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The US is the world's largest seafood importer by value, with an increasing share of imports composed of farmed seafood. Despite numerous policy initiatives, production and growth in the US aquaculture sector is limited, and there is a significant literature discussing potential explanations. In this paper the recent success of imported branzino is used to show that the market is not a constraint. Branzino is a portion-sized white-fleshed fish primarily farmed in the Mediterranean, with no obvious equivalents produced in the US. Since the turn of the century, imports have grown from zero to almost 10,000 metric tons, a quantity that would have made it the fourthlargest farmed fish species if produced in the US, and all is imported fresh. From 2015 when the quantities became more significant, the species entered the large whitefish market, although with a significant price premium relative to tilapia, the largest species in this market, indicating that the opportunity to create separate niches in the seafood market is limited. Financial support from NOAA (NA21OAR4170091 and NA21OAR4170093), USDA Hatch project number 1015617, Horizon 2020 project MedAID (GA number 727315), and Florida Sea Grant is acknowledged. The conclusions are those of the researcher( s) and do not necessarily reflect the views of the funding organizations.

The purpose of the work performed during the preparation of this thesis was to provide a better knowledge on fish mucosal immunity and immune responses in a marine fish model (European sea bass) against a pathogenic virus (Betanodavirus), with a view of developing possible strategies of vaccination. The thesis is developed in seven chapters, the basic terminology has been introduced and defined in Chapter 1. The general aspects of Teleost immunology, basic information of the animal model (European sea bass) and viral encephalopathy and retinopathy (VER) disease were also described. To increase the knowledge of mucosal immunity, some basic cellular aspects typical of T cells like in vitro induction of proliferation by lectins and expression of T cell-related genes during proliferation were investigated (Chapter 2). GIALT leukocytes were able to proliferate, as measured by CFSE incorporation, in response to ConA and PHA. The proliferation was higher at 48 h and PHA induced higher proliferation with respect to ConA. The mean percentages of cells recognized by both monoclonal antibodies against pan-Tcells (mAb DLT15) and CD45 cells (mAb DLT22) doubled after 48 h of stimulation by lectins. T cells were founded in the epithelium of branchial filaments and transcription was particularly high for TRβ, TRγ and IL-10 followed by CD8, CD45 and CD4, thus confirming that proliferating cells contained T cells. In addition, the cellular characterization of a new polyclonal antibody against sea bass IgT-specific leukocytes was dealt (Chapter 3). IgT-specific leukocytes were labelled by IIF and detected by flow cytometry and fluorescence microscopy. These cells presented dimensions and morphology of leukocytes-type cells and were more abundant in the head kidney than in the spleen or gills. Moreover, a very poor content of soluble IgT was obtained in serum and a high content in mucus. Finally, the immunoprecipitation of IgT-specific leukocytes from head kidney with Dynabeads allowed us to get two fractions, one of them rich in IgT-specific leukocytes and the other rich in IgM-specific leukocytes as verified by RT-PCR. On the other hand, the effects of Betanodavirus immunization on immune responses in sea bass were investigated. First, a capture-based ELISA system that can be used as a tool to investigate and quantify the presence of VERv in biological samples of adult or juveniles sea bass was developed (Chapter 4). In fact, VERv was detected and quantified in brain homogenates of in vivo infected sea bass. This capture-based ELISA system was able to detect different RGNNV strains and can be speculated that is able to detect other genotypes because of the conservation of capsid protein residues and the similarities between genotypes. Subsequently, was performed an experimental approach that consisted of investigate the possibilites of immunizing young sea bass against VERv by means of mucosal (immersion) vaccination employing a formylated Betanodavirus preparation. (Chapter 5). The results of this round of immunisations showed that very few serum antigen-specific IgM can be detected by Indirect ELISA; no in vitro VERv-induced gills leukocyte proliferation can be induced; a modulation in transcription levels of genes coding for Mx and ISG-12 was observed after 24 hours and VERv antigens were detected in the gills by immunohistochemistry. These results shown that a single immersion vaccination without boosting induces a weakly systemic IgM-based immunity in sea bass. The following was to evaluate immune response of sea bass after intraperitoneal and immersion immunization with different vaccines preparations inactivated by using formylation, BPL and temperature (Chapter 6). Interestingly, 30 days post-intraperitoneal immunization with formalin-inactivated VERv a significant antigen-specific IgM titer was detected, at difference with other inactivation protocols. Moreover, the quantitative expression of antiviral genes in gut and head kidney was analyzed and a challenge experiments using live VERv in the IP formalin inactivated group was performed. Mx gene showed a modulation of transcripts on gut after 48 hours and on head kidney after 24 hours post injection. Instead ISG-12 gene was quantitatively expressed after 48 hours on gut and head kidney. Finally, a significant increase (81.9 %) in the relative percentage survival of immunizated fish with respect to un-immunized fish was observed. This result suggest that intraperitoneally vaccination with formalin-inactivated VERv could be a possible candidate vaccine for viral encephalopathy and retinopathy of sea bass. In Chapter 7, features of sea bass mucosal immunity focusing in proliferating mucosal T cells and IgT-specific leukocytes are examined. Also immune responses after mucosal and systemic immunization of sea bass against Betanodavirus are discussed. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di fornire una migliore conoscenza sull'immunità mucosale nei Vertebrati utilizzando pesci Teleostei come modello, tramite lo studio delle risposte immunitarie in un modello di pesci marini (la spigola Europea) nei confronti di un virus patogeno (Betanodavirus), al fine di sviluppare possibili strategie di vaccinazione. L’elaborato è costituito da 7 capitoli, dove, inizialmente viene introdotta e definita la terminologia di base utilizzata (Chapter 1). Sono stati anche descritti gli aspetti generali dell'immunologia dei Teleostei, le informazioni di base del modello animale (spigola europea) e la malattia dell'encefalopatia virale e della retinopatia (VER). Per aumentare la conoscenza dell'immunità mucosale sono stati studiati alcuni aspetti cellulari di base tipici delle cellule T e l'espressione dei geni correlati alle cellule T durante la proliferazione in vitro indotta da lectine (Chapter 2). I leucociti delle branchie, in risposta alle lectine ConA e PHA, sono stati in grado di proliferare, come misurato dall'incorporazione di un colorante vitale. La proliferazione è stata superiore misurata a 48 ore e la PHA ha indotto una maggiore proliferazione rispetto alla ConA. Le percentuali medie di cellule riconosciute da entrambi gli anticorpi monoclonali contro le cellule pan-T (mAb DLT15) e le cellule CD45 (mAb DLT22) sono raddoppiate dopo 48 ore di stimolazione da parte di lectine. Le cellule T sono state indiciduate tramite immunoistochimica nell'epitelio dei filamenti branchiali e la trascrizione è stata particolarmente elevata per TRβ, TRγ e IL-10 seguita da CD8, CD45 e CD4, confermando così che le cellule che proliferano sono cellule T. Inoltre è stata effettuata la caratterizzazione cellulare di un nuovo anticorpo policlonale contro i leucociti IgT-specifici della spigola (Chapter 3). I leucociti IgT-specifici sono stati marcati mediante IIF ed rilevati mediante citometria di flusso e microscopia a fluorescenza. Queste cellule presentano le dimensioni e la morfologia tipiche dei leucociti e sono risultate più abbondanti a livello renale piuttosto che nella milza o nelle branchie. Inoltre, mentre nel siero è stato rilevato un basso contenuto di IgT solubili, nel muco è risultato elevato. Infine, l'immunoprecipitazione di leucociti IgT-specifici a livello renale con Dynabeads ci ha permesso di ottenere due frazioni, una delle quali ricca di leucociti IgT-specifici e l'altra ricca di leucociti IgM specifici, come è stato verificato mediante RT-PCR. Parallelamente, sono stati studiati gli effetti dell'immunizzazione del Betanodavirusv (VERv) sulle risposte immunitarie nelle spigole. Innanzitutto è stato sviluppato un sistema capture-based ELISA che può essere utilizzato come strumento per indagare e quantificare la presenza di VERv in campioni biologici di spigole adulte o giovani (Chapter 4). VERv è stato rilevato e quantificato in omogenati di cervello di spigola infettata in vivo. Questo sistema ELISA è stato in grado di rilevare diversi ceppi RGNNV e si può ipotizzare che sia in grado di rilevare altri genotipi a causa della conservazione dei residui proteici del capside e le somiglianze tra genotipi. Successivamente, è stato eseguito un approccio sperimentale che consiste nell'esaminare le possibilità di immunizzazione della spigola giovane contro VERv attraverso vaccinazione mucosale (immersione), impiegando un preparato di Betanodavirus inattivato con formalina. (Chapter 5). I risultati di questo ciclo di vaccinazioni hanno mostrato che pochissime IgM specifiche possono essere rilevate mediante saggi di ELISA indiretto; in vitro, l’induzione della proliferazione dei linfociti nelle branchie da parte di VERv non può essere indotta; dopo 24 ore è stata osservata una modulazione dei livelli di trascrizione di geni che codificano per Mx e ISG-12 e attraverso l'immunoistochimica sono stati rilevati nelle branchie gli antigeni VERv. Questi risultati hanno dimostrato che una singola immersione della vaccinazione, senza richiamo, induce nella spigola un'immunità sistemica debole. Il passo successivo è stato quello di valutare la risposta immunitaria della spigola Europea dopo dell'immunizzazione intraperitoneale e per immersione con diverse preparazioni di Betanodavirus inattivato in seguito a formilazione, BPL e la temperatura (Chapter 6). È interessante notare che 30 giorni dopo l'immunizzazione intraperitoneale con VERv inattivato con la formalina, è stata rilevata una significativa quantità di IgM specifiche, a differenza degli altri protocolli di inattivazione. Inoltre, è stata analizzata l'espressione quantitativa dei geni antivirali nell'intestino e a livello renale ed è stato fatto un esperimento controllo utilizzando VERv vivo in il gruppo immunizzato intraperitonealmente con virus inattivato con formalina. Il gene Mx ha evidenziato una modulazione nella sua trascrizione nell’intestino dopo 48 ore e a livello renale dopo 24 ore dall'iniezione. Invece, il gene ISG-12 è stato quantitativamente modulato dopo 48 ore, nell'intestino e a livello renale. Infine, è stato osservato un aumento significativo (81,9%) nella sopravvivenza dopo challenge di pesci immunizzati rispetto a pesci non immunizzati. I risultati mostrano che la vaccinazione intraperitoneale con VERv inattivato con formalina potrebbe essere un possibile candidato vaccino per l'encefalopatia virale e la retinopatia della spigola europea. Nel Chapter 7 sono esaminate le caratteristiche dell'immunità mucosale della spigola, focalizzandosi sulla proliferazione mucosale delle cellule T e dei leucociti IgT-specifici. Sono, inoltre, discusse le risposte immunitarie dopo l'immunizzazione mucosale e sistemica della spigola europea contro il Betanodavirus. Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare

A growing consumer awareness of food quality, based on high degree of safety, adequate nutritional value, sustainable production, eco-environmental attention, animal welfare and use of raw materials, has facilitated the spread of the "organic production". Organic aquaculture has lagged behind the organic agriculture sector in terms of quantities and diversity of certified organic products because of the absence of detailed accepted standards and criteria until recently. The main challenges for organic aquaculture are to improve the coordination between production and market and to achieve an appropriate framework to drive further development. In organically cultured fish, differences in feeds and nutrition compared to conventional systems are likely to result in differences in the quality of the flesh, and this is a significant factor in consumer choice. The present study aims at evaluating the growing performances, IGF-I and IGF-II levels, oxidative stress and contaminant markers in European sea bass (Dicentrarchus labrax) fed with organic and conventional diet in field conditions. Growing performances and condition factors showed a positive growing trend in both groups, as evidenced by molecular analyses. IGF-I and IGF-II showed similar levels throughout the whole experimental period confirming their role during growth. A greater productivity in conventional fed fish compared to the organic ones was observed. The higher productivity was likely due to diet composition, since differences were significantly mitigated during starvation period. Fillet analysis of organic sea bass showed a higher content in MUFA and lower in PUFAs n-6 indicating that diets with a content in fatty acids closer to that of wild fish reflect the same fatty acid profile of the flesh. On the other hand, the considered oxidative stress and contaminant markers did not show any significant differences among groups.

L'esposizione umana ai PFC avviene principalmente attraverso la dieta ed in particolar modo il pesce è risultato tra i prodotti alimentari più inquinati. Il perfluorottano sulfonato (PFOS) e l’acido perfluorottanoico (PFOA) sono i composti più importanti e studiati. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di effettuare un monitoraggio preliminare sulla presenza di queste due molecole in 50 campioni di muscolo di branzini, di cui 30 allevati e 20 pescati, prelevati in diverse località italiane del mar Mediterraneo. Il metodo utilizzato prevede un’estrazione con solvente seguita da due passaggi di purificazione: uno con sali ed uno con fase solida dispersiva. L’estratto è stato poi analizzato mediante un sistema UPLC-MS/MS. I dati mostrano ampia contaminazione di questa specie ed evidenziano una netta prevalenza di PFC nei branzini pescati (PFOS da 112,4 ng/L a >2000 ng/L e PFOA da 3,3 ng/L a 487,0 ng/L) rispetto a quelli allevati (PFOS da 11,1 ng/L a 104,5 ng/L e PFOA da

Sažetak Svrha ovog istraživanja bila je usporediti kemijski sastav i količinu teških metala u mesu lubina i komarče iz uzgoja i slobodnog ulova. Ukupno je analizirano 30 uzoraka komarče i 30 uzoraka lubina, konzumne veličine, od čega je polovica uzoraka bila iz uzgoja, a polovica iz slobodnog ulova. Analize kemijskog sastava pokazale su da kod obje vrste ribe postoji statističku značajna razlika u količini vode, bjelančevina, masti i kolagena između jedinki iz ulova i uzgoja. Utvrđena je 4 odnosno 8 puta veća količina masti u mesu uzgojenih jedinki lubina i komarče u odnosu na jedinke iz ulova. Količine teških metala kadmija (Cd) i olova (Pb), kod obje vrste ribe te neovisno o podrijetlu ribe, bile su manje od najvećih dopuštenih količina propisanih hrvatskim i EU pravilnicima. Za razliku od količine Cd i Pb, količina žive (Hg) određena u pojedinim uzorcima obje vrste ribe iz ulova bila je veća od NDK, ukazujući na zdravstvenu neispravnost određenih jedinki. Budući da sadržaj teških metala u mišićnom tkivu riba može varirati u ovisnosti o vrsti, spolu, starosti, godišnjem dobu, načinu prehrane i dostupnosti hrane, u cilju cjelovite procjene potencijalnih opasnosti uslijed konzumacije navedenih vrsta riba potrebno je provesti opsežnije istraživanje, uzimajući u obzir navedene čimbenike., The aim of this research was to compare chemical composition and content of heavy metals in the meat of sea bass and gilt-head sea bream, both in farmed fish and from free fishing. A total of 30 samples of gilt-head sea bream and 30 samples of sea bass of commercial size, out of which half the samples were farmed fish and the other half were from free fishing. Chemical composition analyses have shown that in both kinds of fish there is a statistically significant difference in content of water, protein, fat and collagen between the samples from free fishing and farmed fish. There was determined four times, i.e. eight times higher content of fat in the meat of farmed samples of sea bass and gilt-head sea bream in comparison to samples of farmed fish. Contents of heavy metals, cadmium (Cd) and lead (Pb) with both fish species and regardless of the origin of fish, were lower than the maximum quantities allowed proscribed by Croatian and EU regulations. As opposed to the quantities of Cd and Pb, the quantity of mercury (Hg) determined in certain samples of both fish species from free fishing was higher than maximum quantity allowed, indicating to the fact that some samples were not safe for consumption. Considering the fact that the content of heavy metals in muscle tissue of fish can vary depending on species, sex, age, season, diet and food availability, in the goal of the total assessment of potential dangers due to consummation of the abovementioned fish species, it is necessary to conduct a more detailed research, taking into account the listed factors., Zusammenfassung Der Zweck dieser Untersuchung war, den Vergleich der chemischen Zusammensetzung und der Inhaltsmenge der schweren Metalle im Fleisch von Seebarsch und Goldbrasse aus der Zucht und aus dem freien Fang zu machen. Insgesamt wurden 30 Muster Seebarsch und 30 Muster Goldbrasse von Konsumgröße analysiert, die Hälfte davon war aus der Zucht und die andere Hälfte aus dem freien Fang. Die Analyse der chemischen Zusammensetzung hat gezeigt, dass bei beiden Fischsorten ein statistisch bedeutender Unterschied hinsichtlich Wassermenge, Eiweißstoffe, Fette und Collagen bei dem Fisch aus der Zucht und aus dem freien Fang besteht. Es wurde für beide Sorten eine 4 bis 8 Mal größere Fettmenge im Fleisch von Fischen aus der Zucht als im Fleisch von Fischen aus dem freien Fang festgestellt. Die Menge von Schwermetallen Kadmium (Cd) und Blei (Pb) war bei beiden Sorten niedriger als die kroatischen und die EU Vorschriften als Größtmenge vorschreiben, u.zw. ohne Rücksicht darauf, ob die Fische aus der Zucht oder aus dem freien Fang stammten. Zum Unterschied von Cd und Pb Mengen, war die festgestellte Quecksilbermenge (Hg) in manchen Mustern beider Fischsorten aus dem Fang größer als NDK, was auf die gesundheitliche Unrichtigkeit einiger Einzelfische hinweist. Da der Inhalt von Schwermetallen im Muskelgewebe der Fische variieren kann, u.zw. in Bezug auf Sorte, Geschlecht, Alter, Jahreszeit, Nahrung und Nahrungszugänglichkeit, ist es nötig bei angeführten Fischssorten umfangreiche Untersuchungen durchzuführen. Dies erweist sich als Schlußfolgerung wegen der potentiellen Gefahren hinsichtlich des Konsums der angeführten Fischsorten., Sommario Lo scopo di questa ricerca era paragonare la composizione chimica e la quantità di metalli pesanti nella carne di orata e quella di branzino dall'allevamento e dalla pesca libera. Sono stati analizzati 30 campioni di branzino e 30 campioni di orata, di misura consumo, la metà delle quali proveniva dall'allevamento e l'altra dalla pesca libera. Le analisi del contenuto chimico hanno mostrato che da tutti i due i tipi di pesce c'era una notevole differenza in statistica nella quantità dell'acqua, delle proteine, dei grassi e del collagene tra le entità dalla pesca e quelle dall'allevamento. È stata rivelata da 4 a 8 volte maggiore quantità dei grassi nella carne delle entità d'orata e branzino dall'allevamento rispetto alle entità dalla pesca. Le quantità di metalli pesanti, il cadmio (Cd) e il piombo (Pb), da ambedue tipi di pesce, e indipendentemente dalla loro provenienza, erano minori dalle quantità massime consentite prescritte nei regolamenti croati e dell'Unione europea. A differenza della quantità del cadmio e del piombo, la quantità del mercurio (Hg) determinata in certi campioni di tutte e due i tipi di pesce dall'allevamento era maggiore della quantità massima consentita, e questo vuol dire che certe entità non erano conformi alla sicurezza sanitaria. Siccome il contenuto di metalli pesanti nel tessuto muscolare può variare rispetto al tipo, sesso, età, stagione, regime alimentare e del cibo accessibile, bisogna fare degli studi più dettagliati che, allo scopo di valutazione del pericolo potenziale del consumo di branzino e orata, prenderanno in considerazione i suddetti indicatori.

Le micobatteriosi ittiche sono patologie studiate sia per il loro riscontro nell’allevamento intensivo, sia in quanto zoonosi. Di esse esistono modelli sperimentali creati per inoculazione parenterale. E’ stato messo a punto un modello di infezione “per immersione” in branzini utilizzando il M. fortuitum con l’obiettivo di riprodurre una situazione spontanea ed individuare la via di entrata. Due gruppi di branzini di 10g sono stati tenuti, per due ore, in due sospensioni di M. fortuitum contenenti rispettivamente 102 germi/ml e 105germi/ml, un terzo gruppo è stato utilizzato come controllo. Soggetti per ogni gruppo sono stati prelevati a 16 e 24 ore p.i., quindi giornalmente per i successivi 6 giorni ed infine settimanalmente per 9 settimane per l’indagine istologica e batteriologica. Per l’istologia i soggetti venivano fissati in toto in formalina tamponata 10%. Sono stati osservati complessivamente 39 soggetti “esposti” e 9 controlli. Dagli organi (cute, branchie, occhio, intestino, fegato, rene, peritoneo, milza) dei soggetti fissati in formalina sono state allestite sezioni istologiche seriate colorate poi con ematossilina-eosina, Ziehl-Neelsen e con metodica immunoistochimica (IHC) impiegante l’anticorpo policlonale anti-Mycobacterium bovis (Dako) diluito1:3000 con rivelazione medinte sistema Kit LSAB perossidasi (Dako). Mentre l’esame batteriologico ha dato positività solo dalla quarta settimana p.i., l’istologia ha mostrato lesioni già a partire dalla I settimana p.i.. La lesione riscontrata era un granuloma, da singolo e focale a multiplo e confluente, inizialmente caratterizzato dall’accumulo di aggregati nodulari di istiociti e rari linfociti alla periferia. In seguito mostrava necrosi di singole cellule che con il progredire della lesione tendeva a coinvolgere tutta la porzione centrale. Lesioni granulomatose specifiche, con presenza di acido-resistenti e di positività specifica con l’IHC, sono state riscontrate, in ordine di frequenza decrescente, nelle branchie, milza, rene anteriore, fegato e peritoneo. In 15 soggetti su 39 osservati (38,46%) le branchie mostravano lesioni così distribuite: in 10 casi alla base delle lamelle e nello stroma della lamella primaria; in 1 solo caso lo stroma della lamella primaria; in 4 casi solo la base delle lamelle. Altri siti, quali tratto anteriore e tratto posteriore dell’intestino, cute a livello di linea laterale e occhio, campionati come le branchie per valutare le possibili vie di entrata, non hanno mostrato lesioni specifiche. Il modello sperimentale ha riprodotto la malattia e, circa le possibili vie di entrata, i risultati sembrerebbero indicare nelle branchie la prima sede di replicazione batterica riconoscendo a questo organo un ruolo importante come “porta” di entrata per il micobatterio.

Summary Twenty-eight polymorphic microsatellites were isolated from the sea bass, Dicentrarchus labrax, using a microsatellite enrichment protocol and selective hybridization with oligonucleotide probes. Analysis for these markers and 11 recently described microsatellites of D. labrax found linkage between 26 loci and revealed eight linkage groups.