Search

Considered as one of the most productive method for obtaining highly accurate structural information about biological macromolecules, X-ray crystallography still faces two major hurdles, despite tremendous technological advances that this method have encountered: production of high-quality/well diffracting crystals and solving the phase problem inherent to the method,. Therefore, mono-cationic lanthanide complex with nucleating and phasing properties, known as “Crystallophore” (Xo4), has been developed.Despite the important advantages that TbXo4 provides, the different studies undergone on it show that it is not 100% successful, in particular in term of crystallization, hence the importance of increasing its success. The objective of this thesis was to better understand the interaction and nucleation properties of TbXo4 and its behaviour on the protein surface.To this end, we have addressed the question by a two-fold approach. The first approach has consisted in exploring the chemistry offered by lanthanide complexes by evaluating the nucleating properties of thirteen crystallophore variants, provided by our collaborators at ENS Lyon, on a panel of three commercial proteins. This approach has enabled us to select a new variant of crystallophore, TbXo4-OH, characterized by a propanol extension on the free nitrogen of the triazacyclononane macrocycle which provides similar nucleating properties compared to the reference molecule TbXo4. We have also developed a new protocol of use of these molecules.The second approach was a biological approach that has consisted in analysing the interaction sites between TbXo4 and the protein target. This analysis was combined with mutagenesis (point mutation), on two protein models, in order to confirm amino acids or groups of residues that are related in the binding of the molecule.Also, the present work has demonstrated the complementarity between molecular dynamics and crystal structure analysis.; Considérée comme l'une des méthodes les plus productives pour obtenir des informations structurales très précises sur les macromolécules biologiques, la cristallographie aux rayons X se heurte toujours à deux obstacles majeurs et ce malgré des avancées technologiques majeures: la production de cristaux de qualité/présentant une bonne diffraction et la résolution du problème de la phase inhérente à la méthode. C’est dans ce contexte que des complexes de lanthanides mono-cationiques ayant des propriétés de nucléation et permettant de résoudre le problème des phases, connus sous le nom de "Crystallophore" (Xo4), ont été développés.Malgré les propriétés uniques qu'offre le TbXo4, les différentes études menées à son sujet montrent que son taux de réussite n’est pas de 100%, en particulier en ce qui concerne la cristallisation, d'où l'importance d'augmenter son taux de succès. L'objectif de cette thèse était de mieux comprendre les propriétés d'interaction et de nucléation du TbXo4 et son comportement à la surface des protéines.Pour ce faire, nous avons abordé la question par une double approche. La première approche a consisté à explorer la chimie offerte par les complexes de lanthanide en évaluant les propriétés de nucléation de treize molécules dérivées du crystallophore, fournies par nos collaborateurs de l'ENS Lyon, sur un panel de trois protéines commerciales. Cette approche nous a permis de sélectionner une nouvelle molécule, TbXo4-OH, caractérisée par une extension propanol sur l'azote libre du macrocycle triazacyclononane, qui offre des propriétés de nucléation similaire par rapport à la molécule de référence TbXo4. Nous avons également développé un nouveau protocole d'utilisation des molécules.La deuxième approche était une approche biologique qui a consisté à analyser les sites d'interaction entre TbXo4 et la cible protéique. Cette analyse a été combinée à de la mutagenèse (mutation ponctuelle), sur deux modèles de protéines, afin de confirmer les acides aminés ou groupes de résidus qui sont liés dans la liaison de la molécule. De plus, le présent travail a démontré la complémentarité entre la dynamique moléculaire et l'analyse de la structure cristalline.

The main objective of this work is to elucidate the crystalline structure of poly(dimethylsiloxane) (PDMS). Silica-filled PDMS elastomers are first synthesized by either physical mixing or in-situ sol-gel loading to obtain specimens that can sustain the extensions necessary for our purpose. Coupling tensile tests and X-ray diffraction (WAXD) at room temperature, it was found that the sol-gel silica filled samples exhibited an anomalously high strain amplification factor. Thereafter WAXD patterns of PDMS elastomer under different extensions was collected at low temperature (typically -100 °C) and the comparison between experimental data and simulations unambiguously demonstrated that the impressive pattern changes observed with increasing deformation originated from textures, the crystal unit cell remaining tetragonal unit cell in all cases; this contradicts the hypothesis of a possible polymorphism. A sudden rise in stress has been previously reported during cooling of a pre-stretched silicone rubber. It is presently shown to appear after crystallization is completed and it is to the combined effect of thermal contraction and the increase of Young’s modulus that results from the presence of crystallites and harder confined amorphous phase. Based on low-temperature powder X-ray diffraction and selected area electron diffraction, an atomic determination of the crystal structure of PDMS was attempted by annealing simulation, DFT optimization as well as Rietveld refinement. Two space groups of / 4₁ (No. 80) and / 4₁ ⁄ a:1 (No. 88-1) with a 0.5 occupancy probability are proposed and the atomic positions are computed for each case. However, no one of this proposal is really satisfying as regard to the computed intensities. Further hypothesis is formulated. As a complement to this work, two cholesterol-based organogelators were studied by different X-ray scattering techniques. The results suggest a change in molecular packing is at the origin of stimuli-responsive chromatic properties in TPE-Cn-Chol molecules. A smectic-A phase with inter-digitated antiparallel bilayer was also evidenced in TPE-Azobenzene-Cn-Chol molecules., L’objectif principal de ce travail est de tenter d’élucider la structure cristalline du poly(diméthylsiloxane) (PDMS). Nous avons d’abord synthétisé des élastomères PDMS chargés en silice soit par mélange physique ou soit par croissance in situ, afin d’obtenir des échantillons pouvant supporter les élongations nécessaires à notre étude. En couplant tests mécaniques et diffraction des rayons X (WAXD) à température ambiante, il a été montré que les échantillons chargés in situ présentaient un facteur d’amplification des déformations anormalement élevé. Des clichés de diffraction obtenus à basse température et sous différentes extensions sur des échantillons cristallisés ont été comparés à des simulations : il a été démontré que les changements observés provenaient d’une évolution de la texture cristalline, la maille restante quadratique. Ceci contredit l’hypothèse d’un polymorphisme. L’augmentation soudaine de la contrainte lors du refroidissement d’un élastomère PDMS pré-étiré est connue. Il est montré que ceci n’apparaît qu’une fois la cristallisation terminée : cet effet serait dû à la contraction thermique et à l’augmentation du module de Young résultant de la présence de cristallites et d’une phase amorphe confinée. Une détermination atomique de la structure cristalline de PDMS a été tentée, basée sur des mesures de diffraction X de poudre à basse température. Les techniques de recuit simulé simulation, l’optimisation de DFT et d’affinement de Rietveld ont été utilisées. Deux groupes d’espace / 4₁ et / 4₁ ⁄ a sont proposés et les positions atomiques calculées pour chaque cas. Toutefois, aucune de ces propositions n’est vraiment satisfaisante en ce qui concerne les intensités calculées. D’autres hypothèses sont formulées. En complément de ce travail, deux organogélateurs à base de cholestérol ont été étudiés par différentes techniques de diffusion des rayons X. Les résultats suggèrent qu’un changement de l’empilement moléculaire est à l’origine des propriétés chromatiques stimulo-sensibles des molécules de TPE-C n-Chol. L’existence d’une phase smectique-A avec bicouche antiparallèle inter-digitée a été également démontrée pour les molécules de TPE-Azobenzene-Cn-Chol.

Feline Immunodeficiency Virus (FIV) is a lentivirus such as Human Immunodeficiency Virus. This virus is a threat for veterinary medicine, and it infects wild and domestic feline species. Between 5 and 10 % of domestic cats are infected worldwide and all feline species are concerned by FIV, each type of FIV adapted to a host species. Infection by FIV leads to an immune deficiency similar to acquired immunodeficiency syndrome induced by HIV among human beings. There is currently no efficient drug against FIV. FIV virion is constituted by supramolecular structures which protect its genome, composed of a dimer of genomic RNA. The capsid is one of these structures and it contains and protects the genome. Reverse transcription occurs inside the capsid and the capsid helps integrate the viral genome into the cellular genome. The capsid protects the genomic RNA from degradation and viral RNA sensing by the antiviral restriction proteins. The viral capsid is an assembly of the capsid protein subunit, CA or p24. This protein assembles as pentamers or hexamers, which finally assemble to form the capsid. It interacts with other cellular partners. These interactions are well described for HIV-1, the most studied species of the lentivirus genus, but little is known for FIV. This ability to assemble helps for the budding of the virions at the plasma membrane and for the formation of supramolecular structures during maturation of the virion. The capsid stability inside the infected cell has a dual behavior, between the protection of the viral genome and its uncoating for the liberation of the genome after reverse transcription. These two behaviors show that capsid is a good therapeutic target. Inhibiting the capsid assembly or its uncoating are two approaches to interfere with the capsid and design drugs against FIV. Compounds which interact with the HIV-1 capsid are currently under clinical trials. As part of a collaboration with a Uruguayan research team, we identified a molecule which interferes with the FIV capsid assembly in vitro. We identified a specific binding of the compound on FIV p24, under its monomeric form. We measured the binding affinity and characterized the binding site of the compound. For the chacracterization of the binding site, we opted for the use of NMR and to do so, we needed the NMR assignment of the protein. Tis assignment had not been done previously and we performed it. We showed that the binding mechanism is similar as the drugs targeting HIV-1 p24 currently under clinical trials. These compounds exhibit a competition for the binding on FIV p24 with cellular proteins interacting with HIV-1 capsid, such as the nucleoporins. This competition could inhibit the entry of the viral genome into the nucleus. Considering these data on HIV-1 and our own experimental results on FIV capsid, we testes if the feline nucleoporins, homologous to the human nucleoporins binding HIV-1 capsid, could bind the FIV capsid and we characterized a binding of these feline nucleoporins on FIV p24. This suggests a mechanism shared among the lentiviruses for the entry into the nucleus through their capsid. This work represents the first steps for the identification of efficient and at low costs of synthesis drugs from screenings of derivatives of our structural guide, for the needs of veterinary medicine., Le virus de l’immunodéficience féline (Feline immunodeficiency virus, FIV) est un lentivirus, comme le virus de l’immunodéficience humaine. Il représente un enjeu de la médecine vétérinaire, aussi bien pour les animaux domestiques que sauvages. Il infecte entre 5 et 10 % des chats domestiques dans le monde, et l’ensemble des espèces félines est concerné par le FIV, dont les différents types sont chacun adaptés à une espèce hôte. L’infection au virus conduit à une immunodéficience similaire au syndrome d’immunodéficience acquise induite par le virus de l’immunodéficience humaine chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace contre le FIV. Le FIV est constitué de structures supramoléculaires, protégeant son génome sous forme d’ARN génomique. La capside est une de ces structures et contient le génome viral. La capside protège le génome jusqu’à la réalisation de la rétrotranscription et participe à l’entrée du génome dans le noyau et à l’intégration du génome viral dans le génome cellulaire. La protection de l’ARN génomique avant la rétrotranscription prévient la détection de l’ARN viral par les protéines de restriction antivirale et sa dégradation. La capside virale est un assemblage d’une protéine sous-unitaire, la protéine de capside, CA ou p24, qui s’assemble en pentamères ou hexamères qui s’assemblent ultimement pour former la capside. La capside interagit avec de nombreux partenaires cellulaires. Ces interactions sont très bien décrites pour le VIH-1, l’espèce virale la plus étudiée du genre des lentivirus, mais sont moins bien caractérisées chez le FIV. Cette capacité à s’assembler de cette façon est requise au moment du bourgeonnement des virions à la membrane plasmique, et lors du réassemblage des sous-unités lors de la maturation du virion. La stabilité de la capside à l’intérieur de la cellule infectée a une ambivalence, entre la protection du génome viral, et la nécessité du désassemblage de la capside pour la libération du génome viral sous sa forme ADN. Ce double comportement montre en quoi la capside est une bonne cible thérapeutique. Perturber l’assemblage ou le stabiliser sont deux approches possibles pour interférer avec la capside et mettre au point des composés actifs contre l’infection au FIV. Pour le traitement du VIH-1, des composés interagissant avec la capside virale sont en cours d’essais cliniques. Dans le cadre d’une collaboration avec une équipe Uruguayenne , nous avons identifié une molécule interférant avec l’assemblage de la capside du FIV in vitro. Nous avons mis en évidence une fixation spécifique de la molécule sur FIV p24, sous sa forme monomérique. Nous avons mesuré l’affinité du composé pour FIV p24 et caractérisé son site de fixation. Pour la caractérisation de ce site de fixation, nous avons choisi d’utiliser la RMN et pour cela, nous avions besoin de l’attribution RMN de la protéine qui n’avait pas été faite préalablement, que nous avons ainsi réalisée. Nous avons montré que le mécanisme de fixation de notre composé est similaire à celui des traitements en cours d’essais cliniques contre VIH-1 p24. Ces molécules agissent par une compétition pour la fixation sur VIH 1 p24 avec des protéines cellulaires interagissant avec la capside du VIH-1, telles les nucléoporines, et cette compétition inhiberait l’entrée du génome viral dans le noyau. Avec ces données décrites chez le VIH-1 et nos résultats expérimentaux sur la capside du FIV, nous avons cherché si les nucléoporines félines, homologues aux nucléoporines humaines se liant à la capside du VIH-1, pouvaient se lier à la capside du FIV et avons montré une affinité de ces nucléoporines pour FIV p24. Cela soutient l’idée d’un mécanisme commun d’entrée des lentivirus dans le noyau des cellules infectées via leur capside. À terme, le criblage de molécules dérivées de notre molécule guide pourrait permettre l’identification de composés efficaces et peu chers à produire pour la médecine vétérinaire.

Foldamer chemistry is a rapidly developing research area where scientists study the construction of various artificial architectures that inspired from the folded conformations of biopolyme rs found in nature. This thesis focuses on the design and construction of complex molecular topologies and switchable molecular motions. In the first part, with the helical disruptor strategy, variable sizes of macrocycles were built up (from 4 units to 12 units) based on quinolinecarboxamides derivatives (Q F ). Macrocycles adopted novel conformations which were totally different with the helical conformations of their own foldamer precursors. Those novel structures were confirmed by NMR and crystallographic studies. In the second part, a symmetrical helix sheet helix foldamer was prepared which has a bind with T shape rod. The photoreactions within aromatic sheets change the architectures of foldamer that cause dissociation of complex and release the rod. A thermal treatment would recover foldamer back to initial conformation and lead to the re formation of host guest complex. I n the third part, to build up the molecular Prusik knot, different turn units were incorporated with helix segments to form helix tur n helix foldamers. The conformations of helix turn helix architectures were well investigated, they adopted several kinds of conformations, such as cone shape, multiple helix and precursor of Prusik knot., La chimie des foldamères est un domaine de recherche en développement rapide où les scientifiques étudient la construction de diverses architectures artificielles inspirées des conformations repliées des biopolymères. Cette thèse porte sur la conception et la construction de topologies moléculaires complexes et de mouvements moléculaires commutables. Dans la pr emière partie, avec la stratégie du disrupteur hélicoïdal, des macrocycles de tailles variables ont été construits (de 4 unités à 12 unités) à base de dérivés de quinoléinecarboxamides (Q F ). Les macrocycles formés adoptent de nouvelles conformations totale ment différentes des conformations hélicoïdales de leurs précurseurs respectifs. Ces nouvelles structures ont été confirmées par RMN et études cristallographiques. Dans la deuxième partie, un foldamère hélice feuillet hélice symétrique, capable d’accueilli r une molécule invitée en forme de T, a été préparé. L’irradiation lumineuse des feuillets aromatiques modifient l’architecture du foldamère ce qui provoquent la dissociation du complexe et libèrent la molécule en forme de T. Un traitement thermique permet la reformation du complexe hôte invité. Dans la troisième partie de cette thèse, la conception d’un noeud Prusik moléculaire, basée sur un foldamère de type hélice feuillet hélice, est discutée. Les conformations des architectures hélice feuillet hélice, t elles que la forme conique, l'hélice multiple et le précurseur du noeud Prusik, ont été étudiées.

The subject for this thesis is to dissect the enzymatic pathway allowing a non-canonical base 2-aminoadenine, or diaminopurine (Z) to replace adenine (A) in the genomes of a number of Siphoviridae bacteriophages. 2-aminoadenine and thymine (T) form the Z:T pair bound by fully saturated triple hydrogen bond. Together with the standard G:C pair they form ZTGC-DNA which is resistant to host’s restriction enzymes. I first focus on cyanophage S-2L, the originally-described bearer of 2-aminoadenine. I identify a DNA primase-polymerase, PrimPol, responsible for its replication, with surprisingly similar activity towards dATP and dZTP. This prompted the characterization of a dATP-specific triphosphatase, DatZ. Its activity and conservation between the phages of interest explains the mechanism behind adenine removal. Secondly, I find that PurZ of phage S-2L’s, a key enzyme in diaminopurine production, is not only an ATPase but also a dATPase. I identify a nucleotide pyrophosphatase, MazZ, as an essential component of the conserved Z biosynthetic pathway, that converts dGTP into dGMP, thus generating one of the substrates of PurZ. High resolution crystallographic structures of all 4 enzymes with their respective ligands explain the specificities observed in catalytic tests - or lack thereof. Finally, I characterized the structure of a Z-specific family A DNA polymerase, PolZ, found in a related vibriophage φVC8 but absent in S-2L. Its crystallographic structure in polymerase-exonuclease “coupled-open” and “coupled-close” states offers an explanation for the observed specificity.; Le but de cette thèse est de décrire le chemin métabolique permettant de remplacer l’adénine (A) par la 2-aminoadénine (Z) dans le génome de bactériophages Siphoviridae. La 2-aminoadénine et la thymine (T) forment la paire Z:T, liée par trois liaisons hydrogène. Avec la paire G:C classique, ils forment un ADN « ZTGC » qui est résistant aux enzymes de réstriction de l’hôte. En premier lieu, mes travaux se sont focalisés sur le cyanophage S-2L, décrit comme porteur de 2-aminoadénine. J’ai d’abord étudié la primase-polymérase, PrimPol, responsable de la réplication de l’ADN chez ces phages, et qui possède la capacité surprenante d’incorporer à la fois le dATP et le dZTP. J’ai ensuite caractérisé une triphosphatase dATP-spécifique, appelée DatZ, conservée chez tous les bactériophages Siphoviridae, responsable de la dégradation spécifique du dATP. J’ai également mis en évidence que PurZ, l’enzyme-clé pour la production de la diaminopurine est non seulement une ATPase mais aussi une dATPase. J’ai identifié une nucléotide pyrophosphatase, appelée MazZ, composant essentiel du chemin de biosynthèse de Z, qui convertit dGTP en dGMP, en générant ainsi un des substrats de PurZ. Structures cristallographiques de haute résolution de tous les 4 enzymes avec leurs ligands respectifs expliquent les spécificités observées dans les tests catalytiques – ou leur absence. Enfin, j’ai caractérisé une structure d’une ADN polymérase Z-spécifique de famille A, PolZ, trouvée dans le vibriophage φVC8, mais absente dans S-2L. J’ai résolu sa structure cristallographique en modes polymérase et exonuléase « couplé-ouvert » et « couplé-fermé », permettant de decrire son activité au niveau atomique.

Edema factor (EF), a major Bacillus anthracis toxin, is activated by host calmodulin (CaM) to produce supraphysiological concentrations of cyclic AMP (cAMP) thus perturbing intracellular signaling. The EF-CaM interaction induces conformational changes in an allosteric switch region of EF that lead to the formation of the catalytic site. Previous in silico studies targeting this switch region, complemented with experimental data, showed that thiophen ureidoacids (TUA) inhibit the enzyme catalytic activity. However, knowledge of the binding site and inhibition mode of TUA compounds are still lacking. Here, we characterize the interaction of the most active TUA compound (TUA-diCl) with EF, CaM and EF-CaM using biochemical assays coupled to biophysical methods and molecular modeling. We show that TUA-diCl interacts with EF, EF-CaM and unexpectedly with CaM. Mapping of the binding site by NMR, showed that TUA-diCl binds to the exposed hydrophobic patches of calcium loaded CaM, causing the compaction and changes in internal dynamics of the protein. Importantly, enzymatic, fluorescence and NMR data show that EF inhibition is due to the interaction of the compound with EF and is CaM-independent. Furthermore, competition experiments between TUA-diCl and the EF catalytic-site inhibitor 2’-MANT-3’-dATP, indicate that TUA-diCl is an allosteric inhibitor of EF. HDX-MS identifies a putative binding site of TUA-diCl on the helical domain of EF, a critical region for CaM insertion. Several possible binding pockets in the helical domain are analyzed in silico. TUA-diCl represents a new class of EF inhibitors with an allosteric mechanism, opening the way towards the design of innovative therapeutic compounds.; Le facteur œdémateux (EF), une toxine majeure de Bacillus anthracis, est activé par la calmoduline de l’hôte (CaM) pour produire des concentrations supra physiologiques d'AMP cyclique (AMPc) conduisant à une perturbation des voies de signalisation. L'interaction EF-CaM induit des changements conformationnels dans une région switch allostérique de EF conduisant à la formation du site catalytique fonctionnel. Des études antérieures in silico ciblant cette région switch, complétées par des données expérimentales, ont montré que les uréidoacides thiophènes (TUA) inhibent l’activité enzymatique de EF. Cependant, les connaissances sur le site de liaison et sur l'interaction étaient manquantes. Nous présentons ici une étude de l'interaction du TUA-diCl, le composé le plus actif, avec les protéines EF, CaM et le complexe EF-CaM à l'aide d’essais biochimiques couplés à des méthodes biophysiques et de modélisations moléculaires. Le TUA-diCl interagit avec EF isolé, le complexe EF-CaM et de manière inattendue avec CaM. L’étude du site de liaison entre le composé TUA-diCl et la protéine CaM par RMN indique que le composé se lie aux patchs hydrophobes de CaM qui deviennent accessibles lorsque la CaM est complexée par les ions calciums. Ceci entraîne un compactage de la structure de CaM et des changements de la dynamique interne de la protéine. Les données enzymatiques, de fluorescence et de RMN montrent que l'inhibition d'EF est due à l'interaction du composé sur EF et ne dépend pas de la présence de CaM. Des expériences de compétition entre le TUA-diCl et l’inhibiteur du site catalytique EF 2’-MANT-3’-dATP, indiquent que TUA-diCl est un inhibiteur allostérique de EF. Les expériences HDX-MS ont révélé que le TUA-diCl se lierait au domaine hélicoïdal de EF, une région critique pour l'insertion de CaM. De plus, des approches in silico ont mis en évidence plusieurs sites de liaison possible dans le domaine hélicoïdal. Par conséquent, TUA-diCl représente une nouvelle classe d'inhibiteurs de EF avec un mécanisme d'action allostérique et ouvrant la voie vers la conception de molécules thérapeutiques innovantes.

In the field of biological crystallography, the solution commonly adopted to protect fragile samples from the X-ray beam is the freezing of the samples. Chemical treatment prevents water crystallisation, therefore the destruction of samples, but can be an obstacle to the crystallization of sensitive molecules. To circumvent this difficulty, the experiments are carried out at room temperature called In the field of biological crystallography, the solution commonly adopted to protect fragile samples from the X-ray beam is the freezing of the samples. Chemical treatment prevents water crystallisation, therefore the destruction of samples, but can be an obstacle to the crystallization of sensitive molecules. To circumvent this difficulty, the experiments are carried out at room temperature called in-situ using data coming from a large number of samples to circumvent the difficulties of radiation damage. The methods currently used, called serial crystallography, recover a tiny fraction of the data required on each of the crystals, which leads to a high consumption of rare samples. This thesis presents an approach, using microfluidics, allowing to automatically place and collect biological crystals on an angle allowing to drastically reduce the sample consumption. The aim of the work presented is to set up a high-throughput in situ measurement system, taking advantage of new advances in the development of microfluidic chips adapted to crystalline biological samples, in addition to the robotic approaches implemented on the PROXIMA-1 beamline. The chips will have to be provided with particular qualities which will favor a loading of crystalline samples with a minimum of external stress; withstand the chemical environment of the samples; periodically arranging the crystals throughout the chip; be machined from a material allowing the taking of diffraction collections with a minimum of absorption and background noise diffusion; be adapted to the operational sample changing robot on the line. The work presented verifies the capabilities of the chip to respond to certain current difficulties in crystallography, such as the sensitivity of certain samples or the experimental acquisition of the phase, and examines the direct contributions that this technology could have on the field, such as automatic soaking of ligands, confinement of samples, or allow acquisition of diffraction data on in-cellulo samples.; Dans le domaine de la cristallographie biologique, la solution communément utilisée pour protéger les échantillons fragiles du faisceau de rayon x, est la congélation des échantillons. Un traitement chimique empêche la cristallisation de l’eau et de ce fait la destruction des l’échantillons, mais peut être un frein à la cristallisation de molécules sensibles. Pour contourner cette difficultée, les expériences sont effectués à température ambiante dite in-situ en utilisant des données provenant d’un grand nombre d’échantillons pour contourner les difficultées de dommages de radiations. Les méthodes actuellement utilisés, dite de serial crystallography, récupèrent une fraction infime des données requises sur chacun des cristaux, ce qui amène à une forte consommation d’échantillon difficiles à se procurer. Cette thèse présente une approche, utilisant la microfluidique, permettant de placer et collecter automatiquement les cristaux biologiques sur un angle permettant de réduire drastiquement l’utilisation d’échantillon. Le but des travaux présentés est de mettre en place un système de mesures in-situ à haut débit, en tirant avantage des nouvelles avancées en développements de puces microfluidiques adaptées à des échantillons biologiques cristallins, en complément des approches robotiques mises en places sur la ligne PROXIMA-1. Les puces devront être munies de qualités particulières qui devront favoriser un chargement d’échantillons cristallins avec un minimum de stress externe ; supporter les environnement chimiques des échantillons ; disposer de manière périodique les cristaux tout au long de la puce ; être usinée dans un matériau permettant la prise de collectes de clichés de diffraction avec un minimum d’absorption et de diffusion en bruit de fond ; être adaptées au robot de changement d’échantillons opérationnel sur la ligne. Les travaux présentés vérifient les capacités de la puce à répondre à certaines difficultées actuelles de la cristallographie, comme la sensibilité de certains échantillons ou l’acquisition expérimentale de la phase, et examine les apports directs que cette technologie pourrait avoir sur le domaine, comme le trempage automatique de ligands, le confinement des échantillons, ou permettre une acquisition de donnée de diffraction sur des échantillons

The goal of this work is to improve the understanding of non-covalent interactions, from the study of electron density, notably applied to protein-ligand complexes. The electron density is a relatively conserved property of atoms in similar molecular environments. This preliminary observation establishes the transferability principle. This approximation is at the root of database-based approaches, such as the ELMAM2 atom type library. This database makes it possible to reconstruct the electron density of biological molecules from fragments observed during high-resolution crystallographic experiments (and expressed in the Hansen and Coppens multipolar model). Determination of a specific type of electrostatic interaction, the interaction between induced dipole moments, profits of an innovative approach. Transferable experimental electronic densities are complemented by theoretical polarizabilities. Polarizabilities describe the response of the electron density to the application of an electric field, in order to model the classical interaction between induced dipoles. The development of new software tools, integrated into the MoProSuite software, allows several focal area presented in this manuscript. The transferability of atomic polarizabilities is discussed to evaluate their conservation between different molecular environments. Short-range interactions between molecules involve very strong electric fields. Their effect is taken into account by modelling the polarization phenomenon. The adjunction of polarization to the transferred electron density is evaluated on biological systems and small organic molecules. These transferred, then polarized, densities make it possible to calculate accurate electrostatic interaction energies, which are compared to a theoretical benchmark and an experimental case study. The study of scalar field topology, in the case of the electrostatic potential within protein-ligand complexes, is at an early stage of development. The model and the new tools developed in this thesis are steps toward the application of this approach, which describes the shape of the fields of density and electrostatic potential, to biological systems.; L’objectif de ce travail est d’améliorer la compréhension des interactions non-covalentes, à partir de l’étude de la densité électronique, notamment appliquée aux complexes protéines-ligands. La densité électronique est relativement conservée pour des atomes dans des contextes moléculaires similaires. Cette observation préalable fonde le principe de transférabilité. Cette approximation est à la racine des approches basées sur les bases de données, telles que la librairie de types atomiques ELMAM2, d’origine expérimentale. La base de données permet de reconstruire la densité électronique de molécules biologiques à partir de fragments observés lors d’expériences de cristallographie à haute résolution (exprimés dans le modèle multipolaire de Hansen et Coppens). Une approche novatrice est appliquée ici pour déterminer un type spécifique d’interaction électrostatique : l’interaction entre moments dipolaires induits. Cette interaction classique est représentée à l’aide d’un modèle de densité électronique transféré auquel est adjoint un ensemble de polarisabilités atomiques théoriques. Cette propriété décrit la réponse de la densité à l’application d’un champ électrique. Le développement de nouveaux outils informatiques, intégrés au logiciel MoProSuite, permet plusieurs axes d’étude présentés dans ce manuscrit. La transférabilité des polarisabilités atomiques est discutée pour évaluer leur conservation entre différents contextes moléculaires. Les interactions à courte portée entre molécules impliquent de très forts champs électriques. Leurs effets sont pris en compte en modélisant le phénomène de polarisation. L’adjonction de la polarisation à la densité électronique transférée est évaluée pour des systèmes biologiques et des petites molécules organiques. Ces densités transférées puis polarisées permettent de calculer des énergies d’interactions électrostatiques précises qui sont comparées à un banc de test théorique et appliquées à une étude de cas expérimental. L’étude de la topologie des champs scalaires, dans le cas du potentiel électrostatique au sein des complexes protéine-ligand, est encore à un stade de développement précoce. Le modèle et les nouveaux outils développés dans cette thèse permettent d’envisager l’application de cette approche, qui décrit la forme des champs de densité et de potentiel électrostatique, à des systèmes biologiques.

Agrobacterium tumefaciens bacterium establishes a long-term relationship with plants. It can have two lifestyles: (1) pathogenic when it harbors the virulence plasmid Ti (Tumor inducing) causing the crown gall disease characterized by tumor formation in plant, (2) non-pathogenic living in the rhizosphere. In these two lifestyles, Agrobacterium uses PBP (periplasmic binding proteins) associated with ABC transporters to import molecules from plants as nutrients. PBP selects and binds the ligand that it brings to the ABC transporter, which allows its passage into the cytoplasm by the hydrolysis of two ATP molecules. The specificity of the entire transporter depends on PBP. The molecules transported and degraded by the bacteria appear as a trophic advantage for the colonization of the environment.When A. tumefaciens is pathogenic, the bacterium transfers part of its Ti plasmid into the genome of plant cells, inducing the production and secretion by the plant of specific compounds for the bacterium, called opines. Twenty opines are known to date, and each of them can be metabolized by A. tumefaciens strains. The strain B6 possesses an octopine-type pTi, which harbors metabolism genes of the mannityl-opines family, composed of agropinic acid, agropine, mannopinic acid and mannopine. According to genetic studies in octopine type strains, the associated PBP-transporter ABC systems are AgaABCD, AgtABCD, MoaABCD and MotABCD, respectively.In the rhizosphere, germinating seeds influence the composition of the rhizosphere and promote the growth of microorganisms by releasing molecules such as Raffinose Family of Oligosaccharides (RFO). In silico analyzes of Agrobacterium fabrum C58 indicate that the strain possesses an operon we called mel, similar to the agp operon in Ensifer meliloti 1021 described as responsible for the transport and degradation of RFOs that appears to influence the survival of the bacterium in the rhizosphere. We hypothesized that the PBP MelB of the mel operon in A. fabrum C58 is responsible for the transport of the RFOs.My thesis work allowed to finalize the structural and biochemical characterization of mannityl-opines transporters and allowed the identification and characterization of MelB as responsible for the import of RFO and galactinol (precursor of the RFO). The transport and degradation of the molecules transported by these PBPs are important for the colonization of their environment.; La bactérie Agrobacterium tumefaciens établit une relation à long terme avec les plantes. Elle peut avoir deux modes de vie : (1) pathogène lorsqu’elle possède le plasmide de virulence Ti (Tumor inducing) provoquant la maladie de la galle du collet caractérisée par la formation de tumeur chez la plante, (2) non pathogène vivant dans la rhizosphère. Dans ces deux modes de vie, Agrobacterium utilise les PBP (protéines périplasmiques de liaision) associées à des transporteurs ABC pour importer des molécules issues de plante servant de nutriments. La PBP sélectionne et fixe le ligand qu’elle apporte au transporteur ABC, qui permet son passage dans le cytoplasme grâce à l’hydrolyse de deux molécules d’ATP. La spécificité du transporteur entier dépend de la PBP. Les molécules transportées et dégradées par la bactérie apparaissent comme un avantage trophique pour la colonisation de l’environnement.Lorsqu’A. tumefaciens est pathogène, la bactérie transfère une partie de son plasmide Ti dans le génome des cellules végétales, induisant la production et sécrétion par la plante de composés spécifiques pour la bactérie, appelés opines. Une vingtaine d’opines sont connues à ce jour, et chacune d’elles peut être métabolisée par des souches d’A. tumefaciens. La souche B6 possède un pTi de type octopine, qui porte les gènes de métabolisme de la famille des mannityl-opines, composée de l’acide agropinique, l’agropine, l’acide mannopinique et la mannopine. D’après des études génétiques chez des souches de type octopine, les systèmes PBP-transporteur ABC associés sont respectivement AgaABCD, AgtABCD, MoaABCD et MotABCD.Dans la rhizosphère, les graines en germination influencent la composition de la rhizosphère et favorisent la croissance de microorganismes en libérant des molécules telles que les sucres de la famille du raffinose (RFO, Raffinose Family of Oligosaccharides). Des analyses in silico d’Agrobacterium fabrum C58 indiquent que la souche possèderait un opéron que nous avons appelé mel, proche de l’opéron agp chez Ensifer meliloti 1021 décrit comme responsable du transport et de la dégradation des RFO qui semble influer sur la survie de la bactérie dans la rhizosphère. Nous avons fait l’hypothèse que la PBP MelB de l’opéron mel chez A. fabrum C58 est responsable du transport des RFO.Mon travail de thèse a permis de finaliser la caractérisation structurale et biochimique des transporteurs des mannityl-opines et a permis l’identification et la caractérisation de MelB comme responsable de l’import des RFO et du galactinol (précurseur des RFO). Le transport et la dégradation des molécules transportées par ces PBP sont importants pour la colonisation de leur environnement.

During the plastic deformation of crystalline materials, a soft plasticity, made up of many uncorrelated dislocation movements, can coexist with a wilder plasticity, in the form of collaborative movements: dislocation avalanches. The coexistence of the two plasticities depends on the establishment of a dislocation structure, which is supposed to hinder the spread of avalanches. It is proposed to study the correlation between microstructural evolutions and dislocation arrangements under cyclic loading on the one hand, and the nature of the collective dynamics of dislocations on the other hand, in the case of pure copper single crystals. Various stress imposed fatigue tests are performed to study the influence of (i) the loading path, (ii) the loading ratio and (iii) the crystallographic orientation on the plasticity phenomena. The acoustic emission (EA) technique is used to study both types of plasticity. Continuous EA, which can be considered as background noise resulting from the cumulative effect of many sources, is associated with mild plasticity. Discrete EA, with more energetic signals than those emitted continuously, is associated with wild plasticity. Dislocation microstructures are studied using EBSD (Electron Backscattered Diffraction) and ECCI (Electron Channeling Contrast Imaging) techniques at the end of each fatigue level. The EA-ECCI coupling provides valuable information on the dynamics of dislocations. The monitoring by ECCI, during a fatigue test at Rσ=0.1 shows that a given dislocation structure is stable only for given level of stress. The emergence of a dislocation structure act as an obstacle to avalanche movement. However, the application of a larger stress amplitude allows the rearrangement of the structure, which is largely in the form of dislocation avalanches that can travel longer distances than the dislocation mean free path. Small uncorrelated dislocation movements are confined within the dislocation structures, between dense dislocation arrangements (cells, walls, etc.). Mild plasticity is therefore increasingly restricted as the mean free path decreases. The various tests carried out show that the loading path (at Rσ=0.1) has no influence on the dislocation structure formed, but that the dynamics of the dislocations adapt to the way the material is loaded. The loading ratio (Rσ=-1) has a major influence on the formation of dislocation structures, with the emergence of veins, matrices, persistent slip bands and dense cells, but also on the dynamics of dislocations, with a gradual evolution of mild plasticity during cycles and a reduction in the number of avalanches during the hardening of the material. Concerning the influence of crystallographic orientation, a larger number of activated slip systems limit the contribution of avalanches to plasticity.; Pendant la déformation plastique des matériaux cristallins, une plasticité douce, faite de nombreux mouvements de dislocations non corrélés peut coexister avec une plasticité plus sauvage, sous la forme de mouvements collaboratifs : les avalanches de dislocations. La coexistence des deux plasticités dépend de la mise en place d’une structure de dislocations, celle-ci étant supposée entraver la propagation des avalanches. On se propose d’étudier la corrélation entre les évolutions microstructurales et les arrangements de dislocations sous chargement cyclique, d'une part, et la nature de la dynamique collective des dislocations, d'autre part, pour le cas de monocristaux de cuivre purs. Différents essais de fatigue à amplitude de contrainte imposée sont effectués pour étudier l’influence (i) du chemin de chargement, (ii) le rapport de chargement et (iii) l’orientation cristallographique sur les phénomènes de plasticité. La technique d’émission acoustique (EA) est utilisée pour étudier les deux types de plasticité. L’EA continue peut-être associée à la plasticité douce, tandis que l'EA discrète, présentant des signaux plus énergétiques que ceux émis en continu sont associés à la plasticité sauvage. Les microstructures de dislocations sont étudiées à l’aide des techniques EBSD (Electron Backscattered Diffraction, pour mesurer la désorientation cristalline) et ECCI (Electron Channeling Contrast Imaging, pour imager les dislocations au MEB) à la fin de chaque palier de fatigue. Le couplage EA-ECCI donne de précieuses informations quant à la dynamique des dislocations. Le suivi par ECCI, lors d’un essai de fatigue à Rσ=0,1 montre qu’une structure de dislocation n’est stable que pour le niveau de contrainte qui la vue naître. L’émergence d'une structure de dislocations constituent un obstacle aux mouvements des avalanches. Toutefois, l’application d’une amplitude de contrainte plus importante permet un réarrangement de la structure, celui-ci se faisant en grande partie sous la forme d’avalanches de dislocations pouvant se déplacer sur de plus longues distances que le libre parcours moyen. Les petits mouvements de dislocations non corrélés sont confinés à l'intérieur des structures de dislocations, entre les arrangements denses de dislocations (cellules, murs, etc.). La plasticité douce est en conséquence de plus en plus restreinte à mesure que le libre parcours moyen diminue. Le rapport de chargement (Rσ=-1) a une grande influence sur la formation des structures de dislocations, avec l’émergence de structures veines, matrices, bandes de glissement persistant et cellules denses, mais aussi sur la dynamique des dislocations, avec une évolution progressive de la plasticité douce au cours des cycles et une réduction du nombre d’avalanches pendant le durcissement du matériau. Concernant l’influence de l’orientation cristallographique, un nombre plus important de systèmes de glissement activés permet de limiter la contribution des avalanches à la plasticité.

The maintenance of DNA integrity is central in all organisms to ensure successful life and reproduction.The DNA should be duplicated and transmitted to next generation cells in its entirety with a minimalamount of alteration. Double-strand breaks (DSBs) are the most toxic DNA damages and can originatefrom endogenous or exogenous stresses . In antic-cancer treatments, radiotherapy aims at generatingDSBs locally on tumor cells and thus induce their apoptosis. Current major challenge nowadays is tounderstand the mechanism of resistance of some tumors to these treatments and to characterize newinhibitors of NHEJ to potentiate the effect of radiotherapy. The NHEJ pathway begins with therecognition of CDBs extremities by a Ku70/80 (Ku) heterodimeric protein. Ku serves as a recruitmentplatform for the other factors of the NHEJ pathway involved in the processing and ligation of the DNAends. The first part of this thesis focuses on the characterization of Ku-protein interaction sites and onthe characterization of new molecules as potential drugs against Ku. The interaction sites of two majorKu partners, XLF and APLF, were characterized by calorimetry using peptides containing theinteraction motif of these proteins, called KBM (for Ku-Binding Motifs) or the proteins themselves. Thecrystallographic structure of a Ku-DNA complex with a small molecule, IP6, has been determined. TheIP6 has a strong affinity for Ku with a KD of 50 nM. We showed that this molecule stimulates Ku bindingon DNA by three biophysical methods (calorimetry, switchSENSE and sm-TIRF). Finally, a highthroughput screening of library of Sanofi fragments of 987 molecules was performed in vitro by DSFand validated by NMR on the Ku protein and identified 15 fragments that could interact with Ku. Thiswork paves the way for the rational design of inhibitors derived from the pXLF peptides, pAPLF, IP6molecules or fragments by grafting on these platforms new chemical functions to further improve theaffinity and inhibit the NHEJ pathway. The second part of this thesis focused on protein-DNAinteractions studied by Sanofi in a discovery drugs project in oncology and the analysis of the addedvalue of a new approach switchSENSE implemented at CEA Saclay. We analyzed 4 constructs of aprotein interacting with two DNAs and the effect of 15 inhibitory molecules identified upstream inSanofi's « Integrated Drug Discovery » service. The switchSENSE experiments made it possible tocharacterize the KD of the 4 constructs for DNA and to measure inhibition constants for the inhibitors.These measurements are in good agreement with the measurements made at Sanofi by SPR, MST andNMR. This study positions the switchSENSE as a promising approach in the validation of newinhibitors, in particular for protein-DNA interactions., Pour qu’un organisme soit viable, il est essentiel que la molécule d’ADN soit dupliquée et transmise aux générations filles dans son intégralité avec le moins d’altérations possibles. Des cassures double-brin (CDB) peuvent apparaitre suite à des stress endogènes ou exogènes et constituent les dommages de l’ADN les plus toxiques. La radiothérapie a pour but générer de manière localisée des CDBs dans les cellules tumorales et de déclencher leur apoptose. Un enjeu majeur actuel est de comprendre le mécanisme de résistance de certaines tumeurs à ces CDBs et de caractériser de nouveaux inhibiteurs du NHEJ pour potentialiser l’effet de la radiothérapie. La voie NHEJ débute par la reconnaissance des deux extrémités de l’ADN d’une CDB par une protéine hétérodimérique Ku70/80 (Ku). Celle-ci sert de plateforme de recrutement aux autres facteurs de la voie NHEJ impliqués dans la maturation (processing) et la ligation des extrémités de l’ADN. Le premier volet de cette thèse a porté sur la caractérisation de sites d’interactions protéine-protéine de Ku et sur la caractérisation de nouvelles molécules comme médicaments potentiels dirigés contre Ku. Les sites d’interactions de deux partenaires majeurs de Ku, XLF et APLF, ont été caractérisés par calorimétrie en utilisant des peptides contenant le motif d’interaction de ces protéines appelés KBM (pour Ku-Binding Motifs) ou les protéines elles-mêmes. La structure cristallographique d’un complexe Ku-ADN avec une petite molécule, l’IP6, a été résolue. L’IP6 présente une forte affinité pour Ku avec un KD de 50 nM. Nous avons montré que cette molécule stimule la fixation de Ku sur l’ADN par trois méthodes biophysiques (calorimétrie, switchSENSE et sm-TIRF). Enfin, un criblage haut débit d’une chimiothèque de 987 molécules fragments de Sanofi a été réalisé in vitro par DSF et validé par RMN sur la protéine Ku. Ce crible a permis d’identifier 15 fragments susceptibles d’interagir avec Ku. Ces travaux ouvrent la voie pour la conception rationnelle d’inhibiteurs dérivés des peptides pXLF, pAPLF, de la molécules IP6 ou des fragments identifiés par le crible en greffant sur ces plateformes de nouvelles fonctions chimiques pour améliorer encore l’affinité et bloquer la voie NHEJ. Le second volet de cette thèse a porté sur des interactions de type protéine-ADN étudiées par Sanofi dans un projet de découverte de nouvelles drogues en oncologie et l’analyse de la valeur ajoutée d’une nouvelle approche le switchSENSE implémentée au CEA de Saclay. Nous avons analysé 4 constructions d’une protéine interagissant avec deux ADN et l’effet de 15 molécules inhibitrices identifiées en amont dans le service « Integrated Drug Discovery » de Sanofi. Les expériences de switchSENSE ont permis de caractériser les KD des 4 constructions pour l’ADN et de mesurer des constantes d’inhibition pour les inhibiteurs. Ces mesures sont en bon accord avec les mesures effectuées à Sanofi par SPR, MST et RMN et permettent de positionner le switchSENSE comme une approche prometteuse dans la validation de nouveaux inhibiteurs en particulier pour les interactions protéine-ADN.

Texte intégral accessible uniquement aux membres de l'Université de Lorraine jusqu'au 1er mars 2020.; A thorough investigation has been conducted on the microstructural and crystallographic features of Electric Current Pulse (ECP) treated Cu-40%Zn alloys. The phase transformation orientation relationship (OR) and its correlation with crystal defects have been studied and the formation mechanisms of ECP induced crystal defects in the parent phase and the sub-structures in the β precipitates were also analyzed. The α to β heating phase transformation can be induced by ECP treatment with the formation of fine β precipitates that can be remained to the room temperature. With the increase of the electric current density, the amount of precipitates is increased and the formation sites increase from α grain boundaries to grain interiors. The β precipitates follow different ORs depending on the formation site. The grain boundary β phase obeys the Kurdjumov-Sachs (K-S) OR; whereas the intragranular β respects the Nishiyama-Wasserman (N-W) OR. In the former sites, the {111}α /α dislocations are observed, whereas in the latter, the {111}α/α stacking faults are found. Transformation strain analyses revealed that under the K-S OR the maximum lattice deformation required is a shear on the {111}α /α slip system, whereas under the N-W OR the maximum deformation is a shear on the {111}α /α system. Thus the existing {111}α /α dislocations along the α grain boundaries provide pre-strain required by the transformation via the K-S path, whereas the {111}α /α stacking faultsboarded by {111}α /α partial dislocations offer pre-strain facilitating the transformation via the N-W path. Different types of crystal defects are formed in the α matrix by the ECP treatments depending on the current density. At low density, large amount of {111}α /α stacking faults and then nano twins are produced in the α matrix. At high density, dislocation nets are formed near the β precipitates that are composed of edge typed {111}α /< 11̅0 >α perfect dislocations and the Frank typed dislocations. The volume misfit between the α and the β phase analyzed with transformation deformation reveals that the transformation from α to β requires an expansion along [11̅0]α direction and a contraction along [111]α direction. The former results in the appearance of the {111}α /α edge typed dislocation arrays in front of the {31̅1}α broad faces and the latter induces the formation of the Frank typed dislocations in front of the {121}α broad faces. Thus, dislocation nets formed along the edges of the broad faces of the β precipitates where the two kinds of dislocations meet. Furthermore, the β precipitates contain two kinds of nano-sized and diffuse atomic clusters with the  structure obeying the Burgers OR and with the ω structure obeying the Blackburn OR with the β matrix. They were each formed through a two-stepped atomic displacement. For the  structure, the first step is the atomic shuffle of each second {110}β plane in the βdirection and the second is a structure change mainly by a shear on the {11̅2}β /β. For the ω structure, the first is an atomic shuffle on each second and third {112̅}β plane in the ±[111]β directions and then normal strains in three mutually perpendicular directions (β, β and β). The concomitant appearance of the two structures lies in the fact that the volume increase accompanying the  formation can be canceled by the volume decrease accompanying the ω distortion, which minimizing the transformation strain energy. The results of this work provide fundamental information on the Cu-40%Zn alloys for interpreting the impact of the crystal defects on the solid phase transformation ORs, on the formation of various types of crystal defects induced by the ultra-rapid phase transformation and on the formation mechanisms of sub structures in the product phase.; Ce travail porte sur les caractéristiques microstructurales et cristallographiques des alliages Cu-40%Zn traités par Electric Current Pulse (ECP). La relation d'orientation (RO) de transformation de phase et sa corrélation avec les défauts cristallins ont été étudiés. Les mécanismes de formation des défauts cristallins dans la phase mère et des sous-structures dans les précipités β induit par L'ECP ont également été étudiés. La transformation de la phase α en β peut être induite par un traitement ECP avec formation de précipités fins β pouvant persister à température ambiante. Avec l'augmentation de la densité de courant électrique, la quantité de précipités et les sites de formation augmentent des joints de grains α à l'intérieur des grains. Les précipités β suivent différentes RO en fonction du site de formation. Les joints de grains β sont en RO Kurdjumov-Sachs (KS); tandis que les β intragranulaires sont en Nishiyama-Wasserman (NW). Dans les premiers sites, on observe des dislocations {111}α/α, alors que dans les seconds, les fautes d’empilements {111}α/α sont présentes. Les analyses de déformation de transformation ont révélé que, en RO KS, la déformation maximale du réseau requise est un cisaillement sur le système {111}α/α, tandis qu'en NW, la déformation maximale correspond à un cisaillement sur le système {111}α/α. Ainsi, les dislocations {111}α/α existants le long des joints de grains α fournissent la précontrainte requise par la transformation KS, alors que les fautes d'empilement {111}α/α entourées par les dislocations partielles {111}α/α offrent une précontrainte facilitant la transformation NW. Différents types de défauts cristallins sont formés dans la matrice α par les traitements ECP en fonction de la densité de courant. À faible densité, une grande quantité de fautes d'empilement {111}α/α, puis des nano-mâcles sont produites dans la matrice α. A haute densité, des réseaux de dislocations sont formés à proximité des précipités β composés de dislocations coins parfaites {111}α/α et des dislocations de Frank. La différence de volume entre le phases α et β analysée avec la déformation de transformation révèle que cette dernière nécessite une dilatation dans la direction [11̅0]α et une contraction dans la direction [111]α. La première entraîne l’apparition de dislocations coins {111}α/α devant les larges faces {31̅1}α et la dernière induit la formation des dislocations de Frank devant les larges faces {121}α. Ainsi, des réseaux de dislocations se forment le long des bords des grandes faces des précipités β où les deux types de dislocations se rencontrent. De plus, les précipités β contiennent deux types d’agrégats atomiques de taille nanométrique de structure n en RO Burgers et de structure ω en RO Blackburn avec la matrice β. Ils ont été formés par un déplacement atomique en deux étapes. Pour la structure n, la première étape est le brassage atomique de chaque second plan {110}β dans la direction β et la seconde consiste en un changement de structure principalement par un cisaillement selon {11̅2}β /β. Pour la structure ω, le premier est un mélange atomique sur chaque deuxième et troisième plan {112̅}β dans les directions ±[111]β, puis des déformations normales dans trois directions perpendiculaires (β, β et β). L’apparence concomitante des deux structures réside dans le fait que l’augmentation de volume accompagnant la formation de n peut être annulée par la diminution de volume accompagnant la distorsion ω, ce qui minimise l’énergie de déformation de transformation. Ce travail fournit des informations fondamentales sur les alliages Cu-40%Zn pour interpréter l’impact des défauts sur les relations d'orientation de transformations en phase solide, sur la formation de divers types de défauts induits par la transformation de phase ultra-rapide ainsi que sur les mécanismes de formation des sous-structures des phases produites.

Texte intégral accessible uniquement aux membres de l'Université de Lorraine jusqu'au 1er mars 2020.; A thorough investigation has been conducted on the microstructural and crystallographic features of Electric Current Pulse (ECP) treated Cu-40%Zn alloys. The phase transformation orientation relationship (OR) and its correlation with crystal defects have been studied and the formation mechanisms of ECP induced crystal defects in the parent phase and the sub-structures in the β precipitates were also analyzed. The α to β heating phase transformation can be induced by ECP treatment with the formation of fine β precipitates that can be remained to the room temperature. With the increase of the electric current density, the amount of precipitates is increased and the formation sites increase from α grain boundaries to grain interiors. The β precipitates follow different ORs depending on the formation site. The grain boundary β phase obeys the Kurdjumov-Sachs (K-S) OR; whereas the intragranular β respects the Nishiyama-Wasserman (N-W) OR. In the former sites, the {111}α /α dislocations are observed, whereas in the latter, the {111}α/α stacking faults are found. Transformation strain analyses revealed that under the K-S OR the maximum lattice deformation required is a shear on the {111}α /α slip system, whereas under the N-W OR the maximum deformation is a shear on the {111}α /α system. Thus the existing {111}α /α dislocations along the α grain boundaries provide pre-strain required by the transformation via the K-S path, whereas the {111}α /α stacking faultsboarded by {111}α /α partial dislocations offer pre-strain facilitating the transformation via the N-W path. Different types of crystal defects are formed in the α matrix by the ECP treatments depending on the current density. At low density, large amount of {111}α /α stacking faults and then nano twins are produced in the α matrix. At high density, dislocation nets are formed near the β precipitates that are composed of edge typed {111}α /< 11̅0 >α perfect dislocations and the Frank typed dislocations. The volume misfit between the α and the β phase analyzed with transformation deformation reveals that the transformation from α to β requires an expansion along [11̅0]α direction and a contraction along [111]α direction. The former results in the appearance of the {111}α /α edge typed dislocation arrays in front of the {31̅1}α broad faces and the latter induces the formation of the Frank typed dislocations in front of the {121}α broad faces. Thus, dislocation nets formed along the edges of the broad faces of the β precipitates where the two kinds of dislocations meet. Furthermore, the β precipitates contain two kinds of nano-sized and diffuse atomic clusters with the  structure obeying the Burgers OR and with the ω structure obeying the Blackburn OR with the β matrix. They were each formed through a two-stepped atomic displacement. For the  structure, the first step is the atomic shuffle of each second {110}β plane in the βdirection and the second is a structure change mainly by a shear on the {11̅2}β /β. For the ω structure, the first is an atomic shuffle on each second and third {112̅}β plane in the ±[111]β directions and then normal strains in three mutually perpendicular directions (β, β and β). The concomitant appearance of the two structures lies in the fact that the volume increase accompanying the  formation can be canceled by the volume decrease accompanying the ω distortion, which minimizing the transformation strain energy. The results of this work provide fundamental information on the Cu-40%Zn alloys for interpreting the impact of the crystal defects on the solid phase transformation ORs, on the formation of various types of crystal defects induced by the ultra-rapid phase transformation and on the formation mechanisms of sub structures in the product phase.; Ce travail porte sur les caractéristiques microstructurales et cristallographiques des alliages Cu-40%Zn traités par Electric Current Pulse (ECP). La relation d'orientation (RO) de transformation de phase et sa corrélation avec les défauts cristallins ont été étudiés. Les mécanismes de formation des défauts cristallins dans la phase mère et des sous-structures dans les précipités β induit par L'ECP ont également été étudiés. La transformation de la phase α en β peut être induite par un traitement ECP avec formation de précipités fins β pouvant persister à température ambiante. Avec l'augmentation de la densité de courant électrique, la quantité de précipités et les sites de formation augmentent des joints de grains α à l'intérieur des grains. Les précipités β suivent différentes RO en fonction du site de formation. Les joints de grains β sont en RO Kurdjumov-Sachs (KS); tandis que les β intragranulaires sont en Nishiyama-Wasserman (NW). Dans les premiers sites, on observe des dislocations {111}α/α, alors que dans les seconds, les fautes d’empilements {111}α/α sont présentes. Les analyses de déformation de transformation ont révélé que, en RO KS, la déformation maximale du réseau requise est un cisaillement sur le système {111}α/α, tandis qu'en NW, la déformation maximale correspond à un cisaillement sur le système {111}α/α. Ainsi, les dislocations {111}α/α existants le long des joints de grains α fournissent la précontrainte requise par la transformation KS, alors que les fautes d'empilement {111}α/α entourées par les dislocations partielles {111}α/α offrent une précontrainte facilitant la transformation NW. Différents types de défauts cristallins sont formés dans la matrice α par les traitements ECP en fonction de la densité de courant. À faible densité, une grande quantité de fautes d'empilement {111}α/α, puis des nano-mâcles sont produites dans la matrice α. A haute densité, des réseaux de dislocations sont formés à proximité des précipités β composés de dislocations coins parfaites {111}α/α et des dislocations de Frank. La différence de volume entre le phases α et β analysée avec la déformation de transformation révèle que cette dernière nécessite une dilatation dans la direction [11̅0]α et une contraction dans la direction [111]α. La première entraîne l’apparition de dislocations coins {111}α/α devant les larges faces {31̅1}α et la dernière induit la formation des dislocations de Frank devant les larges faces {121}α. Ainsi, des réseaux de dislocations se forment le long des bords des grandes faces des précipités β où les deux types de dislocations se rencontrent. De plus, les précipités β contiennent deux types d’agrégats atomiques de taille nanométrique de structure n en RO Burgers et de structure ω en RO Blackburn avec la matrice β. Ils ont été formés par un déplacement atomique en deux étapes. Pour la structure n, la première étape est le brassage atomique de chaque second plan {110}β dans la direction β et la seconde consiste en un changement de structure principalement par un cisaillement selon {11̅2}β /β. Pour la structure ω, le premier est un mélange atomique sur chaque deuxième et troisième plan {112̅}β dans les directions ±[111]β, puis des déformations normales dans trois directions perpendiculaires (β, β et β). L’apparence concomitante des deux structures réside dans le fait que l’augmentation de volume accompagnant la formation de n peut être annulée par la diminution de volume accompagnant la distorsion ω, ce qui minimise l’énergie de déformation de transformation. Ce travail fournit des informations fondamentales sur les alliages Cu-40%Zn pour interpréter l’impact des défauts sur les relations d'orientation de transformations en phase solide, sur la formation de divers types de défauts induits par la transformation de phase ultra-rapide ainsi que sur les mécanismes de formation des sous-structures des phases produites.

La cristallographie est une méthode récente dans l’histoire de la pharmacie : il faut attendre le XXème siècle avant que des médicaments directement développés à partir de la structure des macromolécules n’apparaissent. De nombreux succès thérapeutiques peuvent être cités, comme l’imatinib, les inhibiteurs de la protéase dans le HIV ou encore le dabigatran. Toutefois, le développement de tels médicaments par des méthodes structurales restent limitées du fait de la difficulté de caractériser la structure tridimensionnelle de la cible et de dessiner un ligand ou un inhibiteur efficace. Le travail de recherche effectué au cours de cette thèse d’exercice illustre l’intérêt des études cristallographique dans le développement de nouvelles thérapeutiques. La protéine NosL est à l’origine par chimie radicalaire de la synthèse de l’acide 3-méthylindolique à partir du L-tryptophane. Cette moitié indolique est intégrée plus tard dans l’antibiotique nosiheptide, qui n’est pas encore utilisé en clinique du fait de sa trop faible solubilité. Ainsi, il est apparu intéressant d’utiliser la biologie de synthèse, la mutagenèse dirigée et la promiscuité de l’enzyme NosL afin de produire des variants hydrophiles du MIA et à terme modifier le nosiheptide pour le rendre plus soluble et efficace.

En chimie supramoléculaire, le tout est plus grand que la somme de ses parties : les caractéristiques d’un matériau ne sont pas toujours définies par les attributs de molécules isolées et émergent parfois seulement de leur collectivité. Les propriétés dépendent alors de l’organisation moléculaire et l’impossibilité de la prévoir est un obstacle majeur à notre habileté à concevoir des matériaux ayant des caractéristiques prédéfinies. Bien que différentes méthodes permettent de moduler l’organisation, leur portée est généralement limitée et les fragments employés sont souvent étrangers aux propriétés ultimement visées. Ainsi, les organisations favorables sont parfois atteintes aux dépens des propriétés moléculaires. Par conséquent, nous avons choisi d’étudier l’association moléculaire dans des familles de composés pertinentes en électronique organique et de nous pencher sur les façons dont les fragments moléculaires déterminant les propriétés intrinsèques attrayantes peuvent aussi être utilisés pour diriger l’association moléculaire. Nous avons aussi choisi de nous limiter à des composés structurellement apparentés et nous nous sommes concentrés sur des composés de forme quinonoïde qui combinent trois caractéristiques essentielles : (1) La présence d’un système-π étendu; (2) la capacité de s’engager dans diverses interactions intermoléculaires; et (3) un caractère électrodéficitaire favorisant des phénomènes de transfert de charge ou la participation à des réactions rédox. Une première partie de la thèse se concentre sur l’association des thiadiazoles aromatiques. Ces unités sont communes à plusieurs matériaux optoélectroniques et se sont révélées particulièrement efficaces lorsqu’intégrées aux cellules solaires organiques. Afin d’approfondir la pertinence de notre étude à cette technologie, nous avons aussi étudié la formation de co-cristaux entre des dérivés de thiadiazoles et des fullerènes, une autre classe de matériaux couramment intégrée à ce type de dispositif. Cette section est suivie d’un chapitre qui détaille une partie des efforts synthétiques déployés dans la préparation des thiadiazoles. La seconde partie de la thèse se tourne vers des dérivés de triptycène portant des unités quinone et hydroquinone et sur les façons dont leur association et leurs propriétés rédox peuvent être utilisées de concert à l’état solide., In supramolecular chemistry, the whole is greater than the sum of its parts: a material’s characteristics are not always defined by the attributes of isolated molecules and may only emerge from their collectivity. Properties then depend on molecular organization. The difficulty of predicting it from molecular identity alone prevents the design of materials with predefined properties. Few methods allow modulation of organization, and the necessary molecular fragments are often not relevant to the targeted properties. Therefore, useful organizations are often reached at the expense of molecular properties. For those reasons, we have chosen to examine molecular association in families of molecules relevant to organic electronic and to study how the molecular fragments defining the attractive properties can also be exploited to direct molecular association. We have chosen to focus on structurally related compounds that combine three essential characteristics: (1) the presence of an extended π system; (2) the ability to engage in various intermolecular interactions, and (3) an electron-poor nature that promotes either charge transfer or redox reactions. The first part of the thesis details the association of a series of aromatic thiadiazoles. These units are widely used in many optoelectronic materials and are particularly valuable as components of the active layers of organic solar cells. To ensure that our structural analyses are relevant to studies in which the typical components of molecular thin-film devices must be properly organized, we have also examined co-crystallizations of thiadiazole derivatives with the fullerenes C60 and C70, which define a class of compounds widely used as electron acceptors in solar cells. This section is followed by a chapter describing problems in synthesis encountered during the preparation of the thiadiazoles and our efforts to overcome them. The second part of the thesis turns to derivatives of triptycenes containing quinone and hydroquinone units and on how their association and their redox properties can be used in concert in the solid state.

During the plastic deformation of crystalline materials, a soft plasticity, made up of many uncorrelated dislocation movements, can coexist with a wilder plasticity, in the form of collaborative movements: dislocation avalanches. The coexistence of the two plasticities depends on the establishment of a dislocation structure, which is supposed to hinder the spread of avalanches. It is proposed to study the correlation between microstructural evolutions and dislocation arrangements under cyclic loading on the one hand, and the nature of the collective dynamics of dislocations on the other hand, in the case of pure copper single crystals. Various stress imposed fatigue tests are performed to study the influence of (i) the loading path, (ii) the loading ratio and (iii) the crystallographic orientation on the plasticity phenomena. The acoustic emission (EA) technique is used to study both types of plasticity. Continuous EA, which can be considered as background noise resulting from the cumulative effect of many sources, is associated with mild plasticity. Discrete EA, with more energetic signals than those emitted continuously, is associated with wild plasticity. Dislocation microstructures are studied using EBSD (Electron Backscattered Diffraction) and ECCI (Electron Channeling Contrast Imaging) techniques at the end of each fatigue level. The EA-ECCI coupling provides valuable information on the dynamics of dislocations. The monitoring by ECCI, during a fatigue test at Rσ=0.1 shows that a given dislocation structure is stable only for given level of stress. The emergence of a dislocation structure act as an obstacle to avalanche movement. However, the application of a larger stress amplitude allows the rearrangement of the structure, which is largely in the form of dislocation avalanches that can travel longer distances than the dislocation mean free path. Small uncorrelated dislocation movements are confined within the dislocation structures, between dense dislocation arrangements (cells, walls, etc.). Mild plasticity is therefore increasingly restricted as the mean free path decreases. The various tests carried out show that the loading path (at Rσ=0.1) has no influence on the dislocation structure formed, but that the dynamics of the dislocations adapt to the way the material is loaded. The loading ratio (Rσ=-1) has a major influence on the formation of dislocation structures, with the emergence of veins, matrices, persistent slip bands and dense cells, but also on the dynamics of dislocations, with a gradual evolution of mild plasticity during cycles and a reduction in the number of avalanches during the hardening of the material. Concerning the influence of crystallographic orientation, a larger number of activated slip systems limit the contribution of avalanches to plasticity., Pendant la déformation plastique des matériaux cristallins, une plasticité douce, faite de nombreux mouvements de dislocations non corrélés peut coexister avec une plasticité plus sauvage, sous la forme de mouvements collaboratifs : les avalanches de dislocations. La coexistence des deux plasticités dépend de la mise en place d’une structure de dislocations, celle-ci étant supposée entraver la propagation des avalanches. On se propose d’étudier la corrélation entre les évolutions microstructurales et les arrangements de dislocations sous chargement cyclique, d'une part, et la nature de la dynamique collective des dislocations, d'autre part, pour le cas de monocristaux de cuivre purs. Différents essais de fatigue à amplitude de contrainte imposée sont effectués pour étudier l’influence (i) du chemin de chargement, (ii) le rapport de chargement et (iii) l’orientation cristallographique sur les phénomènes de plasticité. La technique d’émission acoustique (EA) est utilisée pour étudier les deux types de plasticité. L’EA continue peut-être associée à la plasticité douce, tandis que l'EA discrète, présentant des signaux plus énergétiques que ceux émis en continu sont associés à la plasticité sauvage. Les microstructures de dislocations sont étudiées à l’aide des techniques EBSD (Electron Backscattered Diffraction, pour mesurer la désorientation cristalline) et ECCI (Electron Channeling Contrast Imaging, pour imager les dislocations au MEB) à la fin de chaque palier de fatigue. Le couplage EA-ECCI donne de précieuses informations quant à la dynamique des dislocations. Le suivi par ECCI, lors d’un essai de fatigue à Rσ=0,1 montre qu’une structure de dislocation n’est stable que pour le niveau de contrainte qui la vue naître. L’émergence d'une structure de dislocations constituent un obstacle aux mouvements des avalanches. Toutefois, l’application d’une amplitude de contrainte plus importante permet un réarrangement de la structure, celui-ci se faisant en grande partie sous la forme d’avalanches de dislocations pouvant se déplacer sur de plus longues distances que le libre parcours moyen. Les petits mouvements de dislocations non corrélés sont confinés à l'intérieur des structures de dislocations, entre les arrangements denses de dislocations (cellules, murs, etc.). La plasticité douce est en conséquence de plus en plus restreinte à mesure que le libre parcours moyen diminue. Le rapport de chargement (Rσ=-1) a une grande influence sur la formation des structures de dislocations, avec l’émergence de structures veines, matrices, bandes de glissement persistant et cellules denses, mais aussi sur la dynamique des dislocations, avec une évolution progressive de la plasticité douce au cours des cycles et une réduction du nombre d’avalanches pendant le durcissement du matériau. Concernant l’influence de l’orientation cristallographique, un nombre plus important de systèmes de glissement activés permet de limiter la contribution des avalanches à la plasticité.

Agars are red algal polysaccharides. These are composed of D-galactose with L-galactose alterned by glycosidic bond -1,4 and -1,3. These galactans harbor several modifications : sulfatations, methylations, pyruvylations. All these modifications hinder the agar degradation by marine bacteria. Zobellia galactanivorans is a marine flavobacterium able to degrade marine polysaccharides, including agars. The aims of this thesis are to identify and characterize the enzymatic tools of Z. galactanivorans to degrade the complex agar. The two subjects are a divergent -agarase (ZgAgaC) and sulfatases that act on agars. To perform this study on the agar specific enzymes, we have developed activity screens on a complex agar collection of substrates produced during the thesis. These screens have been used to show the divergent behaviour of ZgAgaC on complex agar compared to the other -agarases and -porphyranases of the family 16 (GH16). These screens were further used to identify the substrate of two sulfatases active on agar. To conclude, this work has allowed to develop different tools to identify new enzymatic activities and to have a better view of the agar catabolism of Z. galactanivorans.; Les agars sont des polysaccharides majeurs issus de la paroi des algues rouges. Ces polysaccharides sont composés par des résidus D- et L-galactose alternativement liés par des liaisons glycosidiques -1,4 et -1,3. Ces galactanes présentent de nombreuses modifications: sulfatations, méthylations, pyruvilation, branchement, etc.. Toutes ces modifications rendent complexe la dégradation de ces polysaccharides pour des bactéries marines hétérotrophes. Zobellia galactanivorans est une flavobactérie marine capable de dégrader de nombreux polysaccharides d’algues dont les agars. L’objectif de cette thèse était d’identifier et de caractériser les outils enzymatiques dont dispose cette bactérie pour dégrader les agars complexes. Les deux sujets d’étude de cette thèse sont une -agarase divergente (ZgAgaC) et des sulfatases actives sur des agars. Pour pouvoir réaliser cette étude portant sur des enzymes spécifiques des agars, nous avons mis au point des cribles d’activités sur une collection d’agars naturels qui a été préparée au cours de cette thèse. Ces cribles ont permis de mettre en évidence le comportement divergent de ZgAgaC sur des agars complexes, par rapport aux autres -agarases et -porphyranases de la famille 16 des glycosides hydrolases (GH16). Ils ont aussi permis d’identifier les agars complexes sur lesquels deux sulfatases différentes sont actives. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre au point différents outils permettant de mettre en évidence de nouvelles activités enzymatiques et aussi de mieux comprendre le catabolisme des agars chez Z. galactanivorans.

The nucleus is an organelle characteristic of eukaryotic cells and its mechanical properties play an essential role in the behavior of the cell, in particular its motility, polarity and survival. It is surrounded by an envelope comprising an inner membrane and an outer membrane, as well as a large number of proteins. These proteins are either anchored at the nuclear membrane, as emerin, or form a filament meshwork lining the inner nuclear membrane, as lamins. My thesis objectives were to understand molecular mechanisms deficient in two types of genetic diseases caused by mutations in inner nuclear envelope proteins: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, associated to mutations in emerin and A-type lamins, and progeroid syndromes caused by mutations in A-type lamins. First, we showed that the emerin protein self- assembles in vitro and in cells (Herrada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). I then studied the structure of emerin oligomers, determined the minimal protein fragment necessary for the formation of these oligomers, identify residues forming the structural core of these oligomers by solid- state NMR in collaboration with the group of Prof A. Lange (FMP Berlin). And described the impact of emerin mutations causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy on emerin self-assembly (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Then, I observed, mainly using solution-state NMR, that only the self-assembled form of emerin is able to interact with A-type lamin tail, and that mutants causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy and unable to self-assemble are also defective in A-type lamin binding. I also obtained preliminary data showing that phosphorylation of emerin by the Src kinase, observed after a mechanical stress in purified nuclei, regulates the interaction between self-assembled emerin and A-type lamins. Finally, I showed that the monomeric form of emerin is able to form a ternary complex with A-type lamin tail through the chromatin-associated protein Barrier-to- Autointegration Factor (BAF). After having measured the protein-protein affinities within this complex, identified the minimal protein fragments involved in the complex and developed a robust protocol for purification of this complex, I was able to obtain crystals under several conditions. Subsequently, I solved the 3D structure of this complex by molecular replacement at a resolution of 2 Å. Finally, I showed that mutations in A-type lamins causing autosomal recessive progeroid syndromes impair interaction with BAF in vitro, and our collaborators at Univ. Paris Diderot, the team of Dr B. Buendia, showed that these same mutations induce a significant decrease in the proximity between lamin A and BAF in HeLa cells. An article with me as a first author is in preparation that reports all these new data., Der Zellkern ist eine charakteristische Organelle einer eukaryotischen Zelle. Seine mechanischen Eigenschaften spielen eine wesentliche Rolle für das Verhalten der Zelle, insbesondere für deren Beweglichkeit, Polarität und Überleben. Es ist von einer Hülle umgeben, die eine innere Membran und eine äußere Membran sowie eine große Anzahl von Proteinen umfasst. Diese Proteine sind entweder an der Kernmembran verankert, als Emerin, oder bilden ein Filamentnetz, das die innere Kernmembran auskleidet, als Lamine. Ziel meiner Doktorarbeit war, molekulare Mechanismen zu verstehen, die bei zwei Arten genetischer Erkrankungen, die durch Mutationen in inneren Kernhüllproteinen verursacht werden, fehlen: Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie, assoziiert mit Mutationen in Emerin- und A-Laminen, und Progeroid-Syndrome durch Mutationen in A- Laminen ein. Zunächst zeigten wir, dass das Emerin-Protein in vitro und in Zellen selbstorganisiert ist (Herada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). Ich untersuchte dann die Struktur von Emerin-Oligomeren, bestimmte das minimale Proteinfragment, das für die Bildung dieser Oligomere notwendig ist, identifiziere Reste, die den strukturellen Kern dieser Oligomere bilden, durch Festkörper-NMR in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. A. Lange (FMP Berlin) und beschrieb den Einfluss von Emerin-Mutationen, die Emery-Dreifuss- Muskeldystrophie auf die emerierende Selbstorganisation verursachen (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Dann beobachtete ich, hauptsächlich unter Verwendung von Lösungs-NMR, dass nur die selbstorganisierte Form von Emerin in der Lage ist, mit dem A-Typ-Lamin- Schwanz zu interagieren, und dass Mutanten, die Emery-Dreifuss- Muskeldystrophie verursachen und nicht in der Lage sind, sich selbst zu assemblieren in A-Laminen. Ich erhielt auch vorläufige Daten, die zeigen, dass die Phosphorylierung von Emerin durch die Src-Kinase, die nach einer mechanischen Belastung in gereinigten Kernen beobachtet wird, die Wechselwirkung zwischen selbstorganisierten Emerin- und A-Typ-Laminen reguliert. Schließlich zeigte ich, dass die monomere Form von Emerin einen ternären Komplex mit dem A-Typ-Lamin-Tail durch das Chromatin-assoziierte Protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) bilden kann. Nachdem ich die Protein-Protein-Affinitäten in diesem Komplex gemessen, die minimalen Proteinfragmente identifiziert und ein robustes Protokoll für die Reinigung dieses Komplexes entwickelt hatte, konnte ich Kristalle unter verschiedenen Bedingungen erhalten. Anschließend löste ich die 3D-Struktur dieses Komplexes durch molekularen Ersatz mit einer Auflösung von 2 Å. Schließlich zeigte ich, dass Mutationen in A-Laminen, die autosomal-rezessive Progeroid-Syndrome verursachen, die Interaktion mit BAF in vitro beeinträchtigen, und unsere Mitarbeiter von Univ. Paris Diderot, das Team von Dr. B. Buendia, zeigte, dass diese gleichen Mutationen eine signifikante Abnahme der Nähe zwischen Lamin A und BAF in HeLa-Zellen induzieren. Ein Artikel mit mir als Erstautor ist in Vorbereitung, der all diese neuen Daten berichtet.

Neuronal and vascular systems require a complex network to properly perform their functions. The processes involved in creating this network rely on coordinated pathways, often activated through common protein/receptor systems, which lead to cytoskeletal remodelling. In general, neuronal and vascular cells respond to extracellular stimuli in the form of soluble secreted proteins, which interact with surface receptors to mediate attraction or repulsion towards the source of the secreted proteins. This process, called guidance, is regulated by seven families of receptors and their respective ligands, which influence each other and can act on the neuronal system, the vascular system or both.Structural information about the extracellular region of many of these receptors, and how signal is relayed across the membrane, is lacking.This study is focused around the extracellular domain of two single-pass transmembrane receptors of the Roundabout and UNC5 protein families that are majorly involved in angiogenesis: Robo4 and UNC5B.Based on the findings of this study, the Robo4 and UNC5B extracellular domains are extensively glycosylated with N-linked glycans of the complex type. Site-directed mutagenesis of the predicted Robo4 glycosylation sites disrupts protein expression, indicating that they are necessary for protein stability and passage through the glycosylation pathway might be necessary for correct folding. MALS and SAXS data show that in solution the Robo4 extracellular domain is a flexible monomer with extended shape. Several Fabs binding to the extracellular domain of Robo4 were characterised, with the expectation to identify those Fabs that could inhibit the reported Robo4/UNC5B interaction for further characterisation. Complex formation was verified by SEC-MALS and SAXS, and interaction constants were determined using SPR. Crystals of some Robo4 extracellular domain/Fab complexes were produced, although the structure of the complex could not be solved at the present time.Despite a study by another group showing otherwise, pull-down, SEC-MALS and SPR experiments show that the Robo4 and UNC5B extracellular domains do not interact with each other. It is proposed that the difference may be caused by different glycosylation patterns specific to the cell lines used for each study, or by an undetected third party necessary for interaction. This, however, still requires further study. SEC-MALS analysis showed that the UNC5B extracellular domain is a monomer in solution and its crystal structure was solved at 3.4 Å resolution. Comparison to the existing structures of human UNC5A and rat UNC5D shows striking similarities and a high degree of evolutionary conservation of the Ig domains might be indication of the importance of this region, which is responsible for binding to the guidance cue Netrin. Although the Netrin binding region is known to be within the Ig domains, the precise binding site has not yet been determined, but it might be located in proximity, or within, the negatively charged surfaces present on the Ig domains which are observed in the UNC5B structure.It is hoped that the work presented here will give the basis for better biochemical and structural characterisation of these two receptors., Les systèmes neuronaux et vasculaires nécessitent un réseau complexe pour exécuter correctement leurs fonctions. Les processus impliqués dans la création de ce réseau s'appuient sur des voies coordonnées, souvent activées par des systèmes protéine/récepteur communs, qui conduisent au remodelage du cytosquelette.En général, les cellules neuronales et vasculaires répondent aux stimuli extracellulaires sous forme de protéines solubles sécrétées, qui interagissent avec les récepteurs de surface pour favoriser l'attraction ou la répulsion vers la source des protéines sécrétées. Ce processus, appelé guidage, est régulé par sept familles de récepteurs et leurs ligands respectifs, qui s'influencent les uns sur les autres et peuvent agir sur le système neuronal, le système vasculaire ou les deux ensembles.Cette étude est centrée sur deux récepteurs transmembranaires à passage unique, les membres des familles de protéines Roundabout et UNC5 qui sont principalement impliquées dans l'angiogenèse: Robo4 et UNC5B.L'information structurelle sur la région extracellulaire de plusieurs de ces récepteurs, et comment le signal est relayé à travers la membrane, fait défaut.La déglycosylation enzymatique a confirmé que les domaines extracellulaires de Robo4 et UNC5B sont largement glycosylés avec des glycanes liés en azote du complexe type. La mutagenèse dirigée des sites de glycosylation prédits de Robo4 perturbe son expression, indiquant que ces résidus sont nécessaires pour la stabilité de la protéine et que leur glycosylation, ou leur passage dans la voie de glycosylation, pourrait être nécessaire pour un repliement correct. Les données MALS et SAXS montrent qu'en solution, Robo4 ecto est un monomère flexible de forme allongée. Les domaines ne présentent pas des caractéristiques distinctes dans le modèle construit à partir des données SAXS. Plusieurs Fabs se liant au domaine extracellulaire de Robo4 ont été caractérisés, avec l'espoir d'identifier les Fab qui pourraient inhiber l'interaction Robo4 / UNC5B rapportée pour une caractérisation plus poussée. La formation du complexe a été vérifiée par SEC-MALS et SAXS, et les constantes d'interaction ont été déterminées en utilisant SPR. Des cristaux de certains complexes domaine Fab / domaine extracellulaire Robo4 ont été produits, bien que la structure du complexe n'ait pas pu être résolue à l'heure actuelle.Les expériences de pull-down, SEC-MALS et SPR montrent que Robo4 ecto et UNC5B ecto n'interagissent pas entre elles, malgré une étude par un autre groupe montrant le contraire. Étant donné que différentes lignées cellulaires ont été utilisées, des modèles de glycosylation spécifiques, ou une tierce partie non détectée, pourraient être nécessaires pour l'interaction. En raison de leur implication avec les récepteurs extracellulaires, les héparanes sulfates sont un candidat probable, mais d'autres partenaires devraient être envisagés.La structure cristallographique de l'UNC5B ecto est similaire aux structures existantes de UNC5A et UNC5D. Le haut degré de conservation des domaines del’Ig pourrait être une indication de l'importance de cette région, qui est responsable de la liaison à Netrin. Bien que la région de liaison de Netrin soit connue pour être dans les domaines Ig, le site de liaison précis n'a pas encore été déterminé, mais il pourrait être situé à proximité ou à l'intérieur des surfaces chargées négativement présentes sur les domaines Ig observées dans la structure d’UNC5B.Le travail présenté ici devrait servir de base à une meilleure caractérisation biochimique et structurale des récepteurs extracellulaires Robo4 et UNC5B.

Spin crossover (SCO) compounds with a large hysteresis centered around room temperature (RT) are being constantly pursued although such behavior is very rare and most often noticed in coordination networks. In this context, a new molecular discrete compound, the complex [Fe(PM-PeA)2(NCSe)2], showing a large SCO hysteresis spanning RT has been synthesized in both singlecrystal and powder forms. Then, two research lines emerged. The first one concerns the multi-scales study of the structure-properties relationships, combining single-crystal and powder X-ray diffraction at variable temperature. A particular focus has been made on the microstructural scale, almostunexplored until now. For the first time, the coherent domain sizes and the micro-deformation rate has been quantified for a molecular discrete SCO compound. The second part of this work investigates in detail the pressure-induced SCO. The in situ single-crystal X-ray diffraction studies has been carried out to perform a complete characterization of the crystal structure under pressure. Thereafter, an accurate high-pressure X-ray diffraction measurement on the powder, with a synchrotron radiation,provides a fine track of the pressure-induced SCO and showed a piezo-hysteresis. Experiments coupling pressure and temperature brought crucial information pertaining to variation of bulk moduli withtemperature, the piezo-hysteresis width, the temperature dependence of the pressure transition and pressure-induced SCO abruptness, are provided in detail for the first time., Une large hystérèse centrée autour de la température ambiante constitue l'un des objectifs principaux de la recherche sur les matériaux commutables fonctionnels. Dans le domaine très étudié de la conversion de spin, un tel comportement apparaît très rarement. Un nouveau composé, le complexe [Fe(PM-PeA)2(NCSe)2] présentant une large hystérèse autour de la température ambiante a été synthétisé, sous forme de monocristal et de poudre. Ce composé a été la base de deux axes de recherche. Le premier concerne l’étude multi-échelles des relations structure-propriétés en combinant la diffraction des rayons X sur poudre et sur monocristal, à température variable. Un focus tout particulier a été fait sur l’échelle microstructurale, très peu explorée à ce jour. Pour la première fois,la taille des domaines cohérents et le taux de microdéformations, ont été quantifiés pour un composé moléculaire discret à conversion de spin. Le deuxième axe concerne l’investigation de la transition de spin induite par la pression. L’étude in situ par diffraction des rayons X sur monocristal a permis une caractérisation complète de la structure cristalline des deux états de spin, sous pression. Par la suite, un suivi fin de la transition de spin, révélant une piezo-hystérèse, a été fait grâce à la diffraction des rayons X sur poudre, sous pression in situ à l’aide du rayonnement synchrotron. Les expériences couplant pression et température ont donné accès à des informations cruciales, telles que la variation des modules d’élasticité avec la température, les effets de la température sur la pression de transition, le caractère coopératif de la transition et la largeur de la piezo-hystérèse.

The present work is concerned new metalloporphyrins complexes based on cadmium and vanadium metals. The first with the oxo vanadium (IV) complex of 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17, 18-octachloro-5, 10, 15, 20-tetrakis (4-tolylporphyrin) with the formula [V(Cl8TTP)O] (I), which was prepared by reacting the oxo [5, 10, 15, 20 tetrakis (4-tolylporphyrinato)] vanadium (IV) complex ([V(TTP)O]), under aerobic atmosphere, with a large excess of thionyl chloride (SOCl2). The title compound was characterized by UV-visible spectroscopy, cyclic voltammetry and X-ray crystal structure. The syntesis of new Cadmium (II) Metalloporphyrins in was also reported. These complexes were obtained by reacting 5,10,15,20-tetrakis[4-(chloro)phenyl]porphyrin cadmium(II) [Cd(TMPP)] and the following nitrogen ligands: 4,4'diaminophenylmethane (4,4'-mda), 2-aminopyridine (2NH2py), pipyrazine (pipyz) and morphine, the four newly formed cadmium(II) porphyrin complexes. The synthesized complexes were subsequently characterized by UV-visible, fluorescence, 1H NMR, IR and mass spectrometry (MALDI-TOF and ESI). A structural study by X-ray diffraction on a single crystal was described. In a second part of this thesis work, the synthesis of five new analogues of the peptide sequence TAT (37-53) (CFITKALGISYGRKKRR) was performed by the Ala-scan technique. These analogues are coupled to 5-(4-carboxyphenyl)-10,15,20- triphenylporphyrin porphyrin named P1-COOH in order to obtain new peptide-porphyrin compounds. These derivatives were purified by HPLC and characterized by mass spectrometry. A photophysical study was also conducted on these products, which indicates their efficacy for therapeutic applications . A photophysical study was also conducted on these products, which indicates their efficacy for PDT applications., Le présent travail concerne les nouveaux complexes métalloporphyrines basés sur les métaux cadmium et vanadium. Le premier avec le complexe oxo vanadium (IV) de 2, 3, 7, 8, 12, 13, 17, 18-octachloro-5, 10, 15, 20-tétrakis (4-tolylporphyrine) de formule [V(Cl8TTP)O] (I), qui a été préparé en faisant réagir le complexe oxo [5, 10, 15, 20 tétrakis (4-tolylporphyrinato)] vanadium (IV) ([V(TTP)O]), sous atmosphère aérobie, avec un grand excès de chlorure de thionyle (SOCl2). Le composé titre a été caractérisé par la spectroscopie UV-visible, la voltampérométrie cyclique et la structure cristalline aux rayons X. La synthèse de nouvelles métalloporphyrines de cadmium (II) dans a également été signalée. Ces complexes ont été obtenus en faisant réagir la 5,10,15,20-tétrakis[4-(chloro)phényl]porphyrine de cadmium(II) [Cd(TMPP)] et les ligands azotés suivants : 4,4'diaminophénylméthane (4,4'-mda), 2-aminopyridine (2NH2py), pipyrazine (pipyz) et morphine, les quatre complexes de cadmium(II) porphyrine nouvellement formés. Les complexes synthétisés ont ensuite été caractérisés par UV-visible, fluorescence, RMN 1H, IR et spectrométrie de masse (MALDI-TOF et ESI). Une étude structurale par diffraction des rayons X sur un seul cristal a été décrite. Dans une deuxième partie de ce travail de thèse, la synthèse de cinq nouveaux analogues de la séquence peptidique TAT (37-53) (CFITKALGISYGRKKRR) a été réalisée par la technique Ala-scan. Ces analogues sont couplés à la 5-(4-carboxyphényl)-10,15,20- triphénylporphyrine porphyrine nommée P1-COOH afin d'obtenir de nouveaux composés peptidiques-porphyrine. Ces dérivés ont été purifiés par HPLC et caractérisés par spectrométrie de masse. Une étude photophysique a également été menée sur ces produits, ce qui indique leur efficacité pour des applications thérapeutiques. Une étude photophysique a également été menée sur ces produits, ce qui indique leur efficacité pour les applications de PDT.

Apoptosis plays a protective role against the formation of tumor cells. This phenomenon can be regulated by the death receptor pathway, among which the Death Receptor 5 that can be activated by the TRAIL ligand (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), whose major interest is to induce tumor cell apoptosis, specifically. Our work focuses on peptidomimetic ligands of TRAIL: those 16 amino acid peptides exist as monomers or multimers and show affinity for DR5 protein as up to 5-fold the affinity of TRAIL. Functional assays have shown that not only those ligands induce in vitro apoptosis of tumor cells, but also show selectivity for cancer cells, and can reduce mice tumor volume in vivo. The purpose of this project is to characterize the mechanisms by which those ligands interact with DR5, by using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and X-Ray Crystallography. We have produced the recombinant extracellular domain of DR5 in fusion with the NusA protein, in order to increase the folding of the protein, and we have purified the receptor through a 4-step protocol. We assigned the backbone resonances of 89 % of the protein residues with NMR, and secondary structure calculations showed that DR5 adopts the same β strand folding in solution as from the DR5 crystal structures from the PDB (Protein Data Bank). NMR titrations of DR5 with monomeric and multimeric ligands have allowed us to identify the peptide-protein binding area within the first Cystein Rich Domain (CRD1) of the receptor, but also that the binding with oligomeric peptides lead to protein-protein interactions at the level of the CRD2, suggesting the dimerization of the receptor. This was confirmed par Size Exclusion Chromatography assays that showed an oligomerization of the receptor in the presence of dimeric and trimeric peptides. Ongoing crystallography assays are conducted in order to determine the 3D structure at the atomic level of oligomeric complexes with DR5. Our results show that peptidomimetic ligands of TRAIL display a different mechanism from TRAIL in the activation of apoptosis., L'apoptose joue un rôle de protection contre la formation de cellules tumorales. Ce phénomène peut être régulé par la voie extrinsèque qui consiste en partie en l'activation du récepteur de mort DR5 (Death Receptor 5) par le ligand TRAIL (Tumor necrosis factor-Related Apoptosis Induction Ligand), dont l'intérêt majeur est d'induire l’apoptose des cellules tumorales uniquement. Nous nous sommes intéressés à des ligands peptidomimétiques de TRAIL : ces peptides de 16 acides aminés existent sous formes monomériques ou multimériques, et présentent des affinités pour la protéine DR5 jusqu’à 5 fois supérieures à celle de TRAIL. Des études fonctionnelles ont montré que ces ligands induisent l’apoptose des cellules tumorales in vitro, et ce de manière spécifique. Ils agissent également in vivo par réduction du volume de tumeurs de souris. Le but de ce projet est de caractériser les mécanismes d’interaction de ces peptides avec le récepteur DR5, par Résonance Magnétique Nucléaire et Cristallographie aux Rayons X. Nous avons produit le domaine extracellulaire de DR5 par voie recombinante en fusion avec la protéine NusA pour un meilleur repliement des protéines cibles, et un protocole de 4 étapes de purification a permis d’isoler la protéine DR5. Nous avons attribué 89 % des résonances du squelette peptidique de DR5 par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), et le calcul de structure secondaire a montré que la protéine adoptait en solution le même repliement secondaire en brins β que celui des structures de DR5 déposées dans la PDB (Protein Data Bank). Les titrations par RMN de DR5 avec les ligands monomériques et multimériques ont permis non seulement d’identifier la région d’interaction peptide-protéine dans le premier domaine riche en cystéines (CRD1) du récepteur, mais aussi de montrer que la liaison avec les oligomères entraînait des contacts protéine-protéine au niveau du CRD2, suggérant une dimérisation du récepteur. Cette hypothèse a été confirmée par des études de chromatographie d’exclusion de taille, qui ont montré une oligomérisation du récepteur en présence des dimères et trimères. Des études par cristallographie sont en cours afin de déterminer la structure atomique des complexes oligomériques avec DR5. Nos résultats montrent que ces ligands adoptent un mécanisme différent de celui de TRAIL dans l’activation de l’apoptose.

During the cell life many endo or exogenous genotoxic agents lead to the formation of DNA double strand breaks (DSBs). These lesions are extremely toxic and must be repaired in order to maintain the integrity of the genome and the survival of the cell. In mammalian, most DSBs are repaired by the Non Homologous End Joining (NHEJ) pathway. The recognition step of NHEJ is mediated by the ring-shape Ku70-Ku80 (Ku) heterodimer that protects the DNA extremities from resection and can recruit several core NHEJ factors (DNA-PKcs, ligase complex Ligase4-XRCC4 and ligation co-factor XLF) as well as several accessory NHEJ factors (PAXX, APLF and WRN). Beyond its DNA ends binding activity, Ku appears more and more as the central coordinator of the NHEJ pathway. How do all the NHEJ factors interact with Ku and are involved in the repair of all DNA ends (clean or dirty, accidental or programmed) are questions not well elucidated. Our laboratory is interested in the recruitment of XLF and XRCC4 by Ku, either as individual factors or as filaments as the one we described previously1,2.During my thesis, I characterized the crystal structures between Ku70/Ku80/DNA and peptides containing the Ku Binding Motif (KBM) of two NHEJ factors, XLF and APLF (the Aprataxin like-factor nuclease). The KBM of APLF binds to Ku with a tight affinity (Kd of 33nM) and it interacts within a conserved pocket of Ku80. The KBM of APLF is located in a position remote from the DNA binding site, at the periphery of the Ku ring. The crystal structure rationalizes the role of the conserved basic and hydrophobic parts of the APLF KBM motif. The KBM of XLF has a moderate affinity (Kd of 4 µM) and a sequence with a similar basic and hydrophobic parts. Interestingly, the crystal structure of a Ku70/Ku80/ADN complex with a XLF KBM shows that this motif occupies a different site from the KBM of APLF. The XLF motif induces a large conformational change of Ku80 and occupies a cleft that does not exist in the original Ku70/Ku80/DNA complex.I then characterized two mutants of XLF in the KBM motif, (L297E and L297W) that respectively disrupt the binding of the KBM with Ku or redirect the XLF KBM to the APLF site.All together those results help us to better understand the coordination of several NHEJ factors by Ku. This support our idea that Ku acts as a coordinator of the NHEJ pathway.; Au cours du cycle cellulaire, de nombreux agents génotoxiques conduisent à la formation de cassures double brins (CDB) de d’ADN. Ces lésions extrêmement dangereuses doivent être réparées afin de ne pas altérer l’intégrité du génome et la survie cellulaire. Chez les mammifères, la plupart de ces CDB sont prise en charge par la voie de réparation NHEJ (pour Non Homologous End Joining, recombinaison non homologue en français). La première étape de cette voie, la reconnaissance des extrémités d’ADN, est assurée par l’hétérodimère Ku70-Ku80. Ce complexe protège les extrémités d’ADN des activités de résection et recrute les facteurs impliqués dans la poursuite de la voie de réparation (la DNA-PKcs, XLF et le complexe de ligation XRCC4-LigIV) ainsi que des facteurs accessoires (PAXX, WRN et APLF). De cette observation, une vision plus générale de la fonction de Ku a émergé, une fonction de coordination de la voie NHEJ. La manière dont Ku interagit avec tous les facteurs du NHEJ, pour la réparation de toutes les CDB (propres ou non, accidentelles ou programmées) reste une question ouverte. Notre équipe travaillait précédemment sur l’étude des facteurs XRCC4 et XLF, dont ils ont pu mettre en évidence l’association en filaments dans un cristal.Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé les structures cristallines de complexes comprenant Ku70-Ku80, un ADN et des peptides portant un motif de liaison à Ku (KBM) issus des protéines APLF et XLF. Le motif KBM de APLF se fixe de manière très forte à Ku (avec une affinité de 33 nM) et interagit avec une surface conservée sur Ku80. Cette interaction se déroule loin du site de fixation de Ku à l’ADN, à la périphérie du complexe. La connaissance des détails moléculaires de cette interaction a permis de comprendre et de rationnaliser la présence de résidus très conservés à la surface de Ku80 et dans la séquence d’APLF.Le motif KBM présent chez XLF, présentent une affinité plus modérée (un Kd de quelques μM) malgré une similarité de séquence importante avec le KBM de APLF (une région basique suivi d’une région hydrophobe). La structure du complexe Ku70-Ku80-ADN et du KBM de XLF montre que ce peptide se fixe sur un site différent de celui d’APLF. En effet ce peptide induit un large changement de conformation de Ku80 et vient se loger dans le sillon ainsi découvert. Par la suite, j’ai caractérisé deux mutants du KBM de XLF (L297E et L297W) qui respectivement abroge et renforce l’interaction de ce motif KBM avec Ku.Ensemble ces résultats confortent notre idée que Ku joue le rôle de chef d’orchestre de la voie de réparation NHEJ chez l’humain.