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Cry3 aus Arabidopsis thaliana ist eines der ersten identifizierten DASH Cryptochrome (Kleine et al., 2003). Trotzdem war die biologische Funktion von cry3 bisher weitgehend unbekannt und die Frage, ob es sich um einen Photorezeptor handelt, offen. Die meisten verfügbaren Daten basieren auf heterolog exprimiertem cry3. Die immunologische Präzipitation von in planta exprimiertem cry3-GFP ermöglichte es, die Cofaktoren fluorimetrisch zu charakterisieren und als MTHF und FAD zu bestätigen. Somit scheint das in E. coli exprimierte und mit His-tag fusionierte cry3 ein valider Stellvertreter für das in der Pflanze synthetisierte Protein zu sein und die gewonnenen in vitro Daten auf die Situation in planta übertragbar. Um weitere Anhaltspunkte über die biologische Funktion zu erhalten, wurde die Expression und Lokalisation von cry3 untersucht. Die relative Transkriptmenge von CRY3 wird durch alle getesteten Lichtqualitäten transient erhöht, mit einem Maximum etwa zwei Stunden nach Einsetzen der Belichtung. An der Regulation der Transkriptmenge von CRY3 ist neben cry1, cry2 und UVR8 besonders phyA maßgeblich beteiligt, auch unter Rotlicht. Untersuchungen einer cry3-Deletions-Mutante ergaben einen geringen aber reproduzierbaren Einfluss auf die Inhibierung der Hypokotylelongation während der Deetiolierung von Keimlingen. Die Keimlinge der cry3-Mutante reagierten dabei schwächer auf Blaulicht. Eine Komplementation der Mutante scheiterte zwar, doch auch das Chloroplastenproteom der cry3-Mutante zeigte in einer 2D-DIGE Analyse Unterschiede zum Wildtyp. Western Blots konnten dieses Ergebnis untermauern, wenn auch der Unterschied zwischen Wildtyp und cry3 Mutante nur in Chloroplastenextrakten und nicht in Gesamtextrakten ersichtlich war. Zusammengenommen sprechen die Phänotypen der cry3-Mutante für eine Funktion von cry3 als Photorezeptor. Während zunächst angenommen wurde, dass cry3 hauptsächlich in Chlorpolasten und Mitochondrien vorkommt, konnte cry3-GFP hier auch im Zellkern (und dabei speziell dem Nukleolus) gefunden werden und liegt somit in allen DNA enthaltenden Kompartimenten vor. Dies ist besonders interessant da cry3 in vitro einzelsträngige DNA und RNA binden kann (Pokorny et al., 2008). In Chloroplasten konnte cry3 hauptsächlich als lösliches Protein im Stroma gefunden werden. Das Elutionsverhalten in einer SEC deutet zudem darauf hin, dass cry3 an einen großen, löslichen Komplex assoziiert ist. Eine genaue Identifizierung dieses Komplexes steht aus. Über eine CoIP mit Chloroplastenextrakten wurde versucht, mögliche Interaktionspartner von cry3-HA und cry3-GFP zu finden. Die massenspektrometrische Analyse der Eluate führte jedoch zu keinen eindeutigen Befunden. In einem Y2H library screen wurde eine cDNA-Bibliothek überprüft und zwei spezifische Interaktionspartner gefunden. Bei den Kandidaten handelt es sich um NUP205, ein Kernporenprotein und DPE2, ein cytosolisches Protein des Stärkemetabolismus. Weitere Untersuchungen müssen die Y2H Daten verifizieren und zeigen in wieweit diese Protein an einer biologischen Funktion von cry3 beteiligt sind., Cry3 from Arabidopsis thaliana is one of the first identified DASH type cryptochromes (Kleine et al., 2003). However, the biological function of cry3 remained elusive and the question whether cry3 could act as a photoreceptor was unanswered. The majority of available data on cry3 were obtained with heterologously expressed cry3. The effective immune-precipitation of in planta expressed cry3-GFP enabled the fluorimetric characterisation of the bound cofactors as FAD and MTHF, and confirmed the data of recombinant E. coli expressed cry3 (Pokorny et al., 2005; Moldt et al., 2009). Thus the E. coli expressed and HIS-tagged cry3 seems to be a valid surrogate of cry3 expressed in planta. To get further insight into the biological function of cry3, its expression and localisation was examined. The relative transcript level of CRY3 was transiently induced by all tested light qualities with a maximum two hours after the onset of light. The transcript level of CRY3 was regulated by cry1, cry2, UVR8 and phyA. Even under red light phyA was the prominent regulator of cry3 expression. Analysing the cry3 deletion mutant revealed a slight but reproducible effect on inhibition of hypocotyl elongation during deetiolation of Arabidopsis seedlings. The cry3 mutant seedlings showed a weaker response to blue light. Though a complementation of this phenotype failed, the chloroplast proteome was altered in a 2D DIGE analysis comparing the cry3 deletion mutant with the wild type. This result was substantiated by Western blot analyses, even though the differences were only observed in chloroplast extracts but not in whole cell extracts. Thus, in summary the obtained results are in line with a function of cry3 as photoreceptor. While cry3 localisation was believed to be restricted to chloroplast and mitochondria, this study showed that cry3-GFP is also present in the nucleus and especially enriched in the nucleolus. Thus, cry3 is present in all DNA containing cell compartments. This is of special interest due to the ability of cry3 to bind single stranded DNA and RNA, as shown in in vitro studies (Pokorny et al., 2008). In chloroplasts, cry3 was found to be a soluble stroma protein and SEC data indicated an association with a large, soluble complex. However, the identification of cry3 interaction partners using CoIP and subsequent mass spectrometry of the eluates failed to detect a specific candidate. Whereas CoIPs were only used to search for interacting chloroplast proteins, in lines expressing cry3-HA and cry3-GFP, a Y2H library screen was performed with a complete cDNA library including proteins of all cellular compartments. Two specific interaction partners were found: NUP205, a nuclear pore protein and DPE2, a cytosolic protein acting in starch metabolism. Further analyses have to verify the Y2H interactions and show the biological relevance of these findings if any.

Die Familie der Cryptochrome und Photolyasen (CPF) ist eine große Proteinfamilie von Blaulicht Photorezeptoren, welche in allen Bereichen des Lebens vertreten sind. Alle Vertreter dieser Familie verwenden einen Flavinchromophor als katalytischen Kofaktor und zeigen hohe Sequenz- und Strukturähnlichkeiten, obwohl sich ihre Funktionen in lebenden Organismen stark unterscheiden. Einerseits verwenden Photolyasen die Energie des Sonnenlichts zur Reparatur von UV-induzierten DNA Schäden wie dem Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (CPD) Schaden oder dem Pyrimidin-(6-4)-Pyrimidon Photoprodukt ((6 4)PP). Cryptochrome sind andererseits involviert in verschiedenen Blaulicht-regulierten Mechanismen, wie zum Beispiel die photoperiodischen Blühzeiten in Pflanzen oder die Regulierung des circadianen Rhythmus in Tieren. Diese Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Photoreduktion sowie des (6 4) Reparaturmechanismus einer Untergruppe von tierischen Cryptochromen und (6 4) Photolyasen anhand des animal-like Cryptochromes aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY). Durch multiple Sequenzvergleiche mit anderen CPFs und Mutationsstudien konnten die spezifischen und für die Photoreduktion relevanten Aminosäure-Reste identifiziert werden. Dies führte zur Entdeckung eines Tyrosins als vierten Elektronendonor am Ende der konservierten Tryptophantriade. Die Photoreduktion wurde weiterhin mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht mit besonderem Augenmerk auf der Entstehung und den Abbau des Tyrosylradikals. Wie gezeigte wurde, handelt es sich bei CraCRY nicht nur um ein Cryptochrom, sondern es zeigt darüber hinaus (6-4)-Photolyase Aktivität, was es zu einem bifunktionellen Mitglied der CPF macht. Um die Beziehung zwischen Struktur und Funktion zu untersuchen, habe ich die 3D-Struktur von CraCRY im Komplex mit seinen Chromophoren sowie einem (6-4)PP per Röntgenstrukturanalyse entschlüsselt. Dabei zeigte sich ein neuer Modus für die DNA Bindung sowie ein detaillierter Einblick in die aktive Tasche. Ein essentieller Rest für die DNA Reparatur (His1) wies eine veränderte Konformation im Vergleich zu dem bisher veröffentlichen Model auf. Dies könnte auf einen alternativen Reparaturprozess für (6-4)PP hindeuten. Die wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Struktur von Cryptochromen basieren vor allem auf dem Vergleich zu Photolyasen, jedoch besitzen Cryptochrome einen elongierten C-Terminus (CTE), welcher den Photolyasen fehlt. Dieser CTE ist in CraCRY ca. 100 Aminosäuren lang und nicht in der Kristallstruktur enthalten. Um den CTE weiter zu analysieren wurde Wasserstoff-Deuterium-Austausch gekoppelt mit Massenspektrometrie durchgeführt und die unterschiedlichen Reduktionszustände miteinander verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse decken zwar den CTE nicht vollständig ab, jedoch konnten klare Unterschiede zwischen den Reduktionszuständen festgestellt werden. Daraus können wir schließen, dass es durch die Bildung des Tyrosylradikals bei der Photoreduktion zur Umstrukturierung im Bereich der Tyr-Schleife sowie der C-terminalen α22-Helix kommt. Um die intramolekularen strukturellen Veränderungen durch die Photoreduktion und DNA-Reparatur weiter zu untersuchen, wurde zeitaufgelöste Röntgenstrukturanalyse am freien Elektronenlaser SACLA mit einer Klasse II CPD Photolyase (MmCPDII) und CraCRY durchgeführt. Dadurch war es möglich geworden die verschiedenen Konformationen des MmCPDII Flavinchromophors in seinen unterschiedlichen Oxidationszuständen zu zeigen. Diese Arbeiten legen den Grundstein dafür, dass der komplette Reparaturmechanismus der CPD sowie (6-4) Schäden durch zeitaufgelöste SFX aufgelöst werden kann., The cryptochrome/photolyase family (CPF) is a huge protein family of blue-light photoreceptors, which occur in all kingdoms of life. All members of this family utilize a flavin chromophore as catalytic cofactor and show high sequence and structural similarity, although they have different functions inside the living organism. Photolyases use the energy of light to repair UV-light induced DNA lesions like the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) or the pyrimidine-(6-4)-pyrimidone photoproduct ((6-4)PP). Cryptochromes, on the other hand, are involved in many different blue-light regulated mechanisms, like the photoperiodic flowering in plants and the entrainment of the circadian rhythm in animals. This study focuses on the characterization of the photoreduction and (6-4) repair mechanism of the subclass of animal cryptochromes and (6-4) photolyases on the basis of the animal-like cryptochrome from the green algae Chlamydomonas reinhardtii (CraCRY). Through multiple sequence alignment with other CPFs and mutational studies, the specific residues involved in the photoreduction mechanism were successfully identified, leading to the discovery of a tyrosine as distal electron donor at the end of the conserved tryptophan triad. The photoreduction, with regard to the formation and decay of a tyrosyl radical, was extensively studied with several spectroscopic methods. All analyses resulted in the observation of an unusually long-lived tyrosyl radical upon photoreduction. As it turned out, CraCRY is not only a cryptochrome, but also has (6-4) photolyase function, which makes it a bifunctional member of this group. To study structure-function relationships, the 3D structure of CraCRY in complex with its chromophores as well as a (6-4)PP was solved by X-ray crystallography. The structure reveals a new binding mode of the DNA lesion and provides insight into the active site. One of the essential residues for DNA repair (His1) exhibits a different conformation as in the common model, which may indicate an alternative mechanism for (6-4)PP repair. The main knowledge about cryptochrome structures derived from the comparison with photolyases, but cryptochromes contain a highly variable C-terminal extension (CTE), which is missing in photolyases. In CraCRY this CTE is about 100 amino acids long and not shown in the solved crystal structure. For analysis of the CTE, hydrogen-deuterium-exchange coupled with mass spectrometry was used including a comparison of different reduction. Although, the coverage of the CTE was incomplete, there were significant changes between the oxidized and fully reduced state FADH− detectable. It was concluded, that the photoreduction process and the formation of the tyrosyl radical is triggering a structural change in the region between the loop carrying the tyrosyl radical and the C-terminal α22-helix. For further investigation of the intramolecular changes upon photoreduction and DNA repair, time-resolved crystal measurements of a class II CPD photolyase (MmCPDII) and CraCRY were performed within a joint project at the free electron laser SACLA. So far, the different conformations of the flavin cofactor of MmCPDII in its different oxidation states have been successfully derived. In future, it is expected to show the whole repair mechanism for the CPD lesion as well as for the (6 4)PP by time-resolved SFX.

Photolyasen reparieren UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPD) oder (6-4)-Photoprodukte in der DNA durch den lichtabhängigen Prozess der Photoreaktivierung. Sie sind nah verwandt mit den Cryptochromen, die als Blaulicht-Photorezeptoren regulatorische Funktionen ausüben. Mitglieder der Cryptochrom/Photolyase-Familie (CPF) sind in allen Domänen des Lebens vertreten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Cryptochrom CryB aus Rhodobacter sphaeroides aus der Untergruppe der FeS-BCP neben seiner regulatorischen Funktion auch eine Reparaturaktivität zur Spaltung von (6-4)-Photoprodukten besitzt. Damit kann CryB den dual-function-Mitgliedern der CPF zugeordnet werden. Durch den Austausch von Aminosäuren konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der drei Cofaktoren von CryB bei der Photoreaktivierung gewonnen werden. Der Fokus lag dabei auf in vivo Untersuchungen der CryB-Varianten im Knockout-Stamm R. sphaeroides ΔcryB. Es wurde festgestellt, dass der Elektronentransferweg über die Tryptophan-Diade, die essenziell für die in vitro Reduktion des FAD und die Reparaturfunktion von CryB ist, für die in vivo Photoreaktivierung verzichtbar ist. Der in der CPF neuartige Antennenchromophor 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ) ist bei geringen Lichtintensitäten von Bedeutung für eine effiziente Reparatur. Die Entfernung oder Beeinträchtigung einer der lichtabsorbierenden Cofaktoren, FAD oder DLZ, bewirkte keinen Funktionsverlust, jedoch eine stark verringerte Effizienz der Photoreaktivierung. Die Beeinträchtigung beider Cofaktoren zusammen durch Mutagenese verringerte die CryB-abhängige Photoreaktivierungsfähigkeit auf das Level von ΔcryB. Ein Eisen-Schwefel-Cluster kommt als Cofaktor von Photolyasen und Cryptochromen nur in der FeS-BCP-Untergruppe vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Cluster für die strukturelle Integrität des Proteins unverzichtbar ist. Seine Funktion bei der DNA-Reparatur oder bei regulatorischen Prozessen ist nicht abschließend geklärt, dies bedarf weiterer Untersuchungen. Die Kultivierung verschiedener cryB-Knockoutstämme in An- und Abwesenheit von Antibiotika hat ergeben, dass Kanamycin einen deutlich stärkeren Einfluss auf den kanamycinresistenten Stamm ∆cryB hat, als dies bei anderen kanamycinresistenten Stämmen der Fall ist. Der Stamm zeigt vermutlich aufgrund einer eingeschränkten Expression seines Resistenzgens eine erhöhte Sensitivität gegenüber Kanamycin. Ein zuvor unter mikroaeroben Bedingungen beobachteter Phänotyp ist somit wahrscheinlich auf einen durch Kanamycin beeinflussten Effekt zurückzuführen. CryB interagiert mit dem Photorezeptor AppA. Durch Interaktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Proteine wahrscheinlich an ihren jeweiligen C-Termini miteinander interagieren. Eine Co-Kristallisation war bislang nicht erfolgreich; weitere Versuche können in Zukunft Aufschluss über Details der Interaktion geben. Photolyases repair UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) or (6-4) photoproducts in DNA through the light-dependent process of photoreactivation. They are closely related to the cryptochrome blue light photoreceptors, which carry out regulatory functions. Members of the cryptochrome/photolyase family (CPF) are present in all domains of life. This study demonstrates that Rhodobacter sphaeroides cryptochrome CryB, belonging to the sub-group of FeS-BCP, exhibits a repair activity allowing cleavage of (6-4) photoproducts in addition to its regulatory function. Thus, CryB can be assigned to the dual function members of the CPF. Through amino acid exchanges, new insights about the role of the three cofactors of CryB in photoreactivation were obtained. The focus of this work was on in vivo investigations of the CryB variants in the knockout strain R. sphaeroides ΔcryB. It was found that the electron transfer pathway via a tryptophane diad, which is crucial for in vitro reduction of FAD and the repair function of CryB, is not required for in vivo photoreactivation. The novel antenna chromophore of the CPF, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ), is of importance for an efficient repair at low light intensities. Removal or impairment of one of the two light-absorbing cofactors, FAD or DLZ, did not cause a loss of function, but strongly affected the efficiency of photoreactivation. The impairment of both cofactors together through mutagenesis decreased CryB-dependent photoreactivation to the level of ΔcryB. The occurence of an iron-sulfur cluster as a cofactor of photolyases and cryptochromes is restricted to the FeS-BCP sub-group. It could be shown that the cluster is indispensable for the structural integrity of the protein. Its function in DNA repair or in regulatory processes has not yet been conclusively settled, this requires further investigations. The cultivation of different knockout strains of CryB in presence or absence of antibiotics has shown that kanamycin has a much stronger influence on the kanamycin-resistant strain ΔcryB than on other strains resistant to kanamycin. This strain shows an increased sensitivity towards kanamycin, probably due to a decreased expression of its resistance gene. A phenotype previously observed under microaerobic conditions thus probably results from a kanamycin-induced effect. CryB interacts with the photoreceptor AppA. Interaction analyses could show that both proteins probably interact at their respective C-termini. A co-crystallisation has not been successful, but further attempts may give information about details of their interaction in the future.

Photolyasen reparieren UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPD) oder (6-4)-Photoprodukte in der DNA durch den lichtabhängigen Prozess der Photoreaktivierung. Sie sind nah verwandt mit den Cryptochromen, die als Blaulicht-Photorezeptoren regulatorische Funktionen ausüben. Mitglieder der Cryptochrom/Photolyase-Familie (CPF) sind in allen Domänen des Lebens vertreten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Cryptochrom CryB aus Rhodobacter sphaeroides aus der Untergruppe der FeS-BCP neben seiner regulatorischen Funktion auch eine Reparaturaktivität zur Spaltung von (6-4)-Photoprodukten besitzt. Damit kann CryB den dual-function-Mitgliedern der CPF zugeordnet werden.Durch den Austausch von Aminosäuren konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der drei Cofaktoren von CryB bei der Photoreaktivierung gewonnen werden. Der Fokus lag dabei auf in vivo Untersuchungen der CryB-Varianten im Knockout-Stamm R. sphaeroides & Delta;cryB. Es wurde festgestellt, dass der Elektronentransferweg über die Tryptophan-Diade, die essenziell für die in vitro Reduktion des FAD und die Reparaturfunktion von CryB ist, für die in vivo Photoreaktivierung verzichtbar ist. Der in der CPF neuartige Antennenchromophor 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ) ist bei geringen Lichtintensitäten von Bedeutung für eine effiziente Reparatur. Die Entfernung oder Beeinträchtigung einer der lichtabsorbierenden Cofaktoren, FAD oder DLZ, bewirkte keinen Funktionsverlust, jedoch eine stark verringerte Effizienz der Photoreaktivierung. Die Beeinträchtigung beider Cofaktoren zusammen durch Mutagenese verringerte die CryB-abhängige Photoreaktivierungsfähigkeit auf das Level von & Delta;cryB.Ein Eisen-Schwefel-Cluster kommt als Cofaktor von Photolyasen und Cryptochromen nur in der FeS-BCP-Untergruppe vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Cluster für die strukturelle Integrität des Proteins unverzichtbar ist. Seine Funktion bei der DNA-Reparatur oder bei regulatorischen Prozessen ist nicht abschließend geklärt, dies bedarf weiterer Untersuchungen.Die Kultivierung verschiedener cryB-Knockoutstämme in An- und Abwesenheit von Antibiotika hat ergeben, dass Kanamycin einen deutlich stärkeren Einfluss auf den kanamycinresistenten Stamm & #8710;cryB hat, als dies bei anderen kanamycinresistenten Stämmen der Fall ist. Der Stamm zeigt vermutlich aufgrund einer eingeschränkten Expression seines Resistenzgens eine erhöhte Sensitivität gegenüber Kanamycin. Ein zuvor unter mikroaeroben Bedingungen beobachteter Phänotyp ist somit wahrscheinlich auf einen durch Kanamycin beeinflussten Effekt zurückzuführen.CryB interagiert mit dem Photorezeptor AppA. Durch Interaktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Proteine wahrscheinlich an ihren jeweiligen C-Termini miteinander interagieren. Eine Co-Kristallisation war bislang nicht erfolgreich; weitere Versuche können in Zukunft Aufschluss über Details der Interaktion geben., Photolyases repair UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) or (6-4) photoproducts in DNA through the light-dependent process of photoreactivation. They are closely related to the cryptochrome blue light photoreceptors, which carry out regulatory functions. Members of the cryptochrome/photolyase family (CPF) are present in all domains of life. This study demonstrates that Rhodobacter sphaeroides cryptochrome CryB, belonging to the sub-group of FeS-BCP, exhibits a repair activity allowing cleavage of (6-4) photoproducts in addition to its regulatory function. Thus, CryB can be assigned to the dual function members of the CPF.Through amino acid exchanges, new insights about the role of the three cofactors of CryB in photoreactivation were obtained. The focus of this work was on in vivo investigations of the CryB variants in the knockout strain R. sphaeroides & Delta;cryB. It was found that the electron transfer pathway via a tryptophane diad, which is crucial for in vitro reduction of FAD and the repair function of CryB, is not required for in vivo photoreactivation. The novel antenna chromophore of the CPF, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ), is of importance for an efficient repair at low light intensities. Removal or impairment of one of the two light-absorbing cofactors, FAD or DLZ, did not cause a loss of function, but strongly affected the efficiency of photoreactivation. The impairment of both cofactors together through mutagenesis decreased CryB-dependent photoreactivation to the level of & Delta;cryB.The occurence of an iron-sulfur cluster as a cofactor of photolyases and cryptochromes is restricted to the FeS-BCP sub-group. It could be shown that the cluster is indispensable for the structural integrity of the protein. Its function in DNA repair or in regulatory processes has not yet been conclusively settled, this requires further investigations.The cultivation of different knockout strains of CryB in presence or absence of antibiotics has shown that kanamycin has a much stronger influence on the kanamycin-resistant strain & #916;cryB than on other strains resistant to kanamycin. This strain shows an increased sensitivity towards kanamycin, probably due to a decreased expression of its resistance gene. A phenotype previously observed under microaerobic conditions thus probably results from a kanamycin-induced effect.CryB interacts with the photoreceptor AppA. Interaction analyses could show that both proteins probably interact at their respective C-termini. A co-crystallisation has not been successful, but further attempts may give information about details of their interaction in the future.

Ausgangspunkt für die Detektion von Licht ist im gesamten Tierreich die Absorption von Photonen durch photorezeptive Proteine, die sogenannten Opsine und in geringerem Ausmaß die Typ 1 Cryptochrome. Die Taufliege Drosophila melanogaster besitzt sechs eingehend charakterisierte, auch als Rhodopsine bezeichnete Opsine (Rh1-Rh6) und ein Cryptochrom (CRY). Neben den Ocellen und den Hofbauer-Buchner Äuglein werden die Rhodopsine in erster Linie in den Photorezeptorzellen der Komplexaugen, den Hauptorganen der Lichtperzeption exprimiert, wo sie der Vermittlung der visuellen Wahrnehmung dienen. Basierend auf Sequenzvergleichen wurde im Jahr 2000 ein neues Protein namens Rh7 zur Gruppe der Drosophila Opsine hinzugefügt. Bis heute fehlt allerdings jeglicher experimentelle Beleg für die photorezeptive Funktion dieses Proteins. Im Gegensatz dazu wird Cryptochrom in erster Linie in einigen Uhrneuronen des Drosophila Gehirns exprimiert, wo es diesen Neuronen die Fähigkeit zur Lichtdetektion verleiht und das Photoentrainment der inneren Uhr lenkt. Neueren Untersuchungen zu folge spielt CRY allerdings auch bei der visuellen Wahrnehmung der Augen eine Rolle. Die vorliegende Arbeit zielte nun darauf ab die potentielle Funktion von Rh7 als neuen Photorezeptor in Drosophila sowie die Rolle von CRY bei der visuellen Lichtperzeption zu untersuchen. Die Aufnahmen der Elektroretinogramme (ERGs) von transgenen Fliegen, die Rh7 anstelle von oder zusammen mit dem dominanten Photorezeptor Rh1 in den Komplexaugen exprimieren, zeigen, dass Rh7 die Phototransduktionskaskade bei Belichtung mit Weißlicht nicht aktivieren kann. Die Abwesenheit von Rh7 sorgt allerdings trotzdem für eine Beeinträchtigung der lichtinduzierten Antwort der Rezeptorzellen im Komplexauge. So zeigen die Intensitäts-Response Kurven der ERG Rezeptorpotentialamplitude von rh7 Knockout-Fliegen unter Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität nach einer anfänglichen Dunkeladaptation von 15min eine insgesamt, im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Rezeptorpotentialamplitude. Der Verlauf dieser Kurven deutet außerdem darauf hin, dass die Zunahme der Rezeptorpotentialamplitude mit steigender Lichtintensität größer wird. Zudem zeigt das Aktionsspektrum für die Rezeptorpotentialamplitude der rh7 Knockout-Fliegen, dass diese Empfindlichkeitszunahme im gesamten Bereich von 370-648nm auftritt. Diese Beeinträchtigung scheint jedoch zu fehlen, wenn die Fliegen vor Experimentbeginn nur 1min dunkeladaptiert wurden, oder wenn intensives Blaulicht zur Belichtung verwendet wird. Des weiteren ist auch das 4s nach Ende des Lichtpulses im ERG gemessene Nachpotential bei fehlendem Rh7 reduziert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rh7, wenn auch nicht als Photorezeptor, bei Belichtung mit Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität die Lichtantwort in den Rezeptorzellen des Komplexauges in Abhängigkeit von Intensität und Adaptationszustand beeinflusst und dass dieser Einfluss scheinbar nicht durch Licht eines eng begrenzten Wellenlängenbereichs induziert wird. Des weiteren legt die Untersuchung des ERG Nachpotentials nahe, dass Rh7 möglicherweise für eine normale Beendigung der Lichtantwort benötigt wird. Die allgemeine Funktion von Rh7 als Photorezeptor in Drosophila sowie die Eigenschaften der endogenen Funktion von Rh7 werden diskutiert. Unabhängig davon wird in der vorliegenden Arbeit auch gezeigt, dass Fliegen ohne CRY zwar nach 15-minütiger, nicht jedoch nach 1-minütiger Dunkeladaptation bei Belichtung mit Weißlicht niedriger Intensität eine insgesamt geringere ERG Rezeptorpotentialamplitude aufweisen. Dies könnte auf eine Beeinträchtigung der Dunkeladaptationsprozesse bei Abwesenheit von CRY hindeuten., Throughout the animal kingdom light detection is based on the absorption of photons by photoreceptive proteins, the so called opsins and to a minor degree the type 1 cryptochromes. The fruit fly Drosophila melanogaster possesses six well characterized opsins, also referred to as rhodopsins (Rh1-Rh6) and one cryptochrome (CRY). Besides the ocelli and the Hofbauer-Buchner eyelet, the rhodopsins are predominantly expressed in the photoreceptor cells of the compound eye, the major light receptive organ of the fly, where they mediate visual perception. Based on sequence comparisons a new protein, called Rh7, was added to the group of Drosophila opsins in the year 2000. But to date there is no experimental evidence for the photoreceptive function of this protein. By contrast cryptochrome is predominantly expressed in some clock neurons of the Drosophila brain, where it confers light sensitivity to these neurons and guides the photoentrainment of the endogenous clock. But recent publications also envisage a role for CRY in visual perception. The present thesis now aimed to investigate the putative function of Rh7 as a new photoreceptor in Drosophila as well as the role of CRY in visual perception. Recordings of the electroretinogram (ERG) of transgenic flies, that express Rh7 instead of or together with the major photoreceptor Rh1 in the compound eye, show that Rh7 can not activate the phototransduction cascade under white-light. Nevertheless, the absence of Rh7 impairs the light induced response of the receptor cells in the compound eye. Thus, the irradiance-response curves for the ERG receptor potential of rh7 knockout-flies show an overall increased amplitude of the receptor potential compared to controls upon illumination with white-light in the low- and mid-intensity range and after an initial dark adaptation of 15min. The curve shape also indicates that the gain in amplitude gets bigger with increasing light intensity. In addition the action spectrum for the receptor potential of rh7 knockout-flies demonstrates that this increase in sensitivity covers the whole range from 370-648nm. However this impairment seems to be absent when flies were only allowed to dark adapt for 1min before the experiment or when intense blue light is used for illumination. Moreover also the ERG afterpotential measured 4s after lights-off is reduced in absence of Rh7. Taken together these results indicate that Rh7, even though it might not work as a photoreceptor under white-light, alters the light response of the receptor cells in the compound eyes under low- and mid-intense white-light in an intensity and adaptation dependent manner and that this alteration seems not to be caused by light of a limited spectral range. Furthermore the analysis of the ERG afterpotential indicates that Rh7 may also be required for normal light response termination. The general function of Rh7 as a photoreceptor in Drosophila as well as the characteristics of the endogenous function of Rh7 are discussed. Independently the present thesis also demonstrates that flies lacking CRY show a decreased ERG receptor potential amplitude upon illumination with low-intensity white-light when 15min but not when 1min of dark adaptation preceded the recording. This may indicate an impairment of the dark adaptation process without cryptochrome.

The change of day and night is one of the challenges all organisms are exposed to, as they have to adjust their physiology and behavior in an appropriate way. Therefore so called circadian clocks have evolved, which allow the organism to predict these cyclic changes of day and night. The underlying molecular mechanism is oscillating with its endogenous period of approximately 24 hours in constant conditions, but as soon as external stimuli, so called Zeitgebers, are present, the clocks adjust their period to exactly 24h, which is called entrainment. Studies in several species, including humans, animals and plants, showed that light is the most important Zeitgeber synchronizing physiology and behavior to the changes of day and night. Nevertheless also other stimuli, like changes in temperature, humidity or social interactions, are powerful Zeitgebers for entraining the clock. This thesis will focus on the question, how light influences the locomotor behavior of the fly in general, including a particular interest on the entrainment of the circadian clock. As a model organism Drosophila melanogaster was used. During the last years several research groups investigated the effect of light on the circadian clock and their results showed that several light input pathways to the clock contribute to wild-type behavior. Most of the studies focused on the photopigment Cryptochrome (CRY) which is expressed in about half of the 150 clock neurons in the fly. CRY is activated by light, degrades the clock protein Timeless (TIM) and hence entrains the clock to the light-dark (LD)-cycle resulting from changes of day and night. However, also flies lacking CRY are still able to entrain their clock mechanism as well as their activity-rest-rhythm to LD-cycles, clearly showing that the visual system of the fly also contributes to clock synchronization. The mechanism how light information from the visual system is transferred to the clock is so far still unknown. This is also true for so-called masking-effects which are changes in the behavior of the animal that are directly initiated by external stimuli and therefore independent of the circadian clock. These effects complement the behavior of the animals as they enable the fly to react quickly to changes in the environment even during the clock-controlled rest state. Both of these behavioral features were analyzed in more detail in this study. On the one hand, we investigated the influence of the compound eyes on the entrainment of the clock neurons and on the other hand, we tried to separate clock-controlled behavior from masking. To do so "nature-like" light conditions were simulated allowing the investigation of masking and entrainment within one experiment. The simulation of moonlight and twilight conditions caused significant changes in the locomotor behavior. Moonlit nights increased nocturnal activity levels and shifted the morning (M) and evening (E) activity bouts into the night. The opposite was true for the investigation of twilight, as the activity bouts were shifted into the day. The simulation of twilight and moonlight within the same experiment further showed that twilight appears to dominate over moonlight, which is in accordance to the assumption that twilight in nature is one of the key signals to synchronize the clock as the light intensity during early dawn rises similarly in every season. By investigating different mutants with impaired visual system we showed that the compound eyes are essential for the observed behavioral adaptations. The inner receptor cells (R7 and R8) are important for synchronizing the endogenous clock mechanism to the changes of day and night. In terms of masking, a complex interaction of all receptor cells seems to adjust the behavioral pattern, as only flies lacking photopigments in inner and outer receptor cells lacked all masking effects. However, not only the compound eyes seem to contribute to rhythmic activity in moonlit nights. CRY-mutant flies shift their E activity bout even more into the night than wild-type flies do. By applying Drosophila genetics we were able to narrow down this effect to only four CRY expressing clock neurons per hemisphere. This implies that the compound eyes and CRY in the clock neurons have antagonistic effects on the timing of the E activity bout. CRY advances activity into the day, whereas the compound eyes delay it. Therefore, wild-type behavior combines both effects and the two light inputs might enable the fly to time its activity to the appropriate time of day. But CRY expression is not restricted to the clock neurons as a previous study showed a rather broad distribution within the compound eyes. In order to investigate its function in the eyes we collaborated with Prof. Rodolfo Costa (University of Padova). In our first study we were able to show that CRY interacts with the phototransduction cascade and thereby influences visual behavior like phototaxis and optomotor response. Our second study showed that CRY in the eyes affects locomotor activity rhythms. It appears to contribute to light sensation without being a photopigment per se. Our results rather indicate that CRY keeps the components of the phototransduction cascade close to the cytoskeleton, as we identified a CRY-Actin interaction in vitro. It might therefore facilitate the transformation of light energy into electric signals. In a further collaboration with Prof. Orie Shafer (University of Michigan) we were able to shed light on the significance of the extraretinal Hofbauer-Buchner eyelet for clock synchronization. Excitation of the eyelet leads to Ca2+ and cAMP increases in specific clock neurons, consequently resulting in a shift of the flies´ rhythmic activity. Taken together, the experiments conducted in this thesis revealed new functions of different eye structures and CRY for fly behavior. We were furthermore able to show that masking complements the rhythmic behavior of the fly, which might help to adapt to natural conditions., Der Wechsel von Tag und Nacht stellt für viele Organismen eine große Herausforderung dar, da sie ihre Physiologie und auch das Verhalten den äußeren Gegebenheiten anpassen müssen. Um dieser Aufgabe gerecht zu werden, haben viele Organismen innere Uhren entwickelt, welche es ihnen erlauben, den Wechsel von Tag und Nacht vorherzusehen. Diesen inneren Uhren liegt ein molekularer Mechanismus zugrunde, welcher einen Rhythmus von etwa 24 Stunden generiert. Eine wichtige Eigenschaft dieser Uhren ist es, dass sie durch äußere Faktoren, so genannte Zeitgeber, an den Tag-Nacht-Wechsel angepasst werden können. Viele Studien an Mensch, Tier und Pflanze weisen darauf hin, dass Licht der wichtigste Zeitgeber ist, wobei auch Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder soziale Interaktionen die innere Uhr an den Tag-Nacht-Wechsel anpassen können. Ziel dieser Arbeit ist es, die Auswirkung von Licht auf das Lauf-verhalten und die innere Uhr genauer zu beleuchten, wozu der Modellorganismus Drosophila melanogaster herangezogen wird. Zahlreiche Forschergruppen haben sich bereits mit der Synchronisation der inneren Uhr durch Licht beschäftigt, wobei klar hervorgeht, dass die Taufliege verschiedene Möglichkeiten hat, Lichtinformationen für die Synchronisation der Uhr zu verwenden. Der wohl am besten untersuchte Prozess ist die Synchronisation durch das Pigment Cryptochrom. Dieses Molekül ist in etwa der Hälfte der Uhrneuronen exprimiert und greift direkt in den molekularen Uhrmechanismus ein, wodurch dieser an den Tag-Nacht-Wechsel angepasst werden kann. Schaltet man jedoch das Gen für dieses Molekül aus so zeigt sich, dass die Tiere dennoch dazu in der Lage sind sich an den Licht-Dunkel-Wechsel anzupassen. Dies bedeutet, dass die visuellen Organe Informationen an die innere Uhr weiterleiten können, wobei der Mechanismus dafür noch nicht vollständig entschlüsselt werden konnte. Selbiges trifft auf sogenannte Maskierungseffekte zu: Maskierung beschreibt eine Veränderung des Verhaltensmusters, welches nicht durch die innere Uhr gesteuert, sondern direkt durch äußere Reize hervorgerufen wird. Diese direkten Effekte komplettieren das Verhalten der Tiere, da sie dadurch selbst zu endogen ungünstigen Zeiten adäquat auf äußere Reize reagieren können. In dieser Arbeit wird sich beider Phänomene angenommen: Zum einen soll die Bedeutung des visuellen Systems für die Synchronisation der inneren Uhr genauer untersucht, und zum anderen soll uhrgesteuertes Verhalten von Maskierung getrennt werden. Zu diesem Zweck wurden Lichtbedingungen simuliert, die den natürlichen ähnelten und die Untersuchung beider lichtabhängiger Effekte ermöglichten. Die Untersuchung von Dämmerung und Mondlicht zeigte deutlich, dass diese starke Veränderungen im Lauf-Verhalten hervorrufen. Die Simulation von Mondlicht bewirkte einen Anstieg der Nachtaktivität und ein Verschieben der Aktivitätsmaxima der Fliege in die Nacht. Das Gegenteil war bei Dämmerungssimulation zu beobachten, da die Tiere mehr Aktivität in den Tag legten. Bei gleichzeitiger Simulation von Mondlicht und Dämmerungsphasen zeigte sich, dass die Dämmerung ein stärkerer Zeitgeber ist als Mondlicht ist. Dieses Ergebnis geht einher mit der Annahme, dass die Dämmerung ein wichtiges Signal für die Synchronisation der inneren Uhr ist, da der Anstieg der Lichtintensität am frühen Morgen unabhängig von der Jahreszeit sehr ähnlich ist. Die Untersuchung von verschiedensten Mutanten konnte zudem zeigen, dass die Komplexaugen der Fliege von größter Bedeutung für die beobachteten Veränderungen im Verhaltensmuster und die Anpassung der inneren Uhr an "natürliche" Lichtbedingungen sind. Dabei stellte sich heraus, dass vor allem die inneren Rezeptorzellen wichtig für die Synchronisation der inneren Uhr und somit uhrgesteuerter Verhaltensänderungen sind. Für Maskierungseffekte scheint eine komplexe Interaktion von mehreren Rezeptorzellen für die Anpassung an Dämmerungs- und Mondlichtbedingungen vorzuliegen, da diese nur bei Mehrfachmutationen verschiedener Rhodopsine, den lichtabsorbierenden Molekülen der Fliege, verschwanden. Jedoch scheinen nicht nur die Komplexaugen das rhythmische Verhalten in Mondlichtnächten zu beeinflussen. Wird das Gen für Cryptochrom, dem Photorezeptor der inneren Uhr, ausgeschaltet, verschieben die Tiere ihre Abendaktivität noch stärker in die Nacht als es bereits beim Wildtyp der Fall ist. Durch verschiedene genetische Manipulationen konnten wir den Grund dieses Verhaltens auf die Expression von Cryptochrom in nur vier Uhrneuronen pro Hemisphäre zurückverfolgen. Zugleich zeigten unsere Ergebnisse, dass die Komplexaugen und Cryptochrom entgegengesetzte Wirkung auf das Timing der Abendaktivität haben. Während die Komplexaugen die Abendaktivität in die Nacht hinein schieben, bewirkt Cryptochrom, dass die Aktivität noch während des Tages stattfindet. Dies bedeutet, dass das wildtypische Verhalten eine Mischung aus beiden Lichteingängen ist und sich die Tiere somit ideal an die äußeren Gegebenheiten anpassen können. Cryptochrom wird jedoch nicht nur in den Uhrneuronen, sondern unter anderem auch in den Komplexaugen der Tiere exprimiert. Um die Funktion in den Augen genauer zu untersuchen, konnten wir in Kollaboration mit Prof. Rodolfo Costa (University of Padova) zunächst zeigen, dass CRY mit der Phototransduktionskaskade über das Protein INAD interagiert und dadurch visuelles Verhalten, wie zum Beispiel Phototaxis oder die optomotorische Antwort, beeinflussen kann. In weiteren Experimenten konnten wir zudem zeigen, dass CRY in den Augen die lokomotorische Aktivität der Fliegen beeinflusst. Dabei trägt es zur Wahrnehmung von Licht bei, ohne jedoch per se ein Photopigment zu sein. Vielmehr scheint CRY die Phototransduktion dahingehend zu verändern, dass es den Phototransduktionskomplex an das Cytoskelett innerhalb der Rhabdomere bindet und somit die Umwandlung von Lichtenergie in elektrische Signale erleichtert. Zusammen mit Prof. Orie Shafer (University of Michigan) ist es uns zudem gelungen, die Rolle des extraretinalen Hofbauer-Buchner-Äugleins für die Synchronisation der Uhr genauer zu beleuchten. Die Anregung des Äugleins führte dabei zu einem Anstieg der Ca2+ und cAMP Mengen in bestimmten Uhrneuronen und dies bewirkte eine Phasenverschiebung des Verhaltens der Taufliege. Somit konnten in dieser Arbeit neue Erkenntnisse über die Funktionen von Cryptochrom und verschiedener Augenstrukturen für das Verhalten der Fliege gewonnen werden. Dabei konnten die Bedeutungen der inneren Uhr sowie von Maskierungseffekten für das Verhalten der Tiere in der Natur herausgearbeitet werden.

Cryptochromes and photolyases constitute a group of highly distributed, FAD-binding, bluelight dependent signaling proteins ans enzymes, which together form the photolyase/cryptochrome-superfamily (PCSf). Photolyases recognize UV-induced DNA lesions between adjacent pyrimidine bases, namely cyclobutanpyrimidindimers (CPD) and (6-4)-pyrimidine-pyrimidone-photoproducts ((6-4)), and repair them blue-light dependently, whereas cryptochromes rather show regulatory functions in vivo. The plant representatives are involved in responses to blue-light stimuli and take influence on growth, development and the circadian clock of the plant. Cryptochromes in animals participate in the circadian clock as blue-light sensors (type I), or light-independently as part of the central oscillator (type II). Cryptochromes from bacteria are still poorly understood, the best characterized representatives from Synechocystis sp. PCC6803 belongs to the CryDASH family whose exact biological function is still unknown. This work dealt with functional and the first structural characterization of a true bacterial cryptochrome,cryptochrome B from Rhodobacter sphaeroides (RsCryB). RsCryB shows no DNA repair activity and participates in the light-dependent and oxygen-dependent regulation of photosynthesis genes in R. sphaeroides. It defines a new family of proteins in the PCSf, predominantly occurring in proteobacteria, the proteobacterial cryptochromes (CryPro). Despite low sequence identity to the other representatives of the PCSf, the structure of the CryPro family is analogous to the conserved overall fold of the superfamily. Surprisingly, one [4Fe-4S] clusters was identified, which is along with the catalytic cofactor FAD the defining element of RsCryB's C-terminus. This cluster is structurally and chemically related to known clusters of eukaryotic primase subunits, as was shown by EPR experiments. Moreover 6,7- dimethyl-8-ribityl-lumazine was identified as antenna chromophore of RsCryB, yet unknown inside the PCSf. These studies are complemented by an DNA binding analysis of the class II CPD photolyase from Methanosarcina mazei (MmCPDII), the model photolyase for plant homologs, as well as an analysis of the fully reduced state of MmCPDII by ultrafast spectroscopy. In the third part of the project the native antenna chromophore of the (6-4)-photolyase from Dunaliella salina was identified as 8-hydroxy-5-deazaflavin and the in vitro repair of (6-4)-damages by the enzyme was shown., Cryptochrome und Photolyasen sind eine Gruppe ubiquitärer, FAD bindender, blaulichtabhängiger Signalproteine bzw. Enzyme, welche zusammen die Photolyase/Cryptochrom-Superfamilie (PCSf) bilden. Während Photolyasen UV-induzierte DNA-Läsionen zwischen benachbarten Pyrimidinbasen, nämlich die Cyclobutanpyrimidindimere (CPD) und die (6-4)-Pyrimidin-pyrimidon-Photoprodukte ((6-4)), erkennen und blaulichtabhängig reparieren, üben Cryptochrome regulatorische Funktionen in vivo aus. Die pflanzlichen Vertreter sind in der Antwort auf Blaulichtreize involviert und nehmen Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und die circadiane Uhr von Pflanzen. In Tieren partizipieren Cryptochrome in der circadianen Uhr als Blaulichtsensensor (Typ-I), oder lichtunabhängig als Teil des zentralen Oszillators (Typ-II). Cryptochrome aus Bakterien sind weniger gut untersucht, der bestcharakterisierte Vertreter aus Synechocystis sp. PCC6803 gehört zur CryDASH-Familie, deren genaue biologische Funktion noch immer unklar ist. In dieser Arbeit erfolgte eine funktionelle und die erste strukturelle Charakterisierung eines echten bakteriellen Cryptochroms, des Cryptochroms B aus Rhodobacter sphaeroides (RsCryB). RsCryB zeigt keine DNA-Reparaturaktivität und reguliert die Photosynthese von R. sphaeroides auf dem Transkriptlevel sauerstoff- und blaulichtabhängig. RsCryB definiert eine neue, überwiegend in Proteobakterien auftretende Proteinfamilie in der PCSf, die proteobakteriellen Cryptochrome (CryPro). Trotz geringer Sequenzidentitäten zu anderen Vertretern der PCSf ist die Struktur der CryPro-Familie homolog zur konservierten Überstruktur der Superfamilie. Überraschenderweise konnte in RsCryB ein [4Fe-4S]-Cluster identifiziert werden, der neben dem katalytischen Kofaktor FAD das bestimmende Element der C-terminalen Domäne ist. Dieser Cluster ist strukturell und chemisch verwandt mit bekannten Clustern aus eukaryotischen Primaseuntereinheiten, wie durch EPR-Experimente gezeigt werden konnte. Daneben wurde in RsCryB mit 6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin, ein für die PCSf neuer Antennenchromophor identifiziert. Diese Studien werden ergänzt durch eine Analyse der DNA-Bindung der Klasse II CPD-Photolyasen aus Methanosarcina mazei (MmCPDII), sowie durch die Analyse des vollständig reduzierten Zustandes der MmCPDII mittels Ultrakurzzeitspektroskopie. In einem dritten Teilprojekt konnte der Antennenchromophor der (6-4)-Photolyase aus Dunaliella salina als 8-Hydroxy-5-deazaflavin identifiziert und die in vitro Reparatur des (6-4)-Schadens durch das Enzym demonstriert werden.

The behavior of mammals and their physiological processes are dependent on the daily rhythms. These rhythms are controlled by an endogenous circadian clock that responds to light/dark cycles of environment. In mammals, the circadian clocks, are arranged hierarchically, and work in almost all cells and tissues. Suprachiasmatic nuclei (SCN) in the hypothalamus are at the top of the hierarchy and work as a major circadian pacemaker. This work presents the clock genes that have been discovered in the last twenty years in the SCN of mammals. The first chapter focuses on the general mechanism of circadian rhythms and structure of the SCN. The second chapter describes the transcriptional-translational feedback loops that are an essential part of the proper function of the circadian clock, and function of individual genes is briefly introduced in this chapter. The following chapters already include a chronological characterization of Clock, Bmal1, Period and Cryptochrome genes, as they were discovered. If the clock gene expresses different function from the clockwork mechanism, it is briefly introduced in the final paragraph on the chapter. The final chapters deal with other molecules, casein kinases, ROR and REV-ERB receptors that affect its function expression and degradation of circadian genes in the...

Cryptochrome (CRY) sind UV-A/Blaulicht Photorezeptoren, die in allen Organismenreichen vorkommen und eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu DNA-Photolyasen haben. Sie tragen die gleichen Kofaktoren wie DNA-Photolyasen, zeigen aber mit Ausnahme der cryDASH-Familie keine DNA-Reparaturaktivität. Cryptochrome nutzen stattdessen das Lichtsignal, um um in Pflanzen deren Entwicklung zu steuern. Cryptochrom 1 (CRY1) und 2 (CRY2) aus Arabidopsis thaliana vermitteln nach Absorption des Lichtsignals über die in ihrer N-terminalen PHR (photolyase related) Domäne gebundenen Chromophore die Signalweiterleitung über ihre C-terminale Extension an downstream Interaktionspartner. Eine lichtabhängige Phosphorylierung sowie Dimerisierung scheint für beide Cryptochrome für die Signaltransduktion und ihre biologische Funktion essentiell zu sein. Während CRY1 lichtstabil ist, wird CRY2 nach Blaulichtbelichtung schnell abgebaut. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Arabidopsis CRY2. Insbesondere die Prozesse der Dimerisierung, der Phosphorylierung und des lichtgesteuerten Abbaus wurden näher untersucht. Cryptochrom 2 interagiert über seinen C-Terminus (CCT2) mit der C-terminalen WD-40 Domäne von COP1, einer E3-Ligase, die als Repressor der Photomorphogense in Pflanzen fungiert. Des Weiteren haben unter anderem Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass nur die dimere Form von CCT2 biologisch aktiv ist. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, CCT2 als Fusion mit dem Rapalog-induzierbaren FKBP(v)-Protein, sowie COP1 als Volllängen- oder verkürztes Protein, welches nur aus der C-terminalen Domäne besteht, in E. coli löslich zu exprimieren und anschließend mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. Mit Hilfe dieser Proteine sollte geklärt werden, ob nur die dimere Form von CCT2 mit COP1 interagiert. Hierfür waren Co-Immunopräzipitationsanalysen (Co-IP) geplant. Weiterhin sollten die gereinigten Proteine für Kokristallisationsexperimente eingesetzt werden. Die Ausbeuten an löslichem COP1, bzw. verkürzter COP1 Proteine waren gering und Versuche der Optimierung der Expression gelangen nicht. Des Weiteren zeigte sich, dass das CCT2-Fusionsprotein nach Expression in E. coli und nachfolgender Aufreinigung und Ankonzentrierung Oligomere bereits ohne Zugabe des chemischen Inducer bildet. Dennoch wurden Co-IPs durchgeführt, die aber keine Aussage darüber ermöglichten, ob CCT2 als Dimer für die Interaktion mit COP1 vorliegen muss. Aufgrund der vorgenannten Probleme war eine Kokristallisation von CCT2 mit COP1 nicht möglich. Die blaulichtabhängige Phosphorylierung und der Abbau von CRY2 in vivo wurde durch immunologische Analysen untersucht. Inbesondere wurde hierbei der Frage nachgegangen, welchen Einfluss Mitglieder der SPA-Proteinfamilie auf die Phosphorylierung und den Abbau von CRY2 haben. Die vier in Arabidopsis vorhandenen SPA Proteine fungieren zusammen mit COP1 ebenfalls als Repressoren der Photomorphogenese. Zur Beantwortung der Frage, ob SPA-Proteine am Abbau von CRY2 beteiligt sind, wurden CRY2 Gehalte in zahlreichen spa Mutanten untersucht. Weiterhin wurde eine mögliche Interaktion von SPA Proteinen mit CRY2 in vitro überprüft. Es konnte hierbei ein Einfluss der SPA Proteine auf die Stabilität von CRY2 im Blaulicht gezeigt werden, inbesondere unter niedrigen Fluenzraten. In Co-IP Analysen wurde eine direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und SPA4 gezeigt. Zusammengefasst zeigen die erzielten Ergebnisse, dass SPA-Proteine am Abbau von CRY2 beteiligt sind und hierfür vermutlich eine direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und SPA4 erforderlich ist. Weitere Analysen von CRY2 Proteinleveln in phyA Mutanten zeigten einen bis dahin unbekannten Einfluss von Phytochrom A auf die Stabilität von CRY2. Konsistent mit der Rolle der SPA-Proteine im Signalweg von phyA wiesen die phyA-Mutanten im niedrigen Fluenzratenbereich höhrere CRY2-Level als der Wildtyp auf. Dieser phyA Effekt wurde nur im Blaulicht, nicht aber unter Rot- und Dunkelrotlicht beobachtet. Somit kann davon ausgegangen werden, dass für den Abbau von CRY2 dessen vorherige Aktivierung durch Blaulicht zwingend erforderlich ist. Die Analyse einer phyB-Mutante zeigte hingegen keinen Unterschied zum Wildtyp. D, The UV-A/blue light photoreceptor cry2 plays a fundamental role in the transition from the vegetative to the reproductive phase in the facultative long-day plant Arabidopsis thaliana by stabilizing the photoperiodic pathway element CO and modulating FT expression under long-day conditions. The level of cry2 protein itself is regulated by light with a strong decrease upon transition of etiolated seedlings to blue light. Both, cry2 signaling and its degradation occur in the nucleus. Degradation of cry2 is preceded by phosphorylation and polyubiquitination and mediated by the 26S proteasome. Although, the E3 ubiquitin ligase COP1 has been identified as one element involved in cry2 degradation, several cop1 mutants show only some reduction but no prevention of cry2 degradation. We thus reasoned that SPA proteins, which act in concert with COP1, could also have a role in cry2 degradation. To test this hypothesis we analyzed cry2 protein levels in spa single, triple and quadruple mutants. cry2 degradation under continuous blue light was alleviated in a fluence rate-dependent fashion in all spa mutants analyzed. Consistent with a role of SPA proteins in phyA signaling we found enhanced levels of cry2 in the phyA mutant in particular under low fluence rate blue light. Moreover, in vitro pull-down studies showed that photoactive cry2 interacts directly with SPA1 and SPA4. Together our results suggest that cry2 is under control of SPA and phyA thus adding another piece of information on the molecular mechanisms of interaction between cryptochrome and phytochrome photoreceptors.

In dieser Arbeit wurden grundlegende Eigenschaften des Cryptochroms 3 in Arabidopsis thaliana untersucht. Dieser Blaulichtrezpetor gehört zur Familie der DASH-Cryptochrome. Es wurde die Expression von cry3 in verschiedenen Organen bzw. Geweben von Arabidopsis thaliana auf RNA und Proteinebene untersucht, um daraus Rückschlüsse auf die Funktion von cry3 ziehen zu können. Durch Generierung transgener Pflanzen, die cry3-GFP exprimieren, wurde die Organellen-Lokalisation des Proteins auch in intatkten transgenen Linien nachgewiesen. Ferner wurden Pflanzenlinien etabliert, in denen das Protein nur in Mitochondrien- bzw. nur in Chloroplasten lokalisiert ist, um diese Linien dann phänotypisch mit dem Wildtyp vergleichen zu können, in dem cry3 in beiden Organellen lokalisiert. Anhand transienter Expression des cry3-GFP Fusionsproteins wurde eine mögliche lichtabhängige Lokalisation in den Chloroplasten untersucht. Die N-terminale α-Helix von cry3 wurde auf eine mögliche regulatorische Funktion für den Import in die Chloroplasten hin untersucht. Dies wurde anhand transienter Expression in Protoplasten nicht bestätigt. Darüberhinaus konnte eine bisher für DASH Cryptochrome unbekannte Lokalisation im Nucleolus gezeigt werden., Cryptochrome 3 of Arabidopsis thaliana is a member of the DASH-Cryptochrome Family. In this thesis the expression pattern and protein content of cry3 in different tissues was investigated to obtain basic knowledge about the currently unknown function of cry. Furhtermore, the localization in chloroplasts was shown in transgenic plants, overexpressing cry3. The mature protein is transported into chloroplasts and mitochondria. Therefore, transgenic plants were generated, in which cry3 is imported only in one of these organelles. A possible light effect of the chloroplast targeting could not been shown. Furthermore, a to-date for the DASH-cryptochromes unknown nucleus-localization was shown for cry3.

Cryptochromes are blue/UV-A light photoreceptors, which are closely related to photolyases but do not show DNA repair activity. Apart from the classical plant cryptochromes cry1 and cry2, a third Cryptochrom was identified in Arabidopsis thaliana. Cryptochrome 3 (cry3) belongs to the subfamily of the DASH cryptochromes and was shown to be localized in the chloroplasts and mitochondria. Although cry3 has been characterized quite well considering protein structure and biochemical properties, the biological function of this protein in the plant remains unknown until today. In this thesis the biological function of cry3 in the plant has been investigated. The localization of cry3 in chloroplasts and mitochondria could be confirmed by immunological studies on organellar fractions of Arabidopsis cell culture and immunolocalization studies using gold labelled secondary antibodies. Therefore any artefacts of the previous localization studies by overexpression and GFP fusion of cry3 can be excluded. At transcript level CRY3 expression is regulated by light. During the early phase of deetiolation cry3 is transiently induced mainly by far-red light. Phytochrome A was identified as the responsible photoreceptor for this regulation of cry3. PIF1 and PIF3 are also involved in this phytochrome dependent process. In adult plants grown in light / dark cycles, CRY3 expression shows a circadian regulation, which is also affected by the photoperiod. For functional analysis of cry3, several seed collections were screened for cry3 mutants and transgenic cry3 lines were produced. For further functional analysis cry3 overexpressor lines, RNAi knock-down lines, a cry3 knock-out transposon line and several T-DNA insertion lines with altered CRY3 expression and truncated cry3 c-term are now available. Two of these mutant lines are affected in seed germination under limiting light conditions. However this phenotype could not be proven beyond any doubt. Apart from this reduced germination rate the analyzed cry3 lines did not show any clear phenotypic differences compared to wild type plants. Cry3 does not seem to affect blue, green or UV light dependent regulation of plastid genes in Arabidopsis. Growth of Arabidopsis plants treated with elevated levels of UV-B light is not affected by cry3, although cry3 has been described to repair UV lesions in vitro in single stranded DNA and in double stranded DNA with loop structures. The results of this thesis clearly disagree with a function for cry3 as a DNA repair enzyme, because the PCR based repair assay described here could not detect any effect of cry3 on the repair activity in chloroplasts, mitochondria or in the nucleus., Cryptochrome sind Blau-/UVA-Photorezeptoren, die eng mit den Photolyasen verwandt sind, aber keine DNA-Reparaturaktivität besitzen. Neben den „klassischen“ pflanzlichen Cryptochromen cry1 und cry2 wurde in Arabidopsis thaliana mit Cryptochrom 3 (cry3) ein drittes Cryptochrom identifiziert. Dieses Cryptochrom aus der Familie der DASH-Cryptochrome wurde als plastiden- und mitochondrienlokalisiertes Protein beschrieben. Obwohl Cryptochrom 3 schon sehr gut strukturell und biochemisch charakterisiert ist, konnte die biologische Funktion dieses Proteins in der Pflanze bisher noch nicht aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wurde daher die biologische Funktion von cry3 in der Pflanze untersucht. Die cry3-Lokalisation in Chloroplasten und Mitochondrien konnte durch Zellfraktionierung und Immunolokalisationsstudien eindeutig bestätigt werden. Damit konnten Artefakte bei den bisherigen Untersuchungen durch die Überexpression und GFP-Fusion von cry3 ausgeschlossen werden. Die CRY3-Expression wird auf der Transkript-Ebene durch Licht reguliert. CRY3 wird während der Deetiolierungsphase hauptsächlich durch dunkelrotes Licht transient induziert. Phytochrom A konnte als der hauptverantwortliche Photorezeptor für diese Reaktion identifiziert werden. An dieser phytochromabhängigen Regulation sind auch PIF1 und PIF3 beteiligt. In ergrünten Pflanzen unterliegt die CRY3-Expression einer circadianen Regulation, welche anscheinend auch durch die Photoperiode beeinflusst wird. Zur funktionellen Analyse von Cryptochrom 3 wurden cry3-Mutanten in verschiedenen Mutanten-Kollektionen identifiziert und außerdem verschiedene cry3-Linien hergestellt. Zur weiteren Untersuchung der cry3-Funktion steht eine cry3-Überexpressionslinie, eine RNAi-knock-down-Linie, eine cry3-knock-out-Linie mit einer Transposon-Insertion, verschiedene T-DNA-Insertionslinien mit veränderter CRY3-Expression bzw. verkürztem cry3 C-Terminus, sowie eine putative knock-out-Linie mit einer Punktmutation in der splicing Erkennungssequenz zur Verfügung. Zwei dieser Mutantenlinien waren in ihrer Keimungsfähigkeit unter spezifischen Bedingungen beeinträchtigt. Der Keimungsphänotyp konnte in dieser Arbeit allerdings nicht eindeutig belegt werden. Abgesehen von dieser reduzierten Keimrate waren bei den untersuchten transgenen cry3-Linien keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede festzustellen. Auch ein Einfluss von cry3 auf die Blau-, Grün- und UV-Licht-abhängige Regulation von plastidenkodierten Genen konnte nicht nachgewiesen werden. Das Wachstum von Arabidopsis unter erhöhter UV-B-Bestrahlung wird durch cry3 nicht beeinflusst. Für cry3 ist zwar in vitro eine Photolyasefunktion bei einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA mit loop-Strukturen beschrieben worden, dennoch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine in vivo Funktion von cry3 als DNA-Reparaturenzym, weil durch einen PCR-basierten Reparatur-assay kein Einfluss von cry3 auf die DNA-Reparatur in Chloroplasten und Mitochondrien nachgewiesen werden konnte.

The influence of short wave ultraviolet radiation can cause severe DNA damages by forming photoadducts. The major UV-induced photolesions are cyclobutane-pyrimidine dimers (CPDs) which are formed in a photochemically induced cyclization reaction of two adjacently located pyrimidine bases, mainly thymine. To ensure the genetic integrity many organisms contain DNA photolyases. These enzymes are capable of repairing DNA lesions by blue light induced cleavage of the dimer. The full details of the repair mechanism are not yet clear. Only three protein structures of photolyases without any detail on substrate binding were available. One of the aims of this study was to elucitate the binding and repair mechanism of photolyases by cocrystallization of a photolyase and CPD-comprising DNA. This study presents the 1.8 Å cocrystal structure of A. nidulans photolyase bound to duplex DNA comprising a synthetic CPD lesion. The structure reveals the CPD lesion completely turned out of the double helix and flipped into the active site. Interestingly, the thymine dimer was found to be split into two thymines by synchrotron radiation at 100 K. The structure mimics a structural intermediate during DNA repair in which back-flipping of the thymines into duplex DNA has not yet taken place. Both, the dinucletide flipping mechanism which has been a long-standing hypothesis, supported by many computer model calculations, biochemical data and NMR spectroscopy, and the DNA bending of 50 ° upon DNA binding could be confirmed with this cocrystal structure. Likewise, the exact geometry of the catalytic flavin cofactor and the precise binding mode between the CPD lesion and the photolyase could be elucidated. Observed interactions between DNA and the photolyase define a 5-NpT◊TpNpNp-3 signature as a common signature motif of DNA binding by photolyases. Structural considerations give rise to either a direct tunneling electron transport pathway from the C8 methyl group of the FAD cofactor to the CPD lesion or an indirect pathway involving the adenine moiety. The structural insights gained from this work provide valuable information on the detailed understanding of the most important direct DNA repair process. Cryptochromes are closely related to photolyases and are part of the same superfamily. As a member of the blue light photoreceptor family they are known to regulate the circadian rhythm in numerous organisms. The second part of this thesis deals with the structure determination and characterization of A. thaliana cryptochrome 3 (cry3) which belongs to the class of the so called DASH-crpytochromes. Up to know, the physiological function of this class of cryptochromes is mostly unknown. The crystal structure of A. thaliana cry3 was solved at a resolution of 1.9 Å, revealing MTHF as an antenna cofactor. Furthermore, the cocrystal structure of A. thaliana cry3 bound to a pentanucleotide comprising a CPD lesion could be obtained and successfully characterized by X-ray crystallography at a resolution of 2.0 Å. This structure reveals the DNA lesion bound in its repaired state before back flipping of the two thymines out of the active site, in analogy to the cocrystal structure with the A. nidulans photolyase decribed above. Additionally, the observed binding mode of DNA to A. thaliana cry3 mainly corresponds to that monitored in photolyases leading to the assumption that the electron transfer pathways should be mostly identical. Photolyases contain either 8-HDF, MTHF or FAD as an antenna cofactor to broaden their activity spectrum. The ELISA activity assays on T. thermophilus photolyase carried out in the third part of this thesis show an eightfold higher repair activity at 450 nm for the FMN-containing photolyase compared to the activity of the cofactor-free R46E mutant of the enzyme. Thus, the importance of FMN as an alternative antenna chromophore could be confirmed. Reconstitutions of the native photolyase with the naturally occuring cofactors FMN and 8-HDF as well as the artificial 8-iodo-8-demethyl-riboflavin (8-IRF) and subsequent crystallographic analysis of the binding modes clearly showed the promiscuity of the antenna pigment binding site. With the insertion of various synthesized antenna chromophores possessing different spectral properties it should now be possible to broaden the activity spectrum for photolyase DNA repair., Die Einwirkung von kurzwelliger UV-Strahlung führt in allen Organismen durch die Bildung von Photoaddukten zu schwerwiegenden Schädigungen der die Erbinformationen tragenden DNA. Die überwiegend auftretenden Photoschäden sind hierbei Cyclobutanpyrimidindimere (CPDs), die durch eine photochemisch induzierte Zyklisierungsreaktion von zwei auf einem DNA-Strang benachbarten Pyrimidinen, meist Thyminen, entstehen. Die für die genetische Integrität eines Organismus notwendige Reparatur wird in vielen Lebewesen mit Hilfe von Photolyasen durch die blaulichtinduzierte Spaltung dieser Dimere bewerkstelligt. Demzufolge besteht ein großes Interesse an der Aufklärung des Reparaturmechanismus, der diesen Enzymen zugrunde liegt. Bis zum Beginn dieser Arbeit lagen drei Proteinkristallstrukturen von Photolyasen vor, die ohne Substrat kristallisiert wurden. Diese Arbeit präsentiert die bei einer Auflösung von 1.8 Å gelöste Cokristallstruktur von A. nidulans Photolyase in einem Komplex mit Duplex-DNA, die einen synthetisch hergestellten CPD-Schaden enthält. Der unter dem Einfluss der verwendeten Synchrotronstrahlung bei 100 K in zwei Thymine gespaltene CPD-Schaden ist vollständig aus der Duplex-DNA heraus- und in das aktive Zentrum der Photolyase hineingedreht. Die Struktur imitiert ein strukturelles Intermediat während der DNA-Reparatur, in dem das Zurückdrehen der Thymine in die Duplex-DNA noch nicht stattgefunden hat. Sowohl die seit langem bestehende und durch Modellrechnungen, biochemische Daten sowie NMR-Spektroskopie gestützte Hypothese des dinucleotid-flipping-Mechanismus, als auch das Knicken der DNA um 50 ° bei DNA-Bindung, konnten mit Hilfe dieser Struktur bestätigt werden. Gleichermaßen konnten die exakte Geometrie des katalytischen Flavincofaktors und der genaue Bindungsmodus des CPD-Schadens mit der Photolyase aufgeklärt werden. Die beobachteten Wechselwirkungen des Substrats mit der Proteinumgebung definieren die Sequenzabfolge 5-NpT◊TpNpNp-3 als allgemeines Erkennungsmotiv für Photolyasen. Aus strukturellen Überlegungen heraus ergeben sich für den Elektronentransport vom FAD auf den CPD-Schaden sowohl ein direkter Weg über die C8-Methylgruppe des FAD als auch ein indirekter Weg, der über die Beteiligung des Adeninrestes verläuft. Die im Verlauf dieser Arbeit erhaltenen strukturellen Erkenntnisse liefern wertvolle Informationen über das detaillierte Verständnis des wichtigsten direkten DNA-Reparaturprozesses. Cryptochrome sind strukturell eng mit den Photolyasen verwandt und bilden mit ihnen eine Superfamilie. Sie gehören zu den wichtigsten Blaulichtrezeptoren und steuern bspw. die circadiane Rhythmik in vielen Lebewesen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Struktur und der Charakterisierung von Cryptochrom 3 (Cry3) aus A. thaliana. Das Enzym gehört zur Klasse der sogenannten DASH-Cryptochrome, deren Funktion bisher weitgehend ungeklärt ist. Durch die Aufklärung der Kristallstruktur von A. thaliana Cry3 bei einer Auflösung von 1.9 Å konnte MTHF als Antennenchromophor identifiziert werden. Die Cokristallstruktur von A. thaliana Cry3 mit einem Pentanukleotid, das einen CPD-Schaden enthält, konnte ebenfalls erfolgreich röntgenkristallographisch bei einer Auflösung von 2.0 Å gelöst werden. Analog zu der für A. nidulans Photolyase erhaltenen Cokristallstruktur, ist der DNA-Schaden ebenfalls im reparierten Zustand vor dem Zurückdrehen der beiden Thymine aus der Bindungstasche gebunden. Des Weiteren entspricht der beobachtete Bindungsmodus von DNA an A. thaliana Cry3 nahezu dem für die Photolyase festgestellten. Für die Elektronentransportwege ist daher zu vermuten, dass sie weitgehend übereinstimmen. Zur Erweiterung ihres aktiven Spektrums besitzen Photolyasen als Antenntenchromophore 8-HDF, MTHF oder FAD. Die im dritten Teil dieser Arbeit durchgeführten ELISA-Aktivitätsassays an FMN-haltiger T. thermophilus Photolyase zeigen im Vergleich mit der cofaktorfreien R46E-Mutante bei 450 nm eine achtfach höhere Reparaturaktivität und bestätigen damit die Bedeutung des alternativen Antennenchromophors FMN. Durch Rekonstitution der T. thermophilus Photolyase mit natürlich vorkommendem FMN und 8-HDF sowie dem artifiziellen 8-Iodo-8-demethylriboflavin (8-IRF) und anschliessender kristallographischen Bestimmung der Bindungsmodi konnten die Vielseitigkeit der Antennenbindungstasche klar beweisen. Der Einbau unterschiedlicher Antennenchromophore mit verschiedenen spektralen Eigenschaften ermöglicht so künftig ein „Wellenlängentuning“ und die Erweiterung des aktiven Spektrums für die DNA-Reparatur von Photolyasen.

Many animals have ability to percieve the magnetic field of the Earth and use this clue for both orientation and navigation. Yet little is known about physiological mechanism that underlies this sensory ability. Although physiological mechanism still remains unclear, there are three major hypotheses how animals can detect the magnetic field. In this study I focused on the radical pair theory. I analyzed how manipulation of the ambient magnetic field influence the expression of CRY 1, CRY 2 and c-Fos in the pigeon´s retina. I observed in incerased numbers of CRY1, c-Fos and CRY1+c-Fos possitive cells in the ihned nuclear layer (INL) of the retina in animals sbjected to the periodical manipulation of the magnetic field inclination. These data demonstrate that the INL constains a population of neurons that are responsive to magnetic stimuli and strongly suggest that Cry 1 is involved in detection of the Earth magnetic field.

Cryptochromes are photolyase-like blue/UV-A light receptors that regulate various light developmental responses in plants. Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (Atcry2) is the major photoreceptor mediating blue light regulation of flowering induction. Although the biological role of crys in plants is well-known, the initial photochemistry underlying cryptochrome activation and regulation remain poorly understood. In the present work we addressed several aspects in the early activation events of cry 2. Many members of the photoreceptor families and components of the light signalling transduction pathway dimerize. Therefore, we studied wheter Atcry2 dimerizes, too. Immunoprecipitation studies of transgenic Arabidopsis extracts expressing both, cry2-GFP and cry2 revealed that full-lenght Atcry2 is a homodimer in vivo in a light-independent fashion. The identity of the domains involved in cry2 homodimerization were investigated, and both CNT2 and CCT2 were found as monomers. Because of the sequence similarity of cry2 with cry1, heterodimerization between cry1 and cry2 was also studied, but no cry1-cry2 heterodimers were found in our experiments. The in vivo effect of dimerization was investigated using Arabidopsis transgenic lines expression either CCT2-GFP or cry2-GFP in addition of the endogenous cry2. Cry2-GFP dimers showed phosphorylation and degradation under blue light in the same way as the endogenous cry2, whereas under the same conditions the CCT2-GFP monomers remained stable and unphosphorylated. Moreover, cry2-GFP was able to promote early flowering in plants kept under short day conditions. Whereas under the same conditions CCT2-GFP expressing transgenic Arabidopsis flowered as late as wild-type. Crys purified from Escherichia coli contain two chromophores, which were identified as flavin adenine dinucleotide (FAD) and methenyltetrahydrofolate (MTHF), whereas the presence of MTHF was not found for Atcrys purified from an eukaryotic source as insect cells. The detailed knowledge of which chromophore(s) are attached under natural conditions is important for the interpretation of spectroscopic data of these receptors. Therefore, we overexpressed epitope-tagged cry2 in planta. Specific immuno-precipitation of the tagged cry2 protein allowed purification of sufficient amounts of the photoreceptor to identify its chromophores. Based on fluorescence emission data we found that cry2 binds indeed FAD and MTHF in planta. In addition, energy transfer from MTHF to FAD was observed. Because of their similarity in aminoacid sequence and structure, photolyases have been taken as a model for crys photocycle. However, crys were shown to undergo a photocycle in which semireduced flavin (FADHo) accumulates upon blue light irradiation in contrast to photolyase that accumulates fully reduced FADH-. Green light irradiation of cry2 causes a change in the equilibrium of flavin oxidation states, and attenuates cry2-controlled responses such as flowering. Here, we provided in vivo evidence for semireduced flavin (FADHo) being the active FAD redox state in Atcry2 by analysis of the expression of flowering genes, linking in vitro with physiological studies. In order to address further insight into the role of phosphorylation on Atcry2 activity, cry2 protein purification from the plant source following mass spectroscopy was performed. Pitifully, the obtained amounts were too small to allow clear results. Genes that are specifically blue-light induced in cell cultures were identified by PCR and qRT-PCR that can be used in future studies as reporters for transient studies monitoring cry activity., Cryptochrome sind mit DNA-Photolyasen eng verwandte UV-A/Blaulicht-Photorezeptoren, die zahlreiche Entwicklungsprozesse in Pflanzen steuern. Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2 (cry2) spielt hierbei eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Regulation der Blühinduktion. Obwohl die biologischen Funktionen von Cryptochromen in Pflanzen gut untersucht sind, sind deren photochemischen Prozesse, die zur Aktivierung führen, wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Aspekte der Aktivierung von cry2 untersucht. Zahlreiche pflanzlichen Photorezeptoren und Komponenten der Lichtsignaltransduktion dimerisieren. Entsprechend wurde hier untersucht, ob dies auch für cry2 der Fall ist. Immunpräzipitationsstudien an Proteinextrakten transgener Arabidopsis Pflanzen, die cry2-GFP exprimieren, zeigten, dass cry2 in vivo als Dimer vorliegt. Licht scheint keinen Einfluss auf die Dimerisierung zu haben. Bei der Analyse, welche Domänen von cry2 für Dimerisierung notwendig sind, konnten keine eindeutigen Befunde erzielt werden, da sowohl die N-terminale Domäne (CNT2) als auch die C-terminale Domäne (CCT2) als Monomer gefunden wurden. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von cry2 mit cry1 wurde untersucht, ob diese Heterodimere bilden. Die vorliegenden Befunde gaben darauf keinen Hinweis. Um die Rolle der Dimerisierung von cry2 auf dessen biologische Funktion zu untersuchen, wurden transgene Linien untersucht, die neben dem endogenen cry2 zusätzlich CCT2-GFP oder cry2-GFP exprimieren. Cry2-GFP Dimere wurden lichtabhängig phosphoryliert und abgebaut, ähnlich dem endogenen cry2. Im Gegensatz hierzu, blieben die CCT2-GFP Monomere unphosphoryliert und stabil. Weiterhin führte die Expression von cry2-GFP zu einer Beschleunigung des Blühens unter Kurztag-Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp, nicht aber die Expression von CCT2-GFP. Pflanzliche Cryptochrome, die in E. coli exprimiert wurden, tragen zwei Chromophore (FAD und MTHF). Nach Expression in eukaryontischen Systemen wie Insektenzellen konnte bislang allerdings keine Bindung von MTHF an cry nachgewiesen werden. Kenntnisse darüber, welche Chromophore an cry in planta gebunden sind, sind für die Interpretation der spektroskopischen Daten dieser Photorezeptoren bedeutsam. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit Epitop-markiertes cry2 in Pflanzen exprimiert und spezifisch über Immunpräzipitation in Mengen aufgereinigt, die eine Identifizierung der gebundenen Chromophore ermöglichte. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-Emissionsspektroskopie zeigten, dass cry2 in planta sehr wahrscheinlich beide Cofaktoren, FAD und MTHF, bindet. Zusätzlich ergaben diese Untersuchungen Hinweis auf Energietransfer von MTHF auf FAD. Augrund der Ähnlichkeit von Photolyasen und Cryptochromem in ihrer Aminosäuresequenz and Struktur wurde die Photochemie von Photolyasen als Modell für den Photozyklus von Cryptochromen benutzt. Allerdings zeigten in vitro Untersuchungen, dass Cryptochrome nach Anregung mit Blaulicht semireduziertes Flavin (FADHo) akkumulieren, im Gegensatz zu Photolyasen, die vollständig reduziertes Flavin (FADH-) bilden. Zu Blaulicht zusätzlich gegebenes Grünlicht verschiebt das Gleichgewicht der Oxidationszustände von Flavin hin zu oxidiertem FAD und reprimiert cry2-kontrollierte Prozesse wie die Induktion der Blütenbildung. Hier durchgeführte Untersuchungen über die Wirkung von Grünlicht auf die Expression von Blühgenen lieferten zusätzliche Hinweise darauf, dass cry2 mit semireduziertem Flavin den aktiven Zustand dieses Photorezeptors repräsentiert. Zum weiteren Verständnis der Phosphorylierung von cry2 wurde versucht, das Protein aus Pflanzen in Mengen zu isolieren, die für nachfolgende massenspektrometrische Analysen ausreichend sind. Leider wurde dieses Ziel nicht erreicht. Weiterhin wurden die Expression zahlreicher Gene in Arabidopsis Zellkulturen durch PCR- und quantitative real-time PCR-Analysen daraufhin untersucht, ob sie spezifisch durch Blaulicht reguliert werden. Einige Gene konnten hierbei identifiziert werden, die in zukünftigen Untersuchungen als Reporter genutzt werden können, um die Aktivität von Wildtyp und Mutanten Cryptochromen zu untersuchen.

Das aktuell diskutierte Modell der lichtabhängigen Magnetrezeption bei Vögeln beschreibt, dass die Richtung des Erdmagnetfelds durch Radikalpaarprozesse in spezialisierten Photorezeptoren wahrgenommen wird. Dabei werden Cryptochrome, eine Klasse photoaktiver Flavoproteine, als potentielle Kandidaten für das Radikalpaarmodell und damit als mögliches Magnetrezeptormolekül diskutiert. Verhaltensbiologische Experimente mit Zugvögeln zeigen, dass der Magnetrezeptionsprozess offensichtlich stark lateralisiert im rechten Auge stattfindet und dass dieser Prozess Licht aus dem blau-grünen Teil des Spektrums benötigt. Cryptochrome absorbieren Licht in diesem Bereich und besitzen darüber hinaus biochemische Eigenschaften, die für die Funktion des Radikalpaarmodells entscheidend sind. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen habe ich untersucht, ob Cryptochrom (CRY) in der Retina des Rotkehlchens, Erithacus rubecula, einem nachtziehenden Singvogel, zu finden ist. Mit molekulargenetischen Methoden konnte ich erstmals drei individuell exprimierte Cryptochrome aus der Rotkehlchenretina isolieren: Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b und -CRY2. Während eCRY1a und eCRY2 fast vollständig homolog zu Cryptochrom 1 und 2 in der Retina des Haushuhns sind, besitzt eCRY1b eine noch unbeschriebene C-terminale Domäne, die auf neue Proteinbindungseigenschaften und Interaktionspartner hindeutet. Die Identifizierung eines Kernlokalisierungssignals bei eCRY2 weist auf dessen Lokalisierung im Zellkern hin und macht seine Funktion als sensorischer Lichtrezeptor eher unwahrscheinlich. Ein mit Hilfe der Aminosäurensequenz erstelltes Proteinmodell von eCRY1 zeigt, dass dieser Typus zwei Cofaktoren besitzt: das katalytische Chromophor Flavinadenindinukleotid (FAD) und das lichtsammelnde Pterin Methenyltetrahydrofolat (MTHF). eCRY1a und eCRY1b sind Spleißprodukte des gleichen Gens; ihre C-terminalen Domänen sind auf unterschiedlichen Exonen codiert. eCRY1a und eCRY1b besitzen beide keine Membranbindedomäne und liegen zytosolisch vor. Weil jedoch laut Radikalpaartheorie die magnetosensitiven Rezeptoren zumindest im Moment der Photonenabsorption in einer bestimmten Anordnung und Raumrichtung vorliegen müssen, benötigen beide eCRY1-Varianten daher mindestens einen sphärisch fixierten Interaktionspartner. In meiner Arbeit diskutiere ich Opsine als mögliche Partner, da diese in den Aussensegmenten der Photorezeptoren stark geordnet und in konstanter Raumrichtung vorliegen. Die Genexpression von eCRY1a und eCRY1b unterscheidet sich sowohl zwischen den Augen als auch zwischen den CRY-Varianten. Im Mittel waren die Expressionswerte von eCRY1a in der Rotkehlchenretina fünf- bis zehnmal höher als die von eCRY1b. In der Dämmerung und nachts ist eCRY1a im linken Auge signifikant höher exprimiert als im rechten Auge. Im Gegensatz dazu ist die Expression von eCRY1b in beiden Augen gleich, zeigt jedoch einen signifikanten Anstieg zu Beginn des Zuges in der Dämmerung. Durch die unterschiedlichen Expressionsraten von eCRY1a und eCRY1b verschiebt sich zum Zeitpunkt der Richtungsentscheidung des Vogels in der Dämmerung das Verhältnis zwischen den beiden Cryptochrom1-Varianten im rechten Auge zugunsten von eCRY1b. Die Ergebnisse meiner Expressionsstudie deuten darauf hin, dass die in Verhaltensversuchen nachgewiesene Lateralisation des Magnetkompass bereits auf Rezeptorebene in der Retina beginnen könnte. mRNA in situ- als auch immunohistochemische Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei Zugvögeln sowohl die mRNA als auch die Proteine beider eCRY1-Typen in den Innensegmenten der retinalen Photorezeptoren lokalisiert sind. Die räumliche Nachbarschaft zu Opsinen unterstützt die Annahme einer möglichen Interaktion zwischen diesen und Cryptochrom. Darüber hinaus lässt dieser Befund Spekulationen zu, dass die neuronale Verarbeitung der aus den Photorezeptoren stammenden magnetischen Richtungsinformation analog zum bildverarbeitenden Sehen stattfinden könnte. Modelle für eine mögliche Verschaltung und Signalverarbeitung der Cryptochromsignale werden in dieser Arbeit diskutiert. Insgesamt unterstützen die Befunde meiner Arbeit die im Radikalpaarmodell diskutierte Annahme, dass Cryptochrome eine entscheidende Rolle bei der Perzeption von magnetischer Kompassinformation bei Zugvögeln spielen und möglicherweise als Magnetrezeptormoleküle fungieren. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zu einem besseren Verständnis des Gesamtprozesses der Magnetrezeption bei Tieren leisten, und zwar von der Rezeptorzelle bis zur Verhaltensantwort. Meine Ergebnisse tragen möglicherweise auch dazu bei, die bekannten neurowissenschaftlichen und funktionell morphologischen mit den entsprechenden ethologischen Ergebnissen zu verknüpfen. Ich würde es sehr begrüßen, wenn meine Arbeit zu weiterführender Forschung auf diesem spannenden Gebiet anregt und zu einem besseren Verständnis der noch unbekannten Aspekte der Magnetrezeption beitrüge. One of the currently discussed models of the mechanism underlying light-dependent magnetoreception in migratory birds proposes that the direction of the magnetic field is perceived by ‘radical-pair’ processes in specialized photoreceptors, with cryptochromes suggested as potential candidate molecules mediating magnetic compass information. Behavioural studies have shown that avian magnetic compass orientation is lateralized in the right eye and requires light from the blue-green part of the spectrum. Cryptochromes, a class of photoactive flavoproteins are known to absorb in the same spectral range. Furthermore, they possess biochemical properties crucial for the ‘radical-pair’ model, including the ability to form radical pairs. In view of these considerations I searched for cryptochrome (CRY) in the retina of European robins, Erithacus rubecula, passerine birds that migrate at night. With molecular genetic methods I was able to isolate three individually expressed cryptochromes, Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b, and -CRY2. While eCRY1a and eCRY2 are homologous to cryptochrome 1 and 2 found in domestic chicken retina, eCRY1b owns a unique carboxy (C)-terminal, suggesting novel protein properties and interaction partners. eCRY2 was found to be located in the nucleus, therefore its involvement as a sensory light receptor in magnetoreception is less likely. A protein model of eCRY1 reveals the catalytic chromophor flavin adenine dinucleotide (FAD) and a light-harvesting pterin in the form of methenyltetrahydrofolate (MTHF) as cofactors. Both eCRY1-types are splice products of the same gene with their C-terminal domains encoded on different exons. Also, eCRY1a and eCRY1b are both cytosolic; according to the ‘radical-pair’ model they therefore need at least one spherically fixed interaction partner in order to act as magnetoreceptor molecule. Here, opsins are discussed as potential partners because they are arranged in high order and constant spatial direction in the outer segments of the retina’s photoreceptor cells. Expression levels of eCRY1a and eCRY1b differ between eyes as well as between CRY-types. In general, expression levels of eCRY1a in the Robin’s retina were about five to ten times higher than of eCRY1b. eCRY1a shows significant higher transcription levels in the left than in the right eye during dusk and at night. In contrast, the pattern of eCRY1b is similar in both retinae, with a significant peak at dusk. As a result, the ratio of the two eCRY1-transcripts is shifted in favour of eCRY1b in the right eye during the daily onset of migration at dusk. The results of my expression study suggest that the reported lateralization in the behavioural experiments might already start at the receptor level. mRNA in-situ and immunolocalisation experiments show that mRNA as well as the proteins of both eCRY1-types are located in the inner segments of the photoreceptor cells in the bird’s retina. The spatial vicinity further supports the assumption of opsin as interaction partner of eCRY1 in the process of magnetoreception. It also suggests that magnetic input originating in the photoreceptors of the bird’s retina possibly shares neuronal pathways with the visual system. Several models of how the cryptochrome signals could possibly be processed are discussed. In light of the 'radical-pair' model, the findings of my work support a potential role of cryptochromes as transducers for the perception of magnetic compass information in birds. Also, they might represent an important step to a more detailed understanding of the overall process from receptor cell to behaviour. My results contribute to connecting the known neurobiological and functional morphologic findings with respective ethological responses. Hopefully, this work encourages further research in this field in order to unravel the mystery of magnetoreception in animals.

Deactivation channels of excited states in green and red fluorescing proteins (GFP, RFP) and mutants as well as flavoproteins have been investigated by steady-state and femtosecond/picosecond time-resolved fluorescence/absorption spectroscopy. Besides fast internal conversion, energy transfer between chromophores in different maturation states in oligomers of DsRed as well as from the antenna molecule to the flavin cofactor in (6-4) photolyase and cryptochrom2 has been established as photophysical primary process. In cryptochrom1, electron transfer from nearby tyrosyl and tryptophane residues to FAD is the initial step in signal transduction, as is intersystem crossing in the LOV2 domain in phototropin. Mit den Methoden stationärer und femto-/pikosekunden zeitaufgelöster Fluoreszenz/Absorptionsspektroskopie wurden die Desaktivierungswege angeregter Zustände bei grün und rotfluorezierenden Proteinen (GFP, RFP) und ihren Mutanten sowie Flavoproteinen untersucht. Als photophysikalische Primärprozesse wurden schnelle Innere Konversion, Energietransfer zwischen unterschiedlich maturierten Chromophoren in Oligomeren bei RFP und zwischen Antennenpigment und Flavin bei (6-4) Photolyase und Cryptochrom 2, Elektrontransfer von Tyrosyl- bzw. Tryptophanresten zum angeregten Flavin in Cryptochrom 1 und 2 und Intersystem Crossing in der LOV 2-Domäne des Phototropins nachgewiesen.

Cryptochromes (CRY) are blue/UV-A photoreceptors related to the DNA-repair enzyme DNA-photolyase. So far, they have been found in plants, animals and humans. However, their evolutionary origin is unclear. Sequence comparisons indicated that cryptochromes may have arisen twice during evolution, the plant photoreceptors from the class I CPD DNA-photolyases, and the animal cryptochromes from (6-4) photolyases (Kobayashi et al., 2000). Here we show that the Synechocystis gene sll1629 encodes a cryptochrome type photoreceptor. Thus, cryptochromes already exist in cyanobacteria. Closely related to sll1629 is the Arabidopsis gene At5g24850. Its encoded protein carries a dual transit sequence and is targeted to chloroplasts and mitochondria. Thus, CRYs may have been transferred to plants from the photosynthetic endosymbiont. However, Arabidopsis CRY1 and CRY2 are only distantly related to sll1629 but more closely to sequences in ? -proteobacteria, which indicates that plants may have received the cryptochromes by a dual horizontal gene transfer., In dieser Arbeit wurden Photolyase/Cryptochrom-homologe Proteine (cry und phr) aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 und ein neues Cryptochrom (At-cry3) aus der Hoeheren Pflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert. Synechocystis CRY liegt mit den offenen Leserastern sll1628 und sll1630 in einem Operon. Die durch sll1628 kodierte Aminosaeuresequenz besitzt eine schwache Homologie zu einem TPR (tetratricopeptide repeat)-Domaenen Protein; die sll1630 Aminosaeuresequenz ist zu keinem bekannten Protein homolog. Für das in E. coli heterolog exprimierte Synechocystis cry konnte nachgewiesen werden, dass es nicht kovalent FAD bindet. Die phr und cry Mutanten zeigten hinsichtlich Wachstum und Pigmentzusammensetzung weder unter photoautotrophen und heterotrophen Wachstumsbedingungen noch im Dauer-Blau- oder Rotlicht einen vom Wildtyp abweichenden Phaenotyp. Im UV-B ist in der cry Mutante im Gegensatz zur phr Mutante und dem Wildtyp die de novo Synthese fuer das D1 Protein des Photosystem II nicht induziert. In der cry Mutante ist ferner die Phototaxis zum Rot- und Dunkelrotlicht reduziert. Mittels quantitativer RT-PCR-Analysen wurde die lichtabhaengige Induktion der Transkription des psbA3 Gens, das fuer das Photosystem II D1 Protein kodiert, ueber einen großen Spektralbereich und beim Wechsel von niedriger zu hoher Fluenzrate untersucht. Unter den gewaehlten Lichtbedingungen ist mit Ausnahme von Dunkelrot in der cry Mutante die psbA3 Induktion abgeschwaecht, besonders drastisch im UV-A-Bereich. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass sll1629 fuer ein Cryptochrom kodiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Protein At5g24850 (At-cry3) aus Arabidopsis thaliana untersucht. At-cry3 ist 569 Aminosaeuren gross und besitzt ueber einen Bereich von 400 Aminosaeuren ca. 50 Prozent Identitaet zu Synechocystis cry. Durch in vitro Import und GFP-Lokalisationsstudien wurde nachgewiesen, dass die N-terminalen 63 Aminosaeuren von At-cry3 notwendig und hinreichend fuer den Import dieses Proteins sowohl in Mitochondrien als auch in Chloroplasten sind. At-cry3 wurde als His-tag-Fusion heterolog in E. coli ueberexprimiert. Spektroskopische Analysen zeigten, dass At-cry3 nicht kovalent FAD bindet. Weder spektroskopisch noch mit Duennschichtchromatographie konnte ein zweiter Kofaktor nachgewiesen werden. Durch Expression von At-cry3 in einem Photolyase-defizienten E.-coli-Stamm und in vitro und in vivo Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass At-cry3 keine Photolyaseaktivitaet besitzt. Ferner zeigten in vitro DNA-Bindungsstudien, dass At-cry3 sequenzunspezifisch an einzel- und doppelstraengige DNA bindet. Die Frage, ob At-cry3 eine Mutation in Synechocystis cry komplementieren kann, kann mit den vorliegenden Daten noch nicht abschliessend beantwortet werden. In Zusammenarbeit mit unserer AG hat Peter Lockhart, Massey University, New Zealand, einen Stammbaum mit ueber 70 Mitgliedern der Photolyase/Cryptochrom-Familie erstellt. Dieser deutet an, dass Pflanzen ihre Cryptochrome durch einen dualen horizontalen Gentransfer erhalten haben koennten: das CRY3 Gen von Cyanobakterien, den Vorlaeufern der Plastiden, Gene der CRY1/CRY2-Familie von Aplpha-Proteobakterien, den Vorlaeufern heutiger Mitochondrien.

Althougth the physiological functions of plant cryptochromes have been thoroughly investigated and their near relatives, the photolyases have been studied on the molecular level in very detail, the knowledge about the signal transduction of the cryptochromes however is relatively poor. Following the aim to find out more about these molecular processes, this work presents insights into some aspects, using Arabidopsis cry2 as a model. In this thesis, a light dependent posphorylation of cry2 has been discovered and further investigated. The recorded action-spectrum of this phosphorylation shows clear characteristics of a flavin-spectrum. Attempts to identifiy the responsible kinase have not been finished so far. A potential autophosphorylation activity connected with cry2 has been discussed, but could not be proven, finally. Further experiments with heterologouesly expressed cry2 in yeast resulted in data that suggest a role of cry2 as light dependent transcription activator. Also a DNA-binding activity of in vitro-transcribed and -translated cry2 has been demonstrated. Furthermore, the subcellular localization of two putative interaction partners of cry2 ? At5g26280 and At2g02230 - has been described. At2g02230 has been identified as functional F-box protein. Studies to elucidate the degradation pathway of cry2 could not strengthen the model of a proteasomal degradation.Althougth the physiological functions of plant cryptochromes have been thoroughly investigated and their near relatives, the photolyases have been studied on the molecular level in very detail, the knowledge about the signal transduction of the cryptochromes however is relatively poor. Following the aim to find out more about these molecular processes, this work presents insights into some aspects, using Arabidopsis cry2 as a model. In this thesis, a light dependent posphorylation of cry2 has been discovered and further investigated. The recorded action-spectrum of this phosphorylation shows clear characteristics of a flavin-spectrum. Attempts to identifiy the responsible kinase have not been finished so far. A potential autophosphorylation activity connected with cry2 has been discussed, but could not be proven, finally. Further experiments with heterologouesly expressed cry2 in yeast resulted in data that suggest a role of cry2 as light dependent transcription activator. Also a DNA-binding activity of in vitro-transcribed and -translated cry2 has been demonstrated. Furthermore, the subcellular localization of two putative interaction partners of cry2 ? At5g26280 and At2g02230 - has been described. At2g02230 has been identified as functional F-box protein. Studies to elucidate the degradation pathway of cry2 could not strengthen the model of a proteasomal degradation., Obwohl über die physiologische Bedeutung der pflanzlichen Cryptochrome bereits viel bekannt ist, und deren nahe Verwandte, die Photolyasen auch molekular sehr detailliert, einschließlich der Struktur auf atomarer Ebene, charakterisiert sind, sind die Mechanismen der Signalweiterleitung bei den Cryptochromen bis heute nur wenig erforscht. Dem Ziel folgend, diese molekularen Prozesse aufzuklären, wurde in dieser Arbeit Arabidopsis- Cryptochrom 2 untersucht. Es wurde dabei die lichtabhängige Phosphorylierung von cry2 entdeckt und näher untersucht. Das Aktionspektrum dieser Phosphorylierung ähnelt dabei stark einem Flavinspektrum. Versuche, die für diesen Prozess verantwortliche Kinase zu identifizieren, konnten nicht abgeschlossen werden. Eine Autophosphorylierungsaktivität wurde in Kooperation mit Margaret Ahmad (Paris) für cry1 gefunden, ist für cry2 bislang aber nicht gezeigt. In Hefe heterolog exprimiertes cry2 zeigt lichtabhängige Effekte, die auf mögliche Eigenschaften von cry2 als Transkriptionsaktivator schließen lassen. Zudem konnte eine DNA- Bindung für in vitro- transkribiertes und -translatiertes cry2 gezeigt werden. Untersuchungen zum Abbauweg von cry2 konnten unsere These eines proteasomalen Abbau von cry2 nicht bestätigen. Die subzelluläre Lokalisation zweier putativer Interaktionspartner von cry2 - At5g26280 und At2g02230 - wurde über konfokale Laserscan- Mikroskopie untersucht. At2g2230 konnte zudem als funktionelles F-Box Protein identifiziert werden.