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In un recente articolo ci siamo occupati di una nuova virosi su menta piperita (Mentha piperita L.) (Lamiaceae), una delle piante aromatiche più coltivate e note ovunque nel mondo per i suoi molteplici utilizzi. La malattia, consistente in un vistoso “mosaico giallo-oro” sulle foglie (con successiva necrosi del lembo), è stata individuata per la prima volta nel 2012, nel corso di un monitoraggio eseguito in aziende della Piana di Albenga (Savona); e poi ancora, nella stessa area, nel 2013. Le indagini virologiche, conclusesi nel 2016, hanno portato all’identificazione per la prima volta in questa lamiacea di un Hordeivirus: LRSV (Lychnis ringspot virus, virus della maculatura anulare del licnide), costituito da particelle rigide, a “bastoncello”, di cui non sono noti i vettori naturali, la cui diffusione in natura avviene per contatto (tra individui infetti e sani) e per seme (e/o polline). Scopo della Ricerca - LRSV era già stato individuato nel 1972 in M. longifolia in Ungheria (isolato virale indicato come “mentha strain”: “ceppo menta”) (LRSV-M) Data la gravità della malattia riscontrata in Liguria ed il suo ripetersi nel tempo, e considerando che LRSV è stato individuato in Lychins in California (USA) all’interno di semi (d’importazione europea), si è ipotizzato che all’origine delle infezioni verificatesi ad Albenga potrebbe esserci proprio l’utilizzo di seme già infetto (raccolto, ad esempio, da piante-madri i cui fiori sono stati fecondati da polline contenente il virus). Si è quindi è deciso di verificare questa supposizione. Prova sperimentale - Nel 2015, alcune piante di menta sintomatiche (infette da LRSV), provenienti da Albenga, sono state trapiantate all’aperto (nella zona di Portici, Napoli) e monitorate fino alla fioritura. (Da notare che, nello stesso anno, accanto ad esse, sono nati dal seme caduto nel terreno, alcuni nuovi esemplari che evidenziavano sulle foglie “mosaico giallo-oro”). Si è quindi proceduto (sempre nel 2015) con la raccolta, dalle piante originali, del seme che è stato inviato al Plesso Serricolo Scarabelli (Università di Bologna) per verificarne, nel 2016, lo stato sanitario. Esecuzione della prova La prima fase della sperimentazione (marzo) è consistita nell’organizzare i materiali per la semina. Sono state predisposte 8 seminiere composte ciascuna da 8 settori con 12 alveoli l'uno. Germinabilità. La prima conta delle piantine nate, eseguita dopo circa 2 mesi e mezzo (maggio) dall’inizio della sperimentazione, ha fornito i seguenti risultati: “Albenga” = 192/1000 (19,2%), “Prima ditta” = 78/192 (40,6%), “Seconda ditta” = 110/192 (57,3%). Con la seconda conta si è ottenuto il seguente risultato: “Albenga” = 203/1000 (20,3%), “Prima ditta” = 78/192 (40,6%), “Seconda ditta” = 110/192 (57,3%). La terza ed ultima conta (giugno) ha confermato i dati raccolti in quella precedente. Diagnosi. Le inoculazioni meccaniche eseguite con tutte le piantine di menta sintomatiche “A” e “Pd” hanno permesso di osservare sintomi locali e sistemici sulle solanacee (mosaico clorotico su tabacco). Le analisi RT-PCR utilizzando "primers" specifici per LRSV hanno dato esito positivo. Le prove di trasmissione meccanica dalle piantine asintomatiche hanno dato esito negativo.

La stevia (Stevia rebaudiana Bertoni) è una pianta erbacea perenne appartenente alla famiglia delle Asteraceae, nativa del Paraguay. E’ diventata famosa in tutto il mondo da quando, all’inizio degli anni ’70, in Giappone, si capì che poteva costituire non solo una fonte economicamente importante di zucchero (ne contiene il 30% in più rispetto alla canna da zucchero), ma anche di quella tipologia “poco calorica” quindi capace di sostituire i comuni dolcificanti di sintesi (saccarina, aspartame, ecc.) ed essere preziosa per le persone affette da diabete o con problemi di sovrappeso. Attualmente, i maggiori produttori mondiali di stevia sono: Giappone, Cina, Taiwan, Tailandia e Corea. Non a caso, in Liguria, nella Piana di Albenga, i produttori di aromatiche hanno inserito la stevia nella loro già vasta offerta, in modo da accontentare quei consumatori desiderosi di inserire una pianta famosa e “dietetica” in giardino. - Malattie. Dal punto di vista fitosanitario, occorre innanzitutto prevenire le malattie fungine più comuni (marciumi radicali, avvizzimenti, maculature fogliari, muffa grigia, ecc.), e quelle maggiormente specifiche di questa asteracea, come Septoria steviae e Sclerotinia rolfsii, segnalate in USA, India ed anche in Italia (Kamalakannan et al. 2007; Koehler and Shew 2014; Carrieri et al. 2015). Per quanto riguarda le malattie ad eziologia virale, fortunatamente i casi a livello mondiale sono pochi: CMV (virus del mosaico del cetriolo) individuato nel 2016 in Spagna in piante di taglia ridotta e con mosaico fogliare; TSWV (virus dell’ avvizzimento maculato del pomodoro) riscontrato in USA nel 2014 e in Grecia nel 2006 Per quanto riguarda le infezioni ad eziologia virale in Italia, nel 2011, durante sopralluoghi eseguiti nella serra del Giardino delle Erbe di Casola Valsenio (Ravenna) furono individuate alcune piante cresciute in vaso, caratterizzate da un vistoso mosaico clorotico sulle foglie. Ipotizzando la presenza di CMV (trasmesso in natura da afidi) e data la stretta vicinanza con individui ancora asintomatici (anche di altre specie) che avrebbero potuto contrarre l’infezione, si decise di eliminare tempestivamente le stevie con mosaico e non fu quindi possibile identificare il virus coinvolto (M.G.Bellardi, dati personali non pubblicati). Nel 2016, presso un coltivatore di aromatiche della Piana di Albenga sono state individuate stevie in vaso caratterizzate da una sintomatologia molto grave e che ha fatto immediatamente ipotizzare la presenza di un Tospovirus. TSWV su stevia La malattia è stata osservata in un’azienda che aveva acquistato circa 20.000 talee da un rivenditore belga e 3.000 da uno locale. I sintomi sono comparsi nel mese di giugno, 15-20 giorni dopo il trapianto, esclusivamente sulle piante ottenute da talee locali con una percentuale d’infezione di circa il 40%. il virus coinvolto era un isolato di TSWV. A seguito delle inoculazioni meccaniche, il virus è stato trasmesso a diverse solanacee (melanzana, tabacco, peperone, ecc.) ed anche a stevia sana ottenendo, dopo circa una settimana, la medesima sintomatologia osservata ad Albenga. Si tratta della prima segnalazione di un virus su stevia in Italia e, purtroppo, la specie virale coinvolta è TSWV.

La menta piperita (Mentha piperita L.) (Lamiaceae) è certamente una delle piante aromatiche più coltivate per i molteplici utilizzi derivanti dall’olio essenziale costituito prevalentemente da mentolo. Dal punto di vista fitopatologico, mentre per quanto riguarda le malattie fungine che interessano le diverse specie di Mentha le conoscenze sono ampie (tracheomicosi, ruggine, mal bianco, marciumi radicali, ecc.), poco si sa su quelle ad eziologia virale. In Europa, sono note fin da 1968 infezioni da AMV (virus del mosaico dell’erba medica), riscontrato anche in Italia negli anni ‘90 su piante di M. rotundifolia caratterizzate da ampie maculature gialle e/o biancastre sulle foglie; in diversi Paesi del mondo sono stati sporadicamente descritti casi che hanno visto coinvolti: TRSV (virus della maculatura anulare del tabacco), PVX (virus X della patata), i due tospovirus INSV (virus della maculatura necrotica dell’impatiens) e TSWV (virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro) (entrambi in M. peperita), un Geminiviridae (nel 2005 in M. spicata “Viridis” coltivata in Pakistan) ed ancora un Closteroviridae e un Flexiviridae (entrambi nel 2007 in Mentha x gracilis ‘Variegata’, nota come golden ginger mint). Nel 2012, nel corso di un monitoraggio eseguito in aziende della Piana di Albenga, sono state notate piante in vaso cresciute all’aperto di M. piperita caratterizzate da un vistoso “mosaico giallo oro” brillante sulle foglie. La malattia è stata di nuovo riscontrata nella medesima azienda anche nel 2013. In questo caso, oltre al mosaico giallo brillante, le piante mostravano rotture di colore biancastre e, successivamente, una volta trasferite ad Imola, nelle Serre del Plesso Scarabelli (Università di Bologna), necrosi più o meno diffuse sul lembo fogliare. Inizialmente, considerata l’elevata diffusione di AMV negli impianti di orticole, floricole ed aromatiche della zona (su basilico, origano, lavanda e lavandino, rosmarino, peperoncino, erba cedrina, ecc.), si è ipotizzato che la sintomatologia fosse dovuta a questo Bromoviridae, responsabile di “mosaico giallo” sul molte delle specie ospiti naturali, per cui le indagini virologiche sono state condotte per l’individuazione di AMV. Avendo però ottenuto risultati negativi (a seguito dell’applicazione di tecniche sierologiche del tipo ELISA e di biologia molecolare del tipo RT-PCR), si è proseguito con indagini più specifiche per identificare con esattezza la specie virale presente nelle piante sintomatiche di menta piperita. Vengono sinteticamente illustrate le tecniche virologiche applicate che hanno portato all’identificazione per la prima volta in questa lamiacea di un Hordeivirus. LRSV (Lychnis ringspot virus, virus della maculatura anulare del licnide).

Introduzione. Monarda citriodora Cerv. ex Lag. (Lamiaceae) è una pianta aromatica annuale originaria del Nord America, caratterizzata da un gradevole gusto agrumato. Oltre ad essere una piacevole ornamentale (i fiori formano spighe di colore, rosa, azzurro, viola, ecc.) è ricca in olio essenziale (OE) noto, fin dal 1997, per le sue proprietà antimicrobiche in vitro. Scopo. Nel 2015, è stato allestito in Emilia-Romagna un impianto da seme per una valutazione agronomico-colturale. Gli OE distillati da due successive fioriture, ed i rispettivi idrolati (Id), sono stati saggiati in vitro nei confronti di microrganismi patogeni per l’uomo e gli animali; è stata inoltre valutata l’azione citostatica e/o citocida dell’Id vs ceppi fungini biodeteriogeni e cellulosolitici. L’attività antimicrobica è stata messa in relazione con la composizione terpenica e confrontata con quella di Melaleuca alternifolia (tea tree oil-TTO). Materiali e metodi. L’impianto ha dato 3 fioriture (luglio, fine agosto, ottobre); la prima e la seconda hanno fornito una resa (ml/kg) in OE di 10.9% e 4.75% rispettivamente. Gli OE e i corrispondenti Id sono stati sottoposti a GS-MS. Gli OE sono stati testati su 9 ceppi microbici con il test di micro brodo-diluizione, mentre con lo stesso test è stato testato l’Id vs 8 ceppi batterici e 4 muffe; quest’ultime sono state saggiate anche con test di diffusione da pozzetto e micro atmosfera. Risultati. Dal punto di vista colturale, l’impianto non ha mostrato particolari problemi di tipo fitosanitario e le 3 fioriture sono state esuberanti, e capaci di attirare insetti impollinatori. Le due rese in OE sono state maggiori e/o simili a quelle riportate in Letteratura. Dalle analisi in CG-MS è emersa: una maggior concentrazione di composti terpenici negli OE e Id della seconda fioritura; timolo e carvacrolo erano i costituenti principali di tutti i campioni esaminati; gli OE erano caratterizzati anche da un elevato contenuto di -terpinene e p-cymene. L’attività antimicrobica in vitro degli OE delle due fioriture è risultata citocida alle concentrazioni di 0.5% per 8 dei 9 ceppi saggiati con l’eccezione di P. aeruginosa risultato resistente anche alla concentrazione del 4%. L'attività antibatterica in vitro dell'Id nei confronti di 8 stipiti batterici ATCC Gram-positivi e Gram-negativi è in corso di studio. L’Id, è risultato citocida verso tutte le muffe a partire da una diluizione 1:2; inoltre, il test di micro-atmosfera ha evidenziato la capacità delle componenti volatili dell’Id di interferire con la sporulazione di tutte le muffe saggiate poiché questa è risultata drasticamente rallentata. Conclusioni. Gli studi eseguiti confermano M. citriodora ottima specie aromatica ed ornamentale, di facile coltivazione (elevata rusticità) e di rapida crescita, i cui Id e EO possiedono attività in vitro citostatiche e citocide, quest’ultime paragonabili a quelle del TTO.

Nell'ultimo decennio si assiste all'aumento di casi di fitoplasmosi in specie aromatiche da vaso nelle aziende della Piana di Albenga (Savona), derivante soprattutto dalla molteplicità di colture che si trovano in questa area. Ne sono dimostrazione le recenti segnalazioni (2011 e 2012) che hanno interessato esemplari di rosmarino ottenuti talee prelevate da piante-madri coltivate all’interno di aziende produttrici di questo areale: i sintomi consistevano in scopazzi ed arrossamenti fogliari; i fitoplasmi coinvolti appartenevano ai gruppi ribosomici 16SrXII-A (“stolbur”) e 16SrI-B (“aster yellows”). E’ ora la volta del timo (Thymus vulgaris), nota ed importante aromatica da vaso, spesso utilizzata anche come ornamentale in giardino e che, da alcuni anni, è oggetto di particolari attenzioni da parte dell’Area di Patologia Vegetale del Dipartimento di Scienze Agrarie (DipSA; Università di Bologna) per la presenza di fitoplasmi. I primi casi, del tutto sporadici, si sono verificati nel 2008 e poi ancora nel 2009, su piante propagate per talea acquistate da aziende locali di Albenga. La malattia (comparsa in autunno) consisteva in nanismo ed arrossamento degli apici vegetativi; sono stati individuati fitoplasmi diversi, appartenenti del gruppo 16SrX-A agente dello “scopazzo del melo” (‘Candidatus Phytoplasma mali’) ed al gruppo 16SrV-A (“giallume dell’olmo”) (‘Candidatus Phytoplasma ulmi’). Il recente caso verificatosi nel 2014 ci induce ad informare i produttori di timo e di aromatiche in vaso, non solo della Liguria, sul rischio concreto che i fitoplasmi possano diffondersi sempre più nelle coltivazioni, causando danni economici alle produzioni. Sintomatologia Nel mese di dicembre del 2014 sono state inviate dalla Cooperativa L’Ortofrutticola di Albenga alle Serre universitarie del Plesso Serricolo Scarabelli di Imola (Bologna) sei esemplari di timo in vaso, cresciuti ad alberello. Le piante provenivano da un’azienda che aveva realizzato l’impianto con talee prelevate da piante-madri mantenute in loco. Dei sei esemplari quattro erano sintomatici (T.M1; T.M2; T.M3; T.M4) e due asintomatici. La sintomatologia era la medesima per i quattro esemplari analizzati: all'inserzione dei rametti sul fusto era presente un ammasso di radici avventizie di colore arancio-bruno, di consistenza erbacea, che fuoriuscivano dalla corteccia. I rametti erano contorti nella parte basale in corrispondenza delle radici avventizie. La chioma si presentava fitta ed affastellata, con rosettamento apicale. Nel complesso, la pianta era di dimensioni ridotte sia per il volume della chioma che per il diametro del fusto. Il colore delle foglie era verde più chiaro nei due esemplari asintomatici e verde argento e “polverulento” nei timi sintomatici. Materiali e Metodi, Risultati Le piante sono state analizzate nel laboratorio di fitoplasmologia del DipSA. La diagnosi per verificare la presenza di fitoplasmi effettuata mediante saggi molecolari è stata eseguita secondo un procedimento che può essere suddiviso in tre fasi: estrazione del DNA genomico totale del campione da analizzare; amplificazione del DNA del patogeno applicando la tecnica “nested-PCR” con “primers” universali specifici per fitoplasmi; identificazione del gruppo di appartenenza del fitoplasma mediante l’analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP). Due dei quattro campioni sintomatici, T.M1 e T.M3, sono risultati positivi alle analisi di “nested-PCR” ed, a seguito di digestione enzimatica (RFLP) con gli enzimi TruI e Tsp509I, sono risultati infetti da fitoplasmi appartenenti al gruppo ribosomico 16SrI, AY, giallume dell’astro o ‘Candidatus Phytoplasma asteris’. Discussione Il timo, pianta aromatica da vaso o arbustiva è fra le più note ed apprezzate piante officinali nel mondo. La prima considerazione sulla malattia di recente individuata riguarda le analisi di laboratorio, certamente non di “routine” in quanto di tipo molecolare, ma che consento l’identificazione dei fitoplasmi coinvolti. Come accennato, già nel 2008 e nel 2009 in aziende di Albenga erano stati individuati questi procarioti fitopatogeni (la percentuale di piante di timo sintomatiche era del 20%) e, dalle analisi molecolari, era risultata la presenza di fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrX-A (“scopazzo del melo”) (nel 2008) ed al gruppo 16SrV-A (“giallume dell’olmo”) (nel 2009). Dalle analisi relative al caso esposto nelle piante sintomatiche di timo sono risultati presenti non solo fitoplasmi del gruppo del giallume dell’astro, ma anche altri appartenenti a gruppi e sottogruppi diversi. Ciò spiegherebbe, almeno in parte, la differenza fra la sintomatologia riscontrata nel 2008-2009 (arrossamento fogliare e microfillia) e quella delle piante analizzate nel 2014: nanismo della pianta, microfillia e proliferazione di radici dai tralci. Il ritrovamento del fitoplasma AY, del gruppo 16SrI, in timo può essere messo in relazione ai casi del 2011 e 2012 ad Albenga in cui in rosmarino fu verificata la presenza dei medesimi fitoplasmi. Alla luce di questo ulteriore caso su timo e di fronte alla seppur lenta diffusione dei fitoplasmi del giallume dell’astro nella Piana di Albenga, occorre continuare a monitorare le coltivazioni. Fortunatamente, i tecnici responsabili della Cooperativa l’Ortofrutticola sono ben consapevoli della pericolosità delle fitoplasmosi, per cui da ormai diversi anni hanno come punto di riferimento il DipSA dell’Università di Bologna e gli esperti di fitoplasmosi (e virosi) che vi operano. A loro, costantemente, inviano campioni di specie aromatiche ed ornamentali con sintomatologie sospette ed in questo modo riescono ad eseguire dei monitoraggi efficaci (non basati sulla sola sintomatologia che sovente non è diagnostica) sulle culture in atto. In base ai risultati delle analisi sui campioni sintomatici inviati, è infatti possibile poi effettuare interventi mirati. Purtroppo, nonostante gli sforzi continui, questi interventi non sono mai risolutivi e ogni anno si allunga la lista di “nuovi” ospiti naturali di fitoplasmi in questa area. Fra gli interventi indicati, primo fra tutti è l’eliminazione tempestiva delle piante sintomatiche insieme all’utilizzo di materiale di propagazione sano. Nel caso di propagazione agamica, come avviene per il timo ed il rosmarino, le talee vanno prelevate da piante-madri controllate dal punto di vista fitosanitario. E’ questo uno dei punti chiave per la prevenzione dalle fitoplasmosi, anche perchè è ormai prassi comune fra i produttori liguri mantenere per molti anni le piante-madri di aromatiche arbustive nelle immediate vicinanze dell’azienda e da queste prelevare le talee per la propagazione. In questo modo, però, le piante-madri sono soggette ad ogni tipo di avversità, fitoplasmosi incluse, ed il rischio che le talee prelevate siano già infette (sovente in maniera latente) è molto elevato. La prevenzione è quindi alla base della buona riuscita di qualsiasi impianto, sia ornamentale che aromatico, soprattutto nel caso di malattie non curabili come le fitoplasmosi.

I Tospovirus (famiglia Bunyaviridae) costituiscono un gruppo di virus estremamente pericolosi in tutto il mondo, il cui capostipite (TSWV: virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro) è purtroppo assai noto ai coltivatori liguri (e non solo) di orticole, aromatiche ed ornamentali. Di TSWV (e di INSV, virus della maculatura necrotica dell’impatiens) ci siamo ampiamente occupati in questi ultimi anni; basti citare le recenti segnalazioni su specie ornamentali (Iberis semperflorens, Lupinus spp., Stephanotis floribunda, Arctotis x hybrida, ciclamino, calla bianca, ecc.) caratterizzate da gravi sintomatologie che hanno compromesso la produttività degli impianti. TSWV e INSV non rappresentano però le uniche specie di Tospovirus note: fino ad oggi nel mondo ne sono state descritte almeno 19, fra cui IYSV (virus della maculatura gialla dell’iris) presente in Italia su cipolla da seme. In questa breve nota ci occupiamo di una rizomatosa, Alstroemeria spp., segnalata nel 1992 in Italia ospite naturale di TSWV: le piante, cresciute in una serra ligure, manifestavano anulature e maculature gialle sulle foglie, e producevano un numero limitato di fiori. Da allora non si sono registrate ulteriori segnalazioni su questa ornamentale, fino al mese di aprile del 2015 quando, in una serra della Piana di Albenga (Savona) su due piante di una varietà “nana” (proveniente dall’Olanda) sono stati osservati sintomi attribuibili a TSWV. Prendiamo spunto da questo recente caso per parlare degli altri Tospovirus presenti in Europa e del costante pericolo di una loro introduzione nel nostro Paese mediante materiale di propagazione già infetto o contaminato da tripidi viruliferi. Le due piante oggetto di studio, cresciute in vaso, sono state inviate al DipSA (Università di Bologna) nel febbraio del 2015. I sintomi consistevano in anulature più o meno ampie, bianche o giallastre, sulle foglie e/o “variegatura” del lembo fogliare. Nel mese di marzo, si è assistito alla produzione dei boccioli: i fiori, di colore rosso porpora, sono apparsi nomali come forma e dimensione. Questa breve indagine conferma Alstroemeria spp. ospite naturale di TSWV in Italia. Nel 1992 (anno del primo ritrovamento) l’identificazione era stata ottenuta unicamente grazie all’applicazione di tecniche sierologiche (immunodiffusione in gel di agar), mentre oggi sono state utilizzate quelle ben più sensibili di biologia molecolare. La sintomatologia di allora solo in parte è simile a quella osservata sulle due piante oggetto di studio; un “punto” in comune è il non coinvolgimento dei fiori. Una volta esclusa fortunatamente l’introduzione nel nostro Paese del “nuovo” Tospovirus ANSV, resta il dubbio se TSWV fosse già presente nel materiale di propagazione importato o se l’infezione sia stata contratta durante la crescita nella serra ligure, trasmessa da tripidi vettori. Considerando che non si sono notati altri esemplari infetti, si è più propensi verso la prima ipotesi. Ciò significa che, quando si tratta di Tospovirus non bisogna mai abbassare la guardia e che, anche quando gli effetti negativi dell’infezione sulla produzione appaiono molti contenuti (come nel nostro caso), occorre comunque rivolgersi a Laboratori di analisi specializzati nella diagnosi di fitovirus.

Ultimamente, la ricerca scientifica ha avuto un discreto sviluppo nell'evidenziare le potenzialità biologiche degli oli essenziali (OE), sostanze aromatiche di origine vegetale, che sono parte integrante della fitoterapia, raccogliendo prove di efficacia dei trattamenti complementari in diverse patologie umane (come ad esempio quelle dermatologiche, uro-ginecologiche, gastro-intestinali, respiratorie, neurologiche) e specialmente nella prevenzione e/o nel trattamento di alcune patologie infettive, anche farmaco-resistenti. L’uso di OE, però, può essere di grande utilità anche in agricoltura, nel cui ambito le perdite economiche dovute alle malattie delle piante causate da agenti infettivi sono ingenti e purtroppo in continua crescita (Lang e Buchbauer, 2012). In particolare, i batteri fitopatogeni hanno causato nel recente passato vaste epidemie che hanno colpito colture di notevole rilevanza economica. In Italia, si pensi ad esempio a Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), agente causale del cancro batterico dell’actinidia, a Xylella fastidiosa, associato al complesso del disseccamento rapido dell’olivo e ad Erwinia amylovora (Ea), agente del colpo di fuoco delle pomacee. Se si considera che nel controllo delle batteriosi delle piante ancora oggi gli interventi sono essenzialmente di tipo preventivo e si basano quasi esclusivamente sull’uso di composti rameici sottoforma di spray distribuiti sulla superficie delle piante, è chiaro come sia urgente mettere a punto formulati a base di agenti battericidi in grado di agire nella pianta in cui è in atto la malattia; oppure, di interferire con la crescita del patogeno già presente come endofita all’interno pianta-ospite che può rimanere asintomatica per molti anni (Minardi et al., 2014a; Sherif et al., 2015). Quindi, la possibilità di somministrare alle piante dei composti naturali come gli OE per interferire e bloccare la crescita di batteri fitopatogeni rappresenterebbe un importante mezzo di lotta. Recentemente, nell’ambito di un Progetto di Ricerca svoltosi nel 2012-213 (www.siroe.it) (finanziato dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Imola), è stata per la prima volta evidenziata in vitro l’efficacia antimicrobica di OE estratti da Monarda spp. nei confronti di Psa e Ea (Mattarelli et al., 2013). Sulla base dei risultati ottenuti, è stato ipotizzato che il trattamento preinfezionale di piante di Actinidia deliciosa cv. Tomouri con OE estratto da piante fiorite di M. didyma (coltivate ad Imola, Bologna) potesse interferire o bloccare la crescita di un ceppo virulento di Psa in modo tale da ridurre od annullare la comparsa dei sintomi tipici del cancro batterico. Di seguito si descrivono le ricerche eseguite ed i risultati ottenuti

Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the most economically important viral pathogen for both open field and greenhouse ornamental productions in Liguria region. Investigations of the presence and distribution of this Tospovirus in “Piana di Albenga” (Savona) were carried out during 2013 to 2015 including survey and collection of samples belonging to several ornamental species showing symptoms resembling those of TSWV infection. Mechanical inoculations on test plants and serological analysis (PAS-ELISA, LFT) proved TSWV presence in: Alstroemeria spp. (white rings and yellow spots on malformed leaves; asymptomatic flowers), Cyclamen spp. (necrotic concentring rings; malformed flowers), Iberis semperflorens (chloro-necrotic ringspots), Senecio cruentus (necrotic spots), Zinnia elegans (mottling and brown oak-leaf patterns on leaves; colour-breaking on malformed flowers; wilt). Tospoviruses presence was confirmed by RT-PCR using the BR60/BR65 universal primers, which amplify part of the nucleocapsid protein gene of several tospoviruses. Target amplicons of 454 bp were produced for all samples tested. PCR products were cloned and sequenced on both strands. The resulting sequences showed high percentage of identity, ranging from 96.0 to 99.5 %, with several isolates of TSWV. Iberis semperflorens was confirmed as new natural host of TSWV, while the virus was for the first time detected in Z. elegans in Italy. Since TSWV is limiting factor of ornamental plant production and plays important role in the epidemiology of other crops (including aromatic and vegetable species), these results appear serious enough to require better control measures involving both thrips and propagation material.

Erysimum linifolium L. (sin. Cheiranthus linifolium L.) (Brassicaceae), or Aegean wallflower, native to the Mediterranean region, is an evergreen perennial compact shrub that offers silvery-green foliage and beautiful spikes of lilac-mauve flowers through long periods, starting in mid-spring. In Liguria region (northern Italy) this species is mostly cultivated to be used in rock gardens or in mixed garden borders. In 2012, a phytoplasma-like disease was observed in a few pot-plants at an ornamental grower of Albenga area (Liguria region). Symptomatic E. linifolium showed reduced leaf size, rosetting and stunting; in some cases, shortening of internodes and growing reduction involved only a part of the plant. After first symptoms observation, an increasing percentage of symptomatic plants were found at flowering stage, when affected plants did not bloom. In order to verify phytoplasma presence and to determine their identity, samples from symptomatic and asymptomatic plants were collected and tested, after a chloroform/phenol nucleic acid extraction by direct PCR with primers P1A/P7A followed by nested-PCR with primers F1/B6 and R16F2n/R2. RFLP analyses performed with Tru1I and HhaI enzymes, allowed the identification, only in the symptomatic plants, of phytoplasmas belonging to subgroup 16SrI-B (‘Candidatus phytoplasma asteris’). Further confirmation of phytoplasmas identity was obtained after Tru1I RFLP analyses on tuf gene amplified with cocktail primers. ‘Candidatus Phytoplasma asteris” (16SrI) is associated with over 100 economically important plant diseases and represent on of the most diverse and widespread phytoplasma groups. Strains that belong to subgroups 16SrI-A, 16SrI-B and 16SrI-C are distributed worldwide and are associated with diseases in more than 80 plant herbaceous species transmitted by more than 30 species of insect vectors. The 16SrI-B represents the largest and most diverse strain cluster in the group in which at least 20 ribosomal subgroups were recognized. Some of the subgroups were only detected in woody hosts such as 16SrI-P identified in poplar in Eastern Europe, 16SrI-S and 16SrI-Q detected in cherry respectively in China and in Lithuania indicating the ability of some of its strains to infect all kind of plant species. The detection and identification of aster yellows phytoplasmas in E. linifolium in Italy represents however its first report in this species worldwide. Phytoplasmas belonging to 16SrII group (‘Ca. P. aurantifolia’) were detected in 2010 in E. cheiri (sin. C. cheiri) a different species cultivated in south-eastern Iran. In this case, infected plants showed witches’ broom and phyllody. Considering that E. linifolium is propagated by seed, it is very likely that leafhoppers are involved in 16SrI-B phytoplasma spreading in this species. Work on possible insect vector identification is in progress.

TSWV è presente in tutto il mondo ed infetta piante orticole e ornamentali, sia coltivate che spontanee: più di 1000 specie botaniche appartenenti a 15 famiglie di monocotiledoni e 69 famiglie di dicotiledoni. In Italia è stato individuato per la prima volta nel 1989 e da allora si sono succeduti decine e decine di casi in tutte le regioni italiane, coinvolgendo anche coltivazioni di specie officinali. Purtroppo, le malattie da tospovirus sono quasi sempre letali, il che comporta danni economico-produttivi di rilievo. Infatti, i sintomi indotti da TWSV (del tutto simili a quelli dovuti a INSV) sono riconducibili a necrosi, imbrunimenti fogliari circoscritti (spots), in molti casi confluenti in aree più estese, ed anulature concentriche, tali da rendere la pianta non più commercializzabile. Anche per TSWV vale il discorso dell’aspecificità dei sintomi, con conseguenti inevitabili ritardi in termini di diagnosi e profilassi. Escludendo al momento la trasmissione dei tospovirus per seme, la via primaria di diffusione in Natura è quella che si avvale di tripidi, primo fra tutti Frankliniella occidentalis. Tra le associazioni virus-insetto vettore, il rapporto tospovirus-tripide è particolare, in quanto il virus può essere acquisito solo dalle neanidi (di seconda età), per poter essere poi trasmesso sia dalle neanidi che dagli adulti. Questi ultimi possono spostarsi autonomamente, oppure essere trasportati dal vento anche a lunga distanza e diffondere facilmente l’infezione. Di seguito vengono descritti alcuni dei casi personalmente affrontati negli ultimi anni soprattutto in Liguria, regione in cui la capillare diffusione di TSWV e dei tripidi è favorita dalla stretta vicinanza di piccole coltivazioni all’aperto di molte specie suscettibili al virus e ricovero dei vettori naturali, cui si aggiunge una scarsa manutenzione delle zone limitrofe, ricche d’infestanti che contribuiscono alla conservazione di TSWV ed alla proliferazione dei tripidi.

Le piante officinali sono spesso infette da fitoplasmi, responsabili di malattie contraddistinte da giallumi, virescenza e fillodia la cui diffusione è in aumento. Per la prima volta, sono stati eseguiti studi analitico-comparativi che hanno evidenziato l’influenza di questi patogeni sui metaboliti primari e sencondari della pianta

I virus che negli ultimi anni hanno causato danni economici ingenti alle coltivazioni di zinnia in Europa ed ovunque si coltivi questa asteracea sono i due tospovirus: TSWV (v. dell’avvizzimento maculato del pomodoro) ed INSV (v. della maculatura necrotica dell’impatiens). Il primo, responsabile di necrosi e mosaico sulle foglie, malformazione e decolorazione dei petali ed avvizzimento, è stato isolato nel 1997 in Australia, nel 1998 in Iran (zona di Tehran), poi nel 2000 in Francia, nel 2006 in vivai del Messico e nel 2008 in Ungheria; la sua presenza viene ormai considerata ubiquitaria in USA. Solamente di recente, e precisamente nel 2013, INSV è stato isolato per la prima volta da piante di zinnia in Iran (sempre nella zona Tehran) da piante di ridotta dimensione (nanismo), caratterizzate da “spots” necrotici e clorosi fogliari. Si riportano i risultati di un’indagine epidemiologica eseguita nel 2014 nella Piana di Albenga e che ha visto come protagonista una coltivazione di zinnia in vaso caratterizzata da una grave malattia ad eziologia virale: per la prima volta in Italia questa pianta è risultata ospite naturale di TSWV.

Da anni l'Area di patologia vegetale sostiene le cooperative liguri specializzate nella produzione di piante ornamentali, orticole ed officinali per quanto riguarda la difesa dalle malattie dovute a fitoplasmi

Iberis semperflorens L. (Family Brassicaceae) is a perennial evergreen shrub, endemic to southern Italy and Sicily and it has been recently proposed as flowering potted plants for commercial purposes (Iapichino and Bertolino, 2009). During summer 2013, symptoms of chlorotic/necrotic spots and rings were observed in some plants of I. semperflorens potted plants, cultivated in a greenhouse at Albenga (Northwest Italy). Around 5% out of 500 plants were symptomatic and from these plants samples were collected and tested by commercial DAS-ELISA kits for tospoviruses (Agdia, USA). A positive reaction was obtained only with Tomato spotted wilt virus (TSWV) antiserum. Total RNA was extracted from leaves of ELISA positive samples using EZNA total RNA kit (Omega BioTek, USA) and used as template in RT-PCR reactions to confirm the presence of TSWV by using tospo-generic primers, designed to amplify partial coat protein gene (CP) of tospoviruses (Eiras et al., 2001). PCR products of the expected size (453 bp) were cloned in pGEMT Vector (Promega, USA) and two independent clones sequenced at MWG Biotech (Ebersberg, Germany). The consensus sequence (accession No. XXXXX) was compared with other TSWV sequences available in GenBank using DNAMAN. The partial CP sequence showed 99.5% nucleotide identity with several Italian TSWV isolates (HQ839729-31, DQ376177-9, DQ376183, DQ915946). This new finding suggests that I. semperflorens is a newly established TSWV natural host (Parrella et al., 2004) and that it may play a role as reservoir of the virus in nature.

Alcune solanacee coltivate a scopo ornamentale possono albergare diverse specie di viroidi senza mostrare alcun sintomo. Il rischio legato alla possibilità che tali microrganismi possano passare ad infettare anche le solanacee ortive, causando in questo caso danni rilevanti, è ampiamente documentato, specie negli ultimi anni, da numerose segnalazioni. Per questo motivo, è necessario monitorare la presenza dei viroidi nelle solanacee ornamentali al fine di individuare e distruggere potenziali serbatoi di infezione.

La margherita africana (African daisy; Arctotis x hybrida, famiglia delle Asteraceae) è un’erbacea perenne tappezzante originaria dell’Africa meridionale la cui altezza può raggiungere i 60-70 cm. E’ una pianta apprezzata per la fioritura non solo vivace ma anche prolungata, molto adatta per creare bordure ed aiuole. Come quelli della gazania, anche i fiori degli ibridi di Arctotis si schiudono solo quando splende il sole. Nella Piana di Albenga (Savona) la margherita africana è allevata in pieno campo; le talee radicate sono messe a dimora nel vaso di 14 cm di diametro in ottobre; la commercializzazione della pianta fiorita avviene in primavera, a partire dal mese di marzo. La sua coltivazione non pone eccessivi problemi dal punto di vista sanitario: si tratta, infatti, di piante difficilmente attaccate da parassiti o da malattie in genere, fatta eccezione per i marciumi basali, le “muffe” da Botrytis cinerea e gli attacchi di afidi molto pericolosi a primavera per i giovani boccioli. A partire dal mese di novembre del 2012, in un’azienda dove la coltivazione principale è rappresentata dalla dimorfoteca (Dimorphoteca spp.; sin. Osteospermum spp.) (con una produzione di circa 20.000 esemplari l’anno), è stata osservata una grave malattia riguardante la margherita africana (presente nell’azienda con oltre 2.000 vasi). Considerata la gravità dei sintomi che la contraddistinguevano, alcuni esemplari sono stati inviati al CNR di Portici (Napoli) ed all’Università di Bologna (DiPSA) per le analisi del caso. Di seguito si riporta una sintesi dei risultati conseguiti che vedono ancora una volta protagonista il virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro (Tomato spotted wilt virus: TSWV), tospovirus che negli ultimi anni abbiamo spesso riscontrato in coltivazioni di ornamentali (lupino, calla bianca, margherita, ciclamino, ecc.) della Riviera Ligure di Levante.

La monarda (Monarda didyma L.) è una lamiacea perenne originaria dell’America del Nord dalle foglie ovato-lanceolate e fiori rosso scarlatto utilizzata sia come ornamentale, sia come aromatica (Fig. 1A). Infatti, studi eseguiti in Giappone nel 2005 hanno dimostrato una potente attività antimicrobica in vitro del suo olio essenziale nei confronti di Trichophyton mentagrophytes ed Escherichia coli. Nel 2012 è stata avviata una ricerca in Emilia-Romagna con lo scopo di verificare le proprietà antimicrobiche in vitro dell’olio essenziale di M. didyma nei confronti di batteri patogeni sia per l’uomo e gli animali (E. coli, Candida spp.), sia per le piante (Erwinia amylovora e Pseudomonas syringae pv. actinidiae). Nel mese di maggio è stato allestito un campo sperimentale nell’area adiacente al Plesso Serricolo Scarabelli del DipSA ad Imola utilizzando piantine ottenute da seme commerciale (Fig. 1B); la coltivazione è stata costantemente monitorata durante le fasi di crescita al fine di selezionare piante visivamente sane (gli esemplari affetti da malattie fungine e/o virali sono stati eliminati). Nel mese di settembre è stata effettuata la raccolta della parte epigea, costituita quasi esclusivamente da fusti e foglie. L’olio essenziale, ottenuto mediante distillazione in corrente di vapore (Fig. 1C), analizzato in GC-MS, era ricco in timolo (57.95%) e p-cimene (10.32%). Presso i laboratori dell’area di microbiologia del DipSA sono state eseguite le analisi in vitro dalle quali è risultata un’elevata attività antibatterica nei confronti di patogeni animali e vegetali, molto verosimilmente correlabile al fitocomplesso e specificatamente al timolo. L’olio del genere Monarda si conferma possedere una notevole attività antimicrobica, com’era già stato verificato per quello da M. fistulosa nei confronti E. coli (Bellardi et al., 2012). Questi studi aprono nuove possibilità di contenimento di malattie da agenti patogeni basate sull’impiego di sostanze naturali come gli oli essenziali; è quindi indispensabile trasferire la sperimentazione dal vitro al vivo.

In the Summer of 2012, Erysimum linifolium L. pot plants produced at an ornamental grower in Liguria region (northern Italy), showed unusual virus-like disease of dark mottle and stripes on mauve-purple petals. A virus was mechanically transmitted from symptomatic flowers to several test plant species belonging to Chenopodiaceae and Brassicaceae families. This virus was identified as an isolated of turnip mosaic virus (TuMV) by PAS-ELISA analysis, electron microscopy negatively stained crud extracts and immuno-electron microscopy (IEM) tests. In the naturally infected E. linifolium plants, TuMV occurred alone, since any other viruses either by electron microscopy or mechanical inoculations were detected. By applying RT-PCR a fragment of 862 bp was amplified corresponding to all coat protein (CP). The comparison of CP gene showed no correlations between their genetic variation and geographical origins. The diversity in southern Europe appeared very low, most likely due to the rapid growth of TuMV in relation to trade between different Countries. The consequent exchange of infected propagation material shows that some lineages are adapted to particular crop species, and that recombination is a significant generator of the genetic diversity in populations of this virus. This is the first report of TuMV in E. linifolium worldwide.

Nel biennio 2010-2011 sono state eseguite specifiche ricerche riguardanti le infezioni da fitoplasmi su ortensia, sia in coltivazione presso aziende floricole della Liguria, sia su esemplari a dimora in aree urbane del Lazio, e precisamente a Bolsena (Viterbo). Da queste ricerche è emerso che negli ultimi anni il “quadro” sanitario è sensibilmente mutato, sia per quanto riguarda i fitoplasmi coinvolti, sia per quanto concerne importanti aspetti sintomatologici (alterazioni morfologiche e cromatiche sulle infiorescenze) ed epidemiologici (trasmissione in natura tramite vettori animati). Alla luce dei risultati e considerata la pericolosità di questi microrganismi patogeni, ci sembra opportuno effettuare un aggiornamento sulle conoscenze delle fitoplasmosi dell’ortensia in modo da contribuire al miglioramento degli interventi di difesa e profilassi a disposizione sia dei vivaisti e produttori di piante in vaso, sia di degli operatori e manutentori del “verde” pubblico.

La continua evoluzione della resistenza agli antibiotici dei batteri patogeni umani, ha reso necessaria la ricerca di nuovi prodotti antimicrobici come gli oli essenziali ottenuti da piante note nella medicina popolare. In questo studio è stata saggiata e confrontata la capacità antitossigenica degli oli essenziali di Monarda fistulosa ottenuti da piante sane e infette dai fitoplasmi, nei confronti di Escherichia coli e Campylobacter jejuni. In particolare, in E. coli normalizzando con gene endogeno FTsZ sono stati saggiati: il gene CdtIVB codificante l’unità attiva B della olotossina CDT-IV, il gene LuxS codificante l’auto-induttore 2 del sistema Quorum Sensing promotore della CDT ed il gene DksA codificante una DNA kinasi, proteina soppressore-repressore della CDT. Invece, in C. jejuni normalizzando con gene endogeno LpxA coinvolto nella biosintesi del lipide A sono stati saggiati: il gene CdtB codificante l’unità attiva B dell’olotossina CDT, il gene LuxS ed il gene Hns codificante per il regolatore trascrizionale H-NS. E' stata valutata la capacità degli oli essenziali (S) ed (I) di M. fistulosa di modulare l’espressione genica in E. coli ed in C. jejuni dei geni codificanti CDT, le proteine auto-induttori codificate da LuxS del sistema quorum sensing (promotore della CDT) ed i fattori trascrizionali Hns e DNA kinasi DksA (repressori della CDT). I risultati ottenuti sono promettenti e la "bioattività" dell’olio essenziale di M. fistulosa si è dimostrata in vitro anche più potente degli antibiotici specifici, nei confronti sia di E. coli sia di C. jejuni. In particolare, utilizzando le dosi sub-inibenti la crescita batterica, si è osservato che l’espressione della CDT batterica era sotto regolata rispetto al controllo negativo fino ad un massimo di circa 40 volte in E. coli e di circa 20 volte in C. jejuni, in modo dipendente sia dalla concentrazione dell’olio essenziale sia dal tempo di esposizione. Lo stato sanitario della pianta invece sembra non influenzare l'attività antimicrobica non essendosi osservate variazioni significative degli oli (S) ed (I). L’espressione genica dei geni LuxS codificanti gli induttori del sistema quorum sensing, che sta alla base della regolazione della virulenza batterica, risultava sotto-regolata in E. coli fino ad un massimo di circa 30 volte, ed in C. jejuni di 15 volte dopo 6 h. La sovraespressione genica dei geni H-NS, fino ad un massimo di 12 volte e DksA, di 9 volte, codificanti per i regolatori trascrizionali negativi leganti il DNA che sopprimono i fattori di virulenza, supporta l'osservazione che gli oli essenziali di M. fistulosa sono in grado di regolare la virulenza dei batteri patogeni esaminati. I risultati ottenuti sono promettenti per una futura applicazione degli oli di M. fistulosa come agenti inibenti la virulenza di E. coli e C. jejuni nella catena alimentare.

Nel maggio 2012 in una coltivazione in vaso di lupino ornamentale (Lupinus polyphyllus Lindt.; famiglia Fabaceae) della zona di Albenga (Savona) sono state notate numerose piante caratterizzate da una grave sintomatologia sulle foglie tipicamente riferibile all’infezione da Tospovirus: anulature concentriche clorotiche, rosso-arancio e/o nerastre; i fiori apparivano leggermente screziati. Alcuni degli esemplari con sintomi fogliari erano inoltre di taglia ridotta, gli steli fiorali erano vistosamente ripiegati “a gomito” e le foglie più giovani rimanevano piccole e raggomitolate. Dalle analisi sierologiche eseguite applicando la tecnica LFT è risultato che in tutte le piante con anulature concentriche sulle foglie era presente il virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro (TSWV) che è stato trasmesso con inoculazione meccanica su specie erbacee fra cui basilico, fava e peperone (sintomi locali e sistemici di necrosi ed avvizzimento) e fagiolino dall’occhio (anulature locali). L'identità del virus è stata confermata anche mediante RT-PCR, impiegando per lo scopo “primers” specifici per il gene NSM di TSWV. Tali “primers”, infatti, hanno prodotto, solo nei campioni provenienti dalle piante con anulature clorotiche, un amplicone della lunghezza attesa (670 bp). Due degli ampliconi ottenuti, da provenienti da due piante sintomatiche distinte, sono stati clonati e sequenziati alla MWG (Germania). Le sequenze ottenute sono risultate 100% identiche fra loro, mentre confrontandole con le sequenze di TSWV presenti in GeneBank sono risultate per il 99,25% identiche a due isolati di TSWV (35-2 e 43-2). Inoltre, nelle piante infette da TSWV e caratterizzate anche da nanismo e ripiegamento dello stelo fiorale, è stata verificata la presenza di fitoplasmi appartenenti al gruppo ribosomico 16SrXII-A noto anche come “stolbur”. Infezione da TSWV in lupino in Italia, e precisamente ad Albenga, era già stata descritta nel 2007, ma il virus non era stato caratterizzato dal punto di vista molecolare (Bellardi et al., 2008). Dai dati ottenuti l’isolato TSWV-L. polyphyllus si inserisce nella tipologia “A” cui afferiscono anche gli isolati di TSWV detti RB (“Resistant Breaking”) in quanto capaci di superare la resistenza a TSWV in pomodoro. Per quanto riguarda l’infezione da fitoplasmi “stolbur”, si tratta del primo caso di infezione naturale in L. polyphyllus. Dal punto di vista epidemiologico di particolare rilievo risulta l’associazione di questi due patogeni, conseguenza di contemporanee infestazioni nella coltivazione di lupino ornamentale oggetto di studio di tripidi e cicadellidi, vettori di Tospovirus e fitoplasmi rispettivamente.

Lo scenario delle virosi della piante ornamentali in Italia è stato fortemente “scosso” all’inizio degli anni ’90 dalla comparsa dei Tospovirus, preceduta di pochi anni da quella del “tripide occidentale dei fiori” Frankliniella occidentalis. Considerando il grave danno economico che ne è conseguito e l’elevata polifagia sia del vettore che dei tospovirus trasmessi, dedichiamo a questi patogeni una serie di articoli per illustrare le più importanti sintomatologie su specie riscontrate infette in Italia, sottolineando quegli aspetti epidemiologici che hanno reso e rendono ancora impossibile debellarli dalle coltivazioni. I due tospovirus più diffusi e pericolosi sono TSWV (virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro (su cui ci siamo soffermati nel precedente articolo dedicato alle virosi della calla bianca) ed INSV (virus della maculatura necrotica dell’impatiens). Il primo è la specie nota da maggior tempo, segnalata pressoché ovunque in Italia, mentre INSV inizialmente era considerato non una specie virale a se stante, bensì un “ceppo” di TSWV e quindi indicato come “TSWV ceppo lieve” oppure “TSWV H7”, distinto dal “ceppo grave”, “TSWV L” o “TSWV CNPH” corrispondente all’attuale TSWV. Ne consegue che, per alcuni dei primi casi riscontrati in Italia, permane qualche incertezza sull’esatta identificazione del tospovirus coinvolto. La tabella 1 riporta tutti i casi certi, ossia quelli che dal 1990 ad oggi hanno riguardato INSV, da solo od in associazione con TSWV od altri virus. Quelli che andiamo ad illustrare di seguito, in maniera dettagliata sia per quanto riguarda la sintomatologia che le ipotesi sull’origine dell’infezione, sono stati personalmente trattati nel corso di indagini virologiche eseguite in alcune regioni italiane: Liguria, Lombardia, Veneto e Lazio. Dalla descrizione delle malattie sulle diverse specie ornamentali, appare subito evidente come tutti i casi siano stati alquanto gravi, spesso letali, soprattutto se l’infezione ha colpito piante molto giovani. I sintomi da INSV, infatti, possono interessare non solo l’apparato fogliare, ma anche fiori ed organi ipogei (vedi la glossinia). Le piante ornamentali infette, sia nei vivai che nelle coltivazioni, devono essere eliminate tempestivamente, il che implica una diagnosi precoce. Ma, la stessa aspecificità dei sintomi, talvolta confondibili con quelli da infezioni fungine (Phytophtora parasitica, Gleosporium spp., ecc.) o batteriche (Xanthomonas campestris) costituiscono un’ulteriore insidia che può fuorviare la diagnosi visiva e ritardare pericolosamente l’eliminazione dei focolai d’infezione.

Nell’ultimo decennio in Italia le ricerche sulle malattie da virus delle piante ornamentali e officinali sono molto aumentante, mettendo in evidenza la loro pericolosità e le enormi difficoltà per quanto riguardo difesa e prevenzione. Trattandosi di malattie incurabili, gli stessi floricoltori e vivaisti devono, in collaborazione con i tecnici che li assistono e avvalendosi delle indicazioni di esperti fitopatologi e virologi in particolare, adoperarsi affinché certe situazioni di ordine fitosanitario non assumano risvolti irrecuperabili e non aumentino, anno dopo anno, le perdite economiche dovute ai virus. E’ intenzione degli Autori illustrare, in una serie di articoli che appariranno su “Il Floricultore”, alcune fra le più importanti malattie virali che di recente sono state individuate in regioni particolarmente vocate alla produzione di specie ornamentali ed aromatiche, verdi e da fiore, in vaso e/o da reciso, quali Liguria, Emilia-Romagna, Campania, Puglia e Sicilia. L’obiettivo principale è quello di rimarcare la necessità di porre maggiore attenzione alla qualità fitosanitaria del materiale di propagazione utilizzato nell’allestimento degli impianti e, allo stesso tempo, l’indispensabilità di monitoraggi frequenti ed accurati durante le fasi di crescita delle singole specie. E’ di fondamentale importanza, infatti, non solo “partire con il piede giusto”, ossia con rizomi, bulbi, semi, talee, o piantine micropropagate garantite dal punto di vista sanitario, ma anche individuare per tempo eventuali sintomatologie su foglie e/o fiori di probabile origine virale. Un’analisi tempestiva, eseguita presso laboratori abilitati, può evitare che le infezioni presenti si diffondano ulteriormente ad altre specie suscettibili o permangano nell’ambiente costituendo un potenziale pericolo per le produzioni successive. Il primo argomento proposto riguarda la calla bianca (Zantedeschia aethiopica), nota ornamentale appartenente alla famiglia delle Araceae, adatta per il vaso e per il fiore reciso, e che da anni “soffre” per la presenza di un virus presente nel mondo ovunque la si coltivi: Dasheen mosaic virus (DMV). Negli ultimi dieci anni, si sono aggiunte altre due pericolose specie virali: Tomato spotted wilt virus (TSWV), e INSV (Impatiens necrotic spot virus), Tospovirus che rappresentano un vero flagello per le produzioni orticole, ornamentali ed officinali non solo del nostro Paese.

Il genere Erysimum (sinonimo Cheiranthus) (Brassicaceae, prima Cruciferae) comprende circa cento specie di piante annuali, biennali e perenni, alquanto rustiche. Il loro aspetto è simile a quello della violacciocca (Matthiola incana). Si tratta di una brassicacea perenne che raggiunge un’altezza di 30-40 cm, dalle foglie lanceolate verde-argentee e spighe fiorali costituite da fiori delicati e profumati malva o porpora. In Liguria la coltivazione è in vaso (14 cm di diametro); la produzione annua è di circa 50.000 esemplari. Per quanto riguarda le infezioni virali, fin dal 1972 è nota l’infezione in molte specie di Erysimum da un tymovirus indicato come Erysimum latent virus (virus latente dell’erysimum: ELV). Non si registrano particolari sintomatologie indotte da questo patogeno che, infatti, è spesso latente o, in rari casi, risulta associato ad un leggero mosaico fogliare. Per quanto riguarda i fitoplasmi, non si hanno segnalazioni relative ad infezioni in E. linifolium. Quello che presentiamo, è un duplice caso di infezione (da fitoplasmi e da un potyvirus) che, per la prima volta, ha visto coinvolto E. linifolium. Le sintomatologie manifestate dalle piante infette sono state due e ben distinte: la prima ha interessato tutto l’apparto fogliare, la seconda unicamente i fiori. Con un attento monitoraggio fin dalle prime fasi di crescita, riteniamo che entrambe possano essere individuate dagli stessi coltivatori; trattandosi di malattie notoriamente non curabili, l’aspetto sintomatologico costituisce un elemento di diagnosi “visiva” utile per l’eliminazione tempestiva delle piante infette. Sintomatologie Le piante sintomatiche oggetto di studio provenivano da una sola azienda di Albenga. Inizialmente, sono stati notati pochi esemplari caratterizzati da una forte riduzione di crescita (nanismo) e produzione di foglie contorte, arricciate ed ammassate tanto da costituire delle piccole “rosette” conseguenti al raccorciamento degli internodi. In alcuni casi, il nanismo e l’arricciamento fogliare coinvolgevano solo una parte dell’apparato fogliare. Andando avanti con le fasi di crescita, le piante contraddistinte da questa prima sintomatologia sono aumentate numericamente senza produrre fiori, per cui si è ritenuto opportuno valutarne lo stato sanitario. Indagini per fitoplasmi e virus Le analisi di laboratorio eseguite applicando le tecniche PCR e RFLP hanno consentito di verificare nelle piante con nanismo e rosettamento la presenza di fitoplasmi appartenenti al gruppo del “giallume dell’astro” (‘Candidatus Phytoplasma Asteris’: AY), sottogruppo 16SrI-B. Nelle piante di controllo, con e senza screziature sui petali, non è stata rilevata infezione da fitoplasmi. Parallelamente, sono stati effettuati da tutti gli E. linifolium inoculazioni meccaniche su piante indicatrici, utilizzando specie erbacee suscettibili al tymovirus ELV (fra cui cucurbitacee, solanacee e lamiacee). Esiti positivi si sono registrati a seguito dell’utilizzo, per l’inoculo, dei fiori screziati prodotti dalle piante inviate come controllo, e precisamente: lesioni cloro-necrotiche su alcune chenopodiacee (Chenopodium murale e C. amaranticolor), bandature verde cupo lungo le nervature sulle foglie della rucola, aree giallo-oro o internervali su quelle del broccolo. Le analisi immunoenzimatiche PAS-ELISA sono risultate positive per il virus del mosaico della rapa (Turnip mosaic virus: TuMV), potyvirus ubiquitario nelle brassicacee. Considerazioni Nell’impianto di E. linifolium in vaso sono state quindi osservate due differenti e distinte sintomatologie associate a due tipologie di patogeni infettivi. Per quanto riguarda la fitoplasmosi, certamente si tratta della malattia più grave dal punto di vista produttivo in quanto le piante affette sono risultate gravemente compromesse nella crescita. AY è un fitoplasma molto comune e diffuso in tutto il mondo, ed anche in Liguria, dove infetta molte specie ornamentali e da fiore, come il ranuncolo e l’or...

In the Spring of 1990, Croton vein yellowing nucleorhabdovirus (CVYV) was found for the first time in some dwarfed plants of croton (Codiaeum variegatum L.) “Fred Sander” showing malformation and yellow or pink veins. CVYV was mechanically transmitted to Nicotiana glutinosa and Chenopodium amaranticolor and, by leaf-graft, to healthy croton plants in which it induced the same original disease. After about twenty years from the first finding, CVYV has been serologically identified and molecularly characterized as an isolate of Eggplant mottled dwarf virus (EMDV). In electron microscopy of negatively stained crude extracts from croton, fixed in gluteraldeid solution, typical bacilliform virus particles were observed; by applying immunoelectron microscopy tests, using an antiserum to an EMDV Iranian potato isolate, all these particles were clearly decorated. EMDV was also detected in original croton by DAS-ELISA (Bioreba kit; Switzerland) and by RT-PCR using a virus-specific primer pair designed to amplify ca. 900 bp fragment of the P1 polymerase gene. The amplicon was cloned and sequenced at MWG (Ebersberg, Germany) on both strands. Sequence obtained showed 86.5% identity with EMDV eggplant isolate from Greece, confirming the identity of rhabdovirus infecting symptomatic croton. From this serological and molecular study, it appears evident that CVYV can be definitively considered an isolate of EMDV. In the last decade, EMDV has been frequently detected infecting two common ornamental species in Mediterranean area, Hibiscus rosa-sinensis and Pittosporum tobira. From this study croton, typical pot-houseplant appreciated for its large and glossy leaves, can be considered a new natural host of EMDV.

Plants are well recognized to change the secondary metabolites pattern of biosynthetic pathways in response to virus, bacteria, phytoplasma or fungi infections, and/or attacks by phytophagous insects. Most of these secondary metabolites are represented by volatile semiochemicals used as chemical defence in the sense of repellency. Such changes in the phytochemical profile greatly affect the quality and the commercial value of plants used for medicinal and cosmetic purposes. As a continuation of our studies aimed to verify the effect of phytoplasma infections on the volatile chemicals production, we report the differences detected between healthy and infected plants of Grindelia robusta Nutt. (Asteraceae), Echinacea purpurea Moench. (Asteraceae), and Monarda fistulosa L. (Lamiaceae), all species of great importance in the medicinal practice and grown at the Herb Garden of Casola Valsenio (Ravenna, Emilia Romagna region, northern Italy). Before flowering, only a few yellow symptoms were present on the leaves; however in some cases, the plants showed reduction of leaf size and stunting; whereas, at blooming, severe virescence and phyllody symptoms were observed. Samples from symptomatic plants were collected and tested for phytoplasma presence. Nested PCR/RFLP analyses on 16Sr DNA gene confirmed that in all the symptomatic samples examined phytoplasmas identified belonged to ribosomal subgroup 16SrI-B (Aster yellows: AY, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’) in the case of G. robusta and E. purpurea, and to ribosomal soubgroup 16SrXII-A stolbur, for M. fistulosa. These two phytoplasmas are associated with a number of economically important diseases worldwide and recent reports indicated the presence of stolbur phytoplasmas in hyssop (Hyssopus officinalis) and in Parietaria spp., and of AY in woolly foxglove (Digitalis lanata). Essential oils were obtained from aerial parts of healthy and phytoplasma-infected plants by hydrodistillation followed by GC/MS analysis using a reported procedure. In all cases, significant differences in the chemical composition of essential oils were observed. In G. robusta infected plants, a higher percentage of limonene, borneol (both almost > 50%), and borneol acetate (15% in healthy plants and 21.3% in infected ones) were detected. Essential oil of E. purpurea revealed differences for limonene (2.2% in healthy plants and 4.4% in infected ones), cis-verbenol (1.8% and 5.6% respectively), verbenone (2.7% and 11.4%), and to a lesser extent carvone (0.8% to 2.5%). Infection by phytoplasmas belonging to ribosomal soubgroup 16SrXII-A stolbur in M. fistulosa led to an increase of monoterpene hydrocarbons such as -thujene, -pinene, 3-carene, and myrcene and to a decrease in aromatic monoterpene like p-cymene and thymol. Phytoplasmas have an appreciable influence in the content of secondary metabolites and these three species increase the concentration of the above cited monotherpens as chemical response to the presence of these pathogens.

L’erba cedrina o verbena odorosa [Lippia citriodora (L.) Humb. B. et K.; Verbenaceae] è un delicato arbusto aromatico-ornamentale, originario del Cile e del Perù. In Erboristeria trova impiego nella preparazione di tisane, infusi e impacchi, mentre in cucina si usa per liquori, marmellate o come semplice spezia. In Italia, oltre ad essere presente in Giardini di specie officinali ed Orti Botanici, è coltivata in Liguria, soprattutto nella Piana di Albenga (Savona). Dal punto di vista patologico, e virologico in particolare, l’erba cedrina è molto suscettibile al virus del mosaico dell’erba medica (AMV), noto patogeno infettivo trasmesso in natura da afidi, ripetutamente individuato negli ultimi anni in coltivazioni di importanti specie ornamentali ed aromatiche della Piana di Albenga (ortensia, origano, peperoncino, rosmarino, lavanda e lavandino, Lavandula stoechas, Teucrium fruticans, ecc.). Durante i numerosi sopralluoghi condotti nell’ultimo biennio in coltivazioni di aromatiche di Albenga, così come nel Giardino delle Erbe di Casola Valsenio (Ravenna), sono state osservate piante di erba cedrina con sintomi riconducibili all’infezione da AMV. - La malattia. I sintomi indotti da AMV variano d’intensità a seconda dell’andamento stagionale. Nei casi più lievi, la pianta manifesta un leggero mosaico, costituito da macule giallo-oro rotondeggianti o “marezzature”; in quelli più gravi, l’apparato fogliare evidenzia un vistoso mosaico costituito da macchie che, unendosi, possono interessare tutta la lamina. Particolarmente colpite sono le foglie più giovani, il cui lembo è anche leggermente contorto o spiralato. In un cespuglio, rami con foglie asintomatiche si alternano ad altri con mosaico giallo. La taglia della pianta infetta è ridotta e, nel caso di infezioni precoci, essa assume l’aspetto di un piccolo cespuglio che produce poche infiorescenze. - Epidemiologia. Il primo caso d’infezione naturale di AMV in erba cedrina si è verificato nelle regioni del Sud Italia, nel 1966; successivamente, la malattia è stata più volte osservata su piante presenti sia in giardini privati (dove viene coltivata come ornamentale), sia in impianti indirizzati alla raccolta delle foglie e delle sommità fiorite da destinare al settore farmacologico e cosmetico, soprattutto in Emilia-Romagna. Tutti i campioni sintomatici sono risultati infetti da AMV: l’identificazione è stata effettuata mediante l’applicazione della tecnica immunoenzimatica PAS-ELISA; l’isolato AMV-erba cedrina, applicando le tecniche di biologia molecolare, è risultato appartenere al sottogruppo I degli isolati noti di AMV. Considerazioni AMV in L. citriodora costituisce una novità per la Liguria. Alla luce delle numerose recenti segnalazioni di “nuovi” ospiti di questo virus nella Piana di Albenga, questo ulteriore ritrovamento di AMV desta molta preoccupazione, in quanto ne attesta la costante presenza e capillare diffusione. Nel caso di malattia in atto, i provvedimenti da adottare devono essere mirati e drastici, ad iniziare con l’eliminazione immediata delle piante che manifestano i sintomi descritti, anche nelle forme più lievi.

In un recente articolo comparso su Natural 1 ci siamo occupati di una malattia dovuta a fitoplasmi osservata nel 2009 su Monarda fistulosa L. (monarda o erba bergamotto) coltivata nel Giardino delle Erbe “Augusto Rinaldi Ceroni” di Casola Valsenio (Ravenna). Almeno il 50% delle piante facenti parti di un piccolo lotto presentava sintomi di nanismo e giallume fogliare, seguiti, al momento della fioritura, da virescenza e malformazioni dei verticilli fiorali. Applicando la tecnica di biologia molecolare PCR, fu diagnosticata, nei soli campioni sintomatici, l’infezione da fitoplasmi appartenenti al gruppo XII-A “stolbur”. I successivi sopralluoghi per verificare l’andamento della malattia in campo hanno permesso di osservare, anche nel 2010, la presenza della medesima malattia associata a fitoplasmi appartenenti non solo al sottogruppo XII-A “stolbur”, bensì anche a quello I-B “aster yellows”. Parallelamente agli studi eseguiti su questa fitoplasmosi, pericolosa per gli effetti negativi sulla produttività dell’impianto, e trattandosi di una pianta officinale, abbiamo dato il via a delle ricerche di tipo “qualitativo” prendendo in esame l’olio essenziale, con il duplice scopo di: verificarne la composizione e, per prima volta, saggiarne l’attività antimicrobica. Estrazione ed analisi dell’olio essenziale Gli olii essenziali da analizzare, sia per quanto riguarda la composizione che l’attività antibatterica, sono stati ottenuti nel 2010, presso il Giardino delle Erbe di Casola Valsenio, sottoponendo a distillazione in corrente di vapore due lotti di materiale vegetale fresco: il primo (900 gr) costituito da piante asintomatiche (A), il secondo (120 gr) da piante sintomatiche (S). Si trattava, come già specificato in precedenza, di piante comunque infette da uno o due fitoplasmi. I due lotti, A ed S, sono stati distillati applicando lo stesso procedimento: distillazione di steli, foglie e fiori, questi ultimi a diversi a diversi stadi di sviluppo (capolini, inizio/piena fioritura); tempo di distillazione di circa un’ora; lavaggio del distillatore con acetone e acqua distillata al termine di ogni estrazione. Le due quantità distillate (una per ciascun lotto) sono state conservate in boccette di vetro scuro in frigorifero (circa 4°C), fino al momento delle successive analisi; ad esse è stata unito un terzo olio essenziale, sempre da M. fistolosa, coltivata a Villazzano (Trento) (indicato come V). L’analisi dei tre olii essenziali (A,S,V) è stata effettuata mediante gas-cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-SM). L'attività di tutti e tre gli oli essenziali di M. fistulosa è risultata molto potente rispetto agli antibiotici di riferimento. In particolare, il saggio di inibizione della tossina condotto sugli olii A e V ha dimostrato un'elevata capacità inibitoria dell'espressione delle esotossine dei patogeni saggiati: infatti, la produzione di esotossine era diminuita non solo rispetto al controllo negativo, ma anche rispetto agli antibiotici, in un modo dipendente sia dalla concentrazione dell’olio essenziale, che dal tempo di esposizione. I risultati dell'elevata attività antimicrobica e dell'azione inibitoria sulle tossine dei patogeni saggiati da parte dell'olio essenziale di M. fistulosa sono molto promettenti e potranno favorire lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici più sicuri per l'uomo.

Alla vasta famiglia delle Campanulaceae appartengono specie annuali, biennali e perenni adatte per le aiuole, il giardino roccioso ed alpino e le bordure in genere. Ad Albenga (Savona) si è da poco affermata una graziosa campanulacea, Isotoma axillaris Lidt. (sin. Laurentia axillaris; in inglese “blue stars” o “rock isotome”) dai fiori stellati, molto numerosi, di colore viola chiaro. Si tratta di una pianta con crescita a cespuglio compatto, tendenzialmente ricadente, particolarmente adatta per la decorazione di aiuole e balconi. Ad Albenga è una coltivazione ancora di nicchia, con una produzione annuale valutata sui 100.000 esemplari, ma destinata certamente ad affermarsi ulteriormente vista la sempre maggiore richiesta del mercato. Per quanto riguarda gli aspetti agronomico-colturali, l’isotoma viene cresciuta in vaso (diametro del 14), all’interno di serre fredde: l’impianto avviene nel mese di marzo e la fioritura in maggio. Ben si presta anche alla coltivazione in pieno campo, da aprile in poi. Questa campanulacea richiede piena luce, abbondanti irrigazioni ed una spuntatura in pre-fioritura che ne aumenti l’accestimento. Il caso patologico che presentiamo e che ha portato all’identificazione per la prima volta in I. axillaris di INSV (impatiens necrotic spot virus: virus della maculatura necrotica dell’impatiens), si è verificato nella primavera del 2011 in una serra che precedentemente aveva ospitato piante di cineraria (Senecio spp.) molte delle quali avevano manifestato i tipici sintomi dell’infezione da Tospovirus. Si ritiene utile segnalare questo recente ritrovamento affinché i produttori di specie ornamentali, aromatiche ed anche orticole della Piana di Albenga non abbassino la guardia e che, nel caso di sospetta virosi, informino tempestivamente i tecnici a cui normalmente si appoggiano e gli specialisti in campo virologico per avviare assieme quelle strategie di difesa in grado di salvaguardare le loro produzioni dai danni economici dovuti alle infezioni da Tospovirus. Reperimento dei campioni – Nel mese di aprile del 2011, in un impianto di I. axillaris in vaso, è stata notata un’alterazione cromatica sulle foglie, seguita dal disseccamento del lembo. In realtà, nelle fasi iniziali della malattia, data la modesta dimensione delle foglie di questa campanulacea, non è stato facile individuare i sintomi costituiti da anelli concentrici clorotici o biancastri, poi necrotici, a volte di diametro di pochi millimetri, molto ravvicinati. Non sono state notate alterazioni morfologiche e/o cromatiche sui fiori; ciò nonostante, le piante caratterizzate dalla presenza di molte foglie con anulature erano fortemente compromesse nel loro sviluppo dato il successivo disseccamento dei getti coinvolti dalla sintomatologia. Indicativamente, la malattia dell’anulatura concentrica interessava il 7% delle piante in produzione. Alcuni individui sintomatici sono stati sottoposti alle indagini virologiche del caso. Il ritrovamento di INSV in I. axillaris costituisce una novità in senso assoluto, dato che fino ad ora era stata segnalata la presenza di questo virus in Canada, nel 1991, su di un’altra specie (spontanea) dello stesso genere, I. fluviatilis (L. fluviatilis). Si allunga quindi la lista degli ospiti naturali di INSV e, non a caso, ciò si verifica in Liguria, regione notoriamente vocata alla produzione di specie ornamentali, e precisamente nella Piana di Albenga, area dove nel recente passato abbiamo più volte individuato nuovi ospiti di Tospovirus. Ricordiamo, a tal proposito, il recente caso di Stephanotis floribunda (gelsomino del Madagascar) riscontrato infetto per la prima volta in Italia da TSWV. Dal punto di vista epidemiologico è stato più volte sottolineato come la stretta vicinanza di specie ornamentali suscettibili con altre ospiti di tospovirus, spontanee e/o coltivate, favorisca il contagio, ossia la trasmissione per mezzo di tripidi viruliferi. Nel caso da noi descritto, supponiamo che il verifi...

Lippia citriodora HBK (Verbenaceae) is an aromatic plant, with white-lilac flowers and pale-green leaves having a strong lemon scent, native to South America. This species is known to be susceptible to Alfalfa mosaic virus (AMV), responsible of bright yellow mosaic on leaves, necrotic spots and stunting. In the last decade, AMV has been frequently found infecting L. citriodora crops in the Herb Garden of Casola-Valsenio (Emilia-Romagna region).To confirm AMV presence, symptomatic leaves collected from two crops in 2006 and again in 2011, were tested in PAS-ELISA. To determine specific subgroup, IC-RT-PCR was performed using a polyclonal serum against an AMV isolate from lettuce, combined with two AMV specific primer pairs: a DNA fragment of c.a. 750 bp, covering the entire coat protein gene (CP), was obtained. Products were gel purified, cloned in pGEMT Easy vector (Promega, USA) and sequenced on both strands. Comparison of CP sequences of AMV-L. citriodora isolates with referenced sequences of AMV isolates, revealed the maximum (98.2-97.0%) nucleotide identity with isolates of subgroup I, compared with 95.5-94.0% of subgroup IIA and 95.2% (average between the two sequences) of subgroup IIB. These results confirm that AMV isolates infecting L. citriodora belong to subgroup I, which includes all isolates found in Italy until now. AMV presence could be explained by accidental vegetative propagation of latent infected plants or aphid transmission, although two independent events of infection likely affected at different time the crops of L. citriodora analyzed, since 1.2% of nucleotide difference between the two isolate has been detected.

The Teucrium genus (Lamiaceae family) contains about 300 species of evergreen and deciduous shrubs with some species widely used as ornamental plants in rock gardens. During spring 2010 and again in the same period of 2011, some plants of Teucrium fruticans L., also known as “tree germander”, growing singly in pots in a Ligurian nursery (Savona province, Northern Italy), were noted for a bright yellow calico mosaic on the leaves. About 1% of approximately 2000 plants inspected exhibited symptoms. Preliminary electron microscope observations of leaf-dips showed semispherical bacilliform particles, consistent with Alfamovirus and Oleavirus, in preparations obtained only from leaves of symptomatic plants. Three symptomatic and two asymptomatic plants were checked for the presence of Cucumber mosaic virus,or Alfalfa mosaic virus in PASELISA by using commercial kits (Bioreba, Switzerland), and Olive latent virus 2 (OLV2) by immunodecoration of virus particles with an OLV2 antiserum produced against an Italian OLV2 isolate. Symptomatic plants were positive only to AMV, whereas all asymptomatic plants were negative to all viruses checked. The virus was succesfully transmitted mechanically to Chenopodium amaranticolor and Ocimum basilicum which reacted, as expected for infections caused by AMV (1), with chlorotic local lesion followed by mosaic and bright yellow mosaic respectively. The disease was transmitted also by grafting an infected scion on healthy T. fruticans, and symptoms appeared after about 3 weeks. AMV infection in symptomatic grafted plant was verificated by PAS-ELISA, confirming that bright yellow mosaic symptoms observed in T. fruticans were induced by an isolate of AMV. Immunocapture Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction assay, following the protocol described by Wetzel et al. (2), was performed on leaf extracts from one symptomatic plant, using a polyclonal serum raised against a French isolate of AMV, kindly provided by H. Lot (INRA, Station de Pathologie Végétale, Avignon, France). Specific AMV primer pair was used in the RT-PCR reactions (3). A DNA fragment of c.a. 750 bp, covering the entire coat protein gene (CP), was obtained after ICRT- PCR and fragment was gel purified with the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA), cloned and two independent clones sequenced (MWG Biotech, Germany). The consensus sequence was submitted to EMBL (Accession No. FR854391). Pairwise comparison of the AMV-T. fruticans isolate CP sequence (named Tef-1) with those of AMV reference isolates, revealed the maximum (98.0-97.3%) nucleotide identities with isolates belonging to subgroup I, 95.5-94.0% identities with subgroup IIA isolates and 95.6% identity with the subgroup IIB isolate Tec-1 (4). Among subgroup I isolates, Tef-1 had the maximum CP nucleotide identity with the CP gene belonging to an AMV isolate identified in 2010 in Lavandula stoechas in the same geographic area, suggesting a common origin for these two viral isolates. The overall results clearly indicate that an AMV isolate was the causal agent of the calico-type mosaic observed in T. fruticans. To our knowledge, this is the first report of T. fruticans as a natural host of AMV.

Rosemary (Rosmarinus officinalis L.; Lamiaceae family) is a common and attractive evergreen shrubby species growing wild in the Mediterranean area, but cultivated for aromatic, ornamental and medicinal purposes. The interest towards this species is strongly arising, due to biological activities of essential oils extracted from leaves and flowers. In the Spring of 2011, symptoms of yellowing, necrotic spots, leaf rolling and stunting were observed on rosemary plants cultivated at three commercial aromatic growers of “Piana di Albenga” (Liguria region); in 2012 other plants showing witches’ broom symptoms were collected in the same area. In order to verify phytoplasma presence and to determine their identity, asymptomatic and symptomatic samples were tested by applying a direct PCR assay with universal primers P1A/P7A, followed by nested-PCR using primers F1/B6 or R16F2n/R2. Only from symptomatic samples expected length bands were obtained and RFLP analyses using restriction enzyme Tru1I allowed to classify phytoplasmas as belonging to ribosomal group 16SrXII-A (stolbur) in 2011 samples and 16SrI-B (aster yellows) in 2012 samples. Phytoplasma finding in rosemary represents the first report in this species. Considering that Liguria is the most important region for aromatic plants production, for a rapid and efficient eradication of this disease it is necessary to eliminate all symptomatic plants that could play an important role in the epidemiology of stolbur and aster yellows, as well as vectors (leafhoppers) and weeds, using suitable mechanical methods. Specific phytoplasma control of mother-plants before their vegetative propagation is also a necessity to prevent economic losses in rosemary crops.

Monarda fistulosa L. (“wild bergamot”) is an annual or perennial medicinal plant known for the strong thera-peutic effects: its essential oil is characterized by high antibacterial, antimycotic, and anti-inflammatory activi-ties and, for this reason, has been recently proposed for the treatment of seborrhoea (Zhilyakova et al., 2009). During a survey carried out in 2009 in Italy, wild ber-gamot showing yellows, stunting, virescence and flower bud proliferation was found for the first time infected by a phytoplasma belonging to ribosomal subgroup 16SrXII-A “stolbur” (Bellardi et al., 2011). In 2010, a study to verify the correlations between phytoplasma presence and symptom expression, and the effects of these prokaryotes on essential oil composition was car-ried out. During Summer 2010, molecular tests to confirm phy-toplasma presence were carried out in M. fistulosa plants belonging to the same crop surveyed in 2009, (Herb Garden, Casola Valsenio, Italy). Starting from July, increasing percentages of plants showing phyto-plasma symptoms (more than 80%) were observed. Symptomless (=SLP) and symptomatic plants (=SP) (Fig. 1) were labelled by visual inspection of their aerial parts and tested at blooming stage to verify phytoplasma presence and to determine their identity. After a chloro-form/phenol extraction (Prince et al., 1993), plants were tested by direct PCR with primers P1/P7 followed by nested PCR with primers R16F2/R2 . RFLP analyses were performed with TruI and Tsp509I for 16 hours at 65°C and with HhaI for 16 hours at 37°C and analysed on 5% polyacrilamide gels after ethidium bromide staining. About 900 gr fresh aerial part material of SP and about 120 gr of SLP were collected in August at the end of flowering, and hydrodistilled; the two oils were separated from water and kept in tightly closed amber vials before analyses. Identification of the compounds was made by combined gas chromatography mass spec-trometry (GC/MS) and by comparing retention times of M. fistulosa components with those of a control oil from plants grown in Trentino Region (Northern Italy) While in 2009, only 50% of the plants showed phyto-plasma symptoms and was found to be infected only by stolbur, in 2010, amplifications resulted from both symptomless and symptomatic plants (any phyto-plasma-free plant was detected). Both, direct and nested PCR, as well as RFLP analyses on 16Sr DNA gene, confirmed that in all wild bergamot plants, stolbur phy-toplasma was present in single infection in SLP sam-ples, and in mixed infection with phytoplasma belong-ing to ribosomal subgroup 16SrI-B (Aster yellows, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’: AY) in SP samples. Considering that every single plant, with or without symptoms, was phytoplasma-infected, no phytoplasma-free material has been collected to obtain control oil from healthy plants. The increasing of phytoplasma in-fection (100%) inside the Herb Garden occurred as a consequence of the presence of leafhoppers, weeds and other medicinal phytoplasma-infected plants, such as Echinacea purpurea Moench, Digitalis lutea L., D. lanata Ehrh., Grindelia robusta L., recently reported as “new natural host” of AY and/or stolbur phytoplasmas (Bellardi et al., 2007). Differences in compositions between the oils from SP and SLP were observed. As shown in table 1, in which the percentage presence of 18 components is listed ac-cording to their elution order, the oil from SP showed an increase in the quantity of some monoterpenes like -thujene, - and -pinene, and -phellandrene as well as in the content of -caryophyllene and a marked de-crease in the content of thymol. On the other hand, oil from SLP yielded only a significant increase in thymol concentration as only relevant modification and a marked decrease in monoterpene compounds. Composition of the oils obtained by distillation varies significantly among different M. fistulosa hybrids (Mazza and Marshall, 1992); thy...

Uno dei virus maggiormente diffusi nelle coltivazioni di specie orticole, ornamentali, foraggere ed officinali di tutto il mondo è il virus del mosaico dell’erba medica (alfalfa mosaic virus: AMV; famiglia Bromoviridae). Fu individuato per la prima volta in erba medica (“alfalfa” o “lucerne”) nell’America del Nord nel 1931 e poi, a partire dagli anni quaranta, in vari Paesi Europei, fra cui anche l’Italia. Negli ultimi decenni, AMV è stato ripetutamente segnalato in coltivazioni, sia in pien’aria che in serra, di molte nostre Regioni, rendendosi responsabile di malattie anche gravi dal punto di vista economico, senza tralasciare la sua presenza ormai ubiquitaria su tante specie ornamentali arbustive molto comuni del “verde” urbano ed extraurbano dei centri abitati e le Lavande. Uno dei sintomi che ne contraddistingue la presenza è il tipico “mosaico giallo- oro” sulle foglie. Il caso che andiamo ad illustrare, e che vede coinvolto AMV, si riferisce ad una specie arbustiva attualmente molto utilizzata a scopo ornamentale soprattutto nelle zone litoranee, per la sua robustezza e rusticità, oltre che per la bellezza del fogliame e dei fiori: Teucrium fruticans L. T. fruticans, appartenente alla famiglia delle Lamiaceae (ex Labiatae), è diffuso in Europa ed anche in Italia. E’ un arbusto sempreverde dalle foglie ovate, grigio-verdi, aromatiche se spezzate. I fiori sono di colore lavanda chiaro od azzurro pallido, lunghi fino a 1,5-2 cm; la fioritura va da febbraio ad ottobre. Si utilizza per la realizzazione di siepi sagomate, alte anche 2-3 m. Il “mosaico giallo”: lamalattia è stata individuata a partire dal mese di marzo-aprile e fino alla fioritura, sia del 2010, sia del 2011. Le piante manifestavano una vistosa maculatura giallo-oro concentrata nelle zone periferiche del lembo fogliare; in alcuni casi, la confluenza delle singole aree gialle determinava la quasi totale scomparsa della normale colorazione verde, per cui la foglia appariva pressoché completamente di colore oro-brillante; la taglia è apparsa normale, così come la fioritura, anche se i petali si mostravano di una tinta più tenue, quasi sbiadita. La malattia interessava circa l’1% delle piante in produzione. Il rinvenimento di AMV in T. fruticans in Liguria costituisce una novità, dato che si tratta di un nuovo ospite naturale di questo virus. Ulteriori indagini di laboratorio, soprattutto di tipo molecolare, sono attualmente in corso per caratterizzare questo isolato e determinarne con esattezza il sottogruppo di appartenenza. Parallelamente, si cercherà di verificare se la presenza di AMV in T. fruticans sia in grado di influire sul suo metabolismo secondario, ossia sulla qualità e quantità dei principi attivi, mediante l’opportuna comparazione degli oli essenziali estratti da individui sani ed infetti dal virus. Indipendentemente dalle ulteriori ricerche riguardanti il genoma di AMV ed il rapporto pianta-patogeno, questo nuovo caso su di una specie coltivata in Liguria, e nella Piana di Albenga in particolare, si presta ad importanti considerazioni di tipo epidemiologico che vedono coinvolti i produttori liguri. Non dimentichiamo, infatti, che di recente ci siamo occupati di nuove infezioni naturali da AMV su specie coltivate in quest’area geografica, come ad esempio Lavandula stoechas, Rosmarino ed Origano (caratterizzate da mosaico giallo-oro sulle foglie), Peperone (con sintomi di mosaico di tipo “calico” sulla lamina fogliare e malformazione delle bacche) ed Ortensia (con ingiallimenti fogliari).

L’echinacea purpurea [Echinacea purpurea Moench., ] è una pianta ornamentale caratterizzata da ampi capolini fiorali raggiati, simili a quelli della margherita. Nel settore Erboristico è una delle piante officinali più interessanti, impiegata per le dimostrate proprietà immunostimolanti, antivirali, antibatteriche ed antinfiammatorie dovute alla presenza di diversi polifenoli, fra cui l’acido caffeico ed i suoi esteri. Gli agenti patogeni infettivi di cui ci proponiamo di sottolineare la pericolosità per scongiurarne l’ulteriore diffusione nel nostro Paese, sono i fitoplasmi. Il sintomo più grave associato alla presenza di fitoplasmi riguarda il fiore, che risulta profondamente deturpato, sia morfologicamente che cromaticamente; ne viene quindi compromesso il “normale” utilizzo in ambito ornamentale, ma non solo. Se si considera, come accennato poc’anzi, l’impiego terapeutico di E. purpurea si intuisce come un’infezione da fitoplasmi possa influire sulla resa degli impianti in termini di qualità e quantità del prodotto destinato anche all’utilizzo nel settore erboristico. “Virescenza” - I primi sintomi sono stati osservati nel Giardino delle Erbe di Casola Valsenio (Ravenna) su alcune piante che, già a metà di maggio, in anticipo quindi rispetto alla normale epoca di fioritura per questa specie alle nostre latitudini (indicativamente metà di giugno), hanno prodotto fiori piccoli e completamente verdi, sorretti da gambi stranamente ingrossati. Successivamente, altre piante, di taglia normale, erano caratterizzate da capolini fiorali costituiti da petali anch’essi di colore verde (virescenza). In alcuni casi, l’anomalia di colore interessava solo parzialmente il fiore, che si presentava metà verde e metà del tipico colore rosa intenso. Non sono stati notati sintomi a livello dell’apparato fogliare, come ad esempio giallumi, arrossamenti o malformazioni. La “virescenza” comprometteva oltre il 50% delle piante in coltivazione. “Fillodia” - La malattia è apparsa al momento della fioritura (giugno), quando la quasi totalità delle piante coltivate in un piccolo lotto del campo sperimentale della Facoltà di Agraria (Bologna) ha prodotto capolini fiorali costituiti da un ammasso di foglioline, di forma allungata, verdi. Spesso, su di una stessa pianta, si sono notati fiori normali come forma e dimensioni, ed altri caratterizzati da strani ciuffi di foglie, molto addensate l’una sull’altra, tanto da raggiungere un’altezza anche di 10-12 centimetri. Anche in questo caso, le foglie della pianta apparivano normali come forma, dimensione e colore. Per confermare la presenza di fitoplasmi, sono state applicate le tecniche PCR e RFLP, mediante le quali è stata verificata la presenza di due fitoplasmi diversi: 16SrI-B nei campioni che manifestavano virescenza del fiore, e 16SrIX-C nelle piante con fillodia.

La Monarda od Erba bergamotto (Monarda fistulosa L.) è una specie erbacea appartenente alla grande famiglia delle Lamiaceae, spesso indicata anche come “erba indiana”, sia perchè originaria dell'America settentrionale, sia perchè molto amata dagli indiani pellerossa. Nell'area ora coperta da New York gli indiani Oswego usavano infatti le foglie di M. fistulosa in infusione per curare problemi respiratori; ancora oggi le sue foglie aromatiche vengono usate per conferire sapore al tè “Earl Grey”. Sia M. fistulosa che l’altrettanto comune M. didyma, sono molto amate come piante perenni da giardino: la loro altezza varia dai 70 ai 180 cm circa e producono in piena estate abbondanti fiori (bianchi, violetti, rosa, rossi o violacei) adatti anche ad essere recisi. La fioritura è costituita da un fascio tondo di minuscoli fiori campanulati; sono in realtà le brattee circostanti che conferiscono alla Monarda una peculiare bellezza (i fiori di M. fistulosa sono generalmente di un bel colore lilla o violetto). Mischiando questa specie aromatiche con altre, come achillea, agastache, lavatera, lobelia, nepeta, maggiorana, salvia e veronica, si creano colorate e profumate bordure. Dal punto di vista agronomico e fitopatologico in particolare, è considerata alquanto rustica e di facile coltivazione. L’unica malattia che può comprometterne la crescita a lo sviluppo è il mal bianco (Oidium spp.). Grazie però ad un accurato lavoro di miglioramento genetico, sono state di recente selezionate e commercializzate varietà poco suscettibili o tolleranti, soprattutto di M. didyma. Da diversi anni M. fistulosa è coltivata nel Giardino delle Erbe “Augusto Rinaldi Ceroni” di Casola Valsenio (Ravenna) come pianta mellifera. Nel 2009, durante una delle ispezioni che annualmente sono eseguite dalla Facoltà di Agraria di Bologna (DiSTA-Patologia vegetale) per valutare visivamente la crescita e la sanità delle specie officinali ivi presenti, è stato notato che il 50% delle Monarde ottenute da seme, al primo anno d’impianto, presentava sintomi riferibili a fitoplasmi. Di questi pericolosi agenti patogeni capaci di “trasformare” i fiori di specie officinali coltivate nel Giardino delle Erbe, ci siamo già occupati in precedenti articoli apparsi su questa Rivista, vedi la malattia indicata con il termine di “virescenza” in Grindelia robusta, Digitale lanata e, più di recente in Echinacea purpurea . In tutti questi casi, a seguito dell’applicazione di tecniche di diagnostica molecolare, i fitoplasmi coinvolti sono risultati appartenere al gruppo 16SrI del giallume dell’astro (Aster Yellows: AY, sottogruppo 16SrI-B). Abbiamo quindi voluto verificare se anche la malattia osservata su Monarda fosse associata alla presenza di fitoplasmi e, nel caso di esito positivo, l’appartenenza o meno dei procarioti coinvolti al gruppo ribosomico già individuato su altre specie nel medesimo ambiente. L’individuazione di fitoplasmi in M. fistulosa non costituisce una novità in senso assoluto. Già in passato, infatti, e precisamente nel biennio 1997-’98, erano state descritte alcune gravi sintomatologie associate alla presenza di questi patogeni in coltivazioni del Canada. Questo descritto costituisce quindi il primo ritrovamento di fitoplasmi in Monarda in Italia ed in Europa, ed il primo ritrovamento in questa specie di fitoplasmi “stolbur”.

Il virus del mosaico dell’erba medica (AMV), unica specie conosciuta del genere Alfamovirus (Bromoviridae), è noto in tutto il mondo per l’elevata polifagia. Lo spettro di piante ospiti naturali è, infatti, assai ampio: almeno 600 specie distribuite in 50 famiglie botaniche, principalmente Fabaceae (Leguminose), Solanaceae e Lamiaceae (Labiate). AMV infetta molte piante coltivate come foraggere (erba medica, sulla, trifoglio, ecc.), ortensi (patata, peperone, fagiolo, pisello, lattuga, sedano, ecc.), ornamentali (viburno, ortensia, pelargonio, ecc.) ed officinali (lavanda e lavandino, erba cedrina, menta, basilico, ecc.), a cui si aggiungono numerose specie spontanee che costituiscono un immenso serbatoio di conservazione del virus nell’ambiente. Dal punto di vista epidemiologico, questo virus trova negli afidi (oltre venti specie) i principali vettori naturali, ma la grande diffusione di AMV è diretta conseguenza della possibilità di infettare il polline ed il seme di molte specie vegetali, con percentuali anche alquanto elevate. Come si nota nella Tabella 1, in alcune leguminose, come nel genere Medicago, esse sono molto variabili, soprattutto in funzione della varietà di erba medica interessata e del ceppo di AMV coinvolto; è stato anche notato che l’infettività nei semi persiste per oltre 5 anni. Dalla Letteratura non risulta alcuno studio riguardante la trasmissione di AMV nel seme di basilico (Ocimum basilicum), specie aromatica fra le più importanti dal punto di vista economico in Italia ed in particolare in Liguria, ove costituisce uno dei “fiori all’occhiello” della produzione agricola tipica. Ogni anno però, anche se con percentuali d’infezione abbastanza basse, i coltivatori di basilico liguri notano all’interno degli impianti alcune piantine con i caratteristici sintomi fogliari di tipo “calico” (mosaico biancasto e/o giallo oro) indotti da AMV. Trattandosi di pochi esemplari, essi si limitano ad allontanare tempestivamente gli individui infetti per evitare la diffusione del virus tramite le popolazioni di afidi. Ne consegue che, da quanto ci risulta, non è mai stata verificata sperimentalmente l’origine della presenza di AMV nelle coltivazioni di basilico (e non solo della Liguria), quindi neppure la possibilità che il virus in questa aromatica possa localizzarsi nel seme, così come avviene in altri ospiti naturali. Quella che presentiamo costituisce la prima ricerca condotta su seme raccolto da piante-madri di basilico infette da AMV. Prova sperimentale Fasi della prova sperimentale condotta nel biennio 2010-2011 in serra condizionata ed ombreggiata, all’interno di gabbie a prova di insetto: 2010 - inoculazione meccanica di piante virus-esenti di O. basilicum “Gigante genovese” con AMV-L. stoechas. 2011 - raccolta dei semi dalle piante-madri di basilico sintomatiche e risultate infette da AMV-L. stoechas (mediante saggi PAS-ELISA e RT-PCR) - lavaggio e semina degli stessi in cassetta alveolare ricolma di torba Germinabilità ottenuta: 26,42% - osservazione visiva delle piantine durante la crescita 2011 - lavaggio e semina di semi commerciali di O. basilicum “Gigante genovese” (c.s.) Germinabilità ottenuta: 66.99% - osservazione visiva delle piantine durante la crescita Tre delle piantine nate dal seme raccolto nel 2011 da O. basilicum infetto con AMV-L. stoechas hanno mostrato i sintomi tipici di mosaico giallo e/o biancastro. La presenza di AMV-L. stoechas in queste tre piantine è stata verificata mediante l’applicazione delle tecniche PAS-ELISA, RT-PCR ed inoculazioni meccaniche del succo prelevato da porzioni di foglie con sintomi su piante indicatrici, fra cui Vigna sinensis che ha manifestato ampie lesioni locali di colore rosso. La percentuale di infezione di AMV nel seme di basilico è risultata dello 0,54%. Queste indagini, seppure preliminari, dimostrano chiaramente e per la prima volta, come anche nel basilico avvenga la trasmissione per seme di AMV.

Echinacea purpurea Moench (L.), known as purple coneflower, is one of the most important medicinal plants, used worldwide for its immunostimulant, bacteriostatic and anti-inflammatory properties, as natural drug and/or food supplement (as infusion). In a previous study carried out in 2002 in Italy to verify possible influence of viral infectious on the plant oil composition, the oil from plants (grown at the Herb Garden of Casola Valsenio, Emilia Romagna region) infected by Cucumber mosaic virus (CMV) was compared to the one from healthy plant by combined gas chromatography mass spectrometry (GC/MS) analyses. Significant quantitative variations in their compositions were verified; the infected materials afforded a lower content of sesquiterpene hydrocarbons (e.g., the percentage of germacrene D was reduced of 52%) (Hudaib et al., 2002). Considering that in 2009, E. purpurea plants cultivated in the same Herb Garden showing virescence flower symptoms, were found infected by a phytoplasma belonging to ribosomal subgroup 16SrI-B (Aster Yellows, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’: AY) (Bellardi et al., 2009), the essential oils from CMV-infected, AY-infected, and healthy E. purpurea plants were investigated to confirm that other factors (in addition to origin, cultivation, environmental conditions), such as pathogen infections, may induce variations in the oil composition and quality. Before collection, each plant showing flower virescence, CMV symptoms (yellow mosaic on the leaves) and other asymptomatic ones (control), was labelled after visual inspection of the aerial parts and analyzed by PAS-ELISA, RT-PCR and SSCP (for CMV presence), PCR and RFLP (for AY presence). These diagnostic tests allowed the separation of three distinct batches of plant material (leaves and flowers): AY(16SrI-B)-infected, CMV(belonging to subgroup IA)-infected and healthy. Steam distillation was used to extract essential oil from dried aerial part using a commercial Clevenger apparatus. Identification of the compounds was made by GC/MS. A total of 30 compounds were identified and qualitative composition resulted comparable to that already reported; however the percentages of all compounds in the three oils were different. The main differences were detected for three components: limonene (2.2 % in healthy, 8.4% in CMV-infected, and 4.4% in AY-infected plants), cis-verbenol (1.8% in healthy, 3.4% in CMV-infected, and 5.6% in AY-infected plants), and its relative ketone verbenone (2.7% in healthy, 7.1% in CMV-infected, and 11.4% in AY-infected plants). Another minor increase was recorded for carvone (0.8 % to 2.5 %) content, but only in plants affected by phytoplasmas. These chemical differences in the oil composition can be useful to characterize the “product” whose pharmacological activity is frequently reported to correlate with its components. Considering the economic importance of E. purpurea as medicinal species, in addition to the routine growth-stage control during the plant life cycle, attention should be also paid to the plant health-status upon its collection, to ensure uniformity of the drug constituents and a better standardization of production procedures. Bibliography Bellardi M.G., Paltrinieri S., Contaldo N., Benni A., Bertaccini A.., Biffi S. Natural 1, 2009, 84, 24-31. Hudaib M., Cavrini V., Bellardi M.G., Rubies-Autonell C., J. Essent. Oil Res., 2002, 14, 427-430. Mazza G., Cotrell T. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 3081-3085 and reference cited herein.

Viburnum opulus L. (“snowball”, Caprifoliaceae) is a deciduous shrubs used as decorative plants for its fragrant white flowers that bloom in spring. In May 2011, snowball plants showing a virus-like disease were observed in two ornamental public gardens in Imola (Bologna, Emilia Romagna region). Symptoms appeared distributed on only part of the foliage, and consisted of chlorotic rings and spots, line-patterns and, in some cases, vein clearing on younger leaves. Since only Alfafa mosaic virus (AMV) and Cucumber mosaic virus (CMV) have been reported to naturally infect this Viburnum species, and considering that snowball could be an important source of virus infection, symptomatic plants were examined by applying Immunocapture Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (IC-RT-PCR). Tests were performed on leaf extracts using two polyclonal antisera against an AMV isolate from lettuce and CMV isolate from tomato, respectively. Only AMV was found infecting symptomatic V. opulus. The CPAMV1/CPAMV2 specific AMV primer pairs were used in RT-PCR reactions. A DNA fragment of c.a. 750 bp, covering the entire coat protein gene (CP) of AMV, was obtained after IC-RT-PCR and the product was gel purified and cloned in pGEMT Easy for sequencing. Comparison of the CP sequence of AMV-V. opulus with the CP reference sequences of some AMV isolates, revealed the maximum nucleotide identities with subgroup I isolates. AMV has been previously found infecting V. opulus in Italy in 1995, but the leaf symptomatology observed was only vein yellowing.

Il genere Hosta comprende oltre 40 specie e circa 2000 varietà di piante erbacee perenni originarie di Giappone, Cina e Corea, molto decorative per la crescita Dal punto di vista patologico, le Hosta si sono rivelate fino ad oggi piante alquanto robuste. Per quanto riguarda, invece, le infezioni ad eziologia virale, da circa 20 anni le ricerche riguardanti i virus dell’Hosta si sono intensificate, tanto è vero che al momento é possibile indicare quale virus ubiquitario di questa liliacea HVX (virus X dell’Hosta), a cui si aggiungono TRSV ( virus della maculatura anulare del pomodoro); TRV (virus del “rattle” del tabacco); ArMV (virus del mosaico dell’arabis); TSWV (virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro); INSV (virus della maculatura necrotica dell’impatiens). Mentre TRSV, ArMV e TRV sono trasmessi da nematodi, ed i due tospovirus INSV e TSWV da tripidi, di HVX non si conosce il vettore naturale. Individuato per la prima volta in USA nel 1996, infetta attualmente la maggior parte delle varietà in coltivazione, rendendosi responsabile di sintomatologie anche gravi. Il caso che descriviamo, verificatosi in Emilia Romagna nel 2010, costituisce il primo esempio in Italia di una malattia su Hosta associata alla presenza di HVX. E’ necessario che i produttori di questa liliacea siano a conoscenza dell’elevata capacità di diffusione di questo virus ed attuino tutte le norme di profilassi necessarie per evitare danni economici agli impianti. La malattia Nel mese di ottobre, in un’Azienda specializzata nella produzione di Hosta spp., è stata osservata una malattia sulle varietà “Gold Standard” (foglie giallo oro con sottile margine verde scuro), “Sum and Substance” (foglie verde chiaro tendente al giallo) e “Whirlwind” (foglie ondulate, color crema con bordo verde), caratterizzata da una maculatura verde intenso lungo le nervature, come una sorta di “chiazzatura” del tutto paragonabile all’inchiostro che si spande su della carta assorbente. In alcuni casi, erano visibili delle macchie rotondeggianti verde scuro e, in altri ancora, il tessuto appariva spugnoso, increspato, di diverso spessore ed il lembo alquanto malformato. La malattia interessava circa l’80% della “Gold Standard”, il 20% della “Sum and Substance” ed il 10% della “Whirlwind”. Il caso da noi descritto relativo all’Emilia Romagna costituisce il primo in Italia. Ciò non significa che infezioni da HVX non si siano già verificate in passato in altre aziende del nostro Paese.

Infection caused by Alfalfa mosaic virus (AMV) is one of the most important viral diseases of basil (Ocimum basilicum L.) worldwide. Symptoms elicited by AMV in basil are very characteristics consisting in a bright yellow-white mosaic of “calico-type”. For this reason, basil is routinary used as differential host of AMV. Recently, in some basil cultivations of Southern Italy, realized with seed reproduced by farmers, a recrudescence of the disease caused by AMV was observed. In 2010, a survey was conducted in an insect-proof greenhouse at 20-24 °C to verify seed transmission of AMV in basil. Plants of basil “Gigante Genovese” were sap-inoculated with the subgroup I AMV-Lst isolate and bright yellow mosaic appeared after about 3 weeks on inoculated plants. AMV infection on symptomatic plants was confirmed by PAS-ELISA test with specific AMV antisera. About 2100 mature seeds, harvested from a single AMV-infected basil plant, were sown in steam sterilized soil. Germination rate obtained from the infected plant was much lower (26.42%) than from healthy basil “Gigante Genovese” (66.99%). Only 3 plantlets, obtained from seeds harvested from the infected plant, showed typical bright yellow mosaic, whereas AMV infection was tested, both in symptomatic and asymptomatic plantlets, by back inoculations on local lesion hosts (Vigna unguiculata L. “Black eye”), DAS-ELISA and RT-PCR by using primer pairs specific for AMV coat protein gene. All these diagnostic methods confirmed AMV infection only in the three symptomatic plantlets, thus the percentage of seed transmission was of 0.54%. Moreover, the identity of AMV-Lst was confirmed by sequencing the amplicon obtained by RT-PCR on the RNAs extracted from symptomatic plantlets. AMV has a wide host range including ornamental and vegetable species. Consequently, seed-borne AMV infection may have important practical implications since the virus source can be reintroduced every year with basil seed, leading to spread of virus by aphid to other susceptible crops. This study represents the first evidence of AMV as seed-born disease in basil.

From 2008 to 2010, an epidemiological study on the spread of Alfalfa mosaic virus (AMV) in some Lavandula vera crops located in Liguria Region (Albenga area) has been carried out. In fact, this non-persistent aphid-born virus, represents one of the most dangerous and economically important pathogens involving both growth and ornamental appearance of this aromatic species. In 2008 and 2009 numerous inspections were made at several lavender producers with accurate examination of pot-plants before blooming; AMV was serologically and molecularly detected by applying DAS-ELISA and PCR tests respectively, associated to stunting and yellow mosaic leaf symptoms. Considering that L. vera is propagated by shoots and that mother-plants (10-12 years old) growth at borders of pot-plants crops, in 2010 serological analyses were carried out to control ligurian propagation materials. Some mother-plants of L. vera showing leaf mosaic symptoms resulted AMV infected. One isolate of AMV from affected mother-plants was molecularly characterized and compared with previously characterized Italian lavender isolates of AMV, including a second one found infecting in 2010 L. vera “None Blue” in Emilia-Romagna Region. Results indicated that both these two isolate of AMV-L. vera (from Liguria and Emilia-Romagna) belonged to subgroup I, according with restriction profiles of the coat protein gene and phylogenetic relationships with other AMV isolates belonging to subgroups I and II. As prevention measures, mother-plants could be selected by periodic visual inspections and serologically tested for AMV presence. Virus-free shoots used as propagation material and large crop rotation periods are the most effective type of control.

In the Spring of 2010, Eruca sativa Mill. (Brassicaceae family), also known as rocket, cultivated in a private garden of Sicily region was found to show a severe virus-like disease consisting of mosaic, interveinal yellowing and/or dark greening areas on crinkled leaves and stunting. Preliminary electron microscopy observations of leaf-dips revealed the presence of flexuous filamentous particles 700-750 nm long. Considering that in 1959, in Italy, this species has been indicated as a natural host of Turnip mosaic virus (TuMV), symptomatic leaf samples were serological tested to verify the presence of this potyvirus. Both ISEM and PAS-ELISA analyses were positive to TuMV infection. Mechanical inoculations carried out using rocket leaf sap made it possible to transmit this virus to Chenopodium murale L. (local symptoms) and C. quinoa Willd. (necrotic spots and systemic veinal flecks); any of the others herbaceous species belonging to Brassicaceae family were infected. In order to further characterize the virus at the molecular level, the coat protein (CP) gene of this isolate was cloned and sequenced. Comparison the CP gene with other reported TuMV isolates from different areas of the world showed higher amino acid identities. These results indicated that the degrees of the homology of the CP genes are probably related to the major differences in host specificity, but not to geographic distribution. Although its diffusion in Italy, TuMV does not appears associated with serious diseases outbreaks.

Il virus del mosaico dell’erba medica (alfalfa mosaic virus: AMV; famiglia Bromoviridae) è un patogeno altamente polifago capace di infettare in Natura oltre 600 specie vegetali. In Italia, la sua prima segnalazione risale al 1939 quando venne descritto su peperone (Capsicum annuum); nei decenni successivi, AMV è stato individuato in diverse coltivazioni, soprattutto ornamentali, ortive, foraggere ed anche officinali. Con l’affinamento delle tecniche diagnostiche ed il miglioramento delle conoscenze in campo virologico, numerosi isolati sono stati caratterizzati sotto il profilo biologico e, recentemente, anche molecolare. Delle malattie associate alla presenza di questo virus ci siamo occupati spesso, negli ultimi anni, nel corso di ricerche epidemiologiche eseguite nelle coltivazioni di specie officinali della Piana di Albenga (Savona). Ad esempio, durante un sopralluogo eseguito nel mese di settembre del 2007 in un impianto all’aperto di peperoncino aromatico fu osservata una sintomatologia consistente in nanismo, mosaico di tipo “calico” sulla lamina fogliare e malformazioni delle bacche: le piante risultarono infette da AMV (Clamer informa, 3, 2008); più di recente, fine 2007-inizio 2008, questo virus è stato individuato anche in un impianto in piena aria di rosmarino (Rosmarinus officinalis) allevato in vaso, caratterizzato da un vistosa variegatura giallo oro sulle foglie (Clamer informa, 12, 2008). Fra le specie officinali notoriamente ospiti naturali di AMV vi è la lavanda (Lavandula vera; sin.: L. angustifolia, L. officinalis) con i suoi numerosi ibridi, meglio noti come “lavandini” (Lavandula hybrida: L. vera x L. latifolia), sulle cui foglie ed anche sul fusto induce la comparsa del tipico mosaico color oro. Non sempre, però, i sintomi sono evidenti sull’apparato fogliare: in alcuni casi, infatti, la pianta, seppure ospite del patogeno, è apparentemente normale (infezione latente). La malattia del “mosaico giallo” è attualmente diffusa ovunque si coltivino piante del genere Lavandula; non a caso, negli ultimi anni, anche negli impianti di aromatiche della Piana di Albenga si sono registrati casi di infezione più o meno gravi, soprattutto su L. vera.

Fra le molteplici colture in vaso che caratterizzano la produzione floricolo-ornamentale della Piana d’Albenga (Savona), si annovera Stephanotis floribunda Brongn. (Gelsomino del Madagascar; Asclepiadaceae), una bella pianta rampicante sempreverde, dalle foglie ovate, cuoiose e lucide, e dai fiori bianchi, carnosi, riuniti a grappoli, leggermente profumati. Nel mese di luglio 2009, il 2% delle piante presenti nella serra di un’azienda della zona di Albenga ha manifestato sintomi fogliari consistenti in anulature necrotiche biancastre e/o nerastre, concentriche, alquanto regolari, spesso confluenti tra loro. Le foglie maggiormente interessate dal sintomo diventavano inizialmente clorotiche, poi di colore giallo-oro, lasciando un caratteristico alone verde scuro, di alcuni millimetri, attorno alle anulature. La fioritura è apparsa normale. L’impianto era stato ottenuto utilizzando talee radicate, di 5-7 cm, importate nel mese di maggio dall’Olanda. La sintomatologia così particolare, nonché le abbondanti infestazioni da tripidi che si erano verificate nei mesi precenti, hanno indotto ad ipotizzare la presenza di un Tospovirus. A seguito dell’applicazione della tecnica immunoenzimatica PAS-ELISA, nelle foglie sintomatiche di S. floribunda è stata diagnosticata la presenza di TSWV (virus dell’avvizzimento maculato del pomodoro). I saggi biologici hanno consentito di trasmettere il virus ad alcune solanacee, fra cui Solanum melongena e Capsicum annuum le quali hanno evidenziato anulature e/o lineature clorotiche sulle foglie inoculate. L’identificazione del virus è stata confermata applicando tecniche di biologia molecolare quali RT-PCR utilizzando i primers TSWV-CP(+) 5’-TTAACTTACAGCTGCTTT-3’ e TSWV-CP(-) 5’-CAAAGCATATAAGAACTT-3’ che amplificano un frammento di circa 800pb che codifica per la proteina di rivestimento (nucleocapsid protein). Successivamente, l’amplificato è stato clonato mediante un kit commerciale “Perfect Blunt Cloning Kit” utilizzando le istruzioni della casa produttrice; la sequenza ottenuta è stata confrontata con altre di riferimento depositate in GenBank. TSWV è noto infettare S. floribunda fin dal 1988 in Oregon (USA); in Europa è stato ripetutamente rinvenuto in coltivazioni di questa ornamentale della Grecia e dell’Olanda. Si tratta della prima segnalazione di TSWV in Gelsomino del Madagascar in Italia.

Oncidium is a large genus of orchids that includes over 600 species. The quality of Ligurian Oncidium plant pots and cut flowers is highly appreciated in the Italian floral auction market, and the number of producers have increased in Sanremo area in the last decade. During the 2008 Spring season, Impatiens necrotic spot virus (INSV) was found by DAS-ELISA infecting greenhouse-grown Oncidium orchids displaying leaf symptoms ranging from necrotic concentric rings to necrotic lesions 1-2 cm in diam. Subsequently, symptomatic leaves exhibited yellowing and necrosis along the veins; no flower symptoms were observed. Oncidium plants were growing adjacent to Ranunculus hybrids infected by this tospovirus. To confirm the presence of INSV, total RNA was extracted from symptomatic Oncidium leaves and used for RT-PCR amplification of the nonstructural protein gene of INSV. The resulting primers directed the amplification of a PCR product of approximately 1300 nucleotides. To verify that the amplified products were derived from INSV RNA, the PCR fragment was cloned and 2 independent clones were sequenced in both directions. Sequence analyses of the cloned PCR product showed 98.6% nucleotide sequence identity, and 98.2 and 99.2% amino acid identity and similarity, respectively with a previously published INSV-NSs sequence (Gene Bank Accession no. NC_003624). Methods for reducing the risk of this disease include using uninfected plant material, removing weeds which act as hosts of the insect vector (Frankliniella occidentalis) or using insecticides to prevent virus transmissions. This is thought to be the first report of INSV infecting Oncidium in Italy.

Origanum vulgare L. (family Lamiaceae) is a perennial herbaceous species, originating from Mediterranean regions and Asia, widely cultivated as culinary herb and for therapeutic purposes. During spring-summer 2009, 3-4% of potted plants, randomly distributed in protected nurseries of Albenga area (Liguria region), were noted to be stunted and showing a bright yellow leaf mosaic (“calico” type). Mother-plants growing in the same nurseries for cutting production were symptomless. Preliminary electron microscopy observations of leaf-dips prepared from symptomatic and asymptomatic plants, revealed the presence of bacilliform virus-like particles in only symptomatic samples. Symptoms observed on herbaceous hosts mechanically inoculated with crude sap of a single affected plant (isolate Orv-1), were: chloro-necrotic lesions in Chenopodium murale, Beta vulgaris, Phaseolus vulgaris and Vigna unguiculata; systemic mosaic in Capsicum annuum and Nicotiana benthamiana; systemic mosaic and necrotic line-patterns in N. tabacum “Samsun”. The virus was serologically identified as an isolate of Alfalfa mosaic virus (AMV) by applying DAS-ELISA technique and molecularly using AMV-specific oligonucleotides pair, designed to retrotrascribe and amplify the coat protein (CP) gene. Restriction profile obtained after BamHI digestion of the putative CP gene amplicon, identified Orv-1 as an AMV subgroup I isolate (Parrella et al., 2000). A large set of oligonucleotides were used to amplify and sequence the whole RNA3 segment. Sequence analysis revealed that Orv-1 RNA3 was 2038 nucleotides in length, containing two open reading frames (ORFs) identified by sequence comparisons as coding the putative movement proteins (MP) and the CP. The first ORF consisted of 867 residues, coding for the 31 kDa putative MP, the second consisted of 657 residues, coding for the 24 kDa putative CP. Orv-1 RNA3 showed the highest percentage of identity with the RNA3 of the 425 Madison isolate (Acc. n. K02703) also belonging to AMV subgroup I. Phylogenetic relationships of Orv-1 isolate with members of AMV subgroups I and II, clearly showed that both CP and MP nucleotide sequences of this O. vulgare isolate clustered within the subgroup I, confirming preliminary results obtained by restriction analysis of the CP gene. Further works are in progress in order to sequence the entire genome of the Orv-1 AMV isolate. Although AMV was already reported to infect O. vulgare, first in Argentina (Feldman and Gracia, 1977) and then in New Zealand (Fletcher, 1987), to our knowledge this is the first record of AMV infecting this aromatic plant in Italy. This finding confirms an increasing diffusion of AMV in Liguria region, especially in aromatic crops.

Isotoma axillaris Lidt. (sin. Laurentia axillaris; also known as blue stars or rock isotome) is a perennial species of Campanulaceae native to Australia, typically cultivated as annual in Liguria region. Leaves are ovate or obvate in outline, with pinnatified lamina; solitary flowers bloom in April-May at the leaf axils. In 2011, severe symptoms resembling those caused by tospoviruses occurred in an ornamental farm located at Albenga area (Savona). Small necrotic concentric rings and necrosis of leaf lamina were present in almost 7% of plot blooming plants grown outdoors. Twenty symptomatic plants collected during inspections were maintained in insect-proof greenhouse at Bologna University. Virus was isolated by mechanical transmission to Chenopodiaceae species. Symptomatic I. axillaris was negative for Tomato spotted wilt virus and positive for Impatiens necrotic spot virus (INSV) in DAS-ELISA tests. To further confirm the presence of INSV, total RNA was extracted and used for RT-PCR. Nucleotide sequences obtained were found to be closely related to published sequences (98% nucleotide identity with INSV available under GenBank Accession Nos DQ523598, L20886, AB109100, and L20885). To now, INSV has been found in 1991 naturally infecting I. fluviatilis (sin. L. fluviatilis), another species of Isotoma, weed in Canada. Our finding is thought to be the first report of natural occurrence of INSV in I. axillaris. Investigations of the ornamental farm looking for thrips vector of INSV were performed and many populations were found, suggesting that thrips are the main responsible for INSV spreading as well as increasing of its natural hosts. FIRST REPORT OF HOSTA VIRUS X (HVX) INFECTING HOSTA IN ITALY Bellardi M.G.1, Cavicchi L.2 and Davino S.3 1 DiSTA-Patologia Vegetale, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale G. Fanin 42, 40127 Bologna, Italy. 2 Plesso Didattico G. Scarabelli, Alma Mater Studiorum, Università di Bologna, Viale G. Ascari 17, 40026 Imola, Bologna, Italy. 3 SENFIMIZO, Sez. di Patologia Vegetale e Microbiologia agraria, Università degli Studi di Palermo, Viale delle Scienze edificio 5, 90128 Palermo, Italy. E-mail: mariagrazia.bellardi@unibo.it Species of Hosta (Liliaceae) are herbaceous perennials more often grown for their foliage (blue, gold, green or variegated) then for their flowers. Virus diseases reported elsewhere in the word on cultivated hosta species include Hosta virus X (HVX), first described in USA in 1996, and considered to be the main pathogen of this genus. In October of 2010, the following systemic virus-like symptoms were observed on leaves of three varieties cultivated in Emilia-Romagna region (Italy) (“Gold Standard”, “Sum and Substance” and “Whirlwind”): irregular green blotched scattered in the yellow lamina, green bands running along the veins having an “ink-bleeding” look, malformations, different leaf thickness. Electron microscopic observations revealed the presence of virus particles ca. 560-600 nm in length, which in ISEM and PAS-ELISA tests clearly reacted with the antiserum to HVX (provided by University of Minnesota, MN, USA). Mechanical inoculations carried out using symptomatic hosta leaf sap made it possible to transmit HVX to Chenopodium murale L. (necrotic pin-point lesions) and Gomphrena globosa L. (necrotic red spots 2-3 mm in size). By applying RT-PCR with specific primers HVXCP+ 5’-ATGGCAAGTGACGCACCAACTCCACC-3’ and HVXCP- 5’- TCAACTTGAGCCTTCCGGG-3’ that amplified a fragment of 663 nt based on the coat protein gene, HVX appeared closely related to polish isolate FJ821705 (98% nucleotide identity). To prevent HVX spread it is important to minimize mechanic contact between plantlets during cultivation, and immediately remove those showing visible virus-like symptoms. Considering that two of the infected varieties tested have been imported from Holland, certified virus-free propagation material must...