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Der Verlauf nach einer Nierentransplantation weist eine große Variabilität auf. Genetische Faktoren scheinen diesen zu beeinflussen. Der nukleäre Transkriptionsfaktor \(\kappa\)B (NF-\(\kappa\)B) stellt einen Schlüsselmechanismus bei der Inflammation, der Immunabwehr und der Zellproliferation dar. So wurde in dieser Studie geprüft, ob der NF\(\kappa\)B1-Promotorpolymorphismus (-94ins/delATTG) mit der Abstoßungsreaktion und der Infektion mit dem Cytomegalievirus nach einer Nierentransplantation assoziiert ist. Die Analysen ergaben, dass der homozygote Insertionsgenotyp ein 1,7-fach höheres Risiko aufwies eine CMV-Infektion zu erlangen. Die Infektionen traten nicht nur häufiger, sondern auch zu einem späteren Zeitpunkt auf, was mit einem schwereren Verlauf verknüpft ist. Der Promotorpolymorphismus war nicht mit der akuten Abstoßungsreaktion assoziiert. Zukünftig könnte so nicht nur der Serostatus beim Prophylaxeschema des CMV berücksichtigt, sondern auch genetische Varianten als Risikofaktoren einbezogen werden.

The HCMV protein hIE1 is a multifunctional regulator that can, on one hand, antagonise the immune system in different ways and, on the other hand, promote lytic replication through interaction and stabilisation of the cellular protein hFEN1 or by transactivation of viral promoters. IE1 antagonises PML-NBs, a part of the intrinsic immune system, through interaction with PML followed by it´s deSUMOylation and disruption. Quantitative analysis, using NanoBRET assays, showed that the interaction of PML with IE1 is species-specific. Using further biological methods, it was shown that the deSUMOylation and disruption of PML is also species-specific. The species specificity, similarity of crystal structures and low sequence identity of hIE1 and rIE1 core were used to search for a possible interaction surface of hIE1 with PML. Stably expressed mutants were generated in which helices (H1, H1/2, H4, H5, H8 or H10/11) of hIE1 were exchanged with helices of rIE1. As none of these mutants were able to interact with PML or disperse it, we assume that the interaction surface consists of several protein helices. Furthermore, the functional integrity of the mutants was investigated by analysing additional hIE1 functions. A possible interaction site of hFEN1 was identified in helix 1 of hIE1, while the other helices have no influence on the interaction. Furthermore, since we found that interaction of hIE1 with hFEN1 is not sufficient for protein stabilisation, we assume that recruitment of an additional cellular factor is required for hFEN1 stabilisation. Transactivation of promoters was investigated by Gaussia luciferase assays and showed that only the mutant carrying helix 1 exhibited activity. In summary, these results indicate that the exchange of protein helices affects different functions of hIE1. However, no interaction surface of IE1 and PML could be identified. In addition, various functions of rIE1 were analysed in comparison to hIE1. It could be shown that while hFEN1 interaction and stabilisation is species-specific, the core domain of rIE1 is sufficient to activate viral promoters and antagonise the innate immune system through STAT2 interaction and relocalisation. Furthermore, since rIE1, unlike hIE1, cannot colocalise with mitotic chromatin, RCMV probably encodes a different protein that ensures genome maintenance. These results suggest that specific functions of IE1 have been conserved during evolution, which are probably crucial for maintaining CMV in different species.

Human cytomegalovirus (HCMV) has been known to be a widespread pathogen in the human population. In most cases an infection remains asymptomatic and without consequences for its host. However, immunocompromised patients are at risk of suffering from severe complications like retinitis, colitis or in case of antenatal infections hearing losses or microcephaly. As treatment options are currently limited and associated with high levels of toxicity, new viral targets are needed to treat this growing group of patients. While the crucial role of glycoprotein UL132 (gpUL132), a viral tegument protein, for replication of HCMV has been known for some time, its underlying mechanisms remain elusive. A pronounced morphological and replicative defect in the cytoplasmic viral assembly complex (cVAC) has been described in the absence of gpUL132. This study aimed at better understanding the role of gpUL132 in cVAC biogenesis and viral replication. The emphasis was placed on the interaction between gpUL132 and cellular microtubules. The phenotype was controlled using a circularity assay. The quantitative role of gpUL132 in cVAC biogenesis was investigated with nocodazole washout assays. To control for protein concentrations as possible qualitative differences, Western blots were performed. In this study, it was shown that the cVAC defect observed with gpUL132-deficient viruses does not depend on noncentrosomal nucleation. Furthermore, an SxIP-motif found in gpUL132 did not exhibit any influence on cVAC morphology or nucleation. The protein concentrations did not indicate differences depending on the presence of gpUL132. A hitherto unknown decrease of intracellular calmodulin-regulated spectrin-associated protein 2 levels during late stage infections with gpUL132 competent mutant viruses was observed. Its role remains unclear. More work is needed to reveal the mechanisms of viral modulation of the cellular cytoskeleton.

Bei Patienten mit Erkrankungen des blutbildenden Systems ist die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) eine häufig eingesetzte kurative Therapie. Im Rahmen dieser Transplantation werden nicht nur vom Spender gewonnene hämatopoetische Stammzellen auf den Empfänger übertragen, sondern immer auch im peripheren Blut vorhandene T-Zellen. Dies kann zum einen einen positiven Effekt zum anderen aber auch negative Folgen für den transplantierten Patienten mit sich bringen. Eine negative Auswirkung wäre die sogenannte Graft-vesus-Host Disease (GvHD), bei der die T-Zellen des Spenders Zellen des Empfängers als fremd erkennen und angreifen. Klinisch manifestiert sich dies vor allem an Leber, Haut und Darm mit Ikterus, Dermatitiden und Diarrhoen. Einen gewünschten Effekt, den die übertragenen T-Zellen vor allem bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) mit sich bringen können, ist der sogenannte Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt. Dabei richten sich vom Spender stammende Immunzellen gegen die Tumorzellen des Empfängers und senken damit das Rezidivrisiko der Leukämie. In verschiedenen Studien konnte eine positive Korrelation von CMV-Reaktivierung nach HSZT und einem niedrigerem Rezidivrisiko der hämatopoetischen Grunderkrankung gezeigt werden. Diese Doktorarbeit widmet sich auf Grundlage dessen der Frage, ob Cytomegalievirus (CMV)-spezifische cytotoxische T-Zellen (CTL) direkt durch Kreuzreaktivität zum GvL-Effekt beitragen. Zunächst wurden periphere mononukleäre Zellen (PBMC) aus dem Blut neun gesunder Spender isoliert, die als CMV-seropositiv ausgetestet wurden. Diese wurden mit dem CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid stimuliert und in Kultur angereichert. Zusätzlich wurden die expandierten CMV-spezifischen CTL durch eine spezifische Selektion über den Aktivierungsmarker CD137 weiter angereichert. Nach Expansion und Anreicherung zeigten jeweils 75% (Spender 1), 67% (Spender 2), 74% (Spender 3), 86% (Spender 4), 81% (Spender5), 80% (Spender 6), 84% (Spender 7), 51% (Spender 8) und 69% (Spender 9) der CD3+/CD8+-T-Zellen eine IFN-γ-Produktion und CD107a-Expression nach Stimulation mit dem CMVpp65-Einzelpeptid. IFN-γ als Effektormolekül der zytotoxischen Granula der CTL und CD107a als Degranulationsmarker beweisen die spezifische Zytotoxizität. Somit konnte die erfolgreiche Anreicherung funktionsfähiger CMVpp65-spezifischer CTL gezeigt werden. Um zu untersuchen, ob diese nun kreuzreaktiv tumorassoziierte Antigene (TAA) erkennen, wurden sie ebenfalls mit folgenden TAA stimuliert: WT1, Proteinase 3, PRAME, NY-ESO, Muc1 und Bcl-2. Die Stimulation erfolgte entweder über die direkte Zugabe von Einzelpeptiden bzw. Peptidpools oder über die Beladung und Präsentation dieser Peptide bzw. Peptidpools über dendritische Zellen (DC). Die DC wurden aus Monozyten des jeweiligen Spenders generiert. Im Falle von drei Spendern zeigt sich ebenfalls eine deutliche zytotoxische Funktion nach Stimulation mit dem WT1-(DFKDCERRF)-Einzelpeptid durch IFN-γ-Produktion und CD107a-Expression bei 75% (Spender 1), 35% (Spender 4) und 33% (Spender 7) der CD3+/CD8+-T-Zellen. Wie zuvor erwähnt lag der Anteil der CD3+/CD8+-T-Zellen mit spezifischer Zytotoxizität nach Stimulation mit dem CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid bei diesen drei besagten Spendern bei 74% (Spender1), 86% (Spender 4) und 84% (Spender7). So ergab sich für diese drei Spender eine gemeinsame Schnittmenge von 48,92% (Spender 1), 21,07% (Spender 4) und 17,45% (Spender 7) derjenigen Zellen, die sowohl nach Stimulation mit CMVpp65-(NLVPMVATV)-Einzelpeptid und WT-(DFKDCERRF)-Einzelpeptid eine zytotoxische Funktion zeigten, sodass von einer kreuzreaktiven Erkennung dieser beiden Peptide in diesen drei Spendern ausgegangen werden muss. Die für diese Spender gezeigte kreuzreaktive Erkennung könnte zum GvL-Effekt bei Leukämie/Myelom-Patienten nach HSZT beitragen., Patients who suffer a disease affecting the hematopoietic system can be treated with allogenic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). One positive effect which can go along with the HSCT is the so-called graft versus leukemia (GvL) effect. This phenomenon describes a process where donor immune cells attack tumor cells of the recipient organism an thereby lower the relapse risk of the treated disease. Different studies showed a positive correlation between Cytomegalovirus (CMV) reactivation in patients after HSCT and a lower relapse risk of the treated hematopoietic disease. This thesis is devoted to the question whether CMV-specific T cells cause a GvL effect through their cross reactivity. Therefore, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 50 healthy CMV-positive donors. In nine cases CMV-specific T cells were successfully generated and expanded by culturing PBMC in the presence of CMVpp65-( NLVPMVATV)- single peptide to perform the final analysis: testing the cytotoxicity by measuring IFN-ɣ-production and expression of CD107a after presentation of CMVpp65-( NLVPMVATV)- single peptide, CMVpp65 peptide pool and different tumor associated antigens (WT1, Proteinase 3, PRAME, NY-ESO, Muc1 und Bcl-2). As key result in cases of three donors the final analysis demonstrated evidence of cytotoxicity of CMV-specific T cells following presentation of both CMVpp65-(NLVPMVATV)- single peptide and WT1-( (DFKDCERRF)- single peptide. The common intersection of cytotoxic T cells is valued at 74%, 86% and 84%. Thus, we can assume cross reactive recognition of the two peptides in cases of these three donors. This demonstrable cross reactive recognition could possibly have an impact on GvL effect in patients after HSCT who suffered from Leukemia or Myeloma.

PML nuclear bodies (PML-NBs) are dynamic macromolecular complexes that mediate intrinsic immunity against viruses of different families, including human cytomegalovirus (HCMV). Upon HCMV infection, PML-NBs target viral genomes entering the nucleus and restrict viral immediate–early gene expression by epigenetic silencing. Studies from several groups performed in human fibroblast cells have shown that the major PML-NB components PML, Daxx, Sp100 and ATRX contribute to this repression in a cooperative manner. Their role for HCMV restriction in endothelial cells, however, has not yet been characterized although infected endothelium is thought to play a crucial role for HCMV dissemination and development of vascular disease in vivo. Here, we use conditionally immortalized umbilical vein endothelial cells (HEC-LTT) as a cell culture model to elucidate the impact of PML-NB proteins on lytic HCMV infection. Depletion of individual PML-NB proteins by lentiviral transduction showed a particularly strong antiviral effect of PML in HEC-LTT, compared to human fibroblasts. A closer characterization of this antiviral function revealed that PML may not only effectively inhibit HCMV immediate-early gene expression but also act at later steps of the viral replication cycle. At contrast, we surprisingly noted an antiviral behavior of Daxx in complementary approaches: Depletion of Daxx resulted in decreased viral gene expression, while overexpression of Daxx promoted HCMV infection. In summary, our data demonstrate a cell type-specific effect of PML-NB components on lytic HCMV infection and suggest an important role of PML in the inhibition of HCMV dissemination through infected endothelial cells., publishedVersion

Polymorphonuclear leukocytes (PMNs) presumably transmit human cytomegalovirus (HCMV) between endothelial cells in blood vessels and thereby facilitate spread to peripheral organs. We aimed to identify viral components that contribute to PMN-mediated transmission and test the hypothesis that cellular adhesion molecules shield transmission sites from entry inhibitors. Stop codons were introduced into the genome of HCMV strain Merlin to delete pUL74 of the trimeric and pUL128 of the pentameric glycoprotein complex and the tegument proteins pp65 and pp71. Mutants were analyzed regarding virus uptake by PMNs and transfer of infection to endothelial cells. Cellular adhesion molecules were evaluated for their contribution to virus transmission using function-blocking antibodies, and hits were further analyzed regarding shielding against inhibitors of virus entry. The viral proteins pUL128, pp65, and pp71 were required for efficient PMN-mediated transmission, whereas pUL74 was dispensable. On the cellular side, the blocking of the αLβ2-integrin LFA-1 reduced virus transfer by 50% and allowed entry inhibitors to reduce it further by 30%. In conclusion, these data show that PMN-mediated transmission depends on the pentameric complex and an intact tegument and supports the idea of a virological synapse that promotes this dissemination mode both directly and via immune evasion., publishedVersion

In dieser Promotionsarbeit wurde Live Cell Imaging am Institut für Virologie der Universität Ulm etabliert. Ziel der Forschung war ein besseres Verständnis für die dynamischen Vorgänge bei der Bildung des cytoplasmic viral Assembly Compartment (cVAC) in HCMV-infizierten Fibroblasten. Das cVAC ist Schauplatz des "secondary envelopment", eines wichtigen Schrittes bei der Generierung infektiöser Viruspartikel. Nach erfolgreicher Etablierungsphase wurde mittels Live Cell Imaging untersucht, wie sich die Abwesenheit des viralen HCMV-Glykoproteins gpUL132 auf die Dynamik des Infektionsgeschehens in HCMV- infizierten humanen Fibroblasten auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass bei Abwesenheit von gpUL132 eine Bildung des cVAC zwar möglich ist, die cVAC-Phänotypen stellen sich jedoch beeinträchtigt dar. Darüber hinaus scheint sich die Abwesenheit von gpUL132 negativ auf die Stabilisierung des cVAC auszuwirken.

Nach einer meist subklinischen Prim��rinfektion persistiert das humane Cytomegalovirus (HCMV) lebenslang im K��rper und kann unter Immunsuppression reaktiviert werden und schwerwiegende Krankheitsverl��ufe verursachen. In der H��lle von HCMV kommen unterschiedliche Glykoproteine vor, zu denen auch pUL74 z��hlt, das in einem trimeren Komplex zusammen mit gH und gL wichtig f��r den Eintritt in Zielzellen ist. Dieses hochpolymorphe Protein weist bei einem 54 kDa umfassenden Peptidger��st etwa 65 kDa an N-Glykosylierung auf. Neben gro��em Einfluss auf Faltung und Stabilit��t von Proteinen ist f��r N-Glykosylierung viraler Proteine auch eine immunevasive Funktion bekannt. Die Funktion der Glykane an pUL74 war bislang unbekannt. Daher sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob die Glykane essentiell f��r die Integrit��t von pUL74 und dessen Funktion bei der Virusreplikation sind. Sollten sich die Glykane an pUL74 als nicht essentiell erweisen, k��nnte dieses mutierte Virus in der Impfstoffentwicklung eine Rolle spielen. Zun��chst wurde eine Virusmutante generiert, in deren offenem Leserahmen UL74 alle vorhergesagten N- und O-Glykosylierungsstellen durch konservativen Austausch von Aminos��uren entfernt wurden. Diese Virusmutante (pUL74deglyc) wurde dann bez��glich Ausbreitung in der Zellkultur, zellfreier Infektiosit��t und Komplexbildung untersucht. Sowohl die Ausbreitungskapazit��t dieses pUL74deglyc-Virus in Fibroblasten, als auch die zellfreie Infektiosit��t von Fibroblasten war auf das Level einer pUL74stop-Mutante reduziert. Trotz entfernter Glykosylierungsstellen konnte pUL74 im Western Blot als einzelnes Protein auf der H��he von ca. 60 kDa nachgewiesen werden, allerdings in deutlich reduzierter Menge. Ein trimerer Komplex mit gH und gL war jedoch bei der Mutante im Western Blot nicht nachweisbar. Glykosylierungsstellen in der N��he von konservierten Cysteinen scheinen Einfluss auf die Ausbildung von Disulfidbr��cken zu habe. Daher wurden in einem zweiten Ansatz alle O-Glykosylierungsstellen und vier N-Glykosylierungsstellen in der N��he von Cysteinen, die bei der Bildung des trimeren Komplexes wichtig sind, wieder eingef��gt. Mit zunehmender Glykosylierung war pUL74 im reduzierenden Western Blot wieder in h��herer Menge nachweisbar. Der trimere Komplex konnte allerdings weiterhin nicht nachgewiesen werden, und entsprechend war die Infektiosit��t dieser Viren ebenso stark reduziert wie die des pUL74deglyc-Virus. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Glykosylierungsstellen an pUL74 wichtig f��r die Integrit��t des Proteins und die Ausbildung des trimeren Komplexes und damit auch f��r die Virusreplikation sind. In zuk��nftigen Studien k��nnten weitere Glykosylierungsstellen wieder eingef��gt werden, bis auch der trimere Komplex wieder gebildet werden kann, um dann die Auswirkung der noch fehlenden Glykane auf die Immunogenit��t untersuchen zu k��nnen.

Genetische Faktoren scheinen den Verlauf nach einer Nierentransplantation zu beeinflussen. In dem Gen des Wasserkanals Aquaporin 5 wurde der SNP beschrieben, der mit Schl��sselmechanismen der Inflammation wie der Immunzellmigration assoziiert ist. Da nach einer Nierentransplantation Absto��ungsreaktionen und Infektionen mit dem Cytomegalievirus auftreten k��nnen, wurde getestet, ob der SNP mit diesen Komplikationen assoziiert ist. In unserer Studie wurden Speichelproben entnommen. Mittels Polymerase-Kettenreaktion wurde die Position -1364 des SNP analysiert. Die Analysen ergaben, dass das C-Allel des SNP ein Risikofaktor f��r eine CMV-Infektion darstellt. Der \(\it AC/CC\)-Genotyp wies ein mehr als doppelt so hohes Risiko f��r eine CMV-Infektion nach Transplantation auf. Der SNP ist in unserem Kollektiv nicht mit der Absto��ungsreaktion assoziiert.

Die durch eine Infektion mit dem Humanen Cytomegalievirus gesteigerte Morbidit��t und Mortalit��t, insbesondere in den klinischen Bereichen P��diatrie und H��matoonkologie, zu verringern, stellt die virologische Forschung noch immer vor eine gro��e Herausforderung. Die Entwicklung antiviraler Therapeutika ist von gro��er Wichtigkeit f��r die Reduzierung HCMV-assoziierter Erkrankungsf��lle und daraus resultierenden Folgesch��den. In der vorliegenden Arbeit wurden potentielle antivirale Zielstrukturen im Hintergrund des klinischen Isolats Merlin auf Ihre Bedeutung f��r das Wachstum dieses Virusstammes hin untersucht. Es wurden hierf��r durch markerlose BAC-Mutagenese gezielt genetische Bereiche modifiziert, die f��r die bereits zuvor im Labor untersuchten Proteine pUL71, pUL103 und gpUL132 kodieren. Die Viren mit Ver��nderungen in diesen Genbereichen wurden dann in Wachstumsanalysen untersucht. Hierbei konnte f��r den pUL71/pUL103-Proteinkomplex gezeigt werden, dass ein Fehlen dieses viralen Genproduktes im klinischen Isolat zu deutlichen Wachstumsdefekten f��hrt. F��r das ebenfalls untersuchte virale Glykoprotein gpUL132 war hingegen in einer gpUL132-defizienten Merlin Virus-Mutante kein eindeutiger ��ber die gesamte Dauer der Analyse bestehender Wachstumsdefekt festzustellen. Zu finden waren im Hintergrund dieses Virus jedoch ein im Durchschnitt weniger rundes vAC, was vermuten l��sst, dass dieses Glykoprotein f��r die korrekte vAC-Biogenese, Bedeutung besitzt. Die genaue Funktion von gpUL132 bleibt jedoch weiterhin unklar und sollte deshalb Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) kann sich zwischen Zellen zellfrei oder zellassoziiert ausbreiten. Beim Eintritt zellfreier Virionen in Fibroblasten benötigt HCMV den Glykoprotein-Trimer aus den Glykoproteinen H, L und O (gH/gL/gO), um an den zellulären Rezeptor platelet-derived-growth-factor-receptor-alpha (PDGFRα) zu binden und das virale Fusionsprotein Glykoprotein B zu aktivieren. Über die molekularen Grundlagen der zellassoziierten Ausbreitung ist weniger bekannt. In dieser Arbeit sollte der Beitrag des viralen Proteins gO bzw. seines zellulären Rezeptors PDGFRα zum zellassoziierten Wachstum untersucht und die Wirkweise von PDGFRα-Peptiden bei der Hemmung dieser Ausbreitung analysiert werden. In Fibroblastenkulturen, die mit klinischen HCMV-Isolaten infiziert waren, wurde die Expression der Proteine durch Knockdown mittels siRNA vermindert und mit quantitativen Immunoblotting-Analysen gemessen. Der Effekt auf die Virusausbreitung wurde durch Immunfluoreszenz-Nachweis infizierter Zellen in den Isolat-Kulturen erfasst. Um den Wirkmechanismus der inhibitorischen PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 zu analysieren, wurden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt und der Transfer einzelner Viruspartikel in den Infektionsherden durch Immunfluoreszenz visualisiert. Die Verwendung eines doppelt-fluoreszierenden Modellvirus erlaubte dabei, Effekte auf Adsorption und Penetration zu differenzieren. Mit einer gO-Deletionsmutante wurde schließlich geprüft, ob die Hemmwirkung der Peptide von gO abhängt. Sowohl der Knockdown von gO als auch von PDGFRα reduzierte die zellassoziierte Virusausbreitung der klinischen HCMV-Isolate, was die Bedeutung der beiden Proteine für die zellassoziierte Ausbreitung von HCMV belegt. Die Immunfluoreszenz-Färbung der Viruspartikel zeigte, dass die PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 den Partikeltransfer von infizierten Zellen auf neue Zielzellen hemmen, indem sie die Zahl der adsorbierten und den Anteil der penetrierten Viruspartikel vermindern, und zwar mit einer halbmaximalen Hemmkonzentration von 6-7,5 bzw. 13-15 µmol/l. Auch die gO-Deletionsmutante wurde in gleichem Maße gehemmt, was bedeutet, dass eine Bindung an gO für die Hemmwirkung nicht nötig ist. Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass gO und sein zellulärer Rezeptor auch für das zellassoziierte Wachstum von HCMV wichtig sind und damit potenzielle Ziele für eine antivirale Strategie zur Hemmung dieser Ausbreitungsform darstellen. Die PDGFRα-Peptide GT40 und IK40 wirken zwar offensichtlich nicht über eine Störung dieser Interaktion, ihr Wirkmechanismus macht sie aber zu wertvollen Werkzeugen, um die Partikelübertragung bei der zellassoziierten Ausbreitung im Detail zu analysieren.

Das humane Cytomegalovirus (HCMV) breitet sich in vivo vermutlich sowohl zellfrei als auch zellassoziiert aus. Während die zellfreie Infektion mit Laborstämmen gut untersucht wurde, ist zum zellassoziierten Modus wenig bekannt. Als Modellvirus hierfür wurde kürzlich der HCMV-Stamm Merlin-pAL1502 entwickelt. Er unterscheidet sich von zellfrei wachsenden Stämmen durch ein niedriges Verhältnis von gO zu pUL128, die als alternative Komplexpartner von gH/gL die Virusausbreitung beeinflussen. Ob die niedrige gO-Expression repräsentativ für zellassoziierte Patienten-Isolate ist, war unklar. In dieser Arbeit sollte ein fluoreszierendes Derivat von Merlin-pAL1502 generiert werden, um Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung zu visualisieren. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob Merlin-pAL1502 klinische HCMV-Isolate nicht nur bezüglich des Ausbreitungsmodus, sondern auch hinsichtlich der Expression von gO repräsentiert. Das Genom von Merlin-pAL1502 lag als bakterielles artifizielles Chromosom vor. Mittels markerloser Mutagenese wurden das Kapsid-assoziierte pp150 (UL32) und das Hüllglykoprotein M (UL100) mit grün bzw. rot fluoreszierenden Proteinen fusioniert. Das resultierende Virus Merlin-pAL1502-UL32EGFP-UL100mCherry erlaubte es, nackte von umhüllten Viruspartikeln zu unterscheiden. In Anwesenheit eines Hemmstoffes akkumulierten umhüllte Viruspartikel, was für den Transfer umhüllter Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung spricht. Im zweiten Teil wurden mittels quantitativem Westernblot acht klinische HCMV-Isolate und Merlin-pAL1502 bezüglich der Expression der von gO und pUL128 verglichen. Ein Zusammenhang mit dem Wachstum der Isolate und dem Genotyp der polymorphen gO-Proteins wurde durch Herdausbreitungsversuche und Sequenzierung untersucht. Die Expression von gO korrelierte positiv mit der Expression von pUL128, und war bei der Mehrzahl der Isolate signifikant höher als bei Merlin-pAL1502. Unterschiede in der Proteinsequenz von gO konnten die gO-Expressionslevel allein nicht erklären. gO korrelierte nicht mit der Herdgröße, und zellassoziierte Isolate exprimierten gO ähnlich stark wie ein zellfrei wachsender Stamm, was daraufhin deutet, dass eher pUL128 den Ausbreitungsmodus determiniert. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen erstmals einen Transfer kompletter Virionen bei der zellassoziierten Ausbreitung von HCMV, zeigen aber auch, dass es hinsichtlich der gO-Expression lohnend wäre, ein noch besser geeignetes zellassoziiertes Modellvirus auf der Basis der hier analysierten klinischen Isolate zu generieren.

Cell-free human cytomegalovirus (HCMV) can be inhibited by a soluble form of the cellular HCMV-receptor PDGFR��, resembling neutralization by antibodies. The cell-associated growth of recent HCMV isolates, however, is resistant against antibodies. We investigated whether PDGFR��-derivatives can inhibit this transmission mode. A protein containing the extracellular PDGFR��-domain and 40-mer peptides derived therefrom were tested regarding the inhibition of the cell-associated HCMV strain Merlin-pAL1502, hits were validated with recent isolates, and the most effective peptide was modified to increase its potency. The modified peptide was further analyzed regarding its mode of action on the virion level. While full-length PDGFR�� failed to inhibit HCMV isolates, three peptides significantly reduced virus growth. A 30-mer version of the lead peptide (GD30) proved even more effective against the cell-free virus, and this effect was HCMV-specific and depended on the viral glycoprotein O. In cell-associated spread, GD30 reduced both the number of transferred particles and their penetration. This effect was reversible after peptide removal, which allowed the synchronized analysis of particle transfer, showing that two virions per hour were transferred to neighboring cells and one virion was sufficient for infection. In conclusion, PDGFR��-derived peptides are novel inhibitors of the cell-associated spread of HCMV and facilitate the investigation of this transmission mode., publishedVersion

Human cytomegalovirus (HCMV) uses two major ways for virus dissemination: infection by cell-free virus and direct cell-to-cell spread. Neutralizing antibodies can efficiently inhibit infection by cell-free virus but mostly fail to prevent cell-to-cell transmission. Here, we show that the ���molecular tweezer��� CLR01, a broad-spectrum antiviral agent, is not only highly active against infection with cell-free virus but most remarkably inhibits antibody-resistant direct cell-to-cell spread of HCMV. The inhibition of cell-to-cell spread by CLR01 was not limited to HCMV but was also shown for the alphaherpesviruses herpes simplex viruses 1 and 2 (HSV-1, -2). CLR01 is a rapid acting small molecule that inhibits HCMV entry at the attachment and penetration steps. Electron microscopy of extracellular virus particles indicated damage of the viral envelope by CLR01, which likely impairs the infectivity of virus particles. The rapid inactivation of viral particles by CLR01, the viral envelope as the main target, and the inhibition of virus entry at different stages are presumably the key to inhibition of cell-free virus infection and cell-to-cell spread by CLR01. Importance: While cell-free spread enables the human cytomegalovirus (HCMV) and other herpesviruses to transmit between hosts, direct cell-to-cell spread is thought to be more relevant for in vivo dissemination within infected tissues. Cell-to-cell spread is resistant to neutralizing antibodies, thus contributing to the maintenance of virus infection and virus dissemination in the presence of an intact immune system. Therefore, it would be therapeutically interesting to target this mode of spread in order to treat severe HCMV infections and to prevent dissemination of virus within the infected host. The molecular tweezer CLR01 exhibits broad-spectrum antiviral activity against a number of enveloped viruses and efficiently blocks antibody-resistant cell-to-cell spread of HCMV, thus representing a novel class of small molecules with promising antiviral activity., publishedVersion

The human cytomegalovirus (HCMV) infects fibroblasts via an interaction of its envelope glycoprotein gO with the cellular platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRα), and soluble derivatives of this receptor can inhibit viral entry. We aimed to select mutants with resistance against PDGFRα-Fc and the PDGFRα-derived peptides GT40 and IK40 to gain insight into the underlying mechanisms and determine the genetic barrier to resistance. An error-prone variant of strain AD169 was propagated in the presence of inhibitors, cell cultures were monitored weekly for signs of increased viral growth, and selected viruses were tested regarding their sensitivity to the inhibitor. Resistant virus was analyzed by DNA sequencing, candidate mutations were transferred into AD169 clone pHB5 by seamless mutagenesis, and reconstituted virus was again tested for loss of sensitivity by dose-response analyses. An S48Y mutation in gO was identified that conferred a three-fold loss of sensitivity against PDGFRα-Fc, a combination of mutations in gO, gH, gB and gN reduced sensitivity to GT40 by factor 4, and no loss of sensitivity occurred with IK40. The resistance-conferring mutations support the notion that PDGFRα-Fc and GT40 perturb the interaction of gO with its receptor, but the relatively weak effect indicates a high genetic barrier to resistance., publishedVersion

The role of viral envelope glycoproteins, particularly the accessory proteins of trimeric and pentameric gH/gL-complexes, in cell-associated spread of human cytomegalovirus (HCMV) is unclear. We aimed to investigate their contribution in the context of HCMV variants that grow in a strictly cell-associated manner. In the genome of Merlin pAL1502, the glycoproteins gB, gH, gL, gM, and gN were deleted by introducing stop codons, and the mutants were analyzed for viral growth. Merlin and recent HCMV isolates were compared by quantitative immunoblotting for expression of accessory proteins of the trimeric and pentameric gH/gL-complexes, gO and pUL128. Isolates were treated with siRNAs against gO and pUL128 and analyzed regarding focal growth and release of infectious virus. All five tested glycoproteins were essential for growth of Merlin pAL1502. Compared with this model virus, higher gO levels were measured in recent isolates of HCMV, and its knockdown decreased viral growth. Knockdown of pUL128 abrogated the strict cell-association and led to release of infectivity, which allowed cell-free transfer to epithelial cells where the virus grew again strictly cell-associated. We conclude that both trimer and pentamer contribute to cell-associated spread of recent clinical HCMV isolates and downregulation of pentamer can release infectious virus into the supernatant., publishedVersion

Human cytomegalovirus (HCMV) is a human pathogenic herpesvirus associated with a variety of clinical symptoms. Current antiviral therapy is not always effective, so that improved drug classes and drug-targeting strategies are needed. Particularly host-directed antivirals, including pharmaceutical kinase inhibitors (PKIs), may help to overcome problems of drug resistance. Here, we focused on utilizing a selection of clinically relevant PKIs and determined their anticytomegaloviral efficacies. Particularly, PKIs directed to host or viral cyclin-dependent kinases, i.e., abemaciclib, LDC4297 and maribavir, exerted promising profiles against human and murine cytomegaloviruses. The anti-HCMV in vitro activity of the approved anti-cancer drug abemaciclib was confirmed in vivo using our luciferase-based murine cytomegalovirus (MCMV) animal model in immunocompetent mice. To assess drug combinations, we applied the Bliss independence checkerboard and Loewe additivity fixed-dose assays in parallel. Results revealed that (i) both affirmative approaches provided valuable information on anti-CMV drug efficacies and interactions, (ii) the analyzed combinations comprised additive, synergistic or antagonistic drug interactions consistent with the drugs&rsquo, antiviral mode-of-action, (iii) the selected PKIs, especially LDC4297, showed promising inhibitory profiles, not only against HCMV but also other &alpha, &beta, and &gamma, herpesviruses, and specifically, (iv) the combination treatment with LDC4297 and maribavir revealed a strong synergism against HCMV, which might open doors towards novel clinical options in the near future. Taken together, this study highlights the potential of therapeutic drug combinations of current developmental/preclinical PKIs.

Cellular restriction factors (RFs) act as important constitutive innate immune barriers against viruses. In 2006, the promyelocytic leukemia protein was described as the first RF against human cytomegalovirus (HCMV) infection which is antagonized by the viral immediate early protein IE1. Since then, at least 15 additional RFs against HCMV have been identified, including the chromatin regulatory protein SPOC1, the cytidine deaminase APOBEC3A and the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1. These RFs affect distinct steps of the viral replication cycle such as viral entry, gene expression, the synthesis of progeny DNA or egress. This review summarizes our current knowledge on intrinsic immune mechanisms restricting HCMV replication as well as on the viral strategies to counteract the inhibitory effects of RFs. Detailed knowledge on the interplay between host RFs and antagonizing viral factors will be fundamental to develop new approaches to combat HCMV infection., publishedVersion

Das humane Cytomegalovirus erhöht die Morbidität und Mortalität von Menschen mit beeinträchtigtem Immunsystem und kann zu schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen im Kindesalter führen, wenn es intrauterin übertragen wird. Das Virus wächst sowohl zellgebunden als auch zellfrei, wobei es sich in vivo wahrscheinlich vorwiegend zellgebunden verbreitet. Es ist wünschenswert, den Mechanismus dieses Ausbreitungsmodus genauer zu verstehen, um neue Therapieansätze zu entwickeln. Die Glykoproteine B (gB), H (gH), L (gL), M (gM) und N (gN) sind essenziell für das Wachstum zellfreier Stämme. Diese Arbeit untersucht, ob sie auch für die Ausbreitung eines rein zellgebundenen Stamms unentbehrlich sind. Um mögliche Unterschiede zwischen den beiden Ausbreitungsarten zu identifizieren, wurden in einem rein zellgebundenen und einem zellfreien Virusstamm alle genannten Glykoproteine einzeln eliminiert. Zunächst wurden durch markerlose Mutagenese Stopp-Codons in die jeweiligen Leserahmen der Virusgenome eingefügt, die als bakterielle artifizielle Chromosomen in E. coli vorlagen. Aus den mutierten Genomen wurden dann durch Transfektion in Fibroblasten die entsprechenden Viren rekonstituiert. Das Wachstumsverhalten der Virusmutanten nach Transfektion konnte auf einfache Weise gemessen werden, da die Virusstämme jeweils Gaussia Luciferase in das Kulturmedium abgaben und die Expression dieses Reporterenzyms an die Virusreplikation gekoppelt ist. Folglich konnte über den Verlauf der Enzymexpression auf den Phänotyp der Mutanten geschlossen werden. Die Elimination von gB, gH, gL und gM war in beiden genetischen Hintergründen jeweils letal für das Virus. Für gN zeigte sich, dass der zellfreie Stamm trotz der Stopp-Mutationen unvermindert wuchs, wohingegen der zellgebundene Stamm in seinem Wachstum weitgehend reduziert war. Die Lokalisation von gM wies indirekt darauf hin, dass trotz der Stopp-Mutationen – vermutlich aminoterminal trunkierte – gN-Proteine gebildet wurden, die das zellfreie und das zellgebundene Wachstum in unterschiedlichem Ausmaß ermöglichten. Um die Expression von gN vollständig zu verhindern, wurden weitere Stopp-Codons in den Leserahmen eingefügt und diese Mutationen waren im zellfreien und im zellgebundenen Stamm letal. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass gB, gH, gL, gM und gN, die essenziell für die zellfreie Ausbreitung sind, auch unentbehrlich für das Wachstum eines rein zellgebundenen Stamms sind. Vermutlich liegen also beiden Ausbreitungsarten die gleichen Mechanismen zugrunde. Der Aminoterminus von gN scheint jedoch insbesondere an der zellgebundenen Ausbreitung beteiligt zu sein. Dies könnte ein Ansatzpunkt sein, um neue antivirale Interventionsstrategien speziell für das zellgebundene Wachstum zu entwickeln.

Die ��tiologie und Pathogenese der Nekrotisierenden Enterokolitis (NEK) ist bis heute nicht ausreichend gekl��rt. Die Literatur beschreibt zahlreiche Risikofaktoren und Krankheitsmodelle. Diese Arbeit vermutet eine Entstehung einer NEK nach dem ���Triple-Risk���-Modell. Demnach f��hren das gleichzeitige Vorliegen von Vulnerabilit��t des S��uglings, das Auftreten einer kritischen Periode in der postnatalen Reifung, sowie exogene Faktoren zu einem Ausbruch der Krankheit. Ein exogener Faktor k��nnte das Zytomegalievirus (CMV) darstellen. Die hier vorliegende retrospektive und experimentelle Studie untersuchte FFPW-Gewebe aus kindlichem Darm mittels Immunhistochemie auf das Vorkommen und Expression des CMV-Antigens pp65. Untersucht wurden 58 chirurgisch entnommene Darmpr��parate, welche in 4 Gruppen eingeteilt wurden: Gewebe aus Gruppe 1 stammt von NEK-Patienten (n=24), entnommen in der akuten Krankheitsphase, Gewebe aus Gruppe 2 stammt von FIP-Patienten (n=6), Gewebe aus Gruppe 3 (n=17) stammt von Kontroll- Patienten, also Kindern, welche aus anderen Gr��nden (keine NEK, keine FIP) operiert wurden und Gewebe aus Gruppe 4 (N=11) stammt ebenfalls von NEKPatienten, entnommen in Folgeoperationen nach ausgeheilter NEK. Die immunhistochemische F��rbung erfolgte nach einem etablierten Protokoll. Die Expression des Antigens wurde in jeder einzelnen Darmschicht und pro Gruppe quantitativ untersucht. Jedes untersuchte Pr��parat zeigte sich CMV-positiv. Ziel der Arbeit war die folgenden Hypothesen zu ��berpr��fen: 1. NEK ist mit einer h��heren CMV-Expression assoziiert. (NEK vs. FIP) 2. FIP ist mit einer niedrigeren CMV-Expression assoziiert (FIP vs. NEK) Beide Hypothesen konnten best��tigt werden. Es zeigte sich eine signifikant st��rkere Expression des CMV bei NEK-Patienten im Vergleich zu FIP-Patienten. 3. NEK-Kinder sind besonders anf��llig f��r eine erh��hte CMV-Expression aufgrund der Fr��hgeburtlichkeit und ihrer Vulnerabilit��t (NEK vs. Kontrolle). Auch diese Hypothese gilt als best��tigt durch die tendenziell vermehrte Expression des CMV in Darmmukosa. 4. CMV-Expression in einer kritischen Periode in der Entwicklung des S��uglings hat Einfluss auf das Auftreten einer NEK (NEK vs. FIP, NEK vs. Interne Kontrolle) In dieser Arbeit zeigte sich eine Abnahme der CMV-Expression bei NEK-Patienten (Interne Kontrolle) im Verlauf. Damit konnte auch Hypothese 4 best��tigt werden. Das zeitliche Auftreten einer CMV-Infektion scheint einen Einfluss auf das Auftreten einer NEK zu haben und es liegt eine kritische Periode in der postnatalen Reifung vor. 5. CMV hat Einfluss auf das Auftreten einer NEK bei gleichzeitigem Vorliegen der Faktoren eNOS, iNOS, Nitrotyrosin, HIF-1-alpha, Nrf-2 und SOD. Diese stehen repr��sentativ f��r die Vulnerabilit��t der Kinder. Diese Hypothese konnte nicht best��tigt werden. Zusammenfassend hat diese experimentelle Untersuchung eine hohe Pr��valenz des CMV-Antigens pp65 bei chirurgisch entnommenen Darmpr��paraten von NEKund FIP-Patienten ergeben. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass eine erh��hte CMV-Expression tendenziell mit einer NEK und eine signifikant geringere CMVExpression mit einer FIP assoziiert ist. CMV scheint eine NEK-beg��nstigende und verst��rkende Rolle zu spielen und sollte als Risikofaktor f��r das Auftreten einer NEK ber��cksichtigt werden. Auch scheint das Vorliegen einer kritischen Periode in der Entwicklung des S��uglings vorzuliegen. Diese Erkenntnisse bilden einen wichtigen Ansatz f��r zuk��nftige Ma��nahmen in der Diagnostik, Therapie und Pr��vention der NEK. Weitere Studien scheinen notwendig, um zu pr��fen, wie CMV in der akuten Krankheitsphase idealerweise nicht-invasiv nachzuweisen ist und inwiefern Kinder mit einer NEK bei gleichzeitig positivem CMV-Nachweis von einer gezielten CMV-Therapie profitieren k��nnten.

Based on cell culture data, MHC class I downregulation by HCMV on infected cells has been suggested as a means of immune evasion by this virus. In order to address this issue in vivo, an immunohistochemical analysis of tissue sections from biopsy and autopsy materials of HCMV infected organs was performed. HCMV antigens from the immediate early, early, and late phase of viral replication, and cellular MHC class I molecules were detected simultaneously or in serial sections by immuno-peroxidase and immuno-alkaline phosphatase techniques. Investigated organs included lung, gastrointestinal tract, and placenta. Colocalization of MHC molecules with sites of viral replication as well as MHC expression in individual infected cells were analyzed. To detect immune effector cells at sites of viral replication, leukocytes, CD8+ lymphocytes, and HCMV antigens were stained in serial sections. While strong MHC class I expression was detected in the cells surrounding infected cells, it appeared downregulated in the majority of infected cells themselves, particularly in the late replication phase. Despite significantly reduced MHC class I signals on infected cells, sites of infection were infiltrated by inflammatory cells that consisted predominantly of CD8+ lymphocytes. The extent of inflammatory infiltrates was negatively correlated with the extent of HCMV infected cells. Taken together, our findings indicate that HCMV can downmodulate MHC class I expression in vivo, whereas cytokines originating from infiltrating immune effector cells probably up regulates MHC class I expression in noninfected bystander cells. The presence of cytotoxic lymphocytes in close contact to infected cells may reflect control of viral spread by these cells despite MHC class I downmodulation.

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Obwohl das Phosphoprotein pp65 ein Hauptbestandteil von humanen Cytomegaloviren (HCMV) und der codierende Leserahmen UL83 zwischen verschiedenen Virusstämmen hochkonserviert ist, ist das Protein für das Wachstum in Fibroblasten verzichtbar. Um pp65 zu untersuchen, wurden bisher Virusstämme verwendet, die teilweise genetische Veränderungen tragen, welche dazu führen, dass sich die Viren im Gegensatz zu klinischen Isolaten unter anderem zellfrei ausbreiten. Möglicherweise verdeckte dies eine Funktion von pp65, da angenommen wird, dass sich frische klinische Isolate zellassoziiert ausbreiten. In dieser Arbeit soll die Hypothese geprüft werden, dass pp65 dazu beiträgt, wie effizient sich HCMV ausbreitet. Es wurde der reparierte Virusstamm Merlin-RL13tetOUL128LtetO als Modell für klinische Isolate verwendet, da gezielt zwei Genregionen reguliert werden können, die für die zellassoziierte Virusausbreitung verantwortlich sind. Eine UL83-Stopmutante wurde durch „en passant“-Mutagenese hergestellt, sodass das Protein pp65 nicht exprimiert wurde. Wildtyp und UL83-Stopmutante wurden in den Versuchen jeweils miteinander verglichen, während die UL83-Revertante als Kontrolle diente. Um festzustellen, wie stark sich Wildtyp und UL83-Stopmutante zellassoziiert ausbreiten, wurde die Herdgröße in Fibroblasten und in Endothelzellen einige Tage nach der Infektion betrachtet. Die UL83-Stopmutante bildete um ein Fünftel kleinere Herde in Fibroblasten und um mehr als ein Drittel kleinere Herde in Endothelzellen. Um einen möglichen Beitrag von pp65 zur zellfreien Virusausbreitung näher zu beleuchten, wurde aus infizierten speziellen Fibroblastenkulturen (HFFFtet-Zellen) zu verschiedenen Zeitpunkten der Virustiter von Wildtyp und UL83-Stopmutante untersucht. Die UL83-Stopmutante setzte aus HFFFtet-Zellen nur halb so viel Virus frei wie der Wildtyp. Da sich die UL83-Revertante nicht wie die UL83-Stopmutante verhielt, sondern wie der Wildtyp, sind die UL83-Stopmutationen für den Wachstumsdefekt der Mutante verantwortlich zu machen. Dass pp65 zur Virusausbreitung in Fibroblasten und in Endothelzellen beiträgt, wurde hier erstmals als statistisch signifikant nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das virale Protein pp65 die Ausbreitung eines Isolat-ähnlichen HCMV-Stamms unabhängig vom Ausbreitungsmodus und vom Zelltyp fördert und demzufolge bedeutender für das Viruswachstum ist, als bisher angenommen.

The thrombopoietin receptor agonist eltrombopag was successfully used against human cytomegalovirus (HCMV)-associated thrombocytopenia refractory to immunomodulatory and antiviral drugs. These effects were ascribed to the effects of eltrombopag on megakaryocytes. Here, we tested whether eltrombopag may also exert direct antiviral effects. Therapeutic eltrombopag concentrations inhibited HCMV replication in human fibroblasts and adult mesenchymal stem cells infected with six different virus strains and drug-resistant clinical isolates. Eltrombopag also synergistically increased the anti-HCMV activity of the mainstay drug ganciclovir. Time-of-addition experiments suggested that eltrombopag interfered with HCMV replication after virus entry. Eltrombopag was effective in thrombopoietin receptor-negative cells, and the addition of Fe3+ prevented the anti-HCMV effects, indicating that it inhibits HCMV replication via iron chelation. This may be of particular interest for the treatment of cytopenias after hematopoietic stem cell transplantation, as HCMV reactivation is a major reason for transplantation failure. Since therapeutic eltrombopag concentrations are effective against drug-resistant viruses, and synergistically increase the effects of ganciclovir, eltrombopag is also a drug-repurposing candidate for the treatment of therapy-refractory HCMV disease., publishedVersion

Die intrauterine CMV-Infektion ist die häufigste aller viralen Infektionen in der Schwangerschaft. Etwa 0,5% - 4% der Schwangeren durchlaufen eine Primärinfektion (PI) mit dem Zytomegalievirus, der Großteil dieser bleibt jedoch aufgrund eines symptomlosen Verlaufs unerkannt. Wird das Virus auf den Feten übertragen, kann es zu diversen Symptomen kommen, welche sowohl das Zentralnervensystem betreffen, als auch extrazerebral, im retikuloendothelialen System (RES) nachweisbar sein können. Ein CMV Antikörperscreening in der Schwangerschaft ist trotz der Möglichkeit zur frühen Identifizierung von Risikoschwangeren nach aktueller Konsensus-Leitlinie nicht empfohlen (Rawlinson et al. 2017), weshalb in Deutschland die Identifizierung schwangerer Frauen mit einer CMV PI rein zufällig ist und das Risiko für ZNS- Schädigungen bei Neugeborenen erhöht ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das CMV-Monitoring von insgesamt 90 Schwangeren mit CMV-PI hinsichtlich ihres Serostatus bei der Erstdiagnose ausgewertet. 40 dieser Frauen wurden zusätzlich als Studienkollektiv gesondert mit CMV-spezifischem HIG behandelt. Kriterien dieser Auswahl war ein GA ≤ 14,857 Wochen bei der Erstdiagnose und das Einverständnis zur Durchführung einer Amniozentese in der 21. SSW zum Ausschluss einer maternofetalen CMV-Transmission. Kohorte I umfasst neben den 40 Patientinnen des HIG-Studienkollektivs 27 weitere Frauen mit GA ≤ 14,857 Wochen. 33 Frauen mit GA ≥ 15 Wochen wurden als Kohorte II zusammengefasst. Zur Bestimmung des CMV IgG/IgM und der IgG Avidität dienten die Enzymimmunoassays (EIAs) ECLIA und CMIA. Der rekombinante Immunblot wurde zur Bestätigung der Primärinfektion durchgeführt. Um die Ergebnisse von ECLIA und CMIA bezüglich der CMV Avidität als richtig oder falsch einordnen zu können, wurde der rekombinante Aviditätsimmunblot als Referenzstandard herangezogen. Die Datenevaluierung zeigt signifikante Unterschiede zwischen den EIAs ECLIA und CMIA für alle drei Studienkohorten für das CMV IgG und zusätzlich beim HIG Studienkollektiv und der Kohorte I für die IgG Avidität. Die Ermittlung der CMV IgG Antikörperkonzentrationen zeigte sich signifikant different zwischen ECLIA und CMIA (p < 0,0001 für alle drei Studienkollektive). Deren Mediane für ECLIA-IgG liegen bei 6,6 U/ml, 5,95 U/ml und 4,74 U/ml, während deren Mittelwerte bei 11,98 Uml, 12, 65 U/ml und 13,83 U/ml bestimmt wurden. Mit CMIA ergeben sich signifikant höhere Mediane von 102 AU/ml, 98,95 AU/ml und 82,6 AU/ml mit Mittelwerten von 129,22 AU/ml, 117,26 AU/ml und 88,69 AU/ml. Jedoch gibt es für das CMV IgG noch keinen WHO - Standard, was dazu führt, dass verschiedene Einheiten für ECLIA und CMIA vorliegen und diese nicht direkt miteinander vergleichbar sind. Virologisches Einschlusskriterium für die HIG-Studienkohorte war das Fehlen der anti-gB2-IgG-Serokonversion sowie niedrige IgG Aviditäten im Immunblot und ECLIA, was das Vorliegen einer CMV Primärinfektion bestätigt. Erwähnenswert ist die Reaktivität aller Sera der Kohorte I und des HIG Studienkollektivs gegen das p65 Tegumentprotein im recomLine IgG Test neben dem konstitutiven Nachweis von anti-CMV pp150 IgG. Die Gegenüberstellung des CMV IgG und der CMV IgG Avidität in Streudiagrammen zeigt, dass ECLIA bei niedrigem CMV IgG auch niedere Aviditäten und bei hohem CMV IgG hohe Aviditäten ermittelt. Hohe IgG Konzentrationen korrelieren bei CMIA mit niederen und hohen IgG Aviditäten sowie hohe IgG Aviditäten mit niedrigen und hohen IgG Konzentrationen. CMIA ermittelt in 7/40 Fällen (17,5%) des HIG-Studienkollektivs, in 8/53 Fällen (15,1%) der Kohorte I (4/57 nicht auswertbar) und in 3/33 Fällen (9,1%) der Kohorte II falsch hohe IgG Aviditäten, was einer latenten CMV-Infektion und nicht einer CMV Primärinfektion entspricht und damit zu Fehldiagnosen führen kann. Es zeigt sich, dass die EIAs ECLIA und CMIA nicht isoliert zur Diagnostik einer CMV PI in der Schwangerschaft genutzt werden können. Es ist notwendig verschiedene Testsysteme in Kombination zu verwenden, um eine sichere Diagnose zu stellen. Diese Untersuchungen bieten Evidenz dafür, dass sowohl der quantitative CMIA IgG Test als auch der CMV IgG Aviditätstest im Kontext der CMV-Primärinfektion in der Schwangerschaft im Vergleich zum ECLIA Test signifikante Divergenzen aufweist, was dazu führen kann eine CMV PI zu übersehen.

The recombination-activating genes (RAGs) and the DNA cross-link repair 1C gene (DCLRE1C) encode the enzymes RAG1, RAG2 and Artemis. They are critical components of the V(D)J recombination machinery. V(D)J recombination is well known as a prerequisite for the development and antigen diversity of T and B cells. New findings suggested that RAG deficiency impacts the cellular fitness and function of murine NK cells. It is not known whether NK cells from severe combined immunodeficiency (SCID) patients with defective RAGs or DCLRE1C (RAGs&minus, /DCLRE1C&minus, NK) are active against virus infections. Here, we evaluated the anti-HCMV activity of RAGs&minus, NK cells. NK cells from six SCID patients were functional in inhibiting HCMV transmission between cells in vitro. We also investigated the expansion of HCMV-induced NK cell subset in the RAG- or DCLRE1C-deficient patients. A dynamic expansion of NKG2C+ NK cells in one RAG-2-deficient patient was observed post HCMV acute infection. Our study firstly reveals the antiviral activity of human RAGs&minus, / DCLRE1C&minus, NK cells.

HCMV is still a clinical problem with serious consequences. It is the leading cause of disabilities in children due to congenital infection and also the reason for morbidity and mortality in immunocompromised patients. To improve existing passive immunization strategies, we investigated the human antibody response against HCMV regarding exceptionally effective antibodies that cover the main aspects of HCMV dissemination. For this purpose, a systematic screening algorithm was designed that was used to screen plasma samples from a large blood donor population. Since HCMV dissemination can occur via the cell-free and the cell-associated mode, both spread routes were addressed separately in two different approaches. Human antibodies that are exceptionally effective in neutralizing free viral particles were identified by a two-step high-throughput screening. As a screening tool, an endotheliotropic HCMV strain with a secreted luciferase was generated. It facilitates simple and rapid detection of infection levels. A neutralization assay based on this reporter virus was used to investigate the neutralizing activity for infection of the two model cell-types for HCMV. In a first set of 1000 plasmas, the neutralizing capacities against fibroblast infection were compared to that in endothelial cells. We observed that plasma is in general more effective in neutralizing endothelial cell infection. Assuming that good neutralization in fibroblasts would include good neutralization of endothelial cell infection as well, the high-throughput screening was performed on fibroblasts. Consequently, the next 9000 plasma samples were tested on fibroblasts at a suitable dilution that would separate the plasmas with common neutralization from those with exceptionally potent neutralization. According to our cut-off, 2.6% of plasma samples were potently neutralizing. 80 of those potent plasma samples were then further investigated in a second screening step according to their efficacy against different HCMV strains. Plasmas that can be 100-fold diluted and still neutralized 50% infection (NT50 = 100) of all seven strains, were regarded as broad and potent. The screening algorithm identified ���elite��� neutralizing plasma samples that are exceptionally potently neutralizing with cell-type and strain-independent efficacy. Furthermore, it was shown that the elite plasmas are superior to conventional hyperimmunoglobulin preparations, hence potentially improving the passive immunization strategies against HCMV. The fact plasma samples with elite neutralizing capability can be traced back to the corresponding blood donors who can be revisited, could facilitate the usage of their plasma for direct application or the generation of monoclonal antibodies from their B-cells. The finding that neutralizing capacities of human blood donors against HCMV were stable over several years greatly facilitates this purpose. Besides spreading via free viral particles, HCMV also spreads via a cell-associated mode. Recent HCMV clinical isolates, are restricted to cell-associated growth whereas they lose this ability by passaging in cell culture. Since both transmission routes might play an important role in vivo, we investigated human plasma also regarding this transmission route. A suitable reporter virus was generated that grows strictly cell-associated like a clinical isolate. It facilitated the screening of 8400 plasma samples according to their inhibiting effect on HCMV cell-associated spread. Remarkably, this screening did not reveal a plasma that strikingly inhibited focal growth in fibroblasts. As we wanted to assure no false-negative results due to our test system, a second validation of this result was done. By usage of recent clinical isolates instead of the laboratory model strains for cell-associated spread, we excluded strain specific effects. Since we assume that the same glycoproteins that are involved in entry of free viral particles, also mediate cell-associated spread, we rechecked this issue with the previously identified elite neutralizing plasmas. But even the elite neutralizers did not inhibit cell-associated focal growth of clinical-isolates on fibroblasts. In contrast, focal spread of clinical isolates between endothelial cells, can be partially inhibited by elite neutralizers while small foci remain. This reveals that there is a cell type dependent difference in inhibition not only regarding entry of free viral particles but also regarding cell-to-cell transmission of viral particles. This study was designed to find individuals with exceptionally potent activity against HCMV. While we found that a quality of plasma with effective cell-to-cell spread inhibiting activity is nonexistent or extremely rare, we succeeded in identifying individuals with exceptional neutralizing activity against cell-free dissemination. This analysis could be the basis towards an improved passive immunization strategy against HCMV, relying on elite neutralizing antibodies that were potently and broadly effective and superior to conventional immunoglobulins.

Tetraspanins are suggested to regulate the composition of cell membrane components and control intracellular transport, which leaves them vulnerable to utilization by pathogens such as human papillomaviruses (HPV) and cytomegaloviruses (HCMV) to facilitate host cell entry and subsequent infection. In this study, by means of cellular depletion, the cluster of differentiation (CD) tetraspanins CD9, CD63, and CD151 were found to reduce HPV16 infection in HeLa cells by 50 to 80%. Moreover, we tested recombinant proteins or peptides of specific tetraspanin domains on their effect on the most oncogenic HPV type, HPV16, and HCMV. We found that the C-terminal tails of CD63 and CD151 significantly inhibited infections of both HPV16 and HCMV. Although CD9 was newly identified as a key cellular factor for HPV16 infection, the recombinant CD9 C-terminal peptide had no effect on infection. Based on the determined half-maximal inhibitory concentration (IC), we classified CD63 and CD151 C-terminal peptides as moderate to potent inhibitors of HPV16 infection in HeLa and HaCaT cells, and in EA.hy926, HFF (human foreskin fibroblast) cells, and HEC-LTT (human endothelial cell-large T antigen and telomerase) cells for HCMV, respectively. These results indicate that HPV16 and HCMV share similar cellular requirements for their entry into host cells and reveal the necessity of the cytoplasmic CD151 and CD63 C-termini in virus infections. Furthermore, this highlights the suitability of these peptides for functional investigation of tetraspanin domains and as inhibitors of pathogen infections., German Academic Exchange Service (Deutscher Akademischer Austauschdienst, DAAD) to Snježana Mikulicic, by the Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2014-55478-R and BIO2017-86500-R) to María Yáñez-Mó, and by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; FL 696/2-1, FL 696/3-1)

In einer retrospektiven Datenerhebung wurden die Daten von 96 Patienten mit Herztransplantation untersucht, die bei nachgewiesener CMV-Infektion entweder mit Valganciclovir (n=55) oder CMV-Hyperimmunglobuline (CMVIG) (Cytotect®) (n=41) behandelt wurden. Primärer Endpunkt ist das Überleben nach einem Jahr. Sekundäre Endpunkte sind die Virusfreiheit vier Wochen nach Therapiebeginn sowie der Verlauf der laborchemischen Parameter. Es wurde eine 1-Jahresüberlebensrate von 87,3% und 80,5% in der Valganciclovir-Gruppe und CMVIG-Gruppe erreicht. Innerhalb eines Monats wurde eine Virusfreiheit von 74,5% in der Valganciclovir-Gruppe, beziehungsweise 66,0% in der CMVIG-Gruppe erreicht. Während des Beobachtungszeitraums ist kein signifikanter Unterschied bei den laborchemischen Parametern feststellbar. Die vorliegenden Daten lassen eine vergleichbare Sicherheit von Valganciclovir und CMV-Hyperimmunglobulin bei der Therapie von CMV-Infektionen bei herztransplantierten Patienten vermuten.

Die Morphogenese von infektiösen Viruspartikeln des humanen Zytomegalievirus (HCMV) findet in zwei unterschiedlichen Zellkompartimenten statt, dem Zellkern und dem Zytoplasma. Die Tegumentierung ist essentieller Bestandteil bei der Morphogenese, bei welcher zahlreiche virale Proteine in das sich bildende Virion eingebaut werden und die Verbindung zwischen dem Kapsid und der Hüllmembran herstellen. Die Initiierung der Tegumentierung, die daran beteiligten Proteine und deren intrazelluläre Lokalisation sind allerdings noch weitgehend unklar. Das Tegumentprotein pUL48 ist eines der größten viralen Proteine, welches innerhalb der Herpesviren hochkonserviert ist und bei der Tegumentierung eine entscheidende Rolle spielt. Dabei scheint es so zu sein, dass der C-Terminus dieses Proteins für dessen Funktion im viralen Replikationszyklus essentiell ist. In dieser Arbeit konnten die Bedeutung des C-Terminus von pUL48 bestätigt und darüber hinaus zwei funktionelle Domänen identifizieren werden. Zum einen ist im C-Terminus eine nukleäre Exportfunktion determiniert und zum anderen befinden sich dort auch wichtige Bereiche für die Assoziation von pUL48 mit dem Kapsid. Für diese Untersuchungen wurden vier Viren mit verschiedenen Mutationen des pUL48-C-Terminus charakterisiert. Durch Wachstumskinetiken und den Fokus-Expansion-Assay konnten gezeigt werden, dass der C-Terminus des pUL48 für die Virusausbreitung und Morphogenese infektiöser Partikel essentiell ist. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz und der Elektronenmikroskopie konnte für Mutationen im C-Terminus von pUL48 eine beeinträchtigte Interaktion zwischen pUL48 und dem Kapsid festgestellt werden, was vermutlich zu einer Akkumulation von nur teilweise tegumentierten Kapsiden in der Zellperipherie führt. Lokalisationsstudien mit pUL48 konnten außerdem eine verstärkte nukleäre Akkumulation des Proteins, bei Deletion der C-terminalen 80 und 28 Aminosäuren, feststellen. Allerdings konnte eine zu diesen Beobachtungen passende nukleäre Exportsequenz in pUL48, welche durch Analysetools vorhergesagt war, mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nur partiell bestätigt werden. Somit führte diese Arbeit durch die Entdeckung neuer essentieller Domänen nicht nur zu einem Erkenntnisgewinn bezüglich der Tegumentierung und der Bedeutung des Tegumentproteins pUL48 für den viralen Replikationszyklus, sondern identifizierte außerdem eventuelle zukünftige Targets für eine antivirale HCMV-Therapie

Human cytomegalovirus (HCMV) latency is typically harmless but reactivation can be largely detrimental to immune compromised hosts. We modeled latency and reactivation using a traceable HCMV laboratory strain expressing the Gaussia luciferase reporter gene (HCMV/GLuc) in order to interrogate the viral modulatory effects on the human adaptive immunity. Humanized mice with long-term (more than 17 weeks) steady human T and B cell immune reconstitutions were infected with HCMV/GLuc and 7 weeks later were further treated with granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) to induce viral reactivations. Whole body bio-luminescence imaging analyses clearly differentiated mice with latent viral infections vs. reactivations. Foci of vigorous viral reactivations were detectable in liver, lymph nodes and salivary glands. The number of viral genome copies in various tissues increased upon reactivations and were detectable in sorted human CD14(+), CD169(+), and CD34(+) cells. Compared with non-infected controls, mice after infections and reactivations showed higher thymopoiesis, systemic expansion of Th, CTL, Treg, and Tfh cells and functional antiviral T cell responses. Latent infections promoted vast development of memory CD4(+) T cells while reactivations triggered a shift toward effector T cells expressing PD-1. Further, reactivations prompted a marked development of B cells, maturation of IgG(+) plasma cells, and HCMV-specific antibody responses. Multivariate statistical methods were employed using T and B cell immune phenotypic profiles obtained with cells from several tissues of individual mice. The data was used to identify combinations of markers that could predict an HCMV infection vs. reactivation status. In spleen, but not in lymph nodes, higher frequencies of effector CD4(+) T cells expressing PD-1 were among the factors most suited to distinguish HCMV reactivations from infections. These results suggest a shift from a T cell dominated immune response during latent infections toward an exhausted T cell phenotype and active humoral immune response upon reactivations. In sum, this novel in vivo humanized model combined with advanced analyses highlights a dynamic system clearly specifying the immunological spatial signatures of HCMV latency and reactivations. These signatures can be merged as predictive biomarker clusters that can be applied in the clinical translation of new therapies for the control of HCMV reactivation.

Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous herpesvirus causing high morbidity in individuals with an impaired immune defense. The two major types of monocyte-derived macrophages in vitro (MΦ), M1-MΦ and M2-MΦ, are unequally susceptible to infection by HCMV. Anti-inflammatory, anti-immunogenic M2-MΦ get infected about twofold compared to pro-inflammatory, immunogenic M1-MΦ. In this study differences between the two cell subsets regarding early HCMV infection were examined. The hypothesis in this study was particularly, that dissimilar expression of possible entry receptors or intrinsic restriction factors of viral infection define the different susceptibility.

Human cytomegalovirus is a widespread pathogen that is responsible for life threatening diseases in immunocompromised patients and newborns. HCMV manipulates many host cells processes and utilizes multiple strategies to evade and disable immune mechanisms. One of the main effectors of the first phase of viral replication is the immediate-early 1 protein. This protein acts as transcriptional activator and antagonist of the intrinsic and innate immune system. Multiple functions have been described for IE1, but the underlying molecular mechanisms and interactions are still poorly understood due to a lack of structural information. A main function of IE1 is the disruption of ND10 domains which mediate intrinsic immunity against viral infections. IE1 is composed of functionally and structurally divers domains and can be divided into a folded core and intrinsically disordered regions. The folded IE1 core interacts with different host cell proteins and also binding of PML, a TRIM protein and key component of ND10 domains, was mapped to this domain. The main goal of this work was to reveal the structure of the globular IE1 core by X-ray diffraction. The presence of disordered region in IE1 was experimentally analyzed and terminally truncated constructs were generated based on these results, purified and subjected to crystallization screening. However, no suitable crystals for diffraction experiments were obtained. Thus, homologous proteins of other primate cytomegalovirus species were investigated as alternative targets. These proteins showed improved crystallization behavior, but diffraction quality crystals were only obtained for IE1 of rhesus macaque CMV after reductive methylation of surface lysines. An initial structure was solved by MAD phasing to a mediocre resolution of 2.85 Å. Controlled dehydration of the crystals improved the resolution to 2.3Å and at the same time induced a space group change. Examination of the structures before and after dehydration reveal the diffraction enhancing readjustments and also the high flexibility of this domain. The IE1 core forms a single, elongated domain which consists mainly of α-helical bundles. A comparison with known folds suggest that the overall architecture if IE1 is unprecedented. The protein features a mix of left- and right handed coiledcoils, a feature that was also observed recently for the coiled-coil domain of TRIM proteins. These similarities suggest that the protein acts as decoy and binds to PML and other TRIM proteins via helix-helix interactions. Its high flexibility and the homogeneously distribution of conserved surface patches suggest that the IE1 core can adapt itself to varying targets and also avoids mutational escape by utilizing big binding surfaces. Furthermore, the structure allows to review the structural effects of various IE1 mutants and deletions which have been used in various publications to investigate its interplay with host cell proteins. Das humane Cytomegalievirus ist ein weitverbreitetes Pathogen, welches für schwerwiegende Erkrankungen in immungeschwächten Patienten und Neugeborenen verantwortlich ist. HCMV beeinflusst viele Zellprozesse und verwendet verschiedene Strategien um Immunmechanism zu umgehen oder auszuschalten. Ein Haupteffektor der ersten Replikationsphase ist das immediateearly 1 Protein. Dieses Protein wirkt als transkriptioneller Aktivator und Gegenspieler des intrinsischen und angeborenen Immunsystems. Mehrere Funktionen wurden bereits für IE1 beschrieben, jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Wechselwirkungen aufgrund fehlender Strukturinformation großteils unbekannt. Eine der IE1 Hauptfunktionen ist die Zerstörung von ND10 Strukturen, welche intrinsische Immunität gegen virale Infektionen vermitteln. IE1 ist aus mehreren, strukturell und funktionell unterschiedlichen Domänen aufgebaut. Die gefaltete Kerndomäne von IE1 interagiert mit verschiedenen Wirtszellproteinen. Die Binding an PML, welches zu den TRIM Proteinen gehört und eine der Hauptkomponenten von ND10 Strukturen darstellt, wird ebenfalls ˘"ber diesen Bereich vermittelt. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Auflärung der Struktur dieser globulären IE1 Domäne durch Röntgendiffraktion. Dazu wurde experimentell untersucht, in welchem Außmaß unstrukturierte Bereiche in IE1 vorhanden sind. Basierend auf diesen Resultaten wurden verkürzte Varianten für Kristallisationsversuche hergestellt. Da die Qulität der erhaltenen Kristalle nicht ausreichend für Diffraktionexperimente war, wurden homologe Proteine anderer Primatencytomegalieviren als Alternativen untersucht. Diese zeigten besseres Kristallisationsverhalten, allerdings wuchsen geeignete Einkristalle mit ausreichend guter Beugung nur im Fall von Rhesusaffen CMV IE1, nachdem das Protein durch Lysinemethylierung modifiziert wurde. Mittels dieser Kristalle konnte die Stuktur bis zu einer Auflösung von 2.85Å durch MAD Phasierung gelöst werden. Durch gezieltes Dehydrieren der Kristallen, wobei sich auch die Raumgruppe änderte, wurde die Auflösung auf 2.3Å verbessert. Der Vergleich der Strukturen vor und nach Dehydrierung zeigte, welche Änderungen zu der verbesserten Auflösung führten und dass es sich hierbei um ein Domäne mit hoher Flexibilität handelt. Der IE1-Kernbereich bildet eine einzelne, langgestreckte Domäne, welche hauptsächlich aus α-helikalen Bündeln besteht. Ein Vergleich mit bekannten Proteinstrukturen machte deutlich, dass die IE1-Kerndomäne keiner bekannten Faltung zugeordnet werden kann. Das Protein bildet sowohl links- als auch rechtshändige Helixbündel, eine vergleichbare Anordnung wurde vor kurzem auch für die coiled-coil Domäne von TRIM-Proteinen aufgedeckt. Aufgrund dieser Ähnlichkeit kann man annehmen, dass das Protein sowohl PML als auch andere TRIM Proteine mittels Helix-Helix Interaktionen bindet. Die hohe Flexibilität und die gleichmäßig verteilte Oberflächenkonservierung deuten darauf hin, dass sich das Protein an verschiedene Bindepartner anpassen kann und dass es große Interaktionsflächen ausbildet, wodurch einzelne Mutationen der Zielproteine die Bindung nicht blockieren. Die nun aufgeklärte Struktur ermöglicht es außerdem bereits publizierte Effekte verschiedenener IE1-Deletionen und Mutanten, welche für Funktionsstudien verwendet wurden, neu zu bewerten und einzuordnen.

The Human cytomegalovirus (HCMV) is an important, ubiquitously distributed pathogen that causes severe clinical disease in immunocompromised individuals like organ transplant recipients or infants infected in utero. The development of antiviral antibodies is a major defense mechanism against viruses and contributes to the effective control of a HCMV infection. The envelope glycoprotein B (gB) is a major antigen for the induction of virus neutralizing antibodies and hence a component in several experimental HCMV vaccines currently used in humans. However, interpretation of current vaccine results is hampered by significant gaps in our knowledge on neutralizing antibody epitopes on gB. This study focused on the humoral immune response directed against antigenic domain 5 (AD-5) of gB. AD-5 is formed by a continuous sequence comprising residues 133 to 343 of HCMV gB strain AD169. According to a 3D model of HCMV gB, AD-5 corresponds to structural domain I and contains the two internal fusion loops that are required for the fusogenic activity of herpesviral gB. This study identified AD-5 as highly immunogenic and an important target for virus neutralizing antibodies in human sera following HCMV infection, but as being incapable of inducing neutralizing antibodies following immunization of mice. Human monoclonal antibodies (mabs) directed against AD-5 had a broad and potent neutralization capacity. The anti-AD-5 mabs neutralized independent of target cell type or virus origin, complement-independent and as antibody Fab fragments. Furthermore, they prevented cell-to-cell spread of virus in epithelial cells and executed their function at a post-adsorption step. Interestingly, the anti-AD-5 mabs shared a common target site on gB despite originating from different HCMV-infected donors. Mutational analysis of recombinantly expressed AD-5 (n=33) identified an overlapping, discontinuous epitope that consisted of a critical tyrosine residue at position 280 in combination with other surface-adjacent residues, in short, the YNND epitope. The YNND epitope is strictly conserved among different HCMV strains. Recombinant viruses carrying YNND-mutations (n=13) in AD-5 were replication competent but resistant to virus neutralizing mabs. Competition analysis using human HCMV-convalescent sera from unselected donors confirmed the conserved antibody responses to the YNND epitope in HCMV-infected individuals, since a significant fraction of the gB-AD-5 response was found to be directed against this epitope. Moreover, AD-5-specific polyclonal antibodies prepared from individual human sera revealed that the YNND epitope represented the exclusive target for AD-5-directed virus neutralizing activity in some cases. Taken together, the data indicated that AD-5 in general and the YNND epitope in particular represent important target structures for the anti-gB antibody response as well as for the AD-5-specific virus neutralizing activity. The induction of AD-5-specific antibodies following vaccination should be a desirable goal for the development of an effective anti-HCMV vaccine. Furthermore, antibodies targeting the YNND epitope represent powerful tools for passive immunotherapy of HCMV infection. Das humane Cytomegalovirus (HCMV) ist ein ubiquitär vorkommendes Pathogen, das in immunsupprimierten Individuen wie Transplantationspatienten oder kongenital infizierten Neugeborenen zu schwerwiegenden Komplikationen führen kann. Die Entwicklung von antiviralen Antikörpern trägt entscheidend zur effizienten Kontrolle einer HCMV Infektion bei. Das Glykoprotein B (gB) ist ein wichtiges Antigen für die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern und eine wesentliche Komponente von verschiedenen, experimentellen HCMV Vakzinen im Menschen. Die Bewertung bisheriger Vakzinierungs-studien gestaltet sich jedoch schwierig, da wenig über Zielstrukturen für neutralisierende Antikörper auf gB bekannt ist. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der humoralen Immunantwort gegen die antigene Domäne 5 (AD-5) von gB. AD-5 wird aus den Aminosäuren (AS) 133 bis 343 von HCMV gB Stamm AD169 gebildet. Gemäß eines 3D Modells von HCMV gB entspricht AD-5 der strukturellen Domäne I und enthält zwei hydrophobe „Fusion Loops“, welche für die Fusionsaktivität von herpesviralem gB essentiell sind. Zunächst wurde AD-5 als hoch immunogen und als wichtige Zielstruktur von neutrali-sierenden Antikörpern nach HCMV Infektion identifiziert. Drei humane monoklonale Antikörper (mabs), die gegen AD-5 gerichtet sind, neutralisierten unterschiedliche Virus-stämme auf verschiedenen Zelltypen in nanomolaren Konzentrationen. Des Weiteren neutralisierten die anti-AD-5 mabs Komplement-unabhängig und als Fab-Fragmente. Ebenso verhinderten sie die Ausbreitung der Infektion von Zelle zu Zelle in Epithelzellen und inhibierten einen Prozess der Infektion nach der Bindung des Viruspartikels an die Zielzelle. Interessanterweise teilten die anti-AD-5 mabs die gleiche Zielstruktur auf gB, obwohl sie von verschiedenen HCMV-positiven Spendern stammten. Mutationsanalysen mit rekombinant exprimiertem AD-5 (n=33) identifizierten ein überlappendes, diskontinu-ierliches Epitop, welches aus einem Tyrosin an Position 280 und weiteren, strukturell benachbarten AS besteht, kurz das YNND Epitop. Das YNND Epitop ist bei den bekannten Virusstämmen konserviert. Konstruierte rekombinante Viren (n=13), die Mutationen in den kritischen YNND-Resten trugen, waren replikationskompetent, jedoch resistent gegen die Neutralisation durch die anti-AD-5 mabs. Kompetitionsanalysen zufolge war ein Großteil der AD-5-Reaktivität von humanen, HCMV-positiven Seren gegen das YNND Epitop gerichtet, was eine konservierte Immunantwort gegen diese antigene Determinante auf gB bestätigte. Darüber hinaus offenbarten polyklonale AD-5-spezifische Antikörper, die aus Einzelseren aufgereinigt wurden, dass für einige Seren das YNND Epitop die einzige Zielstruktur für neutralisierende Antikörper in AD-5 war. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass AD-5 und insbesondere das YNND Epitop wichtige Zielstrukturen für die humorale Immunantwort und Virus-neutralisierende Antikörper sind. Die Bildung von AD-5-spezifischen Antikörpern nach Vakzinierung sollte ein erstrebenswertes Ziel bei der Entwicklung einer gB-basierten HCMV Vakzine sein. Des Weiteren könnten Antikörper mit YNND-Spezifität vielversprechende Kandidaten für die passive Immuntherapie bei HCMV Infektion darstellen.

Durch vertikale CMV-Transmission während der Schwangerschaft kann es zu kongenitaler CMV-Infektion und schwerwiegender Schädigung des Feten kommen. Die kongenitale CMV-Infektion ist daher von großer Bedeutung für das staatliche Gesundheitswesen. Bisher waren allerdings keine prospektiven Daten zur Häufigkeit der kongenitalen CMV-Infektion in Deutschland verfügbar. In unserer am UKT durchgeführten CMV-Kongenital-Studie wurden verschiedene CMV-spezifische serologische Methoden angewandt und verglichen. Dabei kamen der ELISA von Medac (Deutschland), CLIA von DiaSorin (Italien) sowie der rekombinante Immunoblot von Mikrogen (Deutschland) zum Einsatz. Zum Zeitpunkt der Geburt wurde mütterliches Blut auf IgG, IgM und IgG-Avidität getestet, außerdem wurde EDTA-Nabelschnurblut aller Neugeborenen CMV-seropositiver Mütter mittels CMV-Pool-PCR gescreent und im Falle eines positiven Ergebnisses wurde das Ergebnis mit Hilfe von Nabelschnur-Trockenblutfilterkarten und Guthrie-Karten bestätigt. Der klinische und virologische Status infizierter Neugeborener wurde longitudinal dokumentiert. Insgesamt wurden im Jahr 2008 1564 korrespondierende Mutter-Kind-Paare getestet, die CMV-Seroprävalenz der Mütter lag dabei bei 47,9 Prozent. Die Inzidenz kongenitaler CMV-Infektionen lag bei 0,25 Prozent. Überraschenderweise ergaben sich bei den serologischen Untersuchungen der Mütter viele Inkongruenzen, vor allem bei der Bestimmung des IgM-Status. Es zeigte sich aber, dass durch Kombination verschiedener serologischer Instrumente CMV-Primärinfektionen auch ohne Nachweis einer IgG-Serokonversion mit hoher Wahrscheinlichkeit detektiert werden können. Wegweisend sind dafür ein hoher IgM-Index, niedrige IgG-Avidität, Abwesenheit von gB-Reaktivität im rekombinanten IgG-Immunoblot sowie polyvalente epitopspezifische CMV-IgM-Reaktivität im rekombinanten IgM-Immunoblot.

Der Typ 3 Rezeptor des transformierenden β-Wachstumsfaktors (TGFR-3; transforming growth factor-β; TGF-β) ist ein membranverankertes Glykoprotein, welches extrazellulär eine zona pellucida (ZP)-Domäne enthält (Aminosäuren 454 bis 728). TGFR-3 ist als Hilfsrezeptor maßgeblich an der Rezeptor:Ligand-Wechselwirkung des TGF-β-abhängigen Signalweges beteiligt; im Gegensatz dazu sind die meisten anderen charakteristischen ZP-Proteine in die Bildung proteinogener Matrizes involviert. Erste Interaktionsanalysen ermöglichten die Lokalisierung einer TGF-β-Bindestelle in der Region zwischen der ZP-Domänensequenz und der Transmembrandomäne des Rezeptors. Im Rahmen dieser Arbeit sollte i) die membran-proximale TGF-β2-Bindestelle in TGFR-3 konkret definiert werden, und ii) die ZP-Domäne des Rezeptors mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht werden. Die Charakterisierung der Bindestelle erfolgte über synthetisch hergestellte Peptide, welche eine Eingrenzung auf 14 Reste innerhalb einer gut zugänglichen, oberflächenexponierten Loop-Struktur zuließen. Für proteinkristallographische Experimente wurde ein Fragment des Rezeptors (Aminosäuren 438-782) verwendet. Dadurch konnte die Kristallstruktur der C-terminalen Subdomäne der ZP-Domäne (ZP-C) aus Maus-TGFR-3 bei einer atomaren Auflösung von 2.7 Å gelöst werden. Die Gesamtheit der hier präsentierten Ergebnisse unter Zuhilfenahme einer homologen ZP-C-Struktur aus Ratten-TGFR-3 ermöglicht zudem die Vorhersage eines potentiellen TGFR-3:TGF-β2 Modells. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Aufklärung der molekularen Grundlage für die Antikörpererkennung der antigenen Domäne 4 (AD-4) des Hüllproteins Glykoprotein B (gB) aus dem humanen Zytomegalievirus (human cytomegalovirus; HCMV). GB stellt während der viralen Infektion das wichtigste Fusionsprotein dar, da es den Eintritt des Virus in die Wirtszelle gewährleistet. Die hochaufgelösten Kristallstrukturen der isolierten antigenen Domäne 4 (1.8 Å), eines AD-4-spezifischen Antikörperfragments (SM5-1 Fab; 1.9 Å) und des AD-4:SM5-1 Fab-Komplexes (2.1 Å) erlauben erstmals detaillierte Einblicke in die Wechselwirkung eines Antikörpers mit einem HCMV Hüllprotein. Aus der Komplexstruktur wird deutlich, dass die Interaktion vorranging durch einen auffällig langen, exponierten CDR H3 der schweren Kette bewerkstelligt wird, wobei zusätzlich der CDR L1 der leichten Kette beteiligt ist. Zusammen greifen beide CDRs zwei lineare Sequenzmotive auf der Oberfläche des Antigens an. Anhand der Kristallstrukturen konnte ein Modell erstellt werden, wie SM5-1 möglicherweise die Neutralisation des Virus durch Bindung an die Oberfläche infizierter Zellen bewirkt. The transforming growth factor-β receptor type 3 (TGFR-3) is a membrane-anchored proteoglycan that features a zona pellucida (ZP) domain in its extracellular portion (from amino acids 454 to 728). However, unlike representative ZP domain-containing proteins, TGFR-3 is not involved in the formation of polymeric networks and rather acts as an accessory mediator of receptor:ligand interaction within TGF-β-dependent signal transduction processes. Initial protein characterisation experiments revealed the location of one TGF-β2-binding site in between the ZP domain sequence and the transmembrane domain. Although the TGF-β signalling pathway is more and more structurally investigated, detailed information on the recognition of TGF-β2 by TGFR-3 is scarce. This work aimed i) at the precise identification of the TGF-β2-binding site within the membrane proximal sequence of mouse TGFR-3 and ii) the structural investigation of the protein´s ZP domain by X-ray crystallography. Determination of the binding site was performed by the use of peptide sequences that finally enabled delineation of the responsible element to a stretch of not more than 14 amino acids within a prominent, surface-exposed loop. For structure determination purposes, a fragment of the whole receptor was explored, termed TGFR-3-ZP, including residues 438-782. Here, the 2.7 Å crystal structure of the C-terminal ZP subdomain (ZP-C) of mouse TGFR-3 is presented. Together with the results from peptide analysis and the homologue structure of rat TGFR-3-ZP-C, a possible receptor:ligand complex model is suggested. The second part of this work focusses on the molecular basis for antibody recognition of the antigenic domain 4 (AD-4) from human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein B (gB). During viral infection, gB acts as the main fusogen and accomplishes virus entry into host cells. Here, the high-resolution crystal structures of isolated AD-4, the neutralising monoclonal antibody fragment SM5-1 Fab, and the AD-4:SM5-1 Fab complex are presented to atomic resolutions of 1.8 Å, 1.9 Å, and 2.1 Å, respectively. The crystal structure of the complex reveals that binding of the antibody SM5-1 is dominated by an extraordinary long and exposed heavy chain CDR H3 with additional contribution from light chain CDR L1. CDRs H3 and L1 act in a concerted mechanism by targeting two linear sequence stretches on the antigen surface. The triplet of solved structures provides an overall view of antigen recognition by SM5-1. Finally, a hypothetical model for antibody-induced virus neutralisation can be inferred from the crystal structure of the complex, when the structure is transferred onto models of full length HCMV gB ectodomain in different conformational states.

Die Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) ist weltweit verbreitet und verläuft in immunkompetenten Individuen in der Regel asymptomatisch. In immunsupprimierten Personen oder kongenital infizierten Neugeborenen kann HCMV einen schweren bis lebensbedrohlichen Krankheitsverlauf hervorrufen. Das adaptive Immunsystem spielt bei gesunden Personen für die Kontrolle einer HCMV-Infektion eine tragende Rolle und ist somit ein wichtiger Ansatzpunkt zur Behandlung einer HCMV-Erkrankung. Die derzeitige Therapie mit polyklonalen Immunglobulinpräparaten führt nur zu Teilerfolgen. Bisher gibt es keine Informationen über die Spezifitäten der protektiven Antikörper sowie über deren möglichen Wirkmechanismus. Mit Hilfe eines Infektionsmodells mit dem Murinen Cytomegalovirus (MCMV), das als etabliertes Modellsystem für HCMV gilt, wurden in dieser Arbeit die Antikörperspezifitäten gegen virale Glykoproteine untersucht. Mittels eines Screening-Verfahrens, das auf der rekombinanten Expression von 39 MCMV-Glykoproteinen basierte, wurden 15 Antigene identifiziert, die während einer MCMV-Infektion Antikörper induzierten. In vivo-Therapieversuche mit MCMV-infizierten Mäusen zeigten, dass die Serumantikörper aus MCMV-infizierten Tieren ein größeres Protektionspotential aufwiesen als die Antikörper aus Tieren, die mit replikationsunfähigen Viruspartikeln immunisiert wurden. Folglich könnten nicht-neutralisierende Antikörper, die gegen nicht-strukturelle Glykoproteine auf der Oberfläche infizierter Zellen gerichtet sind, am Schutz beteiligt sein. Dabei könnte der Schutz auf IgG-Fc-vermittelten Effektormechanismen wie ADCC (Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität) beruhen. Zur Untersuchung der Rolle von Fcγ-Rezeptoren (FcγR) wurden zunächst genetisch FcγR-defiziente Mäuse auf Rag1-/--Hintergrund (Fcγ-/-) gekreuzt und gezüchtet. Serumtransferversuche in Fcγ-/--Mäusen bestätigten die essentielle Funktion der aktivierenden Fcγ-Rezeptoren (FcγRI, FcγRIII, FcγRIV) bei der Antikörper-vermittelten Protektion. Der Schutz war nicht einem einzelnen Fcγ-Rezeptor zuzuordnen. Die kombinierte Defizienz von zwei FcγR zeigte einen verminderten Schutzeffekt polyklonaler Mausseren und ließ damit einen redundanten Effekt der FcγR vermuten. FcγR werden auf unterschiedlichen Zellen exprimiert und weisen unterschiedliche Affinität zu den einzelnen IgG-Subtypen auf. Dadurch wird das Fcγ-Rezeptorsystem sehr komplex. Des Weiteren wurde untersucht, welche Zellen zur Kontrolle einer MCMV-Infektion durch Antikörper beitragen. Natürliche Killer- (NK-) Zellen waren für den Antikörper-vermittelten Schutz nicht essentiell, obwohl ihnen in der Literatur eine tragende Rolle bei ADCC zugesprochen wird. Dagegen besaßen adoptiv transferierte Monozyten das Potential, die Viruslast bei einer MCMV-Infektion mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern zu senken. Zusammenfassend sprechen die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse dafür, dass neben der direkten Neutralisation von Viren das Fcγ-Rezeptorsystem eine wesentliche Funktion beim Antikörper-vermittelten Schutz während einer MCMV-Infektion besitzt. The infection with the human cytomegalovirus (HCMV) is distributed worldwide and is usually asymptomatic in immunocompetent individuals. In immunosuppressed individuals or congenitally infected newborns HCMV can cause serious, even life-threatening disease. The adaptive immune system plays a major role for the control of HCMV infection in healthy persons and is therefore an important target for the treatment of HCMV disease. Current therapy with polyclonal immunoglobulin preparations is only partially successful. Informations about the specificity of protective antibodies as well as the potential mode of action are lacking. Using a MCMV (murine cytomegalovirus) infection model, which represents the established animal model system for HCMV, antibody specificities against viral glycoproteins were analyzed. Using a screening procedure based on recombinant expression of 39 MCMV glycoproteins, 15 antigens were identified which induced antibodies during infection. In vivo therapy studies with MCMV-infected mice showed a more potent protective effect by serum antibodies derived from MCMV-infected animals compared to animals that were immunized with replication incompetent virus particles. Thus, non-neutralizing antibodies directed against non-structural glycoproteins, expressed on the surface of infected cells, could contribute to the protective potential of serum antibodies via IgG-Fc mediated effector functions, such as antibody mediated cytotoxicity (ADCC). To investigate the role of Fc-mediated effector functions we generated transgenic mice by crossbreeding Fcγ receptor deficient animals on the Rag1-/- background. Serum transfer experiments in Fcγ receptor deficient Rag1-/- mice demonstrated an essential role of the activating Fcγ receptors (FcγRI, FcγRIII, FcγRIV) in antibody-mediated protection. The protection was not resting on a single Fcγ receptor. Combined deletion of more than one Fcγ receptor was required to demonstrate a negative effect on antibody protection, presumably as a result of redundancy in the Fcγ receptor system. Fcγ receptors are differentially expressed on different cell types, and have a different affinity for each of the IgG subtypes. Thus, the Fcγ receptor system is highly complex. Furthermore, it was investigated which cells contribute to the antibody-mediated control of a MCMV infection. Natural killer cells, which are known to have an important function in ADCC, were not necessary for the antibody-mediated protection. However, passively transferred monocytes had the potential to reduce the viral load in MCMV infected mice in the presence of polyclonal antibodies. In summary, these results demonstrate that besides direct neutralization of viruses the Fcγ receptor system has a vital role in the protection from MCMV infection by antibodies.

The principal focus of this work was the dissection of the humoral immune response against the murine cytomegalovirus (mCMV). mCMV was chosen, because it can be considered a model system for the infection and pathogenesis of the human cytomegalovirus (hCMV). An infection with hCMV is currently the most frequent vertically transmitted infectious disease. Many newborns suffer from long-term medical conditions caused by hCMV infection. hCMV infection is also a leading cause of serious complications, morbidity and mortality in immunosuppressed transplant recipients or AIDS patients. The analysis of the humoral immune response directed against viral glycoproteins, above all against glycoprotein B (gB), was of particular interest. The problem was addressed with two different approaches. Firstly, monoclonal antibodies were generated from B-cells of infected mice using the hybridoma technique. These antibodies were then analyzed for their antiviral potential in vitro, that is, their capability to inhibit infection of susceptible target cells in cell culture. Many isolated antibodies were able to neutralize mCMV in vitro. Most of the antibodies, however, were non-neutralizing. We further successfully identified the target structures of antiviral antibodies. The majority of neutralizing antibodies was directed against antigenic domains on gB. One antiviral antibody that was extraordinarily potent in vitro recognized yet another envelope glycoprotein, gN. The 3D structure of gB had been modeled computationally. A structural domain shown therein was demonstrated to comprise the epitope of a virus neutralizing antibody, which was isolated in this work. In addition, the epitope of another antiviral antibody was identified. Its homologous domain in hCMV (AD-1) has been described to be highly immunogenic. When determining the seropositivity rate against the two domains, the AD-1 homologous domain was demonstrated to be recognized by 100% of mCMV infected animals. DomII was also highly immunogenic. 90% of all infected mice mounted antibody responses against DomII. These findings correspond to the immune response of hCMV infected individuals against these domains. In vivo experiments focused on one DomII-specific antibody with neutralizing activity (1F11) and one non-neutralizing AD-1-specific antibody (5F12). Additionally the in vivo antiviral activity of the gN-specific antibody (32.22) was analyzed. All three antibodies were found to transfer protection against lethal challenge with mCMV when present at the time of infection. It is even possible, that sterilizing immunity was provided. Moreover, the neutralizing antibodies achieved a reduction of the viral load in mice with an already established infection. Thus, in this study for first time mCMV-specific antibodies with known protein targets were isolated that are able to protect against infection with mCMV. The second approach focused on the immunization with the described immunogenic domains of gB. For this, DomII and AD-1 were prokaryotically expressed as GST fusion proteins and purified. Mice were immunized in a prime-boost fashion and the immune response towards these antigens was monitored. Both proteins induced specific antibodies following vaccination. DomII was shown to be particularly immunogenic. The induced antibodies, however, were not able to prevent the infection of susceptible target cells in vitro. Also, the transfer of DomII-specific B-cells or a specific serum pool did not provide protection against infection in vivo. The immunization with UV-inactivated mCMV, on the other hand, led to the induction of antibodies with antiviral activity. This shows that protective immunity against mCMV infection can be induced. It will be the concern of future studies to modify the candidate vaccines in a way that they prompt protective antibody titers. In dieser Arbeit wurde die humorale Immunantwort im Schutz gegen die Infektion mit dem murinen Cytomegalievirus (mCMV) untersucht. mCMV diente hierbei als Modellsystem für die Infektion und Pathogenese des humanen Cytomegalievirus (hCMV). Die Infektion mit hCMV ist heute die häufigste vertikal übertragene Infektionskrankheit und viele Neugeborene leiden unter Langzeitbeschwerden, die durch die Infektion hervorgerufen werden können. Zudem kann der Ausbruch von hCMV in Empfängern von Organtransplantaten oder AIDS Patienten zu schweren Komplikationen führen. Von besonderem Interesse für diese Arbeit war die Analyse der Immunantwort gegen virale Glykoproteine, in erster Linie gegen das immundominante Glykoprotein B (gB). Dafür wurden zwei Arbeitsansätze ausgewählt. Im ersten Arbeitsansatz wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper aus B-Zellen infizierter Mäuse erfolgreich hergestellt. Diese Antikörper wurden in vitro auf ihr Potential hin untersucht mCMV zu neutralisieren, das heißt die Infektion suszeptibler Zielzellen zu verhindern. Viele isolierte Antikörper zeigten diese Fähigkeit, jedoch waren die meisten Antikörper nicht neutralisierend. Zudem wurden die Zielproteine antiviraler Antikörper identifiziert und die Positionen der Epitope darauf genauer eingegrenzt. Es stellte sich heraus, dass der Großteil der neutralisierenden Antikörper, die während einer mCMV Infektion hergestellt werden, gegen gB gerichtet ist. Ein weiterer Antikörper, der in vitro besonders potente antivirale Eigenschaften zeigte, erkannte Glykoprotein N (gN), das wie gB in der Virushülle eingelagert ist. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden wurde die 3D Struktur von gB modelliert. Eine hierbei identifizierte strukturelle Domäne (DomII) enthält das Epitop eines in dieser Arbeit beschriebenen neutralisierenden Antikörpers. Des Weiteren wurde in Homologie zu hCMV der C-terminale Bereich AD-1 als Bindestelle für einen antiviralen Antikörper identifiziert. Die Analyse von Seren infizierter Tiere zeigte eine Seropositivitätsrate von 100% für die Erkennung von AD-1. DomII wurde von 90% der Seren erkannt. Dies entspricht der Seropositivitätsrate von infizierten Personen gegen die entsprechenden Domänen auf hCMV. Zwei in vitro neutralisierende Antikörper und ein nicht—neutralisierender Antikörper wurden ausgewählt und für in vivo Versuche erfolgreich aufgereinigt. Der nicht-neutralisierende Antikörper erkannte AD-1. Ein neutralisierender Antikörper war gegen DomII gerichtet und der andere erkannte ein Epitop auf gN. In Schutzversuchen zeigte sich, dass alle drei getesteten Antikörper die Infektion mit mCMV verhindern können, wenn sie zum Zeitpunkt der Infektion vorhanden sind. Wahrscheinlich wurde hier sogar sterilisierende Immunität erzielt. In der Therapie einer etablierten mCMV Infektion konnten die neutralisierenden Antikörper die Infektion eindämmen und einen Überlebensvorteil bewirken. In dieser Arbeit wurden somit zum ersten Mal mCMV spezifische Antikörper mit in vivo antiviralen Eigenschaften und bekannter Epitopspezifität beschrieben. Der zweite Arbeitsansatz befasste sich mit Immunisierungsstudien, basierend auf Fragmenten von gB. Dafür wurden die relevanten Bereiche (AD-1 und DomII) im prokaryonten System als Fusionsproteine aufgereinigt und in ‚Prime-Boost‘ Schritten an die Tiere verabreicht. Beide Proteine induzierten nach der Immunisierung spezifische Antikörper. DomII stellte sich dabei als außergewöhnlich immunogen heraus. Die induzierten DomII oder AD-1 spezifischen Antikörper konnten jedoch im in vitro System die Infektion suszeptibler Zellen nicht verhindern. Die Verabreichung von DomII-spezifischen B-Zellen oder eines spezifischen Serumpools zeigte auch in vivo keinen antiviralen Effekt. Dagegen wurden nach Immunisierung mit UV-inaktiviertem mCMV Antikörper induziert, die in der Lage waren die Infektion einzudämmen. Eine sterile Immunität wurde hier jedoch nicht beobachtet. Es bleibt die Aufgabe nachfolgender Studien, die Impfstoffe derart zu modifizieren, dass antivirale Antikörper induziert werden und ein Schutz gegen die Infektion mit mCMV erreicht wird.

US28 is a G-protein coupled receptor (GPCR), encoded in DNA of human cytomegalovirus (HCMV). Depending on geographical region 40 to 100% of the population was proved to be HCMV positive. Although the latent infection is asymptomatic, it can lead to severe and life-threatening diseases in immunodeficient hosts. HCMV infection is associated with number of chronic inflammatory diseases, including atherosclerosis, cancer and transplant rejection. The hijacking of a host signaling machineries is the fundamental part of viral host-evasion strategies and here the viral GPCRs play a very important role. US28 receptor is so far the most characterized viral GPCR. Due to the high homology with human chemokine receptors, it can even bind several chemokines. Its constitutive signaling couples efficiently to the hosts signaling networks and enhances viral survival, dissemination and in some cases oncogenesis or cardiovascular diseases. This makes the US28 receptor a very interesting pharmacological target and our goal was to synthesize ligands that would reverse the constitutive signaling of this viral GPCR. Assessing the modulation of US28-mediated activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways, we were able to identify partial inverse agonists of US28 receptor with dihydroisoquinolinone and tetrahydroisoquinoline core structures that showed functional activity equal or superior to the known US28 inverse agonist VUF2274. An exchange of the dihydroisoquinolinone unit for a biphenyl scaffold resulted in ligands with full inverse agonism at US28 receptor. Dihydroisoquinolinones and biphenyls were rapidly and efficiently obtained from simple precursors such as diazonium salts applying radical carboamination reactions or radical biaryl synthesis, respectively. Moreover, by using enzyme catalysis or an enantioselective macrocyclisation reaction employing a chiral auxiliary, we were able to demonstrate that dihydroisoquinolinone core structures of US28 receptor ligands can be obtained in enantiomerically enriched or potentially even enantiomerically pure forms. In addition, partial inverse agonists of US28 receptor with isopropanolamine structure were discovered and analogues of natural antiviral agents with chalcone and flavonol structures were identified as modulators of US28 receptor constitutive activity. First attempts to develope photoexcitable probes, which could enable determination of the proximate amino acids in the binding pocket of these ligands were made. US28 ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), der in der DNA des humanen Zytomegalievirus (HCMV) kodiert ist. Abhängig von der geographischen Region werden 40 bis 100% der Bevölkerung als HCMV-positiv eingestuft. Obwohl die latente Infektion asymptomatisch ist, kann es zu schlimmen und lebensbedrohlichen Erkrankungen in immungeschwächten Wirten führen. Die HCMV-Infektion ist mit zahlreichen chronisch-entzündlichen Krankheiten assoziiert, einschließlich Atherosklerose, Krebs und Transplantatabstoßung. Die Übernahme der Kontrolle über das Signalsystem des Wirtes ist ein grundsätzlicher Teil der viralen Wirtsumgehungsstrategie, wobei die viralen GPCRs eine sehr wichtige Rolle spielen. Der US28-Rezeptor ist der bis heute am besten charakterisierte virale GPCR. Aufgrund seiner hohen Homologie mit humanen Chemokinrezeptoren kann er sogar einige Chemokine binden. Seine konstitutive Signaltransduktion kuppelt effizient zum Signalnetzwerk des Wirtes und erhöht das Virusüberleben, dessen Ausbreitung und führt in einigen Fällen zu Onkogenese oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Das alles macht US28 zu einem pharmakologisch sehr interessanten Targetrezeptor. Unser Ziel war es, Liganden zu synthetisieren, die die konstitutive Signaltransduktion dieses viralen GPCRs inhibieren würden. Nach Untersuchung der Modulation der US28-vermittelten Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) abhängigen Signalübertragungswege konnten wir inverse Partialagonisten des US28-Rezeptors charakterisieren, die eine Dihydroisochinolinon- und Tetrahydroisochinolin-Grundstruktur besitzen und die eine gleiche oder sogar bessere funktionelle Aktivität als der bekannte US28-Inversagonist VUF2274 zeigen. Ein Austausch der Dihydroisochinolinon-Einheit gegen einen Biphenyl-Baustein ergab einen vollständigen inversen Agonisten am US28-Rezeptor. Die Dihydroisochinolinone und Biphenyle wurden schnell und mit geringem Aufwand synthetisiert, wobei einfache Vorstufen, wie Diazoniumsalze, durch radikalische Carboaminierung beziehungsweise enantioselektive Makrocyclisierung umgesetzt wurden. Außerdem konnte durch Enzymkatalyse oder enantioselektive Makrocyclisierung unter Verwendung eines chiralen Auxiliars gezeigt werden, dass die Dihydroisochinolin- Teilstrukturen der US28-Rezeptorliganden in enantiomerenangereicherter oder möglicherweise auch enantiomerenreiner Form gewonnen werden können. Des Weiteren wurden inverse Partialagonisten des US28-Rezeptors mit Isopropanolamin-Struktur sowie natürlich vorkommende antivirale Wirkstoffe mit Chalkon- und Flavonol-Struktur als Modulatoren der konstitutiven Aktivität des US28-Rezeptors entdeckt. Erste Experimente gezielt auf die Entwicklung von photochemisch anregbaren Liganden, durch welche benachbarte Aminosäuren in der Bindungstasche dieser Liganden detektiert werden können, wurden ausgeführt.

Die Infektion mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) ist weit verbreitet und zeigt einen klinisch asymptomatischen Verlauf in immunkompetenten Personen. Zu schwerwiegenden Komplikationen kann es in immunsupprimierten Individuen, wie Transplantationspatienten oder kongenital infizierten Neugeborenen, kommen. Das adaptive Immunsystem trägt entscheidend zur Kontrolle der viralen Infektion bei. Virusneutralisierende Antikörper sind in der Regel gegen Glykoproteine der Hülle, insbesondere gegen Glykoprotein B (gB), gerichtet. In klinischen Studien konnte die Vakzinierung mit gB einen Teilerfolg erzielen. In der vorliegenden Arbeit wurde die humane humorale Immunantwort gegen die antigene Domäne 4 (AD-4) von gB im Detail untersucht. AD-4 wird von >100 Aminosäuren (AS) gebildet und ist diskontinuierlich aufgebaut (AS 121-132 und 344-438). Die Expression der vollständigen Sequenz ist essentiell für die Bindung von humanen AD-4-spezifischen Antikörpern. Ein 3D Modell von HCMV gB wurde benutzt, um benachbarte und oberflächen-exponierte AS innerhalb von AD-4 zu identifizieren, die zu Alaninen mutiert wurden. Ein Screening von AD-4-Mutanten (n=31) ergab, dass die AS-Reste Tyrosin 364 und Lysin 379 (YK-Epitop) für die Bindung von humanen monoklonalen Antikörpern (hu-mAbs) kritisch sind. Das YK-Epitop und benachbarte AS-Reste waren generell wichtig für die AD-4-gerichtete Antikörperantwort während der Infektion. Daneben wurden noch weitere anti-körperbindende Regionen auf AD-4 identifiziert. Rekombinante Viren (n=9), die Mutationen in den kritischen AS-Resten trugen, wurden generiert. Der Verlust der Bindung von hu-mAbs zur isolierten Domäne korrelierte mit dem Verlust der Neutralisationskapazität. Das Neutralisationspotential von humanen polyklonalen AD-4-spezifischen Antikörpern war ebenfalls stark abhängig vom YK-Epitop und den benachbarten AS, was die Dominanz für die antivirale humorale Immunantwort gegen gB unterstreicht. Zudem wurden Kristallstruktur-analysen durchgeführt, um die Antigen-Antikörper-Interaktion auf struktureller Ebene zu charakterisierten. Die Strukturen von AD-4 (1,76 Å), Fab-Fragment des AD-4-spezifischen hu-mAb SM5-1 (1,87 Å) und deren Komplex (2,1 Å) wurden gelöst. Die funktionelle Bedeutung des YK-Epitops konnte strukturell bestätigt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eine Struktur für einen Teil von HCMV gB gelöst werden und die erste Struktur von herpesviralem gB im Komplex mit einem neutralisierenden Antikörper bestimmt werden. Die gezielte Induktion von AD-4-spezifischen Antikörpern nach Immunisierung könnte die Entwicklung eines Impfstoffes gegen HCMV positiv beeinflussen. Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitously distributed virus and infection is usually clinically asymptomatic in healthy individuals. The pathogen causes severe disease in immunodeficient patients, like transplant recipients and congenital infected newborns. The development of antiviral antibodies contributes to the effective control of the infection. During HCMV infection neutralizing antibodies are mainly directed against envelope glycoproteins, especially against glycoprotein B (gB). Clinical studies concerning vaccination with gB demonstrated encouraging results. During this thesis the human humoral immune response directed against antigenic domain 4 (AD-4) of gB was analyzed in more detail. AD-4 consists of >100 amino acids (aa) and is formed by a discontinuous sequence (aa 121-132 and 344-438). Binding of human antibodies to AD-4 was dependent on the expression of the complete AD-4 sequence. A 3D model of HCMV gB was generated and used for the identification of neighboring, surface exposed residues that were exchanged to alanin. An alanin scan of AD-4 mutants (n=31) was carried out and residues tyrosin 364 and lysine 379 (YK-epitope) were identified to be essential for binding of human monoclonal (hu-mAbs) as well as polyclonal AD-4-specific (poly AD-4) antibodies. The YK-epitope was of general importance for the AD-4-directed immune response during infection. However, additional binding sites within AD-4 were also identified. Since both, hu-mAbs and poly AD-4 have virus neutralizing capacity, neutralizing activity of AD-4-specific antibodies was investigated towards recombinant viruses (n=9) harboring mutations at critical contact residues. Loss of antibody binding to isolated AD-4 correlated with loss of neutralizing capacity by AD-4-specific hu-mAbs. Interestingly, neutralization activity of poly AD-4 was also greatly reduced following mutation of the YK-epitope and neighboring residues, emphasizing the importance of the YK-epitope for the anti-gB antibody response. Crystal structure analysis was performed for detailed information on the antigen-antibody-interaction on the structural level. Structures of AD-4 (1.76 Å), a Fab-fragment of the AD-4-specific hu-mAb SM5-1 (1.87 Å) and the complex of both (2.1 Å) were solved. The importance of the YK-epitope for antibody binding was confirmed. The crystal structure of a part of HCMV gB was solved for the first time. This is also the first report of a crystal structure of herpesviral gB in complex with a human neutralizing antibody. The induction of AD-4-specific antibodies following vaccination could be beneficial for the development of an effective anti-HCMV vaccine.

Protection against viruses is provided by the innate, adaptive, and cellular intrinsic immunity. Recently, a subnuclear structure known as nuclear domain 10 (ND10), which represents accumulations of the cellular proteins PML, hDaxx, and Sp100, was shown to mediate intrinsic resistance against infections with human cytomegalovirus (HCMV). The immediate-early protein IE1 of HCMV efficiently antagonizes this antiviral defense mechanism by inducing disruption of the ND10 structures. It has been proposed that this event involves de SUMOylation of the PML protein by IE1, since SUMO-modified forms of PML are essential for ND10 formation. The exact mechanism, however, remains unclear. In order to address the question whether IE1 affects additional proteins besides PML to disrupt ND10 integrity, primary human fibroblasts stably expressing FLAG-tagged versions of SUMO-1 or SUMO-3 were generated. Expression of IE1 in these cells, followed by Western blot analyses, revealed that not only PML but also Sp100 is a specific target of IE1-mediated de SUMOylation. Furthermore, it was observed that overexpression of FLAG-SUMO-1 and FLAG-SUMO-3 promotes HCMV replication. These findings indicate that, besides de-SUMOylation of cellular proteins, HCMV has evolved additional mechanisms to manipulate the SUMO conjugation pathway for its own benefit. In order to gain insight into the structural basis of ND10 disruption, determination of the three-dimensional structure of IE1 was performed. The crystal structure of a central, 45 kDa subdomain of the rhesus macaque cytomegalovirus (RhCMV) IE1 protein revealed an unusual all alpha-helical fold that displays no homology to known protein structures. In vitro and in vivo approaches demonstrated that function and structure are conserved between the IE1 proteins of HCMV and RhCMV. Infection experiments with a recombinant HCMV, expressing the truncated IE1 variant, revealed that the IE1 subdomain is sufficient to induce de-SUMOylation of PML. Intruigingly, this resulted in the dispersal of ND10-associated proteins but not of PML itself, suggesting that ND10 disruption by IE1 is an at least two-step process mediated by distinct domains of the IE1 protein. Finally, the crystal structure of IE1 allowed for the generation and initial characterization of mutant IE1 proteins and, thus, represents a valuable tool to further elucidate the mechanism by which IE1 counteracts ND10-based intrinsic immunity. Das angeborene, erworbene und intrinsische Immunsystem bieten Schutz vor viralen Infektionen. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine als „nukleäre Domäne 10“ (ND10) bezeichnete Struktur im Zellkern, die aus Ansammlungen der zellulären Proteine PML, hDaxx und Sp100 besteht, intrinsische Immunität gegen Infektionen mit humanem Cytomegalovirus (HCMV) vermittelt. Das IE1 Protein von HCMV wirkt diesem antiviralen Abwehrmechanismus effizient entgegen, indem es die ND10-Domänen auflöst. Man vermutet, dass diesem Vorgang eine de-SUMOylierung von PML zugrunde liegt, da SUMO-modifizierte Formen von PML für die ND10-Bildung essentiell sind. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch unklar. Um die Frage zu beantworten, ob IE1 neben PML weitere Proteine beeinflusst, um die Integrität von ND10 zu zerstören, wurden primäre humane Fibroblasten generiert, die FLAG-markierte Versionen von SUMO-1 oder SUMO-3 stabil exprimierten. Die Expression von IE1 in diesen Zellen, gefolgt von Western Blot-Analysen, ergab, dass nicht nur PML, sondern auch Sp100 ein spezifisches Zielprotein der IE1-vermittelten de-SUMOylierung ist. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Überexpression von FLAG-SUMO-1 und FLAG-SUMO-3 die HCMV-Replikation fördert. Dieser Befund weist darauf hin, dass HCMV, zusätzlich zu der de-SUMOylierung zellulärer Proteine, zusätzliche Mechanismen entwickelt hat, um das SUMO-System zu seinem Vorteil zu beeinflussen. Um Hinweise auf die strukturelle Grundlage der ND10-Auflösung zu erhalten, wurde die drei-dimensionale Struktur von IE1 bestimmt. Die Kristallstruktur einer zentralen, 45 kDa großen Unterdomäne von IE1 des Rhesusaffen-Cytomegalovirus (RhCMV) zeigte eine ungewöhnliche alpha-helikale Faltung, die keine Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinstrukturen aufweist. In vitro- und in vivo-Versuche ergaben, dass Funktion und Struktur der IE1-Proteine von HCMV und RhCMV konserviert sind. Infektionsexperimente mit einem rekombinanten HCMV, das die verkürzte IE1-Variante exprimierte, zeigten, dass die Unterdomäne von IE1 ausreicht, um PML zu de-SUMOylieren. Dies führt zu einer Zerstreuung von ND10-assoziierten Proteinen, aber nicht von PML selbst, auf einen mindestens zweistufigen Prozess der ND10-Auflösung schließen lässt – vermittelt durch verschiedene Domänen des Proteins. Zuletzt war es möglich anhand der Kristallstruktur von IE1 mutierte Proteine zu generieren und eine erste Charakterisierung vorzunehmen. Die Struktur stellt daher ein hilfreiches Mittel zur Aufklärung des Mechanismus dar, über den IE1 die ND10-vermittelte Immunität überwindet.

Human cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous Herpesvirus causing morbidity under conditions of impaired immune control. Previous data of our laboratory demonstrated that the susceptibility to HCMV infection, quantified as the percentage of cells expressing the immediate early gene products IE 1-2 at 24 hours post infection, was dramatically different: very low ( roughly 30 %) into M1-Mphi, and in contrast very high ( roughly 70%) in M2-Mphi;. Because it was still not known how HCMV enters and establishes infection into Mphi, we decided to investigate HCMV the entry mechanisms into these two types of Mphi. The first data showed that shortly after infection HCMV particles acquired different cellular distribution in M1- and M2-phi. While the majority of vesicles containing viral particles remained in the cell periphery in M1-Mphi, they accumulated in proximity of the nucleus in M2-Mphi thus suggesting a more efficient intracellular translocation in this cell type. Since the size of HCMV particles is compatible with the average size of macropinosomes, we considered macropinocytosis as a mechanism used by HCMV to enter Mphi66;. Since the actin polymerization inhibitor Latrunculin A caused a significant reduction of the IE 1-2 expression in M1- and M2-Mphi, we could demonstrate that actin polymerization was required for HCMV infection. Then, macropinosome formation appears to be uniquely susceptible to inhibition by amiloride, by using EIPA we could show that both the expression of IE 1-2 viral proteins were inhibited in both M1-and M2-Mphi. Another peculiar feature of macropinocytosis is the high sensitivity to pH variation. By using lysosomotropic agents, respectively we obtained strong reduction in the percentage IE 1-2 positive cells thus demonstrating that HCMV infection of M1- and M2-Mphi takes place by a pH-dependent pathway. In summary, our data indicate that HCMV is internalized in M1- and M2-Mphi by a macropinocytosis pathway followed by a pH-dependent release of the capsids.

Das Cytomegalovirus (CMV) ist ein klinisch relevantes Pathogen, da es in immundefizien-ten Patienten schwere Komplikationen auslöst. Für die Entwicklung neuer Therapieansät-ze ist das Verständnis der Immunkontrolle in gesunden infizierten Personen wichtig. Um dies zu untersuchen wird das Modellsystem des murinen Cytomegalovirus (MCMV) ge-nutzt. In immundefizienten RAG-/- Mäusen wird die MCMV-Infektion nach Verabreichung von Antikörpern kontrolliert. Antikörper vermitteln Schutz über verschiedene Effektormechanis-men. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Hypothese überprüft, dass im Falle der MCMV-Infektion Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC) in vivo ein wichtiges Protektionsprinzip darstellt. Um die Rolle von Immunglobulin-Fc ver-mittelten Effektorfunktionen zu untersuchen, wurde ein rekombinantes MCMV generiert, welches ein heterologes antigenes Protein nur auf der Oberfläche infizierter Zellen, nicht aber als Teil des Viruspartikels exprimierte. Hierfür wurde das Glykoprotein B des huma-nen CMV (hgB) partiell und komplett in das Genom von MCMV157luc inseriert. Die resul-tierenden Viren replizierten in vitro und in RAG-/- Mäusen vergleichbar zu MCMV157luc. hgB wurde in vitro auf der Oberfläche von infizierten Zellen detektiert und induzierte in vivo eine Antikörperantwort. Beide Viren wurden von neutralisierenden Antikörpern ge-gen hgB in vitro nicht neutralisiert. In Schutzversuchen wurden hohe Dosen muriner und humaner hgB-spezifischer Antikörper verabreicht. Es konnte keine Protektion nachgewie-sen werden. Der fehlende Schutz wurde sowohl bei prophylaktischer, als auch bei thera-peutischer Antikörpergabe beobachtet. Die möglichen Ursachen dafür werden im Diskus-sionsteil dieser Arbeit erörtert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde durch sukzessive Entfernung einzelner Zelltypen deren Bedeutung für den Verlauf der MCMV-Infektion bestimmt. In CD8-/- Mäusen verlief die Infektion entsprechend immunkompetenten C57BL/6 Mäusen bis zur Ausbildung von La-tenz. CD8-/-JHT-/- Mäuse, ohne CD8+ T-Zellen und B-Zellen, kontrollierten die MCMV-Infektion selbst nach Depletion der CD4+ T-Zellen. Dies demonstrierte die Austauschbar-keit der konventionellen B- und T-Zellen. Erst die Depletion aller CD3+ Zellen in CD8-/-JHT-/- Mäusen führte zum Verlust der Immunkontrolle. Folglich waren CD3+ doppelt negative (DN) T-Zellen am Schutz beteiligt. Zytotoxizität konnte in vitro nur für CD3+DN T-Zell Re-zeptor (TCR) γδ+ Zellen bestätigt werden. Adoptiver Transfer von präadaptierten TCRγδ+ Effektorzellen in produktiv infizierte, immundefiziente RAG-/- Mäuse reduzierte den Virus-titer signifikant und verlängerte das Überleben der Versuchstiere. Der Transfer der glei-chen Anzahl TCRαβ+ Zellen bewirkte dagegen kein längeres Überleben. Ebenso zeigte der Transfer naiver DN Zellen keinen protektiven Effekt. Diese Ergebnisse fügen eine weitere Ebene zur komplexen Immunkontrolle von CMV hinzu, welche für die klinische Anwen-dung interessant sein könnte. Cytomegalovirus (CMV) is a clinically relevant pathogen because it causes severe compli-cations in immunodeficient patients. Understanding immune control in healthy infected individuals is important for the development of new therapeutic strategies. For research the murine model of MCMV is used. Immunodeficient RAG-/-mice are able to control mu-rine cytomegalovirus (MCMV) infection after application of antibodies. Those antibodies can mediate different protective effector mechanisms. In the first part of this thesis we challenged the hypothesis that antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) provides in vivo an important principle of protection after MCMV infection. To establish the role of immunoglobulin-Fc mediated effector functions we constructed a recombinant MCMV expressing a heterologous antigenic protein only on the surface of infected cells but not as part of the infectious virion. Therefore partial or complete glycoprotein B of human CMV (hgB) was inserted in the genome of MCMV157luc. The resulting viruses rep-licated comparably to MCMV157luc in vitro and in RAG-/- animals. In vitro the hgB protein was detected on the surface of infected cells and in vivo it was able to induce an antibody response. Neutralizing hgB specific antibodies were incapable of neutralizing any one of the hgB expressing viruses in vitro. High doses of murine and human hgb-specific antibod-ies were tested in vivo for their antiviral capacity, but no protection could be detected. Lacking protection was observed after prophylactic as well as after therapeutic applica-tion of antibodies. Possible explanations are considered in the discussion chapter of this thesis. In the second part of this work the influence of certain effector cell types on the course of MCMV infection was determined by their gradual ablation. CD8-/- mice controlled virus infection to the same extent as fully immunocompetent C57BL/6 mice and established latency. CD8-/-JHT-/- mice, which lack both CD8+ cells and B cells, also controlled infection even after in vivo depletion of CD4+ T cells thus demonstrating the dispensability of con-ventional B and T cells. Depletion of all CD3+ cells in CD8-/-JHT-/- mice finally lead to a loss of protection. Therefore CD3+ double negative (DN) T cells were able to mediate protec-tion against MCMV infection. Only CD3+ DN T cell receptor (TCR) γδ+ cells were able to lyse infected cells in vitro. Adoptive transfer of TCRγδ+ effector cells into immunodeficient CMV infected RAG-/- mice lead to significantly reduced viral titers and prolonged survival of the recipients. Transfer of the same number of TCRαβ+ T cells could not elongate sur-vival. Likewise transfer of naîve cells showed no protective effect. These results add an-other layer to the complex immune control of CMV which might be of clinical relevance.

The human cytomegalovirus (HCMV) UL78 ORF is considered to encode an orphan 7-transmembrane receptor (7-TMR). However, until now the UL78 protein (pUL78) has not been characterized. Therefore, the aim of this thesis was to elucidate the function of pUL78. UL78 was expressed in the cytoplasm and was found mainly associated with the endoplasmic reticulum. We provide evidence that pUL78 is also localized on the cell surface from where it is quickly endocytosed. Using the bimolecular fluorescence complementation assay and co-immunoprecipitation experiments it could be shown, that pUL78 is able to form homomeric and heteromeric structure of pUL78 and the US28 protein, respectively. However, the absence of pUL78 had no effect on the inositol phosphate accumulation triggered by the US28 protein. Summarized, the results of this thesis suggest that the UL78 protein of HCMV traffics between the cell surface and cytoplasm from where it might be recycled via early endosomes.

Der klinische Einsatz hochpotenter Immunsuppressiva ist eine wesentliche Voraussetzung für die erfolgreiche Organtransplantation. Unter immunsuppressiver Therpie steigt vor allem das Risiko für opportunistische Infektionen. Aufgrund der Virulenz und Häufigkeit ist die Infektion mit dem humanen Zytomegalievirus (CMV) dabei von besonderer Bedeutung. Immunsuppressiva greifen ähnlich wie antivirale Substanzen an essentiellen, z.T. gemeinsamen Stoffwechselwegen in den Zellzyklus ein. Die Bedeutung von immunsuppressiven Substanzen für die Virusreplikation ist aber bislang nicht systematisch untersucht worden. Mit Hilfe eines neuen optimierten CMV-Replikationstests wurde die potentielle antivirale Wirkung verschiedener Immunsuppressiva untersucht. Für die Evaluation der CMV-Replikation wurde der klassische Focus-Reduktionstest mithilfe eines grün-fluoreszierenden pp65 EYFP CMV weiterentwickelt und durch Einsatz einer Fluorimetermessung automatisiert. Für die eingesetzten Immunsuppressiva konnten in den getesteten klinisch relevanten Konzentrationen verschiedene Interaktionsmuster mit der CMV- Replikation nachgewiesen werden. Die klinische Relevanz der in dieser Studie nachgewiesenen intrinsischen (CSA, MAP-K.-Inh. 3736 und 3830), additiven (CSA, MAP-K.-Inh. 3736 und 3830), synergistischen (Dec.H, Everolimus) bzw. fehlenden (MPA) antiviralen Wirkung kann nur in klinischen Studien getestet werden. Keine der untersuchten, immunsuppressiven Substanzen war in der Lage, die CMV-Replikation komplett zu hemmen. Möglicherweise könnten aber bestimmte Kombinationstherapien die Entwicklung opportunistischer CMV Infektionen unterdrücken. Diese Hypothese muss durch weitere Untersuchungen und durch klinische Daten gestützt werden.

The generation of infectious virus particles in HCMV infected cells is a very complex and only a partially understood process. To determine the detailed mechanistic processes essential for efficient HCMV morphogenesis, it is crucial to identify and investigate the function of involved viral and cellular proteins. In this work, the function of the tegument protein pUL71 was characterized during HCMV infection. Ultrastructural analysis revealed that pUL71 is required for efficient secondary envelopment. Here, the importance of pUL71 for the generation of virus progeny was shown by an impaired viral growth of the UL71 stop mutant virus compared to the HCMV wild-type virus. The role of pUL71 in the process of secondary envelopment was further supported by its association with TGN membranes, which are currently in discussion to serve as the HCMV envelopment site. Furthermore it could be shown that pUL71 recruits the cellular ESCRT-associated protein Vps4A to the viral assembly compartment suggesting that the cellular ESCRT machinery might be involved in HCMV secondary envelopment. The Vps4A interaction domain was identified at the C-terminus of pUL71. Sequence analysis of this domain revealed striking similarities to the MIM2 domain of ESCRT-III proteins which are the cellular interaction partners of Vps4A. These sequence similarities and the importance of pUL71 during the HCMV secondary envelopment leads to the hypothesis that pUL71 might mimic the function of ESCRT-III proteins during HCMV infection to support viral envelopment. Another discovered viral pUL71 interaction partner is the tegument protein pUL103, which is also involved in late steps of HCMV morphogenesis. The similar growth defect of the virus mutants in the absence of pUL71, pUL103 or both proteins together combined with the similar localization of both proteins at the AC leads to the hypothesis pUL71 and pUL103 might form a functional complex facilitating HCMV secondary envelopment.

We could show that HCMV morphogenesis is comparable in fibroblasts, endothelial cells and macrophages and that the absence or the functional impairment of the HCMV tegument protein pUL71 is affecting viral morphogenesis in all investigated cell types in a similar manner. pUL71 is associated with membranes within the AC at late stages of infection, and its absence causes impairment of secondary envelopment, morphological alterations of vesicles within the AC, and influences MVBs in infected fibroblasts, HUVEC, and MDM. Particularly a pUL71 palmitoylation site and a leucine zipper like motif are of great importance for pUL71 function and HCMV morphogenesis, while a C-terminal tetra-lysine motif only augments secondary envelopment. In contrast, a Vps4 interacting motif of pUL71seems to be not important for HCMV morphogenesis.