada mostrou que as bombas estavam sendo expressas. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante para meropenem, a análsie de microscopia eletrônica mostrou que os isolados apresentaram alterações morfológicas, retração do material citoplasmático, incapacidade de divisão celular, rompimento da parede celular e extravasamento do conteúdo citoplasmático. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de polimixina B os isolados apresentaram perda de membrana celular, retração do material citoplasmático, extravasamento do conteúdo citoplasmático e presença de compartimento membranares. Quando submetidos à concentração clinicamente relevante de meropenem associado com polimixina B, os isolados apresentaram uma maior intensidade das alterações ultraestruturais visualizadas. Portanto, foi observada uma maior alteração celular quando os isolados eram submetidos à associação de meropenem e polimixina. Os resultados obtidos são preocupantes porque foram detectados isolados de K. pneumoniae portadores do gene blaKPC-2, qnrB, mutação em gyrA, expressão de bombas de efluxo acrB e acrF e mutação em ramR, infectando e colonizando pacientes, podendo ser importantes reservatórios para disseminação de diversos mecanismos de resistência no ambiente hospitalar.

The Genus Pilosocereus belonging to the Cactaceae family stands out for having the highest number of species, being 35 species distributed from Mexico to Paraguay, being Brazil the country with the greatest number of species distributed among different environments, including caatingas, salt marshes and rocky fields. The species Pilosocereus pachycladus F.RITTER, popularly known as "Facheiro" is used in folk medicine against prostate inflammation. The pioneer phytochemical study of this specie led to the isolation and identification of twelve substances which are: an alcohol (decanol), two fatty acids (palmitic acid and Pp-8b), two porphyrinic substances (Phaeophytin a and Phaeophytin a hydroxylated), five steroids (β -sitosterol, stigmasterol, ergosterol, glycosylated β-sitosterol and glycosylated stigmasterol), a phenolic aldehyde (syringaldehyde) and a phenolic acid (p-hydroxyphenylacetic acid); two substances are unprecedented in Cactaceae family and nine new in Pilosocereus genre. An microbiological assessment of specie Pilosocereus pachycladus against strains of bacteria and fungi showed no antimicrobial activity directly but a complementary study for inhibition of efflux pump found that this specie may act as a source of natural products that modulate multidrug resistance in bacteria and substance identified as syringaldehyde (Pp-6) can served as a promising molecule to enhance the antibiotic activity against the efflux pump. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O gênero Pilosocereus pertencente à família Cactaceae se destaca por possuir o maior número de espécies, com 35 exemplares distribuídos desde o México até o Paraguai, sendo o Brasil o país com o maior número de espécies distribuídas em diferentes ambientes, incluindo caatingas, restingas e campos rupestres. A espécie Pilosocereus pachycladus F. RITTER, conhecido como "Facheiro", é utilizada pela medicina popular contra inflamação prostática. O estudo fitoquímico pioneiro desta espécie levou ao isolamento e identificação de doze substâncias sendo elas: um álcool (decanol), dois ácidos graxos (ácido palmítico e Pp-8b), duas substâncias porfirínicas (feofitina a e feofitina a hidroxilada), cinco esteroides (β-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, β-sitosterol glicosilado, stigmasterol glicosilado), um aldeído fenólico (Siringaldeído) e um ácido fenólico (ácido p-hidroxifenilacético); duas sustâncias são inéditas na família Cactaceae e nove inéditas no gênero Pilosocereus. Uma avaliação microbiológica da espécie P. pachycladus frente a cepas de bactérias e fungos não revelou atividade antimicrobiana direta porém um estudo complementar frente a inibição da bomba de efluxo revelou que esta espécie poderá atuar como uma fonte de produtos naturais que modulam a resistência bacteriana a múltiplas drogas e a substância identificada como Siringaldeído (Pp-6) atuou como molécula promissora para potencializar a atividade antibiótica frente à bomba de efluxo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The high occurrence of Campylobacter spp. in chicken meat and by- products and their increasing antimicrobial resistance have worried public health authorities worldwide. The objectives of this study were to evaluate the Campylobacter contamination in chicken carcasses and antimicrobial resistance of the isolates, as well as to investigate the resistance-modifying and efflux inhibitory activities of plant extract against this microorganism. A total of 95 chicken carcasses from slaughterhouses from Minas Gerais Brazil were analyzed by most probable number method (MPN) associated with subsequent confirmation by polymerase chain reaction (PCR). The isolates were screened for antimicrobial resistance by agar diffusion disk method, and the main genes and mechanisms of resistance were investigated. Twenty ethanolic extracts of plants were tested for antimicrobial, resistance-modifying and accumulation of ethidium bromide activities. The major classes of secondary metabolites in the plant extracts showing biological activities were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). Campylobacter spp. was found in 16.8% of samples with microbial load ranging from 60.0 to 184 MPN/carcass, and C. jejuni was the species most prevalent (93.8 %). The isolates were resistant to at least 5 (31.2 %) of the antimicrobial agents tested, and high resistance rates were observed for cephalosporins (75 - 100 %), quinolones (95 %), tetracycline (50 %) and ampicillin (45 %). Ciprofloxacin resistance proved to be caused by mutation in the gyrA gene, whereas 40 % of the tetracycline resistance was explained by presence of the tet(O) gene. The blaOXA-61 gene, which encodes for a β-lactamase, was found in both resistant and susceptible isolates for ampicillin. Almost all isolates showed the three genes required to synthesize the CmeABC efflux system. The use of phenylalanine-arginine β-naphthylamide (PAβN), a well-known efflux pump inhibitor, decreased the MIC of ciprofloxacin, tetracycline, ampicillin and bile salts by 2 to 8 fold confirming the activity of this resistance mechanism. These extracts showed weak antimicrobial activity comparing to antibiotics, with MIC values ranging from 0.1 to >16.38 mg/mL. However, most of them showed synergistic effects on combining with bile salts when used at subinhibitory concentration, decreasing 2 to 16 fold the MIC values of these antimicrobials. We observed that ten plant extracts increased the accumulation of ethidium bromide in the Campylobacter cells, suggesting inhibition of efflux systems. The extracts of Alpinia zerumbet and Vernonia polyanthes showed greater synergistic effect on combining with bile salts, whereas extracts of Cyperus rotundus and Struthanthus flexicaulis were more effective in inhibiting the efflux systems. Great variety of complex phenolic compounds, including flavonoids, was observed in these plant extracts, which may be involved in the biological activities. Despite low number of chicken carcasses positive for Campylobacter spp. observed in this study, identification of high levels of antimicrobial resistance is an important problem and emphasizes the need for continuous monitoring and new ways to control this pathogen in the poultry production chain. The results reported here suggest that plant extracts may be used to control Campylobacter spp. in chicken and by- products by reducing of the poultry colonization. Nevertheless, future studies are required for more detailed characterization of plant extracts, isolation and identification of active principles, as well as to evaluate activity of these plant extracts in vivo. A elevada ocorrência de Campylobacter spp. em carne e subprodutos de frango e sua crescente resistência a antimicrobianos têm preocupado as autoridades sanitárias em todo o mundo. Os objetivos deste estudo foram avaliar a contaminação de carcaças de frango por Campylobacter spp. e a resistência a antimicrobianos dos isolados; bem como investigar a capacidade de extratos vegetais em modular a atividade de antimicrobianos e de inibir os sistemas de efluxo expressos por este micro-organismo. Noventa e cinco carcaças de frangos abatidos em Minas Gerais Brasil foram analisadas por meio da técnica de Número Mais Provável (NMP) com confirmação pela reação de polimerase em cadeia (PCR). Os isolados foram submetidos ao teste de resistência a antimicrobianos por disco de difusão em ágar, e os principais genes e mecanismos de resistência foram investigados. Vinte extratos vegetais etanólicos foram avaliados quanto às atividades antimicrobiana, moduladora de resistência e de acumulação de brometo de etídeo. As principais classes de metabólitos secundários de extratos vegetais com maior atividade biológica foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Campylobacter spp. foi identificado em 16,8 % das amostras, as contagens variaram entre 60,0 - 184 NMP/carcaça, e a espécie C. jejuni foi prevalente (93.8 %). Os isolados foram resistentes a no mínimo cinco (31,2 %) dos antimicrobianos testados e maior resistência foi observada para cefalosporinas (75 - 100 %), quinolonas (95 %), tetraciclina (50 %) e ampicilina (45 %). A resistência a ciprofloxacina foi associada a mutações no gene gyrA, enquanto que 40 % da resistência à tetraciclina foi relacionada à presença do gene tet(O). O gene blaOXA-61, que codifica uma β-lactamase, foi encontrado em isolados resistentes e suscetíveis a ampicilina. A maioria dos isolados apresentou os três genes do sistema de efluxo CmeABC. O uso de fenilalanina-arginil- naftilamida (PAβN), um inibidor de sistemas de efluxo, diminuiu a MIC de ciprofloxacina, tetraciclina, ampicilina e sais biliares entre 2 e 128 vezes, o que confirmou a atividade deste mecanismo de resistência. Os extratos vegetais apresentaram fraca atividade antimicrobiana em comparação com os antibióticos, com a MIC variando entre 0,1 e >16,38 mg/mL. Entretanto, a maioria deles apresentou sinergismo em combinação com sais biliares quando utilizados em concentrações subinibitórias, com diminuição da MIC destes antimicrobianos entre 2 e 16 vezes. Observou-se que dez extratos vegetais aumentaram a acumulação de brometo de etídeo por Campylobacter spp., o que indica a inibição de sistemas de efluxo. Os extratos de Alpinia zerumbet e Vernonia polyanthes apresentaram maior efeito sinérgico com sais biliares, enquanto que os extratos de Cyperus rotundus e Struthanthus flexicaulis foram mais eficazes na inibição dos sistemas de efluxo. Grande variedade de compostos fenólicos, principalmente flavonóides, foi observada nestes extratos vegetais, os quais podem estar envolvidos nas atividades biológicas. Apesar do baixo número de carcaças de frango positivas para Campylobacter spp. observado neste estudo, a identificação de altos níveis de resistência a antimicrobianos é um importante problema e enfatiza a necessidade de monitoramento contínuo e de novas formas de controle deste patógeno na cadeia produtiva de aves. Os resultados aqui reportados sugerem que extratos vegetais podem ser utilizados para controlar Campylobacter spp. em carne de frango e subprodutos por meio da redução da colonização das aves. Contudo, existe a necessidade de trabalhos futuros para caracterização mais detalhada dos extratos vegetais, isolamento e identificação dos princípios ativos, bem como estudos para avaliar sua atividade in vivo.

A colibacilose, causada por Escherichia coli, é a enfermidade entérica de maior impacto na produção de suínos, podendo levar à morte do animal. Esta bactéria possui grande capacidade de desenvolver resistência a múltiplos antimicrobianos e a desinfetantes. Desta forma, estudos que abordem mecanismos de resistência e perfil de amostras de campo tornam-se necessários. E. coli é amplamente utilizada como modelo de estudos que exploram a resistência intrínseca e extrínseca a multidrogas. Neste trabalho, buscou-se verificar o perfil de sensibilidade de 62 isolados de E. coli de suínos frente a três desinfetantes e a 13 antimicrobianos. Ainda, em 31 destes isolados foi pesquisada a presença de mecanismo de efluxo. Dos três desinfetantes avaliados, o cloreto de alquil dimetil benzil amônio+poliexietilenonilfenileter foi o que se mostrou mais eficaz (100%), seguido do glutaraldeído+cloreto de alquil dimetil benzil amônio (95,2%) e do cloreto de alquil dimetil benzil amônio (88,8%). Dentre os antimicrobianos testados, observou-se maior resistência para a tetraciclina (62,2%) e maior sensibilidade para o florfenicol (88,6%). A alta sensibilidade dos isolados frente aos desinfetantes pode estar relacionada à ausência de mecanismo de efluxo. O índice de resistência múltipla médio aos antimicrobianos foi de 0,52, o que demonstra um perfil multirresistente dos isolados, conduzindo para a necessidade do uso racional destas drogas em suinocultura. Colibacillosis caused by Escherichia coli is the most important enteric disease in pig production, which may lead to death of the affected animal. The bacterium has a great ability to develop resistance to multiple antibiotics and disinfectants. Thus, investigation addressing mechanisms of resistance and profile of field samples is necessary. E. coli is widely used as a model for studies that explore the intrinsic and extrinsic resistance to multidrugs. In this paper, we attempt to associate the susceptibility profile of 62 isolates of E. coli to three disinfectants and 13 antimicrobials. Also 31 isolates were tested for the presence of efflux mechanism. Of the three disinfectants tested, alkyldimethylbenzylammonium chloride+nonyl phenoxy polyethoxy ethanol was the most effective (100%), followed by glutaraldehyde+alkyldimethylbenzylammonium chloride (95.2%) and alkyldimethylbenzylammonium chloride (88.8%). Among the antimicrobials tested, there was greater resistance to tetracycline (62.2%) and higher sensitivity to florfenicol (88.6%). The high sensitivity of the isolates against disinfectants may be related to the absence of efflux mechanism. The average index of multiple resistance to antimicrobials was 0.52, what demonstrates a profile of multidrug resistant isolates, showing the need for rational use of these drugs in pig production.

The study aimed to determine the antimicrobial resistance patterns and to identify molecular resistance markers in Staphylococcus spp. (n=210) isolated from small ruminant mastitis in Brazil. The antimicrobial resistance patterns were evaluated by the disk diffusion test and by detection of the presence of mecA, blaZ, ermA, ermB, ermC and msrA genes by PCR. The efflux pump test was performed using ethidium bromide and biofilm production was determined by Congo red agar test along with PCR for detection of the icaD gene. The isolates were most resistant to amoxicillin (50.0%), streptomycin (42.8%), tetracycline (40.4%), lincomycin (39.0%) and erythromycin (33.8%). Pan-susceptibility to all tested drugs was observed in 71 (33.8%) isolates and 41 Staphylococcus isolates were positive for the efflux pump. Although phenotypic resistance to oxacillin was observed in 12.8% of the isolates, none harbored the mecA gene. However, 45.7% of the isolates harbored blaZ indicating that beta-lactamase production was the main mechanism associated with staphylococci resistance to beta-lactams in the present study. The other determinants of resistance to antimicrobial agents ermA, ermB, ermC, and msrA were observed in 1.4%, 10.4%, 16.2%, and 0.9% of the isolates, respectively. In addition, the icaD gen was detected in 32.9% of the isolates. Seventy three isolates (54 from goats and 19 from sheep) were negative for all resistance genes tested and 69 isolates presented two or more resistance genes. Association among blaZ, ermA, ermB, ermC and efflux pump were observed in 17 isolates, 14 of which originated from goats and three from sheep. The data obtained in this study show the resistance of the isolates to beta-lactamics, which may be associated with the use of antimicrobial drugs without veterinary control. O presente trabalho teve como objetivo determinar os padrões de resistência a agentes antimicrobianos e identificar marcadores moleculares de resistência em Staphylococcus spp. (n=210) isolados de mastite de pequenos ruminantes no Brasil. Os padrões de resistência a agentes antimicrobianos foram avaliados pelo teste de difusão em disco e pela detecção da presença dos genes mecA, blaZ, ermA, ermB, ermC e msrA via PCR. O teste da bomba de efluxo foi realizado utilizando brometo de etídio e a produção de biofime foi determinada pelo teste do vermelho congo em paralelo com o PCR para detecção do gene icaD. Os isolados foram mais resistentes a amoxicilina (50,0%), estreptomicina (42,8%), tetraciclina (40,4%), lincomicina (39,0%) e eritromicina (33,8%). Setenta e um (33,8%) isolados foram sensíveis a todas as drogas testadas e 41 foram positivos para a bomba de efluxo. Embora a resistência fenotípica a oxacilina tenha sido observada observada em 12,8% dos isolados, nenhum possuiu o gene mecA. Entretanto, 45,7% dos isolados continham a gene blaZ, indicando que a produção de beta-lactamases foi o principal mecanismo associado com a resistência dos Staphylococcus aos beta-lactâmicos. Os outros determinantes de resistência a agentes antimicrobianos ermA, ermb, ermC e msrA foram observados em 1,4%, 10,4%, 16,2% e 0,9% dos isolados respectivamente. Além disso, o gene icaD foi detectado em 32,9% dos isolados. Setenta e três isolados (54 de cabras e 19 de ovelhas) foram negativos para todos os genes de resistência testados e 69 isolados apresentaram dois ou mais genes de resistência. A associação entre blaZ, ermA, ermB, ermC e bomba de efluxo foi observada em 17 isolados dos quais 14 eram oriundos de cabras e três de ovelhas. Os dados obtidos no presente estudo indicam a resistência dos isolados aos beta-lactâmicos, o que pode estar associado ao uso sem controle veterinário destas drogas nos animais.