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Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O tamarilho (Solanum betaceum Cav.) é uma espécie arbórea de pequeno porte, pertencente à família Solanaceae, e que apresenta características económicas, nutricionais e biotecnológicas bastante interessantes. No entanto, as populações naturais desta espécie possuem uma baixa variabilidade genética, a qual não é possível ultrapassar sem a aliança entre as técnicas de manipulação genética e os métodos de melhoramento mais convencionais. Os protoplastos podem assim ser considerados como uma ferramenta importante para o melhoramento desta espécie, na medida em que constituem um passo prévio a várias técnicas de manipulação genética, nomeadamente hibridação somática (por fusão de protoplastos) e transformação genética. Recorrendo ao método “one factor at a time”, analisaram-se os principais factores que afectam tanto o rendimento como a viabilidade dos protoplastos obtidos a partir de diferentes explantes em cultura in vitro de tamarilho. Estes dois parâmetros são influenciados pelo estabilizador osmótico (neste caso em concreto, a sacarose), tipos de enzimas hidrolíticas e sua concentração, temperatura e duração da digestão enzimática e métodos de purificação dos protoplastos. O maior rendimento de protoplastos isolados a partir de explantes foliares foi conseguido através da solução K3 com sacarose a 0,4 M contendo celulase “Onozuka” R-10 a 2% (w/v) e macerozima R-10 a 0,5% (w/v). As condições de incubação enzimática com melhores respostas foram a 27 ºC overnight e 30 ºC durante 6 horas para as linhas diplóide e tetraplóide, respectivamente. A centrifugação por gradiente de densidade a 100 g durante 10 min. com obtenção de uma banda interfásica revelou-se o método de purificação dos protoplastos mais eficiente. Para estimar a viabilidade dos protoplastos recorreu-se ao corante de exclusão Evans blue, registando-se valores de protoplastos viáveis acima dos 50%. No entanto, apesar de a quantidade de protoplastos viáveis por grama de peso fresco ser considerável, ainda não foi possível regenerar plantas a partir de protoplastos colocados em meio de cultura. As condições óptimas para o isolamento e purificação de protoplastos de calli e tecidos embriogenicamente induzidos envolveram a digestão enzimática com a combinação de celulase a 1%, driselase a 0,2% e pectinase a 0,02% (w/v), em solução K3 com sacarose a 0,4 M, durante 20 – 22 horas a 25 ºC (para calo embriogénico) ou overnight a 27 ºC (calo não embriogénico e explantes embriogenicamente induzidos), seguida de purificação por sedimentação dos protoplastos num pellet, quando sujeito a uma centrifugação inicial de 100 g durante 10 min. O desenvolvimento de um protocolo eficiente de isolamento e purificação de protoplastos a partir de diferentes explantes permitiu a avaliação do rendimento possível de obter com a extracção de RNA total e a sua aplicabilidade em futuras análises transcriptómicas de populações específicas de células. Tamarillo (Solanum betaceum Cav.) is a small solanaceous tree with interesting economical, nutritional and biotechnological features. The low genetic variability observed in natural populations of tamarillo demands for the need for genetic manipulation techniques to circumvent this problem by complementing the more conventional methods of breeding. Plant protoplast technology can be considered an important tool for S. betaceum improvement because it can be a predecessor step for these genetic manipulation techniques, such as somatic hybridization (by protoplast fusion) and genetic transformation. Thus, the basis of this study was to determine the main factors affecting the isolation of protoplasts from different in vitro cultured tissues of tamarillo. Sucrose as the osmotic stabilizer, types of plant cell wall - degrading enzymes and their concentration, temperature and time of enzymatic incubation, and purification methods were evaluated in terms of their effects on protoplast yield and viability by using the “one factor at a time” method. Results showed that the highest leaf mesophyll protoplast yield was provided by 2% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10 and 0.5% (w/v) macerozyme R-10 dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution. This enzymatic mixture was subjected to an overnight incubation at 27 ºC for diploid lines and to 6 h incubation at 30 ºC for tetraploid genotype. The density gradient centrifugation at 100 g for 10 min with the separation of an interphase band was the most effective protoplast purification method tested. The optimal conditions achieved for calli and embryogenic induced - derived protoplast isolation and purification involved an enzymatic digestion with a combination of 1% (w/v) cellulase “Onozuka” R-10, 0.2% (w/v) driselase and 0.02% (w/v) pectinase, also dissolved in 0.4 M sucrose – K3 solution, for a 20 - 22h incubation period at 25 ºC (embryogenic callus) or an overnight incubation at 27ºC (non-embryogenic callus and embryogenic induced explants), followed by centrifugation at 100 g for 10 min to pellet the protoplasts. Viability of protoplasts from leaf mesophyll and embryogenic callus was evaluating using Evans blue staining, with viable protoplasts over 50%. However, despite the high number of viable protoplasts, an efficient regeneration of plants from leaf mesophyll protoplasts was not yet achieved. The development of efficient protoplast isolation and purification protocols, from different explants allowed for the evaluation of the yield possible to achieve with a method for total RNA extraction in order to estimate the application of this technique in subsequent transcriptomic analysis of specific populations of cells.

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O tamarilho, Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt é uma pequena árvore da família Solanaceae que produz frutos comestíveis bastante nutritivos, com um interesse económico crescente. Várias linhas de investigação têm demonstrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos específicos da morfogénese in vitro, em particular da indução de embriogénese somática (ES), processo chave para a clonagem de plantas, o que abre portas para a propagação de plantas em larga escala. A indução de ES em tamarilho consiste num processo em duas fases no qual os calos embriogénicos (CE) e os calos não embriogénicos (CNE) são inicialmente produzidos (fase de indução) num meio rico em auxina e, após a sua transferência para um meio sem auxina, formam embriões (fase de desenvolvimento). Análises proteómicas comparativas de extractos proteicos de tamarilho permitiram identificar uma proteína (NEP-­‐TC, 26,5 kDa) presente de forma consistente em calos não embriogénicos, com um possível papel inibidor da embriogénese somática. Esta proteína foi associada à família SpoU de metiltransferases (MTase) de RNA dependentes de SAM, por elevada homologia da sua sequência com proteínas dessa família identificadas em Arabidopsis thaliana. Esta família de MTases está anotada como envolvida na metilação de RNA, especificamente tRNA e rRNA, sendo esta reacção essencial na sua estabilização. Neste trabalho, procurou-­‐se analisar o envolvimento da NEP-­‐TC no processo de embriogénese somática, partindo-­‐se da optimização dos protocolos de extracção, separação e caracterização de perfis proteicos de CNE e CE de tamarilho. Verificou-­‐se que a obtenção de um perfil característico deste material, num extracto adequado aos ensaios de actividade realizados, foi conseguido com a utilização do tampão de extracção Tris-­‐HCl pH 8,4 com 100mM de NaCl associado à maceração in vivo do material. A caracterização funcional da NEP-­‐TC como uma MTase de RNA dependente de SAM nunca foi até agora demonstrada experimentalmente. Procurou-­‐se, aclarar essa hipótese através de duas linhas de investigação: (1). Realização de ensaios de actividade enzimática de forma a avaliar a acção de metiltransferases em extratos proteicos totais de CE e CNE, com a presença da NEP-­‐TC. (2). Estudos imunocitoquímicos que permitissem a localização histológica da NEP-­‐TC. Os resultados mostraram que em extractos proteicos totais obtidos de CNE de tamarilho, a actividade específica de MTase é superior comparativamente a extractos obtidos de CE de tamarilho e de CNE de Arabidopsis wild type e knockout para o gene da proteína homóloga da NEP-­‐TC. Conseguiu-­‐se ainda, através da utilização de um soro com anticorpo anti-­‐NEP-­‐TC, localizar a proteína em células de CNE de tamarilho, em particular na região citosólica em torno do núcleo, enquanto que em CE essa detecção não se verificou. Os dados obtidos enquadram-­‐se na caracterização proteómica anteriormente feita para perfis proteicos de extractos destes materiais e na actividade de MTase desta enzima.Estes resultados juntamente com outros previamente obtidos, contribuem com mais informação para o estabelecimento da relação entre a NEP-­‐TC e as enzimas MTases SpoU bem como para a definição da NEP-­‐TC como uma proteína chave no controlo processo de indução de ES. The tamarillo, Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt, is a small solanaceous tree with a rising economic interest due to the edible fruits it produces. Several lines of research have demonstrated the usefulness of this species for understanding specific aspects of in vitro morphogenesis, in particular the induction of somatic embryogenesis (SE), a key process for plant cloning and large scale plant propagation. The induction of SE in tamarillo is of a two-­‐step process in which both embryogenic callus (EC) and non-­‐embryogenic callus (NEC) are initially produced in the same explant on an auxin-­‐rich medium (induction stage) and later transferred to an auxin free medium in which embryo development (developmental stage) occurs. Comparative proteomic analyses of tamarillo extracts have identified a protein (NEP-­‐TC, 26.5 kDa) consistently present in non-­‐embryogenic callus, with a putative inhibitory role on somatic embryogenesis. This protein has been associated with SpoU SAM-­‐dependent RNA MTase family, by sequence similarity with SpoU proteins identified in Arabidopsis thaliana. This SAM dependent RNA MTase family specifically methylates tRNA and rRNA, promoting their stabilization. In this study, attempts to elucidate the role of NEP-­‐TC on tamarillo somatic embryogenesis were carried out., For this purpose protocols for extraction, separation and characterization of protein profiles and extracts suited for the enzymatic activity assays with tamarillo’s NEC and EC were built up. It was found that an extraction Tris-­‐HCl buffer, pH 8.4, with 100 mM NaCl associated with in vivo maceration of the material gave the best results. The association of NEP-­‐TC with SAM dependent RNA MTases has never been experimentally demonstrated so far. Two lines of investigation were pursued to clarify this hypothesis: (1). Activity tests to evaluate the methyltransferase activity of EC and NEC protein extracts, with NEP-­‐TC. (2). Immunocytochemical studies for the localization of NEP-­‐TC. The results showed that, in total protein extracts obtained from tamarillo’s NEC, the specific activity was higher than in protein extracts obtained from tamarillo’s EC and Arabidopsis wild type and knockout for NEP-­‐TC SpoU homologous gene NEC. Immunolocalization assays performed with an antibody against NEP-­‐TC indicated that this protein is present in tamarillo’s NEC cells, particularly in the cytosolic region around the nucleus, whereas this detection was not found in EC. These data support the results obtained through proteomic characterization of protein profiles of these calli and NEP-­‐TC METase activity.These results, together with other data previously obtained in this embryogenic system, seem not only to indicate that a close relationship between NEP-­‐TC and SpoU enzymes occurs but also that NEP-­‐TC is a key protein controlling somatic embryogenesis.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. A disponibilidade de sistemas modelo de embriogénese somática (ES) permitiu criar ferramentas vantajosas para o estudo de processos de diferenciação celular vegetal e para aumentar o nosso entendimento sobre os aspetos funcionais dos genes já implicados na ES. Vários sistemas modelo têm sido amplamente utilizados na caraterização da ES, tais como Daucus carota e Arabidopsis thaliana. No entanto, as descobertas fundamentadas nestas plantas deverão ser testadas noutros organismos ou sistemas para verificar a sua efetividade. Outras espécies têm demonstrado um papel emergente no entendimento de vários processos morfológicos induzidos in vitro, sendo a beringela (Solanum melongena L.) e o tamarilho (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum) exemplos dessa situação. São dois membros da Solanaceae, uma grande e diversa família de plantas cuja importância económica e interesse biotecnológico são bem conhecidos. A beringela apresenta uma notável resposta a várias técnicas de cultura in vitro devido ao grande potencial morfogénico, sendo particularmente vantajosa na indução de ES. A disponibilidade de vários protocolos de ES eficientes, combinados com o número crescente de loci identificados, disponíveis em bases de dados, possibilita a consideração do papel desta solanácea como modelo alternativo em estudos da morfogénese in vitro. Outra solanácea promissora é o tamarilho, uma espécie lenhosa cujo protocolo de ES já se apresenta otimizado. A grande vantagem do sistema de indução nesta espécie é a formação simultânea de tecidos embriogénicos (CE) e não embriogénicos (CNE) a partir do mesmo explante (folhas ou embriões zigóticos maturos) perante as mesmas condições de cultura. A comparação de perfis proteicos de CE e CNE permitiu a identificação de proteínas expressas diferencialmente durante a aquisição da competência embriogénica, incluindo a NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), uma proteína de 26,5 kDa consistentemente presente em CNE, sugerindo um possível papel como inibidor da indução de ES no tamarilho. Esta proteína apresenta um elevado grau de homologia com a família de proteínas SpoU metiltransferases de RNA de Arabidopsis thaliana. No presente trabalho, são analisados os sistemas de indução de ES da beringela e do tamarilho numa abordagem semelhante, de forma a avaliar o seu papel como sistemas modelo alternativos em estudos de ES. Adicionalmente foi estudada outra solanácea, a pera-melão (Solanum muricatum Ait.), que apresenta um hábito intermédio entre a beringela e o tamarilho, devido às suas características semi-arbustivas. Numa fase inicial,pretendeu-se verificar se as condições de indução de ES no tamarilho poderiam ser reproduzidas nesta espécie com potencial para ser explorada comercialmente e da qual ainda pouco se sabe, revelando-se assim interessante para o estabelecimento de novos protocolos de cultura in vitro. Neste sentido, foram efetuados ensaios de ES em todas as espécies usando explantes de tecidos foliares de vários genótipos. Foram testadas várias concentrações das auxinas 2,4-D, NAA e picloram e diferentes quantidades de sacarose, 3% e 9% (w/v) para a beringela, e 9% (w/v) para o tamarilho e a pera-melão. Os resultados demonstraram diferentes respostas, tendo os tecidos de beringela e tamarilho permitido obter calo com caraterísticas embriogénicas e não embriogénicas, ao contrário da peramelão, a partir da qual apenas foi obtido calo com características não embriogénicas. A expressão do gene NEP-TC foi analisada em todos os calos obtidos e tecidos foliares de beringela, pera-melão e tamarilho, tendo a abundância dos seus transcritos sido determinada através de RT-PCR. Os resultados obtidos indicaram que os níveis dos transcritos de NEP-TC variam em todos os tecidos das solanáceas, com elevada abundância em CNE, mas também em CE, e menor expressão em folhas não induzidas, o que está em concordância com os resultados previamente obtidos no tamarilho. Também foi avaliada a capacidade de indução de ES de linhas de Arabidopsis thaliana knockout para genes da família das SpoU metiltransferases de RNA. Plantas homozigóticas para a linha de inserção foram comparadas com plantas wild type. Juntamente foram analisados aspetos morfológicos tais como, o enraizamento e o desenvolvimento da roseta e da inflorescência. Os resultados demonstraram uma taxa de indução de ES ligeiramente mais elevada na linha knockout para o gene homólogo à NEPTC e, relativamente ao desenvolvimento foram registadas diferenças significativas relativamente ao enraizamento. A informação reunida neste trabalho permite a correlação entre sistemas de indução de ES de diferentes solanáceas, que possivelmente terão o potencial para contribuir como sistemas modelo alternativos. No entanto, deverão ser efetuados mais estudos no que diz respeito à otimização do protocolo de indução de ES da beringela e ao papel funcional da NEP-TC tanto na beringela como no tamarilho. Esta proteína estará possivelmente envolvida na indução de ES como um marcador da competência nãoembriogénica e poderá auxiliar na compreensão dos mecanismos de regulação deste processo.The availability of somatic embryogenesis (SE) model systems has created effective tools for studying cell differentiation processes in plants thus increasing our understanding about the functional aspects of genes implicated on SE. Over the years, several models such as Daucus carota and Arabidopsis thaliana have been widely used to characterize SE. However, the effectiveness of the discoveries based on such plants is often difficult to be verified in other systems. In recent years, other species have demonstrated an emerging role for the understanding of various in vitro induced morphological processes. This is the case of eggplant (Solanum melongena L.) and tamarillo (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum), two members of Solanaceae, a large and diverse plant family whose economic importance and biotechnological interest are well known. Eggplant is very responsive to numerous tissue culture techniques due to a high morphogenic potential that is particularly useful for SE induction. The availability of several efficient SE protocols, combined with an increasing number of identified loci available on databases, makes this solanaceous an alternative model to be considered for studies of in vitro morphogenesis. Another promising solanaceous is tamarillo, a tree species in which effective SE protocols have been developed. One of the main advantages of tamarillo is the simultaneous formation of embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC) tissues from the same explant (leaves or mature zygotic embryos) under the same culture conditions. Comparative proteomic analysis of EC and NEC allowed the identification of proteins differentially expressed during the acquisition of SE competence including NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), a 26.5 kDa protein consistently present in NEC, suggesting its putative role as an inhibitor of tamarillo’s SE induction. This protein shows a high degree of identity with the Arabidopsis thaliana RNA methyltransferase (SpoU) family protein. In the present study eggplant and tamarillo SE induction systems were analyzed in a combined approach to testify their role as alternative model systems for SE studies. Additionally another solanaceous, pepino (Solanum muricatum Ait.), with an intermediate habit between eggplant and tamarillo, due to its semi-shrub characteristics, was studied. In an initial step, it was intent to reproduce the SE induction conditions for tamarillo. The availability of somatic embryogenesis (SE) model systems has created effective tools for studying cell differentiation processes in plants thus increasing our understanding about the functional aspects of genes implicated on SE. Over the years, several models such as Daucus carota and Arabidopsis thaliana have been widely used to characterize SE. However, the effectiveness of the discoveries based on such plants is often difficult to be verified in other systems. In recent years, other species have demonstrated an emerging role for the understanding of various in vitro induced morphological processes. This is the case of eggplant (Solanum melongena L.) and tamarillo (Cyphomandra betacea Cav. Sendt. syn. Solanum betaceum), two members of Solanaceae, a large and diverse plant family whose economic importance and biotechnological interest are well known. Eggplant is very responsive to numerous tissue culture techniques due to a high morphogenic potential that is particularly useful for SE induction. The availability of several efficient SE protocols, combined with an increasing number of identified loci available on databases, makes this solanaceous an alternative model to be considered for studies of in vitro morphogenesis. Another promising solanaceous is tamarillo, a tree species in which effective SE protocols have been developed. One of the main advantages of tamarillo is the simultaneous formation of embryogenic (EC) and non-embryogenic (NEC) tissues from the same explant (leaves or mature zygotic embryos) under the same culture conditions. Comparative proteomic analysis of EC and NEC allowed the identification of proteins differentially expressed during the acquisition of SE competence including NEP-TC (GenBank, accession number JQ766254.1), a 26.5 kDa protein consistently present in NEC, suggesting its putative role as an inhibitor of tamarillo’s SE induction. This protein shows a high degree of identity with the Arabidopsis thaliana RNA methyltransferase (SpoU) family protein. In the present study eggplant and tamarillo SE induction systems were analyzed in a combined approach to testify their role as alternative model systems for SE studies. Additionally another solanaceous, pepino (Solanum muricatum Ait.), with an intermediate habit between eggplant and tamarillo, due to its semi-shrub characteristics, was studied. In an initial step, it was intent to reproduce the SE induction conditions for tamarillo. Little is known about this Solanaceae with potential to be explored commercially, revealing itself interesting for the establishment of new protocols of in vitro culture. For this purpose SE was induced in all species using explants from leaftissues from several genotypes. The assays involved SE induction on media containing different concentrations of the auxins 2,4-D, NAA or picloram and different sucrose levels, 3% and 9% (w/v) for eggplant, and 9% (w/v) for tamarillo and pepino. The results showed distinct responses, however, in both eggplant and tamarillo, responsive and nonresponsive calli could be obtained, unlike pepino that only give rise to non-responsive tissues. All cell masses were analyzed in relation with the expression of NEP-TC. The abundance of NEP-TC transcripts in several tissues of eggplant, pepino and tamarillo was determined through RT-PCR analyses. The results showed that NEP-TC transcripts levels vary in a similar way in all the solanaceous tissues, with high abundance in NEC, but also in EC and lower expression in non-induced leaf samples, which is in accordance with previous results obtained with tamarillo. Homozygous plants of knockout lines of Arabidopsis thaliana were also evaluated for their ability to undergo SE, when compared to the wild type controls. Morphogenetic aspects, such as rooting, rosette and inflorescence development were also compared. The results showed a slightly higher rate of SE the homologous gene of NEP-TC knockout line and in terms of development significant differences were registered regarding the rooting process. The information gathered in this work, allows a correlation between the SE induction of different solanaceous species that possibly have the potential to contribute as alternative model systems. However further studies should be focused on the optimization of eggplant’s SE induction protocol and the functional role of NEP-TC on both tamarillo and eggplant. This protein is possibly involved in the induction of SE as a marker of non-embryogenic competence and could help to understand the regulatory mechanisms of this process.

Dissertação de mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. A embriogénese somática é um processo que permite a rápida propagação de espécies economicamente importantes e uma poderosa ferramenta na transformação genética. Uma das fases mais importantes neste processo é a maturação dos embriões somáticos, visto que durante esta fase é comum ocorrer um número significativo de embriões anómalos, o que pode ter implicações na sua conversão em plântulas. A indução da embriogénese somática e o desenvolvimento de embriões de tamarilho (Cyphomandra betacea) foram estudados no Laboratório de Biotecnologia da FCTUC e usados com sucesso na regeneração das plantas a partir de vários tipos de explantes. É um sistema de duas fases no qual a embriogénese somática é induzida em meio MS, na presença de uma auxina e com concentrações elevadas de sacarose, seguindo-se a transferência do tecido embriogénico obtido para um meio sem auxina e com níveis reduzidos de sacarose, de modo a obter embriões somáticos. Trabalhos anteriores demonstraram que optimizando as condições de maturação há um maior rendimento e uma melhor qualidade dos embriões formados. Neste trabalho, pretendeu-se optimizar a maturação de embriões somáticos de tamarilho, testando diferentes tipos de calos embriogénicos em diversas condições de maturação. Calos com diferentes idades, origens e qualidades embriogénicas foram avaliadas, variando a composição do meio de cultura, em particular pela adição de carvão activado, várias concentrações de sacarose e de outros agentes osmóticos para além da sacarose. A manifestação de diferentes capacidades embriogénicas por parte das linhas estudadas perante os tratamentos aplicados, confirmou assim a importância da origem e da idade dos explantes na obtenção de embriões somáticos maduros. O calo induzido a partir de material micropropagado de uma árvore adulta (TJ-CE3) revelou uma ausência de competência embriogénica, que poderá ser justificada pelos baixos níveis endógenos de peróxido de hidrogénio nesta linha de calo (cerca de 6 μmol/l), quando comparados aos detectados em calos embriogénicos (cerca de 12 μmol/l) induzidos na mesma altura, mas a partir de material com origem seminal (linha TV-CE2). De um modo geral, foi a linha TVCE1 a que demonstrou uma resposta melhor, em termos do número de embriões formados, sendo o ABA (2 mg/l, TMA2) o composto mais eficaz, neste tipo de calo, promovendo o desenvolvimento de 204 embriões/100 mg de calo. No caso do TV-CE2, uma linha de calo mais recentemente estabelecida, contrariamente ao esperado, este apresentou respostas inferiores ao TV-CE1, sendo os melhores resultados obtidos para o meio TM2 (50,3 xi embriões somáticos/100 mg de calo). O controlo da maturação e dos processos de conversão através da análise histológica permitiram observar os efeitos das condições de cultura no desenvolvimento dos embriões, em particular no padrão apical-basal e na organização de meristema apical. Observou-se que, mesmo em embriões anómalos o meristema apical se organizou de acordo com o padrão normal, sugerindo que este tipo de embriões, teria potencial para desenvolver de uma forma normal e atingir a conversão em plântulas. Para além dos ensaios de maturação realizados foram testados factores influentes na indução de embriogénese somática como o genótipo, a dimensão do explante e as condições do meio, mais concretamente a sua composição química. Nestes ensaios observaram-se disparidades nas taxas de indução observadas para os 3 genótipos testados e na quantidade de calo observado. Foi o genótipo de tamarilho vermelho que apresentou as taxas de indução mais altas, a rondar os 68% de explantes com tecido embriogénico. A fragmentação dos explantes foliares em secções com 3-10 mm revelou-se uma técnica eficaz, permitindo a formação de quantidades superiores de calo embriogénico. Os ensaios de indução de organogénese in vitro realizados, recorrendo a material vegetal estabelecido in vitro (linha TJ), proveniente de uma árvore adulta, demonstraram, à semelhança do que se observou na maturação de embriões somáticos, uma baixa capacidade organogénica desta linha, visto que das gemas isoladas apenas 13,3% geraram rebentos caulinares Somatic embryogenesis is a process that allows the fast propagation of economical important species and a powerful tool in breeding and genetic transformation. One of the most critical phases in this process is the embryo maturation, because during this stage it is usual to find a significative number of anomalous embryos, what may have implications in their conversion in emblings. Somatic embryogenesis induction and somatic embryo development of the Solanaceous tamarillo tree (Cyphomandra betacea) have been studied at the Biotechnology Laboratoty of FCTUC, and successfully used on the regeneration of these plants from several types of explants. It is a two-step system in which somatic embryogenesis is induced in MS medium containing an auxin and high sucrose concentrations, and the embryogenic tissues obtained must be transferred to an auxin-free medium, with reduced sucrose levels, in order to obtain somatic embryos. Previous work has demonstrated that, by optimizing maturation conditions, a higher yield and a better quality of the formed embryos can be achieved. In this work, it was intended to optimize the maturation of somatic embryos of tamarilho by testing different types of embryogenic callus in different maturation conditions. Callus at different ages, embryogenic origin and quality were assessed by varying the composition of culture medium, in particular by addition of activated charcoal, various concentrations of sucrose and other osmotic agents other than sucrose. The expression of different capacities by the embryogenic lines studied before the treatments applied, thus confirming the importance of the origin and age of the explants to obtain mature somatic embryos. The callus induced from micropropagated material of a mature tree (TJ-CE3) revealed an absence of embryogenic competence, which can be explained by the endogenous low levels of hydrogen peroxide in this callus line (about 6 μmol / l), where compared to those detected in embryogenic callus (about 12 μmol / l) induced at the same time but from seminal material source (line TV-CE2). In general, it was line TV-CE1 that showed a better response in terms of the number of embryos formed being ABA (2 mg / l, TMA2) the most effective compound in this type of callus, promoting the development of 204 embryos/ 100 mg callus. In the case of line TV-CE2, a callus more recently established, contrary to expectations, it showed lower responses to TV-CE1, the best results being obtained for the middle TM2 (50.3 somatic embryos /100 mg callus). Control of the maturation and conversion processes by histological analysis allowed observe the effects of culture conditions on embryo xiii development, in particular in the apical-basal pattern and in the apical meristem organization. It was observed that, even in the abnormal embryos apical meristem is organized according to normal, suggesting that this type of embryos would have the potential to develop normally and achieve conversion to plantlets. In addition to the maturation tests performed were evaluated factors that influence the induction of somatic embryogenesis as the genotype, the size of the explant and the environment conditions, more specifically to their chemical composition. In these tests it was observed differences in the rate of induction observed for the 3 genotypes and the amount of callus observed. Red tamarilho genotype showed higher induction rates, hovering around 68% of explants with embryogenic tissue. Fragmentation of leaf explants into sections of 3-10 mm proved to be an effective technique, allowing the formation of higher amounts of embryogenic callus. The induction of organogenesis assays performed in vitro, using established plant material in vitro (TJ line) from a mature tree, shown, similar to that observed in the maturation of somatic embryos, low organogenic capacity of this line, since that of gems isolated only 13.3% generated stem shoots

A Embrapa Gado de Corte dispõe de coleção de germoplasma de Panicum maximum. Este germoplasma foi introduzido no Brasil em 1982 e foi composto por 426 acessos apomíticos e 417 plantas sexuais, sendo considerado representativo da variabilidade natural da espécie (JANK et al., 2011). A cultivar Tanzânia-1 foi lançada em 1990 e a Mombaça em 1993. Atualmente, a Embrapa Gado de Corte lidera projeto em melhoramento genético de P. maximum do qual a equipe da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia participa visando estabelecer técnicas de biotecnologia vegetal para futuramente serem aplicadas em experimentos de transformação genética (COSTA et al., 2009). P. maximum é uma espécie de grande interesse agronômico e possui plantas de reprodução apomítica e plantas de reprodução sexual. O melhoramento genético desta espécie com posterior avaliação e seleção de materiais genotípicos é essencial para se lançar e recomendar cultivares adaptadas às diversas regiões brasileiras. Os sistemas de cultura de tecidos e transformação genética descritos na literatura para o gênero Panicum não são eficientes e são limitados a uma única cultivar, P. virgatum cv. Álamo. Existem atualmente três sistemas de cultura de tecidos publicados para P. virgatum cv. Álamo que são via: calos embriogênicos, calos derivados de sementes maduras e de inflorescência imatura. Algumas das limitações desses sistemas incluem a baixa longevidade da viabilidade dos calos embriogênicos obtidos, tipicamente menos do que dois meses, e a alta variabilidade genética na resposta morfogênica do sistema derivado de sementes (BURRIS et al., 2009). Dessa forma, é muito importante o desenvolvimento de um sistema de regeneração usando variedades brasileiras amplamente cultivadas no Brasil. O objetivo deste trabalho é estabelecer metodologia de regeneração in vitro de plantas de P. maximum cv. Mombaça e Tanzânia.

– The improvement of tropical maize inbred lines by genetic transformation techniques remains a difficult task since not all genotypes are capable of regenerating efficiently in vitro. The objective of this study was to evaluate three different callus induction media, based on N6 or MS salts containing either 2,4-D (0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 30.0 mg .L-1) or Dicamba (0; 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg.l-1) in the production of embryogenic callus from immature zygotic embryos of the tropical maize inbred line L3. Callus maturation was tested in MS medium containing 60 g.L-1 sucrose and supplemented with different combinations of BAP (0; 0.1; 0.5; 1.0 mg.L-1), NAA (0; 1.0 mg.L-1) and CuSO4 (0; 1.25 mg.L-1). The L3 inbred line presented higher capacity for Type II callus formation on N6 medium content 10 mg.L-1 2,4-D. For the maturation of callus, absence of plant growth regulators and addition of CuSO4 allowed higher percentage of regeneration. The protocol developed presented 85% production of Type II embryogenic callus and 45% plant regeneration.Keywords: 2,4-D, dicamba, embryogenic callus, Zea mays.EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E REGENERAÇÃO DE PLANTAS A PARTIR DE UMA LINHAGEM DE MILHO TROPICAL ELITERESUMO – O melhoramento de linhagens de milho tropical através de técnicas de transformação genética continua a ser uma tarefa difícil uma vez que nem todos os genótipos são capazes de regenerar eficientemente in vitro. O objetivo deste estudo foi avaliar três meios diferentes para a indução de calos embriogênicos, baseados em N6 ou MS sais contendo 2,4-D (0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0; 30,0 mg.L-1) ou Dicamba (0; 0,25 ; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg.l-1) na produção de calos embriogênicos a partir de embriões zigóticos imaturos da linhagem de milho tropical elite L3. A maturação dos calos foi testada em meio MS com 60 g.L-1 de sacarose suplementado com diferentes combinações de BAP (0; 0,1; 0,5; 1,0 mg.L-1), ANA (0; 1,0 mg.L-1) e CuSO4 (0; 1,25 mg L-1). A linhagem L3 apresentou alta capacidade para produção de calos do Tipo II em meio N6 contendo 10 mg.L-1 de 2,4-D. Para a maturação dos calos, ausência de reguladores de crescimento vegetal e adição de CuSO4 possibilitou maior porcentagem de regeneração. O protocolo desenvolvido apresenta produção de 85% de calos embriogênicos do Tipo II e 45% de regeneração de plantas.Palavras-chave: 2,4-D, dicamba, calos embriogênicos, Zea mays

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Vegetal, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra O tamarilho (Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt sin. Solanum betaceum), pertencente à família das solanáceas, é uma árvore que produz frutos comestíveis com elevado valor nutricional. Alguns estudos têm mostrado o interesse desta espécie para a compreensão de aspectos particulares da morfogénese in vitro, particularmente a embriogénese somática (ES). A ES tem demostrado ser uma importante ferramenta na biotecnologia com um grande potencial para a rápida propagação de clones em larga-escala. Além disso, os procedimentos de transformação genética e criopreservação de muitas espécies vegetais, baseiam-se em protocolos eficazes de ES. Uma das formas de induzir ES no tamarilho consiste um processo em duas fases, no qual células embriogénicas são inicialmente induzidas num meio de cultura suplementado com uma auxina (fase de indução) e depois após a sua transferência para um meio de cultura desprovido de auxinas, desenvolvem-se embriões somáticos (fase de desenvolvimento). Vários tipos de explantes, com origem em material adulto ou previamente estabelecido in vitro, e várias condições de indução, têm sido testados para optimizar a resposta do tamarilho à indução de ES. Para superar o reduzido potencial de ES nos tecidos adultos, neste trabalho seguiu-se uma abordagem indirecta, na qual os rebentos de uma árvore adulta foram, primeiramente, estabelecidos in vitro, e uma abordagem directa, na qual se induziu ES em secções do caule de ramos jovens de tamarilho. De modo a optimizar o protocolo de indução de ES no tamarilho, precedeu-se à caracterização da resposta da indução de ES sob vários tipos de stresse, assim como face à indução de ES em diferentes genótipos, de plantas diploides e tetraploides, que foram previamente caracterizados citológica e morfologicamente. Os resultados demonstram que factores como o tipo de auxina, a concentração de sacarose, a presença de ácido ascórbico e o tempo de manutenção dos meios de cultura interferem na resposta à indução de ES. Na indução de ES em tamarilho, células embriogénicas e células não embriogénicas surgem lado a lado nos mesmos explantes, o que se trata de uma condição ideal para avaliar as alterações moleculares e bioquímicas observadas nos diferentes tipos de calos. No trabalho realizado estabeleceu-se, pela primeira vez, um protocolo para a multiplicação de massas de células embriogénicas através do uso de suspensões celulares. O teste de várias massas de células e vários volumes de meio de cultura permitiram analisar a cinética de crescimento das células e optimizar a razão x massa de células / volume a utilizar em ensaios futuros. Além disso, analisaram-se os perfis proteicos das secreções dos dois tipos diferentes de células, sendo as secreções do tecido não embriogénico as que apresentam mais diversidade e quantidade de proteínas. Este tipo de análise pode ser utilizada para compreender a embriogénese numa perspectiva mais integradora. Uma das muitas aplicações do calo embriogénico obtido por indução de ES é a transformação genética. Trabalhos anteriores para outras espécies têm demostrado que as taxas mais elevadas de sucesso na transformação genética têm sido obtidas com este tipo de explante. Neste trabalho procurou-se estabelecer um protocolo de transformação genéticas de células embriogénicas, utilizando três estirpes diferentes de Agrobacterium tumefaciens possuindo o plasmídeo p35SGUSINT. A quantificação da massa de células resistentes à canamicina e os resultados da coloração do ensaio GUS indicaram a estirpe C58C1,como a mais eficiente na transformação de células embriogénicas do tamarilho, sendo, no entanto, necessária uma análise mais detalhada em trabalhos futuros. A informação recolhida neste trabalho, nomeadamente com a análise comparativa da resposta de diferentes genótipos e com o desenvolvimento de um protocolo para a cultura de suspensões celulares, poderá contribuir para responder a alguns dos passos restritivos da ES e da transformação genética no tamarilho, para a qual os conhecimentos fundamentais sobre as plantas modelo tradicionais têm sido insuficientes. Encontrar as proteínas directamente envolvidas na aquisição de competência embriogénica poderá ajudar a compreender os mecanismos reguladores deste processo. Para além disso, o desenvolvimento de protocolos de transformação genética optimizados constitui um importante recurso, não apenas para o melhoramento da espécie, mas também como uma ferramenta da genómica funcional para a identificação e caracterização das vias moleculares envolvidas no processo de ES. Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt (tamarillo) (syn. Solanum betaceum) is a small solanaceous tree which produces edible high nutritional fruits. Several lines of research have shown the interest of this species to understand particular aspects of in vitro morphogenesis, in particular somatic embryogenesis (SE). SE is an important biotechnological tool with great potential for rapid large-scale clone propagation. In addition, genetic transformation and cryopreservation procedures in many plant species rely on efficient SE protocols. One of the pathways to induce SE in tamarillo is a two-step process in which embryogenic tissues and non-embryogenic callus are first produced (induction phase) in an auxin-rich medium and then developed into embryos, following the transfer to an auxin-free medium (development phase). Several explants, with origin from an adult tree or from plants previously established in vitro have been tested in optimization assays of the SE induction protocol in tamarillo. To overcome the lack of potential of adult tissues for SE, an indirect approach was attempted, in which shoots from an adult tree were first established in vitro, and a direct approach, in which SE was intended to be induced from juvenile plant material (intermodal stem segments). To improve the induction protocol of SE in tamarillo several stress conditions were tested for different genotypes of diploid and tetraploid plants. These genotypes were previously characterized cytological and morphologically. The results have showed that different factors, such as the auxin kind, the sucrose concentration, the presence of ascorbic acid on the medium and the medium´s maintenance time were crucial for the SE induction. In tamarillo SE, embryogenic and non-embryogenic cells arise side by side from the same cultured explants, which is an ideal condition to evaluate molecular and biochemical changes occurring in the different types of calli. In this work, a protocol for the embryogenic cells multiplication through cell suspension culture was established for the first time. Several weights of cells and several culture media volumes were tested in order to evaluate the kinetic growth of the cell suspension and optimize the ratio weight/volume for future approaches. Furthermore, protein profiles were obtained from the secretions produced by embryogenic and non-embyogenic cells after the culture period. The profiles analysis showed that the non-embryogenic cells were the ones producing a higher protein diversity and quantity. This type of analysis can be extended to understand embryogenesis in a more integrated perspective. xii One of the many applications for embryogenic tissue obtained by SE induction is its use for genetic transformation. Previous work with other species have reported the highest success levels achieved with this type of explant. In this work, the establishment of an efficient protocol for Agrobacterium-mediated transformation of embrygenic cells, using three different strains carrying the p35SGUSINT plasmid, was for the first time attempted. The quantification of kanamycin resistance cells and the results obtained for the Gus staining assay indicated that C58C1 was the most efficient strain, nevertheless more detailed analysis are needed for future assays. The information gathered in this work, with the comparative analysis of the responsiveness of different genotypes, under several culture conditions, and the development of a cell suspension culture protocol, can contribute to answer to some of the limiting steps of SE in tamarillo, to which fundamental knowledge from the classical model plants has been insufficient. Finding proteins directly involved in the acquisition of embryogenic competence may help to understand the regulatory mechanisms of this process. Furthermore, the development of optimized transformation protocols is critical, not only for the species improvement, but also for functional genomics approaches that would allow to better understand the molecular pathways involved in SE.