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For species survival, the germline must faithfully transmit genetic information to the progeny. Transposable elements (TEs) constitute a significant threat to genome stability due to their capacity to move. In higher eukaryotes, TEs make up a large fraction of the genome, accounting for 20% of the Drosophila genome and more than 45% of the Human genome. In the metazoan gonads, their expression and so their mobilization is limited by a class of small RNAs called PIWI-interacting RNAs (piRNAs) produced by dedicated genomic loci called piRNA clusters that are expressed in a tissue-specific manner. piRNA clusters are composed of a multitude of TEs either full length or truncated that represent the repertoire of TEs that the cell must repress to maintain the stability of its genome. However, a reactivation of endogenous retroviruses, a particular class of TEs, in somatic tissue adjacent to germ cells, promotes its infection and invasion of the germ line as a virus would do. Although the piRNA pathway is an efficient genomic immunity system, it remains unclear how the germline gains protection against a new transposon invasion. The objective of my thesis was to follow the impact of a TE neo-invasion from an adjacent somatic tissue towards the germ line. For this study, I used the ZAM endogenous retrovirus from Drosophila melanogaster as a model. I investigated i) the strategies developed by ZAM to invade the germ cells ii) the consequences of an endogenous retrovirus reactivation and iii) the defense mechanisms developed by germ cells to counteract ZAM invasion and to protect the germline genome from a massive transposition that could endanger the survival of the species. My results revealed for the first time that piRNAs produced locally, in germ cells, act at the tissue scale and thus protect the germ line from an external attack.; Pour la survie des espèces, la lignée germinale doit transmettre fidèlement l'information génétique à la descendance. Les éléments transposables (ETs) sont des séquences d’ADN mobiles qui constituent une menace importante pour la stabilité des génomes. Les ETs constituent une fraction importante du génome des eucaryotes supérieurs, ils représentent 20% du génome de la drosophile et plus de 45% du génome humain. Dans les gonades des métazoaires, la mobilisation des ETs est contrôlée par une classe spécifique de petits ARNs, appelés piARNs, qui interagissant avec les protéines de la famille PIWI. Les piARNs sont produits à partir de loci génomiques dédiés, appelés clusters de piARNs, exprimés de manière tissu-spécifique. Les clusters de piARNs sont composés d'une multitude d’ETs, pleine longueur ou bien tronqués, qui représentent le répertoire des ETs que la cellule peut réprimer afin de maintenir la stabilité de son génome. Cependant, il existe au sein des génomes une classe particulière d’ETs, les rétrovirus endogènes, qui lorsqu’ils sont réactivés dans les tissus somatiques adjacents aux cellules germinales, peuvent envahir les cellules germinales, comme le ferait un virus. Bien que la voie des piARNs soit un système immunitaire génomique efficace pour contrôler la transposition des ETs exprimés dans les cellules germinales, les mécanismes développés par la lignée germinale pour se protéger face à une nouvelle invasion d’ET restent mal connus. Pour lever ce verrou scientifique, durant ma thèse j’ai étudié l’invasion des cellules germinales par un rétrovirus endogène présent dans le génome de Drosophila melanogaster : ZAM. L’objectif du projet visait à étudier i) les stratégies mises en place par ZAM pour envahir les cellules germinales ii) les conséquences d’une réactivation d’un rétrovirus endogène et iii) les mécanismes de défense mis en place par les cellules germinales pour contrer cette invasion et ainsi protéger le génome germinal d’une transposition massive qui pourrait mettre en danger la survie même des espèces. Mes résultats ont permis de révéler pour la première fois que les piRNAs produits localement, dans les cellules germinales, peuvent agir à l'échelle tissulaire.

DNA methylation, associated with gene or transposable element (TE) repression, plays a key role in spermatogenesis. During germ cell development, their methylome is reprogrammed: somatic patterns are erased and germ cell-specific patterns are established. Three de novo DNA methyltransferases (DNMTs) are essential for shaping male germ cell DNA methylation in mice: DNMT3C and DNMT3A enzymes and DNMT3L co-factor. DNMT3C was shown to selectively methylate young TEs. However, the targets and function of DNMT3A was still unknown. During my PhD, I investigated the interplay between DNMT3A and DNMT3C in the epigenetic regulation of spermatogenesis. First (project 1), I reported a striking division of labor: while DNMT3C prevents TEs from interfering with meiosis, DNMT3A broadly methylates the genome—except DNMT3C-dependent TEs—and controls spermatogonial stem cell (SSC) plasticity. By single-cell RNA-seq and chromatin states profiling, I found that Dnmt3A mutant SSCs cannot differentiate due to spurious enhancer activation that enforces a stem cell gene program. I thus demonstrated a novel function for DNA methylation for SSC differentiation and life-long spermatogenesis supply. Second (project 2), I investigated the chromatin determinants of DNMT3C specificity towards young TEs. I found that these sequences present unique dynamics: first a bivalent H3K4me3-H3K9me3 enrichment, followed by a switch to H3K9me3-only. H3K9me3-enrichment was also a hallmark of the sequences that gain DNA methylation upon ectopic DNMT3C expression in cultured embryonic stem cells. As a whole, my work provided novel insights into the complexity of DNA methylation-based control of reproduction., La méthylation de l'ADN, associée à la répression des gènes et des éléments transposables (ET), joue un rôle essentiel dans la spermatogenèse. Le méthylome des futurs gamètes est reprogrammé : les profils de méthylation somatiques sont effacés, des profils spécifiques des cellules germinales sont établis. Trois de novo ADN méthyltransférases (DNMT) sont essentielles à la méthylation de l'ADN des cellules germinales mâles chez la souris : les enzymes DNMT3C et DNMT3A et leur cofacteur DNMT3L. Il a été montré que DNMT3C est l'enzyme qui méthyle sélectivement les ET les plus jeunes évolutivement. Cependant, les cibles et la fonction de DNMT3A étaient encore inconnues. Je me suis donc intéressée aux rôles de DNMT3A et DNMT3C dans la régulation épigénétique de la spermatogénèse. J'ai démontré (projet 1) une division de travail remarquable : alors que DNMT3C empêche les ET d'interférer avec la méiose, DNMT3A méthyle largement le génome, à l'exception des ET dépendants de DNMT3C. J'ai découvert que les cellules souches spermatogoniales (CSS) mutantes pour Dnmt3A ont perdu leur potentiel de différentiation à cause de l’activation erronée d’enhancers qui imposent un programme génétique de cellules souches. Ce travail révèle une nouvelle fonction de la méthylation de l'ADN dans la fertilité mâle. En parallèle (projet 2), j’ai étudié la nature de la spécificité de reconnaissance des jeunes ET par DNMT3C. Ces séquences présentent une dynamique chromatinienne unique: d’abord un profil bivalent de type H3K4me3-H3K9me3 qui évolue vers un enrichissement H3K9me3 exclusif. Mon travail a ainsi fourni des éléments nouveaux pour comprendre le rôle de la méthylation de l’ADN en reproduction.

Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation.; Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose.

International audience; The Weismann barrier has long been regarded as a basic tenet of biology. However, upon close examination of its historical origins and August Weismann’s own writings, questions arise as to whether such a status is warranted. As scientific research has advanced, the persistence of the concept of the barrier has left us with the same dichotomies Weismann contended with over 100 years ago: germ or soma, gene or environment, hard or soft inheritance. These dichotomies distract from the more important questions we need to address going forward. In this review, we will examine the theories that have shaped Weismann’s thinking, how the concept of the Weismann barrier emerged, and the limitations that it carries. We will contrast the principles underlying the barrier with recent and less recent findings in developmental biology and transgenerational epigenetic inheritance that have profoundly eroded the oppositional view of germline vs. soma. Discarding the barrier allows us to examine the interactive processes and their response to environmental context that generate germ cells in the first place, determine the entirety of what is inherited through them, and set the trajectory for the health status of the progeny they bear.

Since the last decennials, fertility is decreasing in industrial countries, and nowadays, infertility reaches a prevalence of 9 to 18% of the general population, with a significant proportion of cases being due to defective gametogenesis. Accordingly, fertility preservation raises a growing concern. Nowadays, a growing number of couples undergo Assisted Reproductive Technology with little success due to the lack of knowledge on mechanisms orchestrating germ cell differentiation. Little is known about how primordial germ cells become gametogenesis-competent cells (gonocytes), because of the lack of suitable physiological models. Primordial germ cells give rise to the next generation by differentiating from pluripotent progenitors into highly specialized cells, the gametes, which in turn generate a totipotent zygote after fertilization. After specification in the early embryo, primordial germ cells colonize the gonad, lose pluripotency and gain their capacity for irreversible sexual differentiation. Gonocytes then become either female (oogonia) or male (spermatogonia), and eventually progress into meiotic divisions. So far, the mechanisms of germ cell changes in potency remain largely elusive.My host laboratory has demonstrated that activation of the canonical WNT/β-catenin signalling is required for ovarian development. Thus, absence of WNT/β-catenin activation eventually triggers defects in germ cell proliferation and sexual differentiation. However, genetic models of cell-specific ablation of Ctnnb1 (encoding β-catenin) were still missing to assess the contribution of WNT/β-catenin in the germ cells. We decided to analyse the role of this signalling pathway by generating specific mouse models for β-catenin loss or gain of function and by investigating the consequences of WNT/β-catenin deregulation in either the somatic or the germ cells of the developing gonad. We first demonstrated that WNT/β-catenin regulates spermatogonial stem cell proliferation and differentiation in the post-natal testis, demonstrating that this signalling activity must be finely tuned over time to ensure spermatogenesis.Secondly, we showed that genetic elimination of Ctnnb1 in mouse primordial germ cells in vivo leads to a precocious loss of pluripotency and to premature germ cell differentiation into gonocytes. We demonstrated, for the first time in vivo, that while ovarian development is getting forward, β-catenin forms proteic complexes containing POU5F1 and CDH1 that transit from the nucleus of the germ cells to their membrane, thus allowing primordial germ cells to exit pluripotency and eventually differentiate. Our results also reveal that the ZNRF3 E3-ubiquitine ligase negatively regulates germ cell exit from pluripotency through a negative feedback loop.Collectively, our results show that the WNT/β-catenin signalling is necessary for determining the proper window of differentiation in both somatic and germ cells. Moreover, WNT/β-catenin controls the germ cell exit from pluripotency through β-catenin non-transcriptional activity, eventually coordinating the development of the different cell types of the fetal ovary. In the future, our results might help to recapitulate gametogenesis in vitro.; La préservation de la fertilité suscite une inquiétude croissante. Depuis les dernières décennies, la fertilité a diminué dans les pays industrialisés. En conséquence, un nombre croissant de couples a recours à la procréation médicalement assistée, sans grand succès par manque de connaissances sur les cellules reproductrices (cellules germinales). L’étude de ces cellules constitue un socle essentiel pour des applications médicales, mais jusqu’à présent, les mécanismes moléculaires qui régissent leur développement restent peu compris en raison de l’absence de modèles d'étude physiologiques.Les cellules germinales sont produites au cours du développement embryonnaire, se multiplient pour constituer un stock suffisant, se différencient dans la gonade en fonction du sexe de l'embryon, puis entrent en méiose pour devenir des gamètes fertiles, les ovocytes (femelles) et les spermatozoïdes (mâles). Mon laboratoire d’accueil a démontré que la voie de signalisation canonique WNT/β-catenin est nécessaire au développement de l'ovaire in vivo et qu'en absence d'activation de cette voie dans l'ovaire embryonnaire de souris, la prolifération et la différenciation des cellules germinales primordiales sont perturbées.Tirant partie de notre expertise dans l'analyse de modèles de différenciation gonadique, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'action de la voie WNT/β-catenin dans la différenciation des cellules germinales, en analysant au moyen de modèles murins de perte et gain de fonction de β-catenin les conséquences de la modification de son expression dans les cellules de la gonade.Dans un premier temps, nous avons démontré que le maintien, après la naissance, de l'activité de la voie WNT/β-catenin dans les cellules souches spermatogoniales du testicule de souris stimule leur prolifération de manière massive, provoquant un défaut de différenciation en spermatozoïdes. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l'ablation génétique du gène Ctnnb1 (codant pour β-catenin) dans les cellules germinales primordiales in vivo entraîne une perte précoce de leur pluripotence et une différenciation prématurée en ovogonies. Nous avons démontré, pour la première fois in vivo, que tandis que le développement ovarien progresse, β-catenin forme des complexes protéiques avec POU5F1 et CDH1 qui transitent du noyau des cellules germinales à leur membrane, permettant ainsi leur sortie de pluripotence et leur différenciation. Nos résultats indiquent que l'E3-ubiquitine ligase ZNRF3 régule la pluripotence des cellules germinales par une boucle de rétroaction négative.Ces données indiquent que dans l'ovaire comme dans le testicule, une régulation fine de l'activité de la voie de signalisation WNT/β-catenin est requise pour déterminer la fenêtre de différenciation des cellules germinales primordiales in vivo. De plus, la voie WNT/β-catenin contrôle la sortie de pluripotence des cellules germinales primordiales via une activité non-transcriptionnelle de β-catenin, permettant à terme de coordonner le développement des cellules somatiques et germinales de la gonade. Dans les années à venir, nos travaux pourraient aider à la génération des gamètes in vitro.

Since the last decennials, fertility is decreasing in industrial countries, and nowadays, infertility reaches a prevalence of 9 to 18% of the general population, with a significant proportion of cases being due to defective gametogenesis. Accordingly, fertility preservation raises a growing concern. Nowadays, a growing number of couples undergo Assisted Reproductive Technology with little success due to the lack of knowledge on mechanisms orchestrating germ cell differentiation. Little is known about how primordial germ cells become gametogenesis-competent cells (gonocytes), because of the lack of suitable physiological models. Primordial germ cells give rise to the next generation by differentiating from pluripotent progenitors into highly specialized cells, the gametes, which in turn generate a totipotent zygote after fertilization. After specification in the early embryo, primordial germ cells colonize the gonad, lose pluripotency and gain their capacity for irreversible sexual differentiation. Gonocytes then become either female (oogonia) or male (spermatogonia), and eventually progress into meiotic divisions. So far, the mechanisms of germ cell changes in potency remain largely elusive.My host laboratory has demonstrated that activation of the canonical WNT/β-catenin signalling is required for ovarian development. Thus, absence of WNT/β-catenin activation eventually triggers defects in germ cell proliferation and sexual differentiation. However, genetic models of cell-specific ablation of Ctnnb1 (encoding β-catenin) were still missing to assess the contribution of WNT/β-catenin in the germ cells. We decided to analyse the role of this signalling pathway by generating specific mouse models for β-catenin loss or gain of function and by investigating the consequences of WNT/β-catenin deregulation in either the somatic or the germ cells of the developing gonad. We first demonstrated that WNT/β-catenin regulates spermatogonial stem cell proliferation and differentiation in the post-natal testis, demonstrating that this signalling activity must be finely tuned over time to ensure spermatogenesis.Secondly, we showed that genetic elimination of Ctnnb1 in mouse primordial germ cells in vivo leads to a precocious loss of pluripotency and to premature germ cell differentiation into gonocytes. We demonstrated, for the first time in vivo, that while ovarian development is getting forward, β-catenin forms proteic complexes containing POU5F1 and CDH1 that transit from the nucleus of the germ cells to their membrane, thus allowing primordial germ cells to exit pluripotency and eventually differentiate. Our results also reveal that the ZNRF3 E3-ubiquitine ligase negatively regulates germ cell exit from pluripotency through a negative feedback loop.Collectively, our results show that the WNT/β-catenin signalling is necessary for determining the proper window of differentiation in both somatic and germ cells. Moreover, WNT/β-catenin controls the germ cell exit from pluripotency through β-catenin non-transcriptional activity, eventually coordinating the development of the different cell types of the fetal ovary. In the future, our results might help to recapitulate gametogenesis in vitro., La préservation de la fertilité suscite une inquiétude croissante. Depuis les dernières décennies, la fertilité a diminué dans les pays industrialisés. En conséquence, un nombre croissant de couples a recours à la procréation médicalement assistée, sans grand succès par manque de connaissances sur les cellules reproductrices (cellules germinales). L’étude de ces cellules constitue un socle essentiel pour des applications médicales, mais jusqu’à présent, les mécanismes moléculaires qui régissent leur développement restent peu compris en raison de l’absence de modèles d'étude physiologiques.Les cellules germinales sont produites au cours du développement embryonnaire, se multiplient pour constituer un stock suffisant, se différencient dans la gonade en fonction du sexe de l'embryon, puis entrent en méiose pour devenir des gamètes fertiles, les ovocytes (femelles) et les spermatozoïdes (mâles). Mon laboratoire d’accueil a démontré que la voie de signalisation canonique WNT/β-catenin est nécessaire au développement de l'ovaire in vivo et qu'en absence d'activation de cette voie dans l'ovaire embryonnaire de souris, la prolifération et la différenciation des cellules germinales primordiales sont perturbées.Tirant partie de notre expertise dans l'analyse de modèles de différenciation gonadique, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'action de la voie WNT/β-catenin dans la différenciation des cellules germinales, en analysant au moyen de modèles murins de perte et gain de fonction de β-catenin les conséquences de la modification de son expression dans les cellules de la gonade.Dans un premier temps, nous avons démontré que le maintien, après la naissance, de l'activité de la voie WNT/β-catenin dans les cellules souches spermatogoniales du testicule de souris stimule leur prolifération de manière massive, provoquant un défaut de différenciation en spermatozoïdes. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l'ablation génétique du gène Ctnnb1 (codant pour β-catenin) dans les cellules germinales primordiales in vivo entraîne une perte précoce de leur pluripotence et une différenciation prématurée en ovogonies. Nous avons démontré, pour la première fois in vivo, que tandis que le développement ovarien progresse, β-catenin forme des complexes protéiques avec POU5F1 et CDH1 qui transitent du noyau des cellules germinales à leur membrane, permettant ainsi leur sortie de pluripotence et leur différenciation. Nos résultats indiquent que l'E3-ubiquitine ligase ZNRF3 régule la pluripotence des cellules germinales par une boucle de rétroaction négative.Ces données indiquent que dans l'ovaire comme dans le testicule, une régulation fine de l'activité de la voie de signalisation WNT/β-catenin est requise pour déterminer la fenêtre de différenciation des cellules germinales primordiales in vivo. De plus, la voie WNT/β-catenin contrôle la sortie de pluripotence des cellules germinales primordiales via une activité non-transcriptionnelle de β-catenin, permettant à terme de coordonner le développement des cellules somatiques et germinales de la gonade. Dans les années à venir, nos travaux pourraient aider à la génération des gamètes in vitro.

La chimiothérapie utilisant le protocole BEP (cisplatine, etoposide et bléomycine) suivie d'une résection chirurgicale des masses résiduelles permet d'obtenir la guérison d'environ 50% des patients atteints d'une tumeur germinale non séminomateuse (TGNS) disséminée de mauvais pronostic. En 2014, l'étude de phase III GETUG13 a établi la valeur pronostique de la cinétique de décroissance des marqueurs tumoraux et montré qu'une chimiothérapie intensifiée en cas de décroissance lente des marqueurs tumoraux après une cure de BEP améliorait la survie sans progression, et de manière numérique mais non significative la survie globale. Cette stratégie est devenue depuis un nouveau standard de traitement. L'objectif de cette étude était d'analyser pour la première fois la reproductibilité de ces résultats dans la vie réelle. Cette étude rétrospective observationnelle a inclus les patients traités à Gustave Roussy pour une TGNS de mauvais pronostic entre juin 2013 et novembre 2017. Les patients éligibles étaient majeurs et présentaient au moins un critère de mauvais pronostic selon l'IGCCCG. Après un cycle de BEP, les marqueurs tumoraux hCG et AFP étaient mesurés à J18-J21. En cas de décroissance favorable (rapide), les patients recevaient 3 cures supplémentaires de BEP (groupe FAV-BEP) tandis que les patients avec une décroissance défavorable des marqueurs recevaient une chimiothérapie dose-dense selon le protocole GETUG 13 (groupe DEFAV dose-dense). Les caractéristiques des patients, des traitements administrés et les résultats oncologiques ont été recueillis. La survie sans progression et la survie globale ont été décrites. Entre juin 2013 et novembre 2017, 35 hommes ont été inclus (25 patients dans le groupe DEFAV-dose-dense et 10 patients dans le groupe FAV-BEP) avec une médiane de suivi de 2.41 ans [95% IC : 0.52 - 5.19]. Le groupe DEFAV-dose-dense dans notre étude était comparable au bras correspondant dans l'essai GETUG13 concernant l'âge médian (33 vs 29 ans), l'élévation des marqueurs tumoraux selon l'IGCCCG (76% vs 80%), le site primitif médiastinal (28% vs 30%) mais la fréquence de métastases viscérales extra-pulmonaires était plus importante (92% vs 56%) et l'état général légèrement plus altéré (44% des patients ECOG 2-4 vs 21%). Tous les patients dans le groupe DEFAV-dose-dense ont reçu 5 cycles de chimiothérapie, avec des effets secondaires limitant l'administration d'un anticancéreux dans 42% des cas (vs 57% dans GETUG13). Parmi les effets secondaires précoces liés à la chimiothérapie dose-dense, nous avons observé 48% de neutropénie de grade 4 (vs 43% dans GETUG13), associée à une fièvre dans 28% des cas (vs 17%), 36% de neuro-toxicité de grade supérieur ou égal à 2 (vs 23%), pas de décès toxique (vs 1%). Une neuro-toxicité résiduelle a été observée chez 48% des 25 patients, toutes de grade 1-2 (44%). Seul un patient a présenté un effet secondaire au long terme de grade 3 (auditif). L'exérèse chirurgicale des masses résiduelles après la chimiothérapie a pu être réalisée chez 80% des patients du groupe DEFAV-dose-dense (vs 70% dans GETUG 13). La chimiothérapie de rattrapage avec autogreffe de cellules souches hématopoïétiques était requise chez 24% des patients du groupe DEFAV-dose-dense (vs 8% dans GETUG 13). Dans le groupe DEFAV-dose-dense, la SSP et la SG à un an étaient de 64% [44.52-79.75] et 80.8% [59.25-92.43] versus une SSP de 60% et une SG de 70.4% à 5 ans dans le bras dose-dense du GETUG13. Dans le groupe FAV-BEP, la SSP et la SG à un an étaient de 70% [39.7-89.2] et 80% [49-94] vs respectivement, 70% et 84% à 3 ans dans GETUG13. Cette étude vérifie pour la première fois la reproductibilité des résultats du GETUG13 dans la vie réelle, concernant la tolérance et les résultats de la chimiothérapie adaptée à la décroissance des marqueurs tumoraux. Une étude multicentrique prospective française est prévue à partir de 2019.

The Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) plays an essential role in development by maintaining gene repression through the deposition of H3K27me3. A variety of cofactors have been shown to control its function in cells of various origins however little is known about PRC2 regulation during gametogenesis. During my PhD, I took advantage of murine models where Ezh2 and Ezh1 were knocked-in, I isolated nuclear extracts from whole adult testis and, identified a new polypeptide interacting with PRC2. This protein is specifically expressed in gonads, is of unknown function and does not contain any conserved domain. I have confirmed its interaction with PRC2, identified the domain of interaction with PRC2 and shown that it could tether PRC2 to chromatin. Thanks to a knockout mouse model, I demonstrated that the protein is required for female fertility, whereas its ablation brings to a global increase of H3K27me3 PRC2-associated mark in male germ cells with little consequences on male fertility. I also contributed to the characterization of the interplay between the long non-coding RNA (lncRNA) HOTAIR and PRC2 complex. Many lncRNAs have been proposed to modulate chromatin-modifying complexes action on chromatin. With the help of novel RNA-tethering system, HOTAIR inducible expression causes transgene repression independently from PRC2. Forced overexpression of HOTAIR also has little impact on transcriptome in breast cancer cells. Generally, PRC2 binding to RNA is not required for chromatin targeting. Taken together these results shed light to the mechanism of a new-identified cofactor regulating PRC2 in the gonads and contribute to dissect PRC2-RNA relationship at molecular level., Répression des genes par le dépôt de la marque H3K27me3. Divers cofacteurs contrôlent sa fonction dans des cellules de différentes origines, comme les gametes. Au cours de ma thèse, j'ai utilisé des modèles murins ou un tag a été introduit dans les gènes Ezh2 et Ezh1, j'ai isolé des extraits nucléaires de testicules adultes entiers et identifié un nouveau polypeptide interagissant avec PRC2. Ce dernier est spécifiquement exprimé dans les gonades et sa fonction est inconnue. J'ai confirmé son interaction avec PRC2 et montré qu'il pourrait recruter PRC2 à la chromatine. Grâce à un modèle de souris knock-out, j'ai démontré que la protéine est nécessaire pour la fertilité féminine, alors que son ablation apporte une augmentation globale de la marque associée à PRC2, dans les cellules germinales masculines avec peu de conséquences sur la fertilité. J'ai également contribué à la caractérisation de l'interaction entre le long ARN non-codant HOTAIR et PRC2. Nombreux ARNnc ont été proposés pour moduler l'action des complexes modifiant la chromatine. Avec l'aide d'un nouveau système de recrutement artificiel d'ARN, l'expression induite par HOTAIR provoque une répression transgénique indépendamment de PRC2. La surexpression forcée de HOTAIR a également peu d'impact sur le transcriptome dans des cellules cancéreuses. En conclusion, la liaison PRC2 à l'ARN n'est pas requise pour le ciblage de la chromatine.

Chez les mammifères, lors de leur différenciation, les cellules germinales font l’objet d’une reprogrammation de leur épigénome. Un effacement quasi total de la méthylation de l’ADN est observé dans les cellules germinales, lorsque celles-ci colonisent les futures gonades. Certaines régions du génome conservent néanmoins de la méthylation à des degrés divers en fonction du sexe des cellules germinales (XX ou XY) et de l’espèce considérée [1,2]. Ces régions où la méthylation est « non-effacée » pourraient alors être porteuses d’informations transgénérationnelles. L’apposition d’une nouvelle signature épigénétique spécifique du sexe des cellules germinales se met ensuite en place à des stades différents dans le testicule (vie fœtale) ou l’ovaire (après la naissance) [3]. Ainsi, chez les mâles, la re-méthylation de l’ADN débute pendant la vie in utero et l’environnement maternel peut donc conditionner l’acquisition de l’information épigénétique qui sera transmise, plus tard, par les spermatozoïdes de l’adulte à sa descendance. Afin de mieux connaitre les étapes clés de la re-méthylation du génome chez les espèces d’élevage, nous nous proposons de caractériser la reprogrammation des cellules germinales mâles comparativement chez trois espèces de ruminants : bovin, ovin et caprin. Des analyses globales ont déjà permis de déterminer des stades d’intérêts, notamment dans l’espèce caprine. Afin de pouvoir analyser la méthylation de l’ADN à ces différents stades, une population de cellules germinales la plus pure possible doit être isolée à partir de testicules fœtaux. Différentes techniques ont été testées, notamment la microdissection par capture laser (LCM, Laser Capture Microdissection). Un second challenge consistera ensuite à miniaturiser les procédés d’analyse, notamment ceux concernant l’étude de la méthylation (LCM-RRBS). L’extraction simultanée de l’ADN et de l’ARNm issus des cellules germinales microdisséquées permettra de comparer l’état épigénétique et transcriptomique des cellules germinales XY au cours des différentes étapes de leur différenciation.

The sex determination and subsequent germ cell differentiation is highly ordered process that starts at embryonic stage and completes at adult life. In the embryonic gonads Sry expression followed by Sox9 expression initiates testis development while in the absence of Sry expression, genes associated to female fate initiate ovary development. The germ cells that migrated towards newly formed gonads continue extensive proliferation until they commit to the male or female pathway. The fate decision of germ cells as male or female does not depend only on germ cell chromosomal sex but also on gonadal micro-environment. If germ cells enter into female gonad, they have to stop proliferation, pass through mitotic arrest and enter into meiosis; then arrest into prophase I. While if germ cells enter into male gonad, they have to stop proliferation and enter into mitotic arrest. Here we show that during embryonic sex determination, Prostaglandin D2 (PGD2) produced by each of the two enzymes: L-Pgds and H-Pgds in somatic cells and germ cells of testis participates in male germ cell differentiation program. PGD2 signalling supports mitotic arrest by activating the expression and nuclear localization of cell cycle inhibitor P21cip1 and by repressing pluripotency markers and PGD2 has negative effects on Stra8 expression. In addition PGD2 supports activation of male specific gene Nanos2. Hence these data suggest that PGD2 signalling through DP2 receptor is required for proper male germ cell differentiation.; La détermination du sexe et la différenciation des cellules germinales est un processus très organisé qui commence au stade embryonnaire et se termine à la vie adulte. Dans les gonades embryonnaires l'expression de Sry suivie par l'expression de Sox9 initie le développement testiculaire tandis que, en l'absence de l'expression de Sry, les gènes associés au sexe féminin initient le développement des ovaires. Les cellules germinales qui ont migré vers les gonades nouvellement formées continuent leur prolifération intense jusqu'à ce qu'ils s'engagent dans la voie le mâle ou femelle. La décision de devenir des cellules germinales mâle ou femelle ne dépend pas seulement du chromosome sexuel des cellules germinales, mais aussi du micro-environnement des gonades. Si les cellules germinales entrent dans la gonade femelle, ils doivent arrêter la prolifération, dépasser l'arrêt mitotique et entrer en méiose et alors s'arrêter en prophase I. Alors que si les cellules germinales entrent dans la gonade mâle, ils doivent arrêter la prolifération et entrer en arrêt de la mitose. Ici, nous montrons que, lors de la détermination du sexe embryonnaire, la prostaglandine D2 (PGD2) produite par chacune des deux enzymes: la L-PGDS et H-PGDS dans les cellules somatiques et les cellules germinales du testicule mâle participe au programme de différenciation des cellules germinales. La voie de signalisation PGD2 entraine l'arrêt de la mitose par l'activation de l'expression et de la localisation nucléaire de l'inhibiteur du cycle cellulaire p21Cip1 et en réprimant les marqueurs de pluripotence et aussi Stra8. En outre, PGD2 est responsable de l'activation du gène spécifique au mâle Nanos2. Par conséquent, ces données suggèrent que la signalisation par le récepteur de PGD2 DP2 est requise pour la différenciation correcte de la cellule germinale mâle.

In vitro and in vivo epidemiological studies showed that the exposure of men to endocrine disruptors triggers the initiation and the progression of the testis cancer (Beiki et al., 2010). The fetal exposure to these products is able to alter the differentiation of germ cells in the timing of their development during the fetal life. The aim of our study was to determine the role of an endocrine disruptor mix on the proliferation of seminoma cells TCam-2. We also identified the pathways involved. In this study, we focused on the estrogen-like effects of an alkylphenol mixture called M4 (4-tert-octylphenol and 4-nonylphenol): in vitro we measured the proliferation of TCam-2 seminoma cells after M4 exposure and in vivo, we measured the tumor growth of NT2/D1 cells xenografted into Nude mice. The results highlighted the implication of ER[alpha]36 receptor, a truncated isoform of ER[alpha], in the response to the alkylphenol mixture M4. This mixture stimulates the cell proliferation of testicular cancer cells and the expression of the ER[alpha]36 receptor. These effects are mediated by CREB phosphorylation via the PI3K-ER[alpha]36-dependant pathway, and end by downregulation of Dnmt3 genes, thus limiting the level of DNA methylation. Therefore ER[alpha]36 appears to be a promising therapeutic target for testis cancer treatment, L’incidence des cancers testiculaires a fortement augmenté au cours des 50 dernières années. Des études épidémiologiques in vitro et in vivo, ont montré que l’exposition des hommes aux perturbateurs endocriniens est impliquée dans l’initiation et la progression du cancer du testicule (Beiki et al., 2010). L’exposition fœtale à ces produits pourrait provoquer des altérations de la différenciation des cellules germinales (CGs) au cours leur développement pendant la vie fœtale. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle des perturbateurs endocriniens œstrogéno-mimétiques en mélange sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2. Nous avons identifié les voies de signalisation impliquées dans la réponse à ces produits. Nous nous sommes focalisés sur les effets d’un mélange d’alkylphénols appelé M4 (4-tert-octylphénol et le 4-nonylphénol), in vitro sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2, et in vivo sur la croissance de tumeurs obtenues à partir des cellules de carcinome embryonnaire NT2/D1 xénogreffées chez la souris Nude. Dans notre étude, nous avons mis en évidence l’implication d’ER[alpha]36, une isoforme tronquée du récepteur ER[alpha], dans la réponse au mélange d’alkylphénols, M4. Ce mélange stimule la prolifération des cellules du cancer testiculaire et l’expression du récepteur ER[alpha]36. Ces effets sont médiés par la phosphorylation de CREB via la voie PI3K-ER[alpha]36-dépendante, et aboutissent à la diminution de l’expression des gènes de la famille Dnmt3, limitant le niveau de méthylation de l’ADN. ER[alpha]36 pourrait donc constituer une cible thérapeutique dans le traitement des cancers testiculaires

Accès restreint aux membres de l'Université de Lorraine jusqu'au 2015-09-01; In vitro and in vivo epidemiological studies showed that the exposure of men to endocrine disruptors triggers the initiation and the progression of the testis cancer (Beiki et al., 2010). The fetal exposure to these products is able to alter the differentiation of germ cells in the timing of their development during the fetal life. The aim of our study was to determine the role of an endocrine disruptor mix on the proliferation of seminoma cells TCam-2. We also identified the pathways involved. In this study, we focused on the estrogen-like effects of an alkylphenol mixture called M4 (4-tert-octylphenol and 4-nonylphenol): in vitro we measured the proliferation of TCam-2 seminoma cells after M4 exposure and in vivo, we measured the tumor growth of NT2/D1 cells xenografted into Nude mice. The results highlighted the implication of ER[alpha]36 receptor, a truncated isoform of ER[alpha], in the response to the alkylphenol mixture M4. This mixture stimulates the cell proliferation of testicular cancer cells and the expression of the ER[alpha]36 receptor. These effects are mediated by CREB phosphorylation via the PI3K-ER[alpha]36-dependant pathway, and end by downregulation of Dnmt3 genes, thus limiting the level of DNA methylation. Therefore ER[alpha]36 appears to be a promising therapeutic target for testis cancer treatment; L’incidence des cancers testiculaires a fortement augmenté au cours des 50 dernières années. Des études épidémiologiques in vitro et in vivo, ont montré que l’exposition des hommes aux perturbateurs endocriniens est impliquée dans l’initiation et la progression du cancer du testicule (Beiki et al., 2010). L’exposition fœtale à ces produits pourrait provoquer des altérations de la différenciation des cellules germinales (CGs) au cours leur développement pendant la vie fœtale. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle des perturbateurs endocriniens œstrogéno-mimétiques en mélange sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2. Nous avons identifié les voies de signalisation impliquées dans la réponse à ces produits. Nous nous sommes focalisés sur les effets d’un mélange d’alkylphénols appelé M4 (4-tert-octylphénol et le 4-nonylphénol), in vitro sur la prolifération des cellules séminomateuses TCam-2, et in vivo sur la croissance de tumeurs obtenues à partir des cellules de carcinome embryonnaire NT2/D1 xénogreffées chez la souris Nude. Dans notre étude, nous avons mis en évidence l’implication d’ER[alpha]36, une isoforme tronquée du récepteur ER[alpha], dans la réponse au mélange d’alkylphénols, M4. Ce mélange stimule la prolifération des cellules du cancer testiculaire et l’expression du récepteur ER[alpha]36. Ces effets sont médiés par la phosphorylation de CREB via la voie PI3K-ER[alpha]36-dépendante, et aboutissent à la diminution de l’expression des gènes de la famille Dnmt3, limitant le niveau de méthylation de l’ADN. ER[alpha]36 pourrait donc constituer une cible thérapeutique dans le traitement des cancers testiculaires

Spermatogenesis in mammals is a complex biological function including cellular processes such as proliferation, meiosis and differentiation, aiming to the production of male gametes in the testis. If the seminiferous epithelium is well described in terms of organization and cellular morphology of cells that compose it, the processes by which undifferentiated diploid germ cells enter meiosis and give haploid cells that undergo many morphological transformations, are not fully decrypted. These processes rely on the coordinated and sequential expression of genes, including specific products for each stage of germ cell development These gene products are essential at each key stage of spermatogenesis. Transcriptomics since the 1990s, and proteomics since the 2000s have contributed to the improved. understanding of these mechanisms. A long term proteomic study aiming at characterizing the proteomes of Sertoli cells and germ cells, and a recent study that characterized and quantified the transcriptome of isolated rat testicular cells at high resolution using de novo sequencing of transcripts (RNA-Seq), have been the basis of my thesis work. The latter study showed the accumulation of long non-Coding RNAs (lncRNAs) and testicular unannotated transcripts (TUTs) at meiotic and post-Meiotic stages of spermatogenesis in the rat. In this context, my thesis work aimed at validating the coding potential of many genes expressed in germ cells using RNA-Seq combined with shotgun proteomics, a so-Called PIT (Proteomics Informed by transcriptomics) approach. In this approach, the protein sequences translated from the transcripts assembled by RNA-Seq in the different testicular cell types are integrated into a custom database of protein sequences used to query mass spectrometry data obtained from proteins of meiotic and post-Meiotic cells. The PIT approach showed that 69 TUTs or lncRNA (corresponding to 44 loci) code for proteins in meiotic cells and post meiotic cells, and we confirmed experimentally the meiotic and post-Meiotic expression for two new transcripts encoding for VAMP9, a protein of the SNARE family, and a new testicular enolase T-ENOL. The post-Meiotic expression of T-ENOL protein was confirmed by immunohistochemistry using a polyclonal antibody raised against the recombinant protein. This approach also allowed us to identify new isoforms of known proteins, specific to each stage of spermatogenesis. Germ cells and Sertoli cells maintain a dialogue which is necessary to the success of spermatogenesis and spermiogenesis. Another part of my work aimed at identifying membrane proteins, in germ cells and residual bodies, that may be involved in the dialogue between Sertoli cells and germ cells, using a ICPL relative quantification proteomic approach. The ICPL analysis enabled us to establish a list of 166 proteins whose expression is differential between pachytene spermatocytes, round spermatids and residual bodies. Their differential expression suggests that these proteins may play a role in spermiogenesis. Thanks to the Gene Ontology annotations, a list of 8 proteins with a putative role in signal transduction, cell recognition or differentiation, thus potentially involved in the dialogue between Sertoli and germ cells was drawn. In addition, I provided a first proteome of rat Sertoli cells, germ cells and residual bodies obtained by shotgun proteomics., La spermatogenèse chez les mammifères est une fonction biologique complexe incluant des processus de prolifération cellulaire, de méiose et de différenciation uniques visant à la production des gamètes mâles au sein du testicule. Si l’épithélium séminifère est bien décrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les processus par lesquels les cellules germinales diploïdes indifférenciées entrent en méiose pour donner ensuite des cellules haploïdes subissant par la suite de nombreuses transformations morphologiques, ne sont pas totalement décryptés. Ils reposent sur l’expression coordonnée et séquentielle de gènes dont les produits spécifiques de chaque stade de développement des cellules germinales sont essentiels aux étapes clés de la spermatogenèse. La transcriptomique depuis les années 1990 et la protéomique depuis les années 2000 ont contribué à l’amélioration de la connaissance de ces mécanismes. Une étude protéomique visant à caractériser par des approches systématiques et différentielles les protéomes des cellules de Sertoli et de la lignée germinale, et d’autre part une étude récente, réalisée dans notre unité, qui a permis de caractériser et de quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolées de rat en utilisant le séquençage de novo des transcrits (RNA-Seq), ont été à la base de mes travaux de thèse. Cette dernière étude a mis en évidence l’accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs) et de transcrits testiculaires non annotés (TUTs) aux stades méiotique et post- méiotique de la spermatogenèse chez le rat. Dans ce contexte, mon travail a consisté à valider le potentiel codant de nombreux gènes exprimés dans les cellules germinales par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant protéomique Shotgun et RNA-Seq. Dans ce type d’approche, les séquences protéiques déduites des transcrits des différents types cellulaires, assemblés par RNA-Seq, sont intégrées dans une base personnalisée de séquences protéiques utilisée pour interroger les données de spectrométrie de masse obtenues à partir de protéines de cellules méiotiques et post-Méiotiques. L’approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant à 44 loci) codent pour des protéines dans les cellules méiotiques et post méiotiques. L’expression post-Méiotique de deux nouveaux transcrits, l’un codant pour la protéine VAMP9, une protéine de la famille SNARE, et l’autre pour une nouvelle énolase T-ENOL a pu être confirmée. L’expression post-Méiotique de T-ENOL a été confirmée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps polyclonal produit contre la protéine recombinante. Cette approche nous a également permis d’identifier de nouvelles isoformes de protéines connues spécifiques de chaque stade de la spermatogenèse. Les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue nécessaire au bon déroulement de la spermatogenèse. Une autre partie de mon travail a consisté à identifier des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels, susceptibles d’intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche protéomique de quantification relative ICPL. Cette approche a permis d’établir une liste de 166 protéines différentiellement exprimées entre les spermatocytes pachytène, les spermatides rondes et les corps résiduels, qui sont susceptibles de jouer un rôle dans la spermiogénèse. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j’ai pu établir une liste de 8 protéines ayant un rôle supposé dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la différenciation. Par ailleurs, j’ai pu établir par protéomique Shotgun un premier protéome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps résiduels chez le rat.

Spermatogenesis in mammals is a complex biological function including cellular processes such as proliferation, meiosis and differentiation, aiming to the production of male gametes in the testis. If the seminiferous epithelium is well described in terms of organization and cellular morphology of cells that compose it, the processes by which undifferentiated diploid germ cells enter meiosis and give haploid cells that undergo many morphological transformations, are not fully decrypted. These processes rely on the coordinated and sequential expression of genes, including specific products for each stage of germ cell development These gene products are essential at each key stage of spermatogenesis. Transcriptomics since the 1990s, and proteomics since the 2000s have contributed to the improved. understanding of these mechanisms. A long term proteomic study aiming at characterizing the proteomes of Sertoli cells and germ cells, and a recent study that characterized and quantified the transcriptome of isolated rat testicular cells at high resolution using de novo sequencing of transcripts (RNA-Seq), have been the basis of my thesis work. The latter study showed the accumulation of long non-Coding RNAs (lncRNAs) and testicular unannotated transcripts (TUTs) at meiotic and post-Meiotic stages of spermatogenesis in the rat. In this context, my thesis work aimed at validating the coding potential of many genes expressed in germ cells using RNA-Seq combined with shotgun proteomics, a so-Called PIT (Proteomics Informed by transcriptomics) approach. In this approach, the protein sequences translated from the transcripts assembled by RNA-Seq in the different testicular cell types are integrated into a custom database of protein sequences used to query mass spectrometry data obtained from proteins of meiotic and post-Meiotic cells. The PIT approach showed that 69 TUTs or lncRNA (corresponding to 44 loci) code for proteins in meiotic cells and post meiotic cells, and we confirmed experimentally the meiotic and post-Meiotic expression for two new transcripts encoding for VAMP9, a protein of the SNARE family, and a new testicular enolase T-ENOL. The post-Meiotic expression of T-ENOL protein was confirmed by immunohistochemistry using a polyclonal antibody raised against the recombinant protein. This approach also allowed us to identify new isoforms of known proteins, specific to each stage of spermatogenesis. Germ cells and Sertoli cells maintain a dialogue which is necessary to the success of spermatogenesis and spermiogenesis. Another part of my work aimed at identifying membrane proteins, in germ cells and residual bodies, that may be involved in the dialogue between Sertoli cells and germ cells, using a ICPL relative quantification proteomic approach. The ICPL analysis enabled us to establish a list of 166 proteins whose expression is differential between pachytene spermatocytes, round spermatids and residual bodies. Their differential expression suggests that these proteins may play a role in spermiogenesis. Thanks to the Gene Ontology annotations, a list of 8 proteins with a putative role in signal transduction, cell recognition or differentiation, thus potentially involved in the dialogue between Sertoli and germ cells was drawn. In addition, I provided a first proteome of rat Sertoli cells, germ cells and residual bodies obtained by shotgun proteomics., La spermatogenèse chez les mammifères est une fonction biologique complexe incluant des processus de prolifération cellulaire, de méiose et de différenciation uniques visant à la production des gamètes mâles au sein du testicule. Si l’épithélium séminifère est bien décrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les processus par lesquels les cellules germinales diploïdes indifférenciées entrent en méiose pour donner ensuite des cellules haploïdes subissant par la suite de nombreuses transformations morphologiques, ne sont pas totalement décryptés. Ils reposent sur l’expression coordonnée et séquentielle de gènes dont les produits spécifiques de chaque stade de développement des cellules germinales sont essentiels aux étapes clés de la spermatogenèse. La transcriptomique depuis les années 1990 et la protéomique depuis les années 2000 ont contribué à l’amélioration de la connaissance de ces mécanismes. Une étude protéomique visant à caractériser par des approches systématiques et différentielles les protéomes des cellules de Sertoli et de la lignée germinale, et d’autre part une étude récente, réalisée dans notre unité, qui a permis de caractériser et de quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolées de rat en utilisant le séquençage de novo des transcrits (RNA-Seq), ont été à la base de mes travaux de thèse. Cette dernière étude a mis en évidence l’accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs) et de transcrits testiculaires non annotés (TUTs) aux stades méiotique et post- méiotique de la spermatogenèse chez le rat. Dans ce contexte, mon travail a consisté à valider le potentiel codant de nombreux gènes exprimés dans les cellules germinales par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant protéomique Shotgun et RNA-Seq. Dans ce type d’approche, les séquences protéiques déduites des transcrits des différents types cellulaires, assemblés par RNA-Seq, sont intégrées dans une base personnalisée de séquences protéiques utilisée pour interroger les données de spectrométrie de masse obtenues à partir de protéines de cellules méiotiques et post-Méiotiques. L’approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant à 44 loci) codent pour des protéines dans les cellules méiotiques et post méiotiques. L’expression post-Méiotique de deux nouveaux transcrits, l’un codant pour la protéine VAMP9, une protéine de la famille SNARE, et l’autre pour une nouvelle énolase T-ENOL a pu être confirmée. L’expression post-Méiotique de T-ENOL a été confirmée par immunohistochimie à l’aide d’un anticorps polyclonal produit contre la protéine recombinante. Cette approche nous a également permis d’identifier de nouvelles isoformes de protéines connues spécifiques de chaque stade de la spermatogenèse. Les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue nécessaire au bon déroulement de la spermatogenèse. Une autre partie de mon travail a consisté à identifier des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels, susceptibles d’intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche protéomique de quantification relative ICPL. Cette approche a permis d’établir une liste de 166 protéines différentiellement exprimées entre les spermatocytes pachytène, les spermatides rondes et les corps résiduels, qui sont susceptibles de jouer un rôle dans la spermiogénèse. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j’ai pu établir une liste de 8 protéines ayant un rôle supposé dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la différenciation. Par ailleurs, j’ai pu établir par protéomique Shotgun un premier protéome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps résiduels chez le rat.

Epidemiological studies have reported an increase in male infertility over the past fifty years, especially in industrialized countries, but also an increase in malformations of the male reproductive tract such as cryptorchidism (no migration of the testes into the scrotum) and hypospadias (malformation of the penis), and testicular cancers. Experimental data suggest that these abnormalities of the male genital tract are related. These symptoms form the testicular dysgenesis syndrome. The causes of the occurrence of this syndrome appear to be environmental in origin. Indeed, the relatively rapid evolution of this syndrome suggests dynamic factors related to lifestyle or environment. One hypothesis is that exposure during fetal or neonatal life to compounds present in the environment can interfere with the hormonal system (environmental endocrine disruptors), would be responsible for the increased incidence of these pathologies. Bench of the main accused, molecules that have estrogenic or anti-androgenic activity types. To date, the mechanisms of action behind the testicular dysgenesis syndrome are poorly understood. Some studies suggest that epigenetic mechanisms are at playThe objective of our work was to identify and characterize the epigenetic mechanisms of action involved in male infertility induced by neonatal exposure to xenoestrogen. For this, we used an experimental model based on a developmental exposure to estrogen (estradiol benzoate). This model induced in adult rats a hypospermatogenesis phenotype due to chronic apoptosis of germ cells.We show that this phenotype is related to an alteration of two pathways, involving upstream effectors epigenetic. The first pathway involves the family of miR- 29s. Thus, we observe an up-regulation of miR -29a, b, c, which causes a decrease in two of his targets: the anti-apoptotic protein MCL- 1 and the enzymes of DNA methylation DNMTs. Falling DNMTs leads to a global hypomethylation (estimated through the Line -1 gene) and to specific hypomethylation of the heat shock factor, HSF1. This causes a re-expression of factors that induce apoptosis in adult germ cells. The second pathway involves up-regulation of miR -18a that causes a down-regulation of its target HSF2 which regulates the heat shock protein HSP70/HSPA2. The down-regulation of HSPA2 is another explanation of germ cell apoptosis in our model. We also show that this phenotype is irreversible when the estrogen exposure takes place in the newborn whereas it is reversible when exposure takes place in adulthood, suggesting that neonatal exposure to estradiol benzoate induced a developmental programming of hypospermatogenesis.Finally, abnormal tissue expressions of miRNAs are found in the blood, suggesting their potential use as biomarkers. We validated this aspect in humans showing that the expression of miR29s and miR-18a was higher in patients with decrease or no sperm counts compared to normal sperm count. In conclusion, our results indicate that hypospermatogenesis due to chronic germ cell apoptosis observed in adult animals after neonatal exposure to EB involves a change in expression of several key epigenetic effectors: miR-29, miR-18a and DNMTs. In addition, miR-29 and miR-18a could be new non invasive circulating biomarkers of men infertility., Un certain nombre d’études épidémiologiques font état d’une augmentation de l’infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d’une augmentation des malformations de l’appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l’hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d’apparition ce syndrome semblent être d’origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l’environnement. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d’action à l’origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L’objectif de notre travail était d’identifier et caractériser les mécanismes d’action de type épigenétique impliqué dans l’infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d’hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l’altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l’expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l’ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l’apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L’augmentation de son expression provoque une chute de l’expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d’HSPA2 est une autre explication de l’apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l’exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu’il est réversible quand l’exposition à lieu à l’âge adulte. Ces données suggèrent que l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate induit une programmation développementale de l’hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d’expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l’homme en montrant que l’expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l’hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l’animal adulte après exposition néonatale à l’EB met en jeu une modification d’expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d’une oligo ou azoospermie chez l'homme.

Epidemiological studies have reported an increase in male infertility over the past fifty years, especially in industrialized countries, but also an increase in malformations of the male reproductive tract such as cryptorchidism (no migration of the testes into the scrotum) and hypospadias (malformation of the penis), and testicular cancers. Experimental data suggest that these abnormalities of the male genital tract are related. These symptoms form the testicular dysgenesis syndrome. The causes of the occurrence of this syndrome appear to be environmental in origin. Indeed, the relatively rapid evolution of this syndrome suggests dynamic factors related to lifestyle or environment. One hypothesis is that exposure during fetal or neonatal life to compounds present in the environment can interfere with the hormonal system (environmental endocrine disruptors), would be responsible for the increased incidence of these pathologies. Bench of the main accused, molecules that have estrogenic or anti-androgenic activity types. To date, the mechanisms of action behind the testicular dysgenesis syndrome are poorly understood. Some studies suggest that epigenetic mechanisms are at playThe objective of our work was to identify and characterize the epigenetic mechanisms of action involved in male infertility induced by neonatal exposure to xenoestrogen. For this, we used an experimental model based on a developmental exposure to estrogen (estradiol benzoate). This model induced in adult rats a hypospermatogenesis phenotype due to chronic apoptosis of germ cells.We show that this phenotype is related to an alteration of two pathways, involving upstream effectors epigenetic. The first pathway involves the family of miR- 29s. Thus, we observe an up-regulation of miR -29a, b, c, which causes a decrease in two of his targets: the anti-apoptotic protein MCL- 1 and the enzymes of DNA methylation DNMTs. Falling DNMTs leads to a global hypomethylation (estimated through the Line -1 gene) and to specific hypomethylation of the heat shock factor, HSF1. This causes a re-expression of factors that induce apoptosis in adult germ cells. The second pathway involves up-regulation of miR -18a that causes a down-regulation of its target HSF2 which regulates the heat shock protein HSP70/HSPA2. The down-regulation of HSPA2 is another explanation of germ cell apoptosis in our model. We also show that this phenotype is irreversible when the estrogen exposure takes place in the newborn whereas it is reversible when exposure takes place in adulthood, suggesting that neonatal exposure to estradiol benzoate induced a developmental programming of hypospermatogenesis.Finally, abnormal tissue expressions of miRNAs are found in the blood, suggesting their potential use as biomarkers. We validated this aspect in humans showing that the expression of miR29s and miR-18a was higher in patients with decrease or no sperm counts compared to normal sperm count. In conclusion, our results indicate that hypospermatogenesis due to chronic germ cell apoptosis observed in adult animals after neonatal exposure to EB involves a change in expression of several key epigenetic effectors: miR-29, miR-18a and DNMTs. In addition, miR-29 and miR-18a could be new non invasive circulating biomarkers of men infertility.; Un certain nombre d’études épidémiologiques font état d’une augmentation de l’infertilité masculine durant ces cinquante dernières années, en particulier dans les pays industrialisés, mais aussi d’une augmentation des malformations de l’appareil reproducteur masculin telles que la cryptorchidie (absence de migration des testicules dans les bourses) ou l’hypospadias (malformation du pénis), et des cancers testiculaires. Des données expérimentales suggèrent que ces anomalies du tractus génital mâle sont liées. Ces symptômes forment le syndrome de dysgénésie testiculaire. Les causes d’apparition ce syndrome semblent être d’origine environnementale. En effet, les évolutions relativement rapides de ce syndrome suggèrent des facteurs dynamiques, en lien avec le mode de vie ou l’environnement. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie fœtale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens environnementaux, PEEs), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Au banc des principaux accusés, les molécules qui possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. A ce jour, les mécanismes d’action à l’origine du syndrome de dysgénésie testiculaire sont encore mal connus. Certaines études suggèrent des mécanismes de type épigenétique dans les effets à long terme des PEEs. L’objectif de notre travail était d’identifier et caractériser les mécanismes d’action de type épigenétique impliqué dans l’infertilité mâle. Pour cela, nous avons utilisé un modèle expérimental (rats nouveau-nés) reposant sur une exposition développementale à un estrogène (estradiol benzoate). Ce modèle induit chez le rat adulte un phénotype d’hypospermatogenèse liée à une à apoptose chronique des cellules germinales testiculaires. Nous montrons que ce phénotype est lié à l’altération de deux voies, impliquant en amont des effecteurs épigénétiques. La première voie implique la famille des miR-29s. Ainsi, nous observons une augmentation de l’expression des miR-29a, b, c qui provoque une diminution de deux de ses cibles: la protéine antiapoptotique MCL-1 et les enzymes de méthylation de l’ADN DNMTs. La chute des DNMTs entraine une hypométhylation globale (estimée à travers le gène Line-1) et spécifique du facteur de choc thermique HSF1. Ceci provoque une réexpression de ces facteurs entrainant l’apoptose des cellules germinales adultes. La deuxième voie implique le miR-18a. L’augmentation de son expression provoque une chute de l’expression de sa cible HSF2 qui régule la protéine de choc thermique HSP70/HSPA2. Le faible taux d’HSPA2 est une autre explication de l’apoptose des cellules germinales dans notre modèle. Nous montrons aussi que ce phénotype est irréversible lorsque l’exposition à lieu chez le nouveau-né alors qu’il est réversible quand l’exposition à lieu à l’âge adulte. Ces données suggèrent que l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate induit une programmation développementale de l’hypospermatogenèse.Enfin, les anomalies tissulaires d’expression des miRNAs se retrouvent au niveau sanguin, suggérant leur utilisation potentielle comme biomarqueurs. Nous avons validé cet aspect chez l’homme en montrant que l’expression des miR29s et du miR-18a était plus élevée chez les patients oligo- ou azoospermiques que les chez patients normospermiques.En conclusion, nos résultats indiquent que l’hypospermatogenèse due à une apoptose chronique des cellules germinales observée chez l’animal adulte après exposition néonatale à l’EB met en jeu une modification d’expression de plusieurs effecteurs épigénétiques clés: miR-29s, miR-18a et DNMTs. De plus, les miR-29s et miR-18a pourraient être de nouveaux biomarqueurs circulants non invasifs de la stérilité masculine dans le contexte d’une oligo ou azoospermie chez l'homme.

In the context of comparative physiology of reproduction, amphibians are poorly studied. This work was dedicated to the analysis of testis differentiation markers in the newt Pleurodeles waltl, which shows a ZZ/ZW genetic mode of sex determination that can be affected by temperature. First, we studied sox9, a testis differentiation marker well characterized in many higher vertebrates. The gene cloned in Pleurodeles shows a good level of identity with other vertebrates. The testis-enriched expression appears late during the testis differentiation process indicating that it is probably not involved in the early steps of testis differentiation. Its use as a marker of testicular differentiation proved difficult since it is expressed not only in the gonads but also in the mesonephros. Then, we studied amh, a testis hormone responsible for müllerian duct regression in many vertebrates. Its early expression in the gonad, significantly higher in male than in female larvae makes it an excellent marker for testis differentiation. Since in Pleurodeles waltl, Müllerian ducts persist in males, it suggests that during the course of evolution, the function of Amh on the regression of Müllerian ducts appeared secondarily after its role in gonadal differentiation. These markers have been used to characterize the gonadal phenotype during sex reversal, or in gonads developed in the absence of germ cells. They showed that these cells do not seem to play a role in gonadal differentiation of Pleurodeles waltl, Dans le contexte de la physiologie comparée de la reproduction, les amphibiens sont peu étudiés. Le travail réalisé durant cette thèse visait à analyser des marqueurs de différenciation testiculaire chez l'urodèle Pleurodeles waltl, dont le déterminisme génétique du sexe (ZZ/ZW) peut être influencé par la température. Nos études ont d'abord porté sur le gène sox9 marqueur de la différenciation testiculaire chez les vertébrés supérieurs. Le gène cloné chez le pleurodèle montre une bonne conservation par rapport aux autres vertébrés. Son expression plus élevée dans la gonade mâle n'apparaît que tardivement suggérant qu'il n'est probablement pas impliqué dans les stades précoces de la différenciation testiculaire. En outre, son expression dans le mésonéphros rend difficile son utilisation comme marqueur de différenciation testiculaire. Nous avons ensuite étudié l'Amh, hormone testiculaire impliquée dans la régression des canaux de Müller chez de nombreux vertébrés. Son expression spécifique de la gonade, précocement plus élevée chez les larves ZZ que les ZW en font un excellent marqueur de la différenciation testiculaire. Le fait que les pleurodèles mâles voient les canaux de Müller persister malgré la présence d'Amh suggère que la fonction primaire de cette hormone était en relation avec la différenciation gonadique et que la fonction de régression des canaux de Müller n'est apparue que secondairement au cours de l'évolution. Ces marqueurs ont été mis à profit pour caractériser le phénotype gonadique lors d'inversions sexuelles ou lors de développements en absence de cellules germinales. Ils ont permis de montrer que les cellules germinales ne semblent pas jouer de rôle dans la différenciation gonadique du pleurodèle

In the context of comparative physiology of reproduction, amphibians are poorly studied. This work was dedicated to the analysis of testis differentiation markers in the newt Pleurodeles waltl, which shows a ZZ/ZW genetic mode of sex determination that can be affected by temperature. First, we studied sox9, a testis differentiation marker well characterized in many higher vertebrates. The gene cloned in Pleurodeles shows a good level of identity with other vertebrates. The testis-enriched expression appears late during the testis differentiation process indicating that it is probably not involved in the early steps of testis differentiation. Its use as a marker of testicular differentiation proved difficult since it is expressed not only in the gonads but also in the mesonephros. Then, we studied amh, a testis hormone responsible for müllerian duct regression in many vertebrates. Its early expression in the gonad, significantly higher in male than in female larvae makes it an excellent marker for testis differentiation. Since in Pleurodeles waltl, Müllerian ducts persist in males, it suggests that during the course of evolution, the function of Amh on the regression of Müllerian ducts appeared secondarily after its role in gonadal differentiation. These markers have been used to characterize the gonadal phenotype during sex reversal, or in gonads developed in the absence of germ cells. They showed that these cells do not seem to play a role in gonadal differentiation of Pleurodeles waltl, Dans le contexte de la physiologie comparée de la reproduction, les amphibiens sont peu étudiés. Le travail réalisé durant cette thèse visait à analyser des marqueurs de différenciation testiculaire chez l'urodèle Pleurodeles waltl, dont le déterminisme génétique du sexe (ZZ/ZW) peut être influencé par la température. Nos études ont d'abord porté sur le gène sox9 marqueur de la différenciation testiculaire chez les vertébrés supérieurs. Le gène cloné chez le pleurodèle montre une bonne conservation par rapport aux autres vertébrés. Son expression plus élevée dans la gonade mâle n'apparaît que tardivement suggérant qu'il n'est probablement pas impliqué dans les stades précoces de la différenciation testiculaire. En outre, son expression dans le mésonéphros rend difficile son utilisation comme marqueur de différenciation testiculaire. Nous avons ensuite étudié l'Amh, hormone testiculaire impliquée dans la régression des canaux de Müller chez de nombreux vertébrés. Son expression spécifique de la gonade, précocement plus élevée chez les larves ZZ que les ZW en font un excellent marqueur de la différenciation testiculaire. Le fait que les pleurodèles mâles voient les canaux de Müller persister malgré la présence d'Amh suggère que la fonction primaire de cette hormone était en relation avec la différenciation gonadique et que la fonction de régression des canaux de Müller n'est apparue que secondairement au cours de l'évolution. Ces marqueurs ont été mis à profit pour caractériser le phénotype gonadique lors d'inversions sexuelles ou lors de développements en absence de cellules germinales. Ils ont permis de montrer que les cellules germinales ne semblent pas jouer de rôle dans la différenciation gonadique du pleurodèle

Spermatogenesis is a complex process located in seminiferous tubules of the testis. Germ cell underwent meiosis during the process following many cytological modifications such as chromatin compaction, biogenesis of both acrosome and flagellum. Subcellular components like the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum were eliminated. Spermatozoa is then a highly organized cell which realized no or little de novo protein synthesis. Spermatozoa is furthermore unable to move and fertilize an oocyte outside of the testis, as it fully becomes functional by interacting with its environment, the epididymis and the female genital tracts. These interactions are translated by modifications of the proteome as proteins cleavage or post-translational modifications. The proteomic approach represents then a relevant method to understand sperm physiology. Nevertheless, few studies are related to sperm proteome which remains poorly known. This study has been conducted using two different approaches. 2D-electrophoresis is especially adapted to post-translational studies while the shotgun approach is a powerful and sensible tool for protein identification. Bioinformatic analyses helped identifying protein families overexpressed in a meaningful way inside the sperm proteome. Microtubules-associated proteins were among those that have been selected due to their role in the dynamic of microtubule network, thus in the sperm motility. The DCDC2C expression profile, a protein belonging to the doublecortin containing domain family, has been characterized in the testis and in the human spermatozoa. Further investigations are necessary in order to define its role in the sperm physiology.Besides the understanding of physiological processes, proteomic tools allow the identification of new markers of sperm quality. The characterization of sperm quality currently relies on a descriptive test that is not yet capable of explaining the infertility of a couple. Improving the diagnostic tool and management of fertility are the main objectives of reproductive studies. We have therefore observed the proteome of 161 normal sperm samples (WHO 2010). The proteome analysis defined a new sperm protein quality index (SPQI). Statistic studies show that this SPQI is significantly related to the progressive motility of the sperm. SPQI could then be used as a new quality marker of the spermatozoa. A kit that could help establishing SPQI routinely is currently in process.; La spermatogenèse est un processus complexe qui se déroule dans le tube séminifère du testicule. Au cours de ce processus, la cellule germinale entre en méiose puis réalise de profondes transformations cytologiques comme la compaction de la chromatine, la formation de l’acrosome et du flagelle. Les organites cytoplasmiques comme l’appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique sont éliminés. Le spermatozoïde est alors une cellule organisée qui ne réalise pas ou peu de synthèse protéique. De plus, à la sortie du testicule, le spermatozoïde n’est pas mobile et incapable de féconder l’ovocyte. C’est par des interactions avec son environnement, l’épididyme et les voies génitales féminines, qu’il acquiert pleinement ces fonctions. Ces interactions se traduisent par des modifications du protéome comme le clivage des protéines ou des modifications post-traductionnelles. Ainsi, l’approche protéomique représente une méthode pertinente pour appréhender la physiologie spermatique. Toutefois, le protéome spermatique a fait l’objet de peu d’études et reste mal connu. Dans cette étude, le protéome du spermatozoïde humain a été réalisé selon deux approches. L’électrophorèse bidimensionnelle est particulièrement adaptée pour l’étude des modifications post-traductionnelles tandis que le shotgun constitue une technologie puissante en terme de sensibilité et d’identification des protéines. Les analyses bioinformatiques ont permis d’identifier les familles de protéines surexprimées de façon significative au sein du protéome spermatique. Parmi celles-ci, les protéines d’associations aux microtubules ont été sélectionnées en raison de leur rôle fondamental dans la dynamique du réseau microtubulaire et par conséquent, la mobilité spermatique. Le profil d’expression de la DCDC2C, une protéine de la famille des domaines à doublecortines, a été caractérisé dans le testicule et le spermatozoïde humain. De plus amples investigations sont nécessaires afin de préciser son rôle dans la physiologie spermatique.Outre la compréhension de processus physiologiques, les outils protéomiques permettent l’identification de nouveaux marqueurs de qualité du spermatozoïde. La caractérisation de la qualité spermatique repose actuellement sur un examen descriptif, le spermogramme-spermocytogramme, qui ne permet pas toujours d’expliquer l’infertilité du couple. Ainsi, l’amélioration des outils diagnostics et de la prise en charge de la fertilité sont les enjeux de la Procréation Médicalement Assistée. Dans ce contexte, nous avons observé le protéome de 161 échantillons de spermes normaux (OMS 2010). L’analyse de ce protéome a permis de définir un nouvel index de qualité protéique (SPQI) Les études statistiques ont montré que le SPQI est significativement associé à la mobilité progressive du spermatozoïde. Ainsi, le SPQI pourrait être un nouveau marqueur de qualité du spermatozoïde. Un kit permettant d’établir le SPQI en routine diagnostique est en cours de développement.

For several years, an increase in the incidence of pathologies connected to the male reproductive functions has been described in numerous studies. These anomalies are classified under the term “testicular dysgenesis syndrome”. This syndrome might find its origins in the deleterious effects of environmental pollutants on the testis development in fetal period. Among theses environmental pollutants, phthalates and bisphenol A (BPA) are the most produced plasticizers found in products of common use. Many studies were performed in order to determine their effects, and allowed to classify them as endocrine disruptors because of their reprotoxic effects. My thesis work is a study of the effects of these two endocrine disruptors on the fetal testis development.Our first study focuses on the effects of BPA on the fetal testis development. Using the organotypic culture model, we developed our study in three species: rat, mouse and human. We demonstrated that BPA decreases the testosterone secretion in the human fetal testis from a 10-8M concentration, while in rat and mouse the testosterone secretion is only affected by 10-5M BPA. We also demonstrated a decreased Insl-3 gene expression, in the same conditions. These results allowed us to evidence a difference of sensibility between species. To understand the mechanisms involved in the BPA toxic effect, we compared it with the effect of DES, another endocrine disruptor with estrogenic activity. Unlike BPA, DES decreases the fetal testosterone secretion in rodents and not in human. This result suggests the involvement of two different signalisation pathways for these two xenoestrogens. This hypothesis is reinforced by the study that we performed in mice invalidated for the estrogen receptor ERα. In those mice, the anti-androgenic effect of BPA is maintained, unlike DES effect.In parallel, we investigated the mechanisms of action of phtalates and particularly of their most prevalent active metabolite, the MEHP (mono-2-ethyl-hexyl phthalate). Following previous studies performed in our laboratory concerning the effects of MEHP, we intended to understand the mechanisms by which MEHP induces the apoptosis in male germ cells. We evidenced an increase in Stra8 gene expression in MEHP treated germ cells. This result suggests that MEHP might induce a wrong differentiation in male germ cells. Furthermore, we investigated the receptors and the signalisation pathway activated by MEHP. We observe that PPARα and PPARγ receptors agonists induce the same phenotypes as MEHP, namely an increase in the apoptosis and in Stra8 gene expression in germ cells.; Depuis plusieurs années, un nombre conséquent d’études décrivent une augmentation de l’incidence de pathologies liées à la fonction de reproduction masculine. Ces anomalies ont été regroupées sous le terme de « syndrome de dysgénésie testiculaire ». Ce syndrome aurait pour origine les effets délétères de polluants environnementaux sur le développement du testicule en période fœtale. Parmi ces polluants environnementaux, les phtalates et le bisphénol A (BPA) sont les plastifiants les plus produits et les plus répandus dans les objets de consommation courante. De nombreuses études leur sont consacrées et ont permis de les classer au rang de perturbateurs endocriniens en mettant notamment en cause leurs effets reprotoxiques. Mon travail de thèse est une étude des effets de ces deux perturbateurs endocriniens sur le développement du testicule fœtal.Nous avons réalisé une première étude concernant les effets du BPA sur le développement du testicule fœtal. Grâce au modèle de culture organotypique, nous avons développé notre étude dans trois espèces : le rat, la souris et l’Homme. Nous démontrons que le BPA diminue la sécrétion de testostérone dans le testicule fœtal humain à partir d’une concentration de 10-8M, alors que chez le rat et la souris, la sécrétion de testostérone n’est affectée qu’à partir de 10-5M de BPA. Nous avons également démontré une diminution de l’expression du gène de l’Insl-3, dans ces mêmes conditions. Ceci nous a permis de mettre en évidence une différence de sensibilité entre les espèces. Pour tenter de comprendre les mécanismes par lesquels le BPA exerce son effet toxique, nous avons comparé ses effets à ceux du DES, autre perturbateur endocrinien œstrogénomimétique. Contrairement au BPA, le DES diminue la sécrétion de testostérone fœtale chez les rongeurs, et non chez l’Homme. Ce résultat suggère l’implication de deux voies de signalisation différentes pour ces deux xéno-œstrogènes. Cette hypothèse est d’ailleurs renforcée par l’étude que nous avons SourceMécanismes d’action des perturbateurs endocriniens bisphénol A et phtalates sur le développement du testicule fœtal / par Thierry N’Tumba-Byn ; sous la direction de Virginie Rouiller-Fabre, Université Paris Sud, 2013 [Thèse de Biologie de la Reproduction et du Développement]réalisée sur des souris invalidées pour le récepteur des œstrogènes ERα, dans lesquelles l’effet anti-androgénique du BPA persiste, contrairement à celui du DES.Parallèlement, nous avons recherché les mécanismes d’action des phtalates et de leur métabolite actif le plus répandu, le MEHP (mono-2-éthyl-hexyl phtalate). Dans la continuité de plusieurs travaux réalisés dans notre laboratoire sur les effets du MEHP, nous avons tenté de comprendre les mécanismes par lesquels le MEHP induit un effet pro-apoptotique dans les cellules germinales mâles. Nous avons mis en évidence une augmentation de l’expression du gène Stra8 dans les cellules germinales traitées au MEHP. Ce résultat nous suggère que le MEHP pourrait induire une différenciation erronée des cellules germinales mâles. De plus, nous avons recherché les récepteurs et la voie de signalisation activée par le MEHP. Nous observons que les agonistes des récepteurs PPARα et de PPARγ entrainent dans les cellules germinales les mêmes phénotypes que le MEHP, à savoir une augmentation du taux d’apoptose et de l’expression du gène Stra8.

Au cours de mon doctorat puis de mes différents stages post-doctoraux, j'ai développé des approches de physiologie et génomique comparatives pour identifier et caractériser des médiateurs moléculaires impliqués dans le contrôle de la prolifération des cellules eucaryotes en réponse aux variations de l'environnement. Je me suis également attachée, dans des modèles biologiques divers, à replacer les mécanismes moléculaires et cellulaires étudiés dans un contexte plus général de physiologie de l'organisme. Depuis ma nomination en tant que Maître de Conférences à l'Université Nancy 1, je me suis focalisée sur l'influence des hormones stéroïdes sur la prolifération et la différenciation normale ou pathologique des cellules germinales. Le projet de recherche que je souhaite développer s'articule autour de 3 mots-clefs : tumeurs hormono-sensibles, perturbateurs endocriniens, voie non conventionnelle de signalisation oestrogénique. Le premier axe renferme un projet concernant les effets d'un mélange d'alkylphénols sur l'initiation et la progression tumorale dans un modèle de cancer testiculaire d'origine germinale puis de cancer mammaire, in vitro et in vivo. Le but est de caractériser le rôle éventuel de ERa36 dans ces processus afin de valider cette forme du récepteur des oestrogènes comme marqueur d'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les cellules hormono-. Le second axe s'inscrit dans un objectif à plus long terme qui sera de valider ERa36 comme marqueur prédictif de réponse aux traitements anti-tumoraux dans les cancers hormono-sensibles et en particulier dans le cancer du sein.

Au cours de mon doctorat puis de mes différents stages post-doctoraux, j'ai développé des approches de physiologie et génomique comparatives pour identifier et caractériser des médiateurs moléculaires impliqués dans le contrôle de la prolifération des cellules eucaryotes en réponse aux variations de l'environnement. Je me suis également attachée, dans des modèles biologiques divers, à replacer les mécanismes moléculaires et cellulaires étudiés dans un contexte plus général de physiologie de l'organisme. Depuis ma nomination en tant que Maître de Conférences à l'Université Nancy 1, je me suis focalisée sur l'influence des hormones stéroïdes sur la prolifération et la différenciation normale ou pathologique des cellules germinales. Le projet de recherche que je souhaite développer s'articule autour de 3 mots-clefs : tumeurs hormono-sensibles, perturbateurs endocriniens, voie non conventionnelle de signalisation oestrogénique. Le premier axe renferme un projet concernant les effets d'un mélange d'alkylphénols sur l'initiation et la progression tumorale dans un modèle de cancer testiculaire d'origine germinale puis de cancer mammaire, in vitro et in vivo. Le but est de caractériser le rôle éventuel de ERa36 dans ces processus afin de valider cette forme du récepteur des oestrogènes comme marqueur d'exposition aux perturbateurs endocriniens dans les cellules hormono-. Le second axe s'inscrit dans un objectif à plus long terme qui sera de valider ERa36 comme marqueur prédictif de réponse aux traitements anti-tumoraux dans les cancers hormono-sensibles et en particulier dans le cancer du sein.

Retinoic acid (RA) is involved in germ cells meiosis onset (CGs) in amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). The aim of the first part of our study was to determine if RA is able to induce meiosis entry in the urodele amphibian Pleurodeles waltl. Our data on PwDmc1 (meiosis marker) expression indicate an earlier meiosis onset in females compared with males depending on RA biosynthesis. In vitro, the treatment of male and female gonads with RA induces an earlier meiosis entry in both sexes. Moreover, we have shown that RA biosynthesis is regulated by steroid hormones. Therefore, the mechanisms which trigger GCs differentiation in mammals might be conserved in urodeles. Many studies indicated that in utero xenobiotic exposure is able to induce alterations in GCs differentiation. These neoplasic cells enter in a period of dormancy until after puberty where they proliferate and the testicular tumours emerge. This prepubertal dormancy suggests that the testicular cancer development is hormone sensitive (McIntyre et al., 2008). In the second part we studied the effects of steroid hormones on the proliferation of the seminoma cell line TCam2. Our results indicate that estradiol and testosterone can induce the proliferation of this cell line and the expression of ER[alpha]36, a truncated form of estrogen receptor alpha. This expression is stimulated by GPER-cAMP/PKA signalisation pathway and activates EGFR expression. ER[alpha]36 could be a potential therapeutic target., Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la différenciation normale et pathologique des cellules germinales (CGs). Dans une première partie, la différenciation normale a été étudiée chez l'amphibien urodèle Pleurodeles waltl. L'acide rétinoïque (AcR) est impliqué dans l'induction de l'entrée en méiose des cellules germinales (CGs) chez les amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). Nous avons voulu savoir si l'AcR était aussi impliqué dans ce processus chez le pleurodèle. Nous avons montré que l'expression de PwDmc1 (marqueur de méiose), survient plus précocement dans les gonades femelles (avant la métamorphose) que dans les gonades mâles (après la métamorphose). In vitro, l'application d'AcR sur des gonades mâles et femelles en culture organotypique ainsi que l'inhibition de la dégradation de l'AcR endogène induisent l'entrée en méiose des CGs. Nous avons également montré que la balance synthèse/dégradation l'AcR endogène est modulée par les hormones stéroïdes. Les mécanismes de différenciation des CGs décrits chez les mammifères semblent donc conservés chez les urodèles. La seconde partie de la thèse s'inscrit dans le contexte de la différenciation pathologique des CGs.De nombreuses études ont montré qu'une exposition in utero à des xénobiotiques pouvait provoquer des altérations de la différenciation des CGs. Ces cellules altérées restent en dormance pendant l'enfance. A la puberté, elles prolifèrent et donnent naissance aux tumeurs testiculaires, suggérant que le développement de ces tumeurs est hormono-sensible (McIntyre et al., 2008). Nous avons étudié les effets des hormones stéroïdes sur la prolifération des cellules séminomateuses humaines TCam2. L'oestradiol et la testostérone stimulent leur prolifération ainsi que l'expression d'une isoforme tronquée du récepteur alpha des oestrogènes ER[alpha]36. Ce récepteur est induit par la voie GPER-AMPc/PKA et semble nécessaire à l'expression du récepteur à l'EGF. Il pourrait donc constituer une cible thérapeutique potentielle.

Retinoic acid (RA) is involved in germ cells meiosis onset (CGs) in amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). The aim of the first part of our study was to determine if RA is able to induce meiosis entry in the urodele amphibian Pleurodeles waltl. Our data on PwDmc1 (meiosis marker) expression indicate an earlier meiosis onset in females compared with males depending on RA biosynthesis. In vitro, the treatment of male and female gonads with RA induces an earlier meiosis entry in both sexes. Moreover, we have shown that RA biosynthesis is regulated by steroid hormones. Therefore, the mechanisms which trigger GCs differentiation in mammals might be conserved in urodeles. Many studies indicated that in utero xenobiotic exposure is able to induce alterations in GCs differentiation. These neoplasic cells enter in a period of dormancy until after puberty where they proliferate and the testicular tumours emerge. This prepubertal dormancy suggests that the testicular cancer development is hormone sensitive (McIntyre et al., 2008). In the second part we studied the effects of steroid hormones on the proliferation of the seminoma cell line TCam2. Our results indicate that estradiol and testosterone can induce the proliferation of this cell line and the expression of ER[alpha]36, a truncated form of estrogen receptor alpha. This expression is stimulated by GPER-cAMP/PKA signalisation pathway and activates EGFR expression. ER[alpha]36 could be a potential therapeutic target., Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à la différenciation normale et pathologique des cellules germinales (CGs). Dans une première partie, la différenciation normale a été étudiée chez l'amphibien urodèle Pleurodeles waltl. L'acide rétinoïque (AcR) est impliqué dans l'induction de l'entrée en méiose des cellules germinales (CGs) chez les amniotes (Bowles et al., 2006 ; Smith et al., 2008). Nous avons voulu savoir si l'AcR était aussi impliqué dans ce processus chez le pleurodèle. Nous avons montré que l'expression de PwDmc1 (marqueur de méiose), survient plus précocement dans les gonades femelles (avant la métamorphose) que dans les gonades mâles (après la métamorphose). In vitro, l'application d'AcR sur des gonades mâles et femelles en culture organotypique ainsi que l'inhibition de la dégradation de l'AcR endogène induisent l'entrée en méiose des CGs. Nous avons également montré que la balance synthèse/dégradation l'AcR endogène est modulée par les hormones stéroïdes. Les mécanismes de différenciation des CGs décrits chez les mammifères semblent donc conservés chez les urodèles. La seconde partie de la thèse s'inscrit dans le contexte de la différenciation pathologique des CGs.De nombreuses études ont montré qu'une exposition in utero à des xénobiotiques pouvait provoquer des altérations de la différenciation des CGs. Ces cellules altérées restent en dormance pendant l'enfance. A la puberté, elles prolifèrent et donnent naissance aux tumeurs testiculaires, suggérant que le développement de ces tumeurs est hormono-sensible (McIntyre et al., 2008). Nous avons étudié les effets des hormones stéroïdes sur la prolifération des cellules séminomateuses humaines TCam2. L'oestradiol et la testostérone stimulent leur prolifération ainsi que l'expression d'une isoforme tronquée du récepteur alpha des oestrogènes ER[alpha]36. Ce récepteur est induit par la voie GPER-AMPc/PKA et semble nécessaire à l'expression du récepteur à l'EGF. Il pourrait donc constituer une cible thérapeutique potentielle.

During the five past decades, a number of epidemiological studies have indicated a higher incidence of infertility problems, male reproductive tract abnormalities and testicular cancers. Among the different hypotheses proposed, fetal or neonatal exposure to environmental compounds that can interfere with endocrine system, termed endocrine disruptors, may be at the origin of the rising incidence of these diseases. The molecules that are supposed to have long term adverse effects on the male genital tract have estrogenic or antiandrogenic properties. Some authors have suggested that the long term effects of endocrine disruptors could be mediated through epigenetic mechanisms. In this context, we have used two types of experimental models based on developmental exposure to these compounds: one model of neonatal exposure to an estrogen (estradiol benzoate) and another model of fetal exposure to an antiandrogen (flutamide). The two experimental models induce a phenotype of hypospermatogenesis in rodents. In the context of neonatal exposure to estradiol benzoate we show that the hypospermatogenesis observed in adult animals is the consequence of a chronic activation of the apoptotic process of testicular germ cells. This cell death process seem to involve the decrease of the key epigenetic effectors of DNA methylation machinery DNA methyltransferases (DNMT3A, 3B & 1), and of the antiapoptotic protein MCL-1 through post transcriptional mechanisms. In term of functional consequences the decrease of DNMTs proteins leads to increased expression of transposable element LINE-1 and Ibtk gene that are normally controlled by DNA methylation. Upstream DNMTs and MCL-1 decrease may be triggered by the increase of other epigenetic factors, the microRNAs belonging to miR-29 family. Concerning in utero exposure to flutamide, our work indicate that the chronic apoptotic process of germ cells may be linked to long term decrease of the inhibitors of apoptosis cIAP1 & 2, and an increase of proapoptotic factors SMAC/DIABLO. On the other hand, the lack of testicular somatic cell death in this model may be the result of higher expression of inhibitors of apoptosis XIAP and SURVIVIN in these cells. Besides, the apoptotic process observed at the adult age may also involve a precocious alteration of DNMTs expression. In summary, our work provides a mechanistic view to the fetal/neonatal programming of adult germ cell death. Indeed, the increased levels of miR-29s may induce: (1) a decrease in DNMTs expression levels that consequently could alter the methylation pattern of some genes, and (2) a decrease in factors that normally prevent germ cells death such as MCL-1.; Un certain nombre d’études épidémiologiques ont montré au cours des cinquante dernières années une augmentation des infertilités, des malformations de l’appareil reproducteur masculin et des cancers testiculaires. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie foetale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Les molécules qui sont suspectées d’avoir des effets néfastes à long terme sur le tractus génital mâle possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. Parmi les mécanismes impliqués dans l’effet à long terme, un certain nombre d’auteurs mettent en avant l’intervention de mécanismes de type épigénétiques. Dans ce contexte, nous avons utilisé deux types de modèles expérimentaux reposant sur l’exposition développementale de rats à ces composés : un modèle d’exposition néonatale à un estrogène (estradiol benzoate) et un modèle d’exposition foetale à un antiandrogène (flutamide). Les deux modèles expérimentaux induisent chez le rongeur un phénotype d’hypospermatogenèse. Dans le cas de l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate nous montrons que l’hypospermatogenèse observée chez les animaux à l’âge adulte est due à l’activation chronique de l’apoptose des cellules germinales testiculaires. Cette apoptose mettrait en jeu, par un mécanisme post-transcriptionnel, la diminution à long terme de l’expression de protéines clés de la machinerie épigénétique de méthylation de l’ADN, les ADN méthyltransférases (DNMT 3A, 3B et 1), et du facteur antiapoptotique, MCL-1. D’un point de vue fonctionnel, la chute d’expression des DNMTs se traduit notamment par l’augmentation d’expression des éléments transposables LINE-1 et du gène Ibtk normalement contrôlés par méthylation de l’ADN. En amont, la chute d’expression des DNMTs et de MCL-1 serait dépendante de l’augmentation d’expression d’autres effecteurs épigénétiques, les microRNAs de la famille miR-29. Dans le cas de l’exposition in utero au flutamide, notre travail indique que l’apoptose chronique des cellules germinales serait liée à la diminution à long terme de l’expression des inhibiteurs d’apoptose cIAP1 et cIAP2, et une augmentation d’expression de leur inhibiteur SMAC/DIABLO. En revanche, l’absence de mort des cellules somatiques testiculaires (Sertoli et Leydig) dans ce modèle serait due à l’augmentation d’expression spécifiquement dans ces cellules des inhibiteurs d’apoptose XIAP et SURVIVIN. Par ailleurs, le phénotype d’apoptose observé à l’âge adulte impliquerait également une altération précoce de l’expression des DNMTs. En conclusion, nous apportons une réponse mécanistique au phénotype de programmation foetale/néonatale d’apoptose des cellules germinales testiculaires adultes. En effet, l’augmentation des miR-29s provoquerait : (1) une chute d’expression des DNMTs altérant ainsi le profil de méthylation des gènes, et (2) une chute d’expression de facteurs protégeant les cellules germinales contre l’apoptose comme le facteur MCL-1.

During the five past decades, a number of epidemiological studies have indicated a higher incidence of infertility problems, male reproductive tract abnormalities and testicular cancers. Among the different hypotheses proposed, fetal or neonatal exposure to environmental compounds that can interfere with endocrine system, termed endocrine disruptors, may be at the origin of the rising incidence of these diseases. The molecules that are supposed to have long term adverse effects on the male genital tract have estrogenic or antiandrogenic properties. Some authors have suggested that the long term effects of endocrine disruptors could be mediated through epigenetic mechanisms. In this context, we have used two types of experimental models based on developmental exposure to these compounds: one model of neonatal exposure to an estrogen (estradiol benzoate) and another model of fetal exposure to an antiandrogen (flutamide). The two experimental models induce a phenotype of hypospermatogenesis in rodents. In the context of neonatal exposure to estradiol benzoate we show that the hypospermatogenesis observed in adult animals is the consequence of a chronic activation of the apoptotic process of testicular germ cells. This cell death process seem to involve the decrease of the key epigenetic effectors of DNA methylation machinery DNA methyltransferases (DNMT3A, 3B & 1), and of the antiapoptotic protein MCL-1 through post transcriptional mechanisms. In term of functional consequences the decrease of DNMTs proteins leads to increased expression of transposable element LINE-1 and Ibtk gene that are normally controlled by DNA methylation. Upstream DNMTs and MCL-1 decrease may be triggered by the increase of other epigenetic factors, the microRNAs belonging to miR-29 family. Concerning in utero exposure to flutamide, our work indicate that the chronic apoptotic process of germ cells may be linked to long term decrease of the inhibitors of apoptosis cIAP1 & 2, and an increase of proapoptotic factors SMAC/DIABLO. On the other hand, the lack of testicular somatic cell death in this model may be the result of higher expression of inhibitors of apoptosis XIAP and SURVIVIN in these cells. Besides, the apoptotic process observed at the adult age may also involve a precocious alteration of DNMTs expression. In summary, our work provides a mechanistic view to the fetal/neonatal programming of adult germ cell death. Indeed, the increased levels of miR-29s may induce: (1) a decrease in DNMTs expression levels that consequently could alter the methylation pattern of some genes, and (2) a decrease in factors that normally prevent germ cells death such as MCL-1., Un certain nombre d’études épidémiologiques ont montré au cours des cinquante dernières années une augmentation des infertilités, des malformations de l’appareil reproducteur masculin et des cancers testiculaires. Une des hypothèses est que, l’exposition durant la vie foetale ou néonatale à des composés présents dans l’environnement capables d’interférer avec le système hormonal (perturbateurs endocriniens), serait responsable de l’augmentation de l’incidence de ces pathologies. Les molécules qui sont suspectées d’avoir des effets néfastes à long terme sur le tractus génital mâle possèdent des activités de type estrogénique ou antiandrogénique. Parmi les mécanismes impliqués dans l’effet à long terme, un certain nombre d’auteurs mettent en avant l’intervention de mécanismes de type épigénétiques. Dans ce contexte, nous avons utilisé deux types de modèles expérimentaux reposant sur l’exposition développementale de rats à ces composés : un modèle d’exposition néonatale à un estrogène (estradiol benzoate) et un modèle d’exposition foetale à un antiandrogène (flutamide). Les deux modèles expérimentaux induisent chez le rongeur un phénotype d’hypospermatogenèse. Dans le cas de l’exposition néonatale à l’estradiol benzoate nous montrons que l’hypospermatogenèse observée chez les animaux à l’âge adulte est due à l’activation chronique de l’apoptose des cellules germinales testiculaires. Cette apoptose mettrait en jeu, par un mécanisme post-transcriptionnel, la diminution à long terme de l’expression de protéines clés de la machinerie épigénétique de méthylation de l’ADN, les ADN méthyltransférases (DNMT 3A, 3B et 1), et du facteur antiapoptotique, MCL-1. D’un point de vue fonctionnel, la chute d’expression des DNMTs se traduit notamment par l’augmentation d’expression des éléments transposables LINE-1 et du gène Ibtk normalement contrôlés par méthylation de l’ADN. En amont, la chute d’expression des DNMTs et de MCL-1 serait dépendante de l’augmentation d’expression d’autres effecteurs épigénétiques, les microRNAs de la famille miR-29. Dans le cas de l’exposition in utero au flutamide, notre travail indique que l’apoptose chronique des cellules germinales serait liée à la diminution à long terme de l’expression des inhibiteurs d’apoptose cIAP1 et cIAP2, et une augmentation d’expression de leur inhibiteur SMAC/DIABLO. En revanche, l’absence de mort des cellules somatiques testiculaires (Sertoli et Leydig) dans ce modèle serait due à l’augmentation d’expression spécifiquement dans ces cellules des inhibiteurs d’apoptose XIAP et SURVIVIN. Par ailleurs, le phénotype d’apoptose observé à l’âge adulte impliquerait également une altération précoce de l’expression des DNMTs. En conclusion, nous apportons une réponse mécanistique au phénotype de programmation foetale/néonatale d’apoptose des cellules germinales testiculaires adultes. En effet, l’augmentation des miR-29s provoquerait : (1) une chute d’expression des DNMTs altérant ainsi le profil de méthylation des gènes, et (2) une chute d’expression de facteurs protégeant les cellules germinales contre l’apoptose comme le facteur MCL-1.

International audience

A comprehensive knowledge of Crassostrea gigas oyster reproduction processes is essential to optimize controlled reproduction in hatchery. This study aimed to determine the origin and the mechanisms of annual renewal of germ cells, still unknown in oysters, and the influence of temperature and photoperiod parameters on the regulation of the reproductive cycle. We characterized an orthologue of the vasa gene, the Oyvlg (Oyster vasa-like gene), the first germ cell specific marker isolated in molluscs. This marker was used to study C. gigas germline development. Oyster germ cells appeared specified during early development from mesentoblast 4d, as primordial germ cells (PGCs) determined by maternal cytoplasmic determinants, including Oyvlg mRNA. In adult oysters, the annual renewal of germ cells results from a proliferation of germinal stem cells (GSCs), self-renewing cells, scattered in the conjunctive tissue during the resting period. One-year experimental conditionings were realized to determine temperature and photoperiod parameter effects on oyster gametogenesis. Experimental conditionings consisted in (1) natural temperature and photoperiod conditions corresponding to Marennes-Oléron bay values, (2) accelerated conditions, twice faster than natural cycles and (3) constant wintering conditions adjusted to 8°C and 8 hours day-length. These analyses revealed a high plasticity of C. gigas reproduction since the rhythm of the reproductive cycle was entirely modelled by temperature and photoperiod variations. Decreasing photoperiod may regulate GSCs proliferation while low temperature (8°C-11°C) would enhance gonial mitosis and high temperature would accelerate germ cell maturation. As a result, manipulation of temperature and photoperiod conditions allows effective controlled reproduction all over the year., Le renouvellement annuel de la population de cellules germinales chez l'huître creuse Crassostrea gigas est une étape clé de son cycle de reproduction. La compréhension de ces mécanismes est essentielle à la maîtrise de la reproduction contrôlée de C. gigas, indispensable pour répondre à une demande croissante des ostréiculteurs, de naissain produit en écloserie. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l'origine et les mécanismes de renouvellement annuel des cellules germinales de C. gigas et de comprendre l'infuence des facteurs environnementaux sur ces processus. Le gène Oyster vasa-like gene (Oyvlg), premier marqueur spécifique des cellules germinales découvert chez les bivalves a été caractérisé. Ce gène, exprimé spécifiquement dans les cellules de la lignée germinale, nous a permis de déterminer que les cellules germinales de C. gigas, d'origine mésodermique, étaient différenciées dès le stade embryonnaire sous la forme de cellules germinales primordiales (PGCs). Ces PGCs seraient spécifiées par la localisation de déterminants cytoplasmiques transmis maternellement à l'embryon, dans une structure équivalente à un cytoplasme germinal. Les ARNm Oyvlg seraient l'un de ces déterminants germinaux. Au stade adulte, la population de cellules germinales apparaît renouvelée annuellement par la prolifération, au début du cycle de reproduction, de cellules germinales souches (GSCs), dispersées en petits groupes dans le tissu conjonctif pendant la période de repos sexuel. La différenciation des GSCs en gonies et la multiplication de ces gonies marque le début de la gamétogenèse. Afin de tester l'effet de la température et de la photopériode sur la gamétogenèse, des huîtres adultes ont été conditionnées expérimentalement pendant un an en écloserie, dans trois conditions de température et de photopériode différentes : (1) conditions dites "naturelles" reproduisant les cycles de température et de photopériode moyens enregistrés à Marennes- Oléron, (2) conditions "accélérées", deux fois plus rapides que les cycles naturels, (3) conditions "hivernales" constantes à 8°C et 8 heures de jour. Ces expérimentations ont mis en évidence une grande plasticité physiologique de la reproduction de C. gigas, dont le rythme se synchronise parfaitement sur celui des facteurs température / photopériode. Des photopériodes décroissantes pourraient stimuler la prolifération des cellules germinales souches alors que la température apparaît comme le facteur prédominant dans la régulation des mitoses goniales et de la maturation. Les températures basses (8°C ¿ 11°C) semblent déclencher les mitoses goniales et les températures élevées accélèrent le processus de maturation des cellules germinales. L'utilisation de cycles de température et de photopériode modifiés (accélérés ou hivernaux) permettraient d'obtenir des pontes toute l'année en écloserie, y compris en période automnale généralement considérée comme réfractaire pour le conditionnement.

A comprehensive knowledge of Crassostrea gigas oyster reproduction processes is essential to optimize controlled reproduction in hatchery. This study aimed to determine the origin and the mechanisms of annual renewal of germ cells, still unknown in oysters, and the influence of temperature and photoperiod parameters on the regulation of the reproductive cycle. We characterized an orthologue of the vasa gene, the Oyvlg (Oyster vasa-like gene), the first germ cell specific marker isolated in molluscs. This marker was used to study C. gigas germline development. Oyster germ cells appeared specified during early development from mesentoblast 4d, as primordial germ cells (PGCs) determined by maternal cytoplasmic determinants, including Oyvlg mRNA. In adult oysters, the annual renewal of germ cells results from a proliferation of germinal stem cells (GSCs), self-renewing cells, scattered in the conjunctive tissue during the resting period. One-year experimental conditionings were realized to determine temperature and photoperiod parameter effects on oyster gametogenesis. Experimental conditionings consisted in (1) natural temperature and photoperiod conditions corresponding to Marennes-Oléron bay values, (2) accelerated conditions, twice faster than natural cycles and (3) constant wintering conditions adjusted to 8°C and 8 hours day-length. These analyses revealed a high plasticity of C. gigas reproduction since the rhythm of the reproductive cycle was entirely modelled by temperature and photoperiod variations. Decreasing photoperiod may regulate GSCs proliferation while low temperature (8°C-11°C) would enhance gonial mitosis and high temperature would accelerate germ cell maturation. As a result, manipulation of temperature and photoperiod conditions allows effective controlled reproduction all over the year., Le renouvellement annuel de la population de cellules germinales chez l'huître creuse Crassostrea gigas est une étape clé de son cycle de reproduction. La compréhension de ces mécanismes est essentielle à la maîtrise de la reproduction contrôlée de C. gigas, indispensable pour répondre à une demande croissante des ostréiculteurs, de naissain produit en écloserie. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l'origine et les mécanismes de renouvellement annuel des cellules germinales de C. gigas et de comprendre l'infuence des facteurs environnementaux sur ces processus. Le gène Oyster vasa-like gene (Oyvlg), premier marqueur spécifique des cellules germinales découvert chez les bivalves a été caractérisé. Ce gène, exprimé spécifiquement dans les cellules de la lignée germinale, nous a permis de déterminer que les cellules germinales de C. gigas, d'origine mésodermique, étaient différenciées dès le stade embryonnaire sous la forme de cellules germinales primordiales (PGCs). Ces PGCs seraient spécifiées par la localisation de déterminants cytoplasmiques transmis maternellement à l'embryon, dans une structure équivalente à un cytoplasme germinal. Les ARNm Oyvlg seraient l'un de ces déterminants germinaux. Au stade adulte, la population de cellules germinales apparaît renouvelée annuellement par la prolifération, au début du cycle de reproduction, de cellules germinales souches (GSCs), dispersées en petits groupes dans le tissu conjonctif pendant la période de repos sexuel. La différenciation des GSCs en gonies et la multiplication de ces gonies marque le début de la gamétogenèse. Afin de tester l'effet de la température et de la photopériode sur la gamétogenèse, des huîtres adultes ont été conditionnées expérimentalement pendant un an en écloserie, dans trois conditions de température et de photopériode différentes : (1) conditions dites "naturelles" reproduisant les cycles de température et de photopériode moyens enregistrés à Marennes-Oléron, (2) conditions "accélérées", deux fois plus rapides que les cycles naturels, (3) conditions "hivernales" constantes à 8°C et 8 heures de jour. Ces expérimentations ont mis en évidence une grande plasticité physiologique de la reproduction de C. gigas, dont le rythme se synchronise parfaitement sur celui des facteurs température / photopériode. Des photopériodes décroissantes pourraient stimuler la prolifération des cellules germinales souches alors que la température apparaît comme le facteur prédominant dans la régulation des mitoses goniales et de la maturation. Les températures basses (8°C – 11°C) semblent déclencher les mitoses goniales et les températures élevées accélèrent le processus de maturation des cellules germinales. L'utilisation de cycles de température et de photopériode modifiés (accélérés ou hivernaux) permettraient d'obtenir des pontes toute l'année en écloserie, y compris en période automnale généralement considérée comme réfractaire pour le conditionnement.

Non disponible / Not available, La vitamine A est essentielle à l'organisme. Elle régule la croissance et la différenciation cellulaires, ainsi que la sécrétion de cytokines par les cellules lymphocytaires. Elle intervient également dans le bon déroulement de la spermatogénèse. Nous avons montré l'existence de sites de liaison spécifiques (récepteurs) de la bêta-Iactoglobuline A (BLG-A) au niveau de préparations enrichies en membranes plasmiques de deux types cellulaires, les hybridomes HPL (hybridomes sécrétant des anticorps anti-hormone placentaire lactogène) et les cellules germinales mâles bovines. Dans les deux cas, la liaison de la BLG-A marquée à l'iode 125 ([125l]-BLG-A) peut être inhibée par la RBP ("retinol-binding protein" ou protéine de transport du rétinol dans la circulation) et par la BLG-A complexée au rétinol ; cependant, ni la BSA (albumine sérique bovine) ni la lactoferrine ne peuvent inhiber cette liaison. Sachant que la RBP et la BLG présentent une grande similarité de structure et que l'affinité de liaison de ces deux protéines est relativement semblable (7,07±0,72 nM et 6,51±0,65 nM respectivement pour la BLG et RBP au niveau des membranes des hybridomes HPL), il est possible de suggérer qu'il existe un récepteur commun aux deux protéines. Le calcul des paramètres de liaison donne des constantes d'affinité Kd de 8,26±2,98 nM et de 26,43±2,68 nM et Bmax de (14,02±2,61) x 10[puissance]12 et de (12,38 ±4,62) x 10[puissance]12 sites par mg de protéines, respectivement pour les hybridomes HPL et les cellules germinales. La masse moléculaire de ce récepteur membranaire a été estimée à 51 kDa au niveau des hybridomes, ce qui est différent de celui décrit dans la littérature, qui fait 63 kDa et reconnaît la RBP mais pas la BLG au niveau des membranes placentaires humaines.

Not available, Cette étude comprend plusieurs parties: la première section concerne le suivi de l'internalisation des PLS dans les cellules germinales humaines par la méthode d'autohistoradiographie en MET et la mise en évidence d'un récepteur membranaire par la méthode de Scatchard. Ces PLS sont considérées comme des transporteurs de stéroïdes au niveau de la lignée germinale humaine grâce à leur internalisation par l'intermédiaire des vésicules recouvertes de clathrines selon un mécanisme déjà décrit pour la transferrine. La deuxième partie traite l'optimisation des milieux de culture pour une survie plus longue que possible de la lignée germinale suivie par le test de viabilité et le comptage du nombre cellulaire ainsi que le suivi de la métabolisation du glucose et du lactate et une étude en CMF. À noter que les milieux sont composes de milieu de base (A), les milieux (B), (C) et (D). La troisième partie est une étude de la prolifération de la lignée germinale de rat par l'incorporation de thymidine tritiée, sous l'effet des PLS (SBPh et ABPr) et d'autres substances connues par leur effet stimulateur de prolifération cellulaire