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Die Translokation von Proteinen durch die prokaryotische Zytoplasmamembran und die Membran des eukaryotischen Endoplasmatischen Retikulums (ER) ist ein wichtiger Schritt in der Biosynthese sekretorischer Proteine sowie Membranproteinen und erfolgt über den hoch konservierten Sec-Translokationskanal (Sec61 in Eu-, SecY in Prokaryoten). Die Analyse der Translokation durch das Sec61/SecY-Translokon zeigt, dass 1) die ineffiziente Translokation von intrinsisch unstrukturierten Proteinen durch Sec evolutionär konserviert ist und 2) das SecY Proteine mit intrinsisch unstrukturierten Domänen (IDD) nicht effizient translozieren kann. Weiterhin wurde gezeigt, dass 3) die konservierte alpha-Helix (L3) bakterieller Porine ein Motiv negativ geladener Aminosäuren beinhaltet, das essentiell für eine SecY-Translokation ist, und welches Teil eines neuen Qualitätskontrollmechanismus in der Biosynthese bakterieller Porine zu sein scheint.

In highly polarized neurons, endoplasmic reticulum (ER) forms a dynamic and continuous network in axons that plays important roles in lipid synthesis, Ca2+ homeostasis and the maintenance of synapses. However, the mechanisms underlying the regulation of axonal ER dynamics and its function in regulation of local translation still remain elusive. In the course of my thesis, I investigated the fast dynamic movements of ER and ribosomes in the growth cone of wildtype motoneurons as well as motoneurons from a mouse model of Spinal Muscular Atrophy (SMA), in response to Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation. Live cell imaging data show that ER extends into axonal growth cone filopodia along actin filaments and disruption of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment impairs the dynamic movement of ER in the axonal filopodia. In contrast to filopodia, ER movements in the growth cone core seem to depend on coordinated actions of the actin and microtubule cytoskeleton. Myosin VI is especially required for ER movements into filopodia and drebrin A mediates actin/microtubule coordinated ER dynamics. Furthermore, we found that BDNF/TrkB signaling induces assembly of 80S ribosomes in growth cones on a time scale of seconds. Activated ribosomes relocate to the presynaptic ER and undergo local translation. These findings describe the dynamic interaction between ER and ribosomes during local translation and identify a novel potential function for the presynaptic ER in intra-axonal synthesis of transmembrane proteins such as the α-1β subunit of N-type Ca2+ channels in motoneurons. In addition, we demonstrate that in Smn-deficient motoneurons, ER dynamic movements are impaired in axonal growth cones that seems to be due to impaired actin cytoskeleton. Interestingly, ribosomes fail to undergo rapid structural changes in Smn-deficient growth cones and do not associate to ER in response to BDNF. Thus, aberrant ER dynamics and ribosome response to extracellular stimuli could affect axonal growth and presynaptic function and maintenance, thereby contributing to the pathology of SMA., Das Endoplasmatische Retikulum (ER) bildet ein dynamisches und kontinuierliches Netzwerk in Axonen von stark polarisierten Neuronen und spielt dabei eine wichtige Rolle in der Lipidsynthese, dem Ca2+ Homöostase und der Aufrechterhaltung von Synapsen. Allerding sind die Mechanismen, die der Regulierung der axonalen ER-Dynamik und seiner Funktion bei der dynamischen Regulierung der lokalen Translation zugrunde liegen, nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die schnellen dynamischen Bewegungen des ERs und Ribosomen in Wachstumskegeln von Wildtyp- und Smn-defizienten Motoneuronen als Reaktion auf einen kurzen Puls von Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) untersucht. Daten der Bildgebung lebender Zellen zeigen, dass sich das ER in axonalen Filopodien des Wachstumskegels entlang von Aktin-Filamenten ausbreitet. Die Beeinträchtigung des Aktin-Zytoskeletts mittels Cytochalasin D Behandlung führt zu einer Einschränkung der dynamischen Bewegung des ERs in den axonalen Filopodien. Im Gegensatz zu den Filopodien scheinen die Bewegungen des ERs in Wachstumskegeln von einem koordinierten Zusammenspiel des Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts zu beruhen. Myosin VI ist insbesondere für die ER-Bewegungen in Filopodien erforderlich, während Drebrin A die Aktin/Mikrotubuli koordinierte ER-Dynamik vermittelt. Darüber hinaus zeigte sich, dass das BDNF/TrkB Signal die Bildung von 80S-Ribosomen in Wachstumskegeln in Sekundenschnelle auslöst. Aktivierte Ribosomen verlagern sich in das präsynaptische ER und vollziehen eine lokale Translation. Diese Ergebnisse beschreiben die dynamische Interaktion zwischen ER und Ribosomen während der lokalen Translation und zeigen eine neuartige potentielle Funktion des präsynaptischen ER bei der intra-axonalen Synthese von Transmembranproteinen wie die α-1β Untereinheit der N-Typ Ca2+ Kanäle in Motoneuronen auf. Darüber hinaus zeigen wir, dass in Smn-defizienten Motoneuronen die dynamischen ER-Bewegungen in axonalen Wachstumskegeln beeinträchtigt sind, was mit einer gestörten Polymerisation von Aktinfilamenten zusammenzuhängen scheint. Interessanterweise erfahren Ribosomen in Smn-defizienten Wachstumskegeln keine schnellen strukturellen Veränderungen und assoziieren nicht mit dem ER als Reaktion auf BDNF. Somit könnten eine abweichende ER-Dynamik und die Reaktion der Ribosomen auf extrazelluläre Reize das axonale Wachstum und die präsynaptische Funktion und Aufrechterhaltung beeinträchtigen und damit zur Pathologie von SMA beitragen.

Die vorliegende Arbeit charakterisiert den Effekt eines transmittierten Endoplasmatischen Retikulum Stress Signals auf murine Kupffer Zellen. Weitergehend werden Strategien vorgestellt, die zur Identifizierung potentiell transmittierter Faktoren beitragen sollen. Diese Strategien basieren auf physikalischen und biochemischen Eigenschaften aktiver konditionierter Medien.

The subtilase cytotoxin (SubAB) belongs to the family of AB5 toxins and is produced together with Shiga toxin (Stx) by certain Stx-producing E. coli strains (STEC). For most AB-type toxins, it is assumed that cytotoxic effects can only be induced by a complete holotoxin complex consisting of SubA and SubB. However, it has been shown for SubAB that the enzymatically active subunit SubA, without its transport and binding domain SubB, induces cell death in different eukaryotic cell lines. Interestingly, the molecular structure of SubA resembles that of the SubAB complex. SubA alone is capable of binding to cells and then being taken up autonomously. Once inside the host cell, SubA is transported, similar to the SubAB holotoxin, via a retrograde transport into the endoplasmatic reticulum (ER). In the ER, it exhibits its enzymatic activity by cleaving the chaperone BiP/GRP78 and thereby triggering cell death. Therefore, the existence of toxic single SubA subunits that have not found a B-pentamer for holotoxin assembly might improve the pathogenic potential of subtilase-producing strains. Moreover, from a pharmacological aspect, SubA might be an interesting molecule for the targeted transport of therapeutic molecules into the ER, in order to investigate and specifically modulate processes in the context of ER stress-associated diseases. Since recent studies on bacterial AB5 toxins contributed mainly to the understanding of the biology of AB-type holotoxins, this mini-review specifically focus on that recently observed single A-effect of the subtilase cytotoxin and addresses whether a fundamental shift of the traditional AB5 paradigm might be required., publishedVersion

Lebenswichtige Vorgänge entwickeln sich häufig dynamisch und in Abstimmung an die Umgebungsverhältnisse. Um den biologischen Abläufen innerhalb der Zelle geeignete Bedingungen zu gewährleisten, verfügen Zellen über zahlreiche Kompartimente mit einer strukturell und biochemisch spezifischen Zusammensetzung. Allerdings sind die überwiegend selbstständig organisierten Zellstrukturen nicht voneinander unabhängig und regulieren sich wechselseitig. Die Untersuchung von Ordnungsprinzipien in lebender Materie erfordert daher nicht nur Mikroskopiemethoden, die hochauflösende Beobachtungen ermöglichen, sondern auch Modellbildungen, um die Komplexität der erfassten Vorgänge reduzieren zu können. In der vorliegenden Arbeit werden selbstorganisierte Strukturbildungsprozesse an Lebendkulturen menschlicher Zellen untersucht. Hierzu werden fluoreszenzmarkierte Zellstrukturen mittels konfokaler Lichtmikroskopie abgebildet und deren orts- wie zeitabhängigen Rückwirkungen unter biochemischer Einflussnahmen quantifiziert. Die Ergebnisse dokumentieren eine gitterartige Anordnung der Austrittsstellen des endoplasmatischen Retikulums. Deren Eigenschaften werden entscheidend von der Beschaffenheit des endoplasmatischen Retikulums bestimmt und können mit einem diffusionsbestimmten Entmischungsprozess erklärt werden. Dabei wird eine kontrast- und auflösungsverbesserte Bildgebungsmethode konfokaler Aufnahmen charakterisiert und am tubulären Netzwerk des endoplasmatischen Retikulums angewandt. Außerdem werden die Bewegungen von Aktinfilamenten im Zellkern analysiert. Somit bildet nukleares Aktin dynamische und anpassungsfähige Strukturen, die einer heterogenen Subdiffusion in der viskoelastischen Umgebung des Zellkerns nach dem Modell einer zeitveränderlichen fraktionalen Brownschen Bewegung unterliegen. Zusammen mit den Modellerklärungen vermitteln die Ergebnisse dieser Arbeit neuartige Erkenntnisgewinne über die vielschichtigen Wechselbeziehungen zwischen der Organisation und Dynamik selbstorganisierter Vorgänge innerhalb von Zellen.

Hintergrund: Genetische Analysen am Universitätsklinikum Münster identifizierten eine neue heterozygote missense Mutation (c.706C>T; p.R236C) im Gen SEC61A1 bei zwei verwandten Patientinnen von Polyzystischer Lebererkrankung. Ziel: Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Zellkulturmodells zur Untersuchung der molekularen und zellulären Effekte der Sec61a1 Mutante R236C. Methoden: Zur transienten oder stabilen Expression von Sec61a1R236C in der Zellkultur wurden Transfektionen mit Plasmidvektoren unterschiedlicher Eigenschaften sowie Knockout-Rescue Zelllinien angesetzt. Anschließende Untersuchung der generierten Zellen erfolgte mittels Immunfluoreszenzmirkoskopie und Western-Blot Analyse. Ergebnis: Eine dauerhafte Expression von Sec61a1R236C ist nicht gelungen. Ein Vergleich der Proteinlevel mit dem Wildtypen zeigt eine signifikant geringere Expression der Mutante. Die Mutante scheint auf unbekannte Weise toxisch zu sein.

Die Biogenese von Peroxisomen umfasst die Bildung von peroxisomalen Membranen, den Import von peroxisomalen Membran- und Matrixproteinen, peroxisomales Wachstum, Teilung und Proliferation. \(\it Hs\)PEX16, \(\it Hs\)PEX3 und \(\it Hs\)PEX19 stellen die bisher einzigen identifizierten Peroxine dar, deren Ausfall eine komplette Blockade der peroxisomalen Biogenese hervorruft. Diese Arbeit konnte zeigen, dass die Expression von \(\it Hs\)PEX16, \(\it Hs\)PEX3 und \(\it Hs\)PEX19 in menschlichen Fibroblasten der jeweilig zugehörigen Komplementationsgruppe die Biogenese von Peroxisomen wiederherstellen kann. Mittels indirekter Immunfluoreszenzmikroskopie konnten zeitlich unterschiedliche Phasen der peroxisomalen Biogenese durch Komplementation PEX3-, PEX16- sowie PEX19 defizienter humaner Fibroblasten charakterisiert werden. Neue \(\textit {in vivo}\)-Proteininteraktionen des \(\it Hs\)Pex3-Proteins lassen Hypothesen über weiterführende Funktionen des Proteins - über die peroxisomale Biogenese hinaus - zu.

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2021; Aachen : RWTH Aachen University 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme (2021). = Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2021, The bile acid-sensitive ion channel (BASIC) is a member of the degenerin/epithelial Na+ channel (Deg/ENaC) gene family. It is expressed mainly in brain, liver and intestine. In the liver the expression is limited on the cholangiocytes and in the brain on unipolar brush cells. As it‘s name bile acid-sensitive ion channel implies, BASIC is activated by bile acids. The physiological function of BASIC is yet unknown.In this study the subcellular localisation of BASIC was examined. After transient transfection of BASIC in heterologous cell lines HEK293 and CHO, a reticular distribution pattern has been observed. To identify this reticular distribution pattern, cells were stained with fluorescent organelle markers or antibodies and were examined with confocal microscopy. In the process, a colocalisation of BASIC and anti-PDI, an antibody against endoplasmtic reticulum, has been found. In order, the protein sequence was analysed to identify motives that could be the reason for the distribution pattern of BASIC in the cell. BASIC consists of two transmembrane domains, an extracellular loop and short intracellular amino- and carboxy-termini. Some truncations on the amino- and carboxy-terminus were made, which did not cause any differences in the reticular distribution pattern of BASIC. Therefore no motive could be determined as important for the targeting of BASIC. A staining of the plasma membrane was also not detected. In summary, this study could identify a localisation of BASIC in endoplasmatic reticulum. So it can be suggested that BASIC plays a role in this intracellular compartment., Published by RWTH Aachen University, Aachen

Lipids are the building blocks for cellular membranes; they provide signalling molecules for membrane dynamics and serve as energy stores. One path of their synthesis is initiated by glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT), which in Dictyostelium resides on the endoplasmic reticulum. When an excess of fatty acids is present, it redistributes to storage organelles, the lipid droplets. Mutants, where the GPAT was eliminated by homologous recombination, produce fewer lipid droplets and are almost devoid of triacylglycerols (TAG), rendering them more resistant to cell death and cell loss in the developmental stages preceding fruiting body formation. The enzyme most closely related to GPAT is called FARAT, because it combines a fatty acyl-reductase (FAR) and an acyltransferase (AT) domain in its sequence. The protein is confined to the lumen of the peroxisome, where it transfers a fatty acid to dihydroxyacetone-phosphate initiating the synthesis of ether lipids, later completed at the endoplasmic reticulum. A mutant lacking FARAT produces lipid droplets that are devoid of the storage lipid monoalkyl-diacyl-glycerol (MDG), but the efficiency of spore formation in the developmental cycle is largely unaltered. Instead, these mutants are strongly impaired in phagocytosis of yeast particles, which is attributed to reduced synthesis of membrane phospholipids containing ether-linked chains.

Sepsis ist eine lebensbedrohliche Organdysfunktion, die durch eine dysregulierte Wirtsantwort auf eine Infektion ausgelöst wird. Eine Komplikation ist die Schädigung der Skelettmuskulatur (SM), critical illness myopathy (CIM). Die systemische Entzündungsreaktion führt zu Zellstress und damit zu vermehrten fehlgefalteten Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum. In der Zelle startet die Unfolded Protein Response (UPR), die zell-protektiv wirkt, aber auch pro-apoptotische Wege auslöst. Ziel dieser Arbeit ist es, das Auftreten von ER-Stress, und die Aktivierung pro-apoptotischer Wege im SM von Patienten mit peritonealer Sepsis zu beschreiben. SM von Sepsispatienten und septischen Mäusen wurde untersucht. Die Analyse der Inflammation und der Aktivität der UPR erfolgte anhand der mRNA-Expression etablierter Marker. Zur Beschreibung der UPR und der pro-apoptotischen Signalwege wurden die Genexpressionen von ATF4, ATF6, XBP1, CHOP und CASP12 betrachtet. Zudem wurden histologische Färbungen im SM durchgeführt. Dabei wurden Färbungen mit CD68+-Makrophagen, TUNEL, CHOP und CASP12 analysiert. Die Ergebnisse der Sepsispatienten wurden mit Kontrollpatienten und Diabetes-Patienten verglichen. Laborwerte dienten zur Charakterisierung der Studiengruppen und zur Ermittlung von Korrelationen. Im Skelettmuskel von Sepsis-Patienten und -Mäusen konnte eine verstärkte Entzündungsreaktion durch vermehrtes CD68 und die Aktivierung der UPR durch die mRNA-Expressionen von XBP1u/s gezeigt werden. Die Betrachtung der Apoptose-Mediatoren CHOP und CASP12 ergab auf mRNA-Ebene kaum Unterschiede. Die Färbungen von CHOP und CASP12 lieferten Hinweise für die Assoziation von UPR und Apoptose im septischen Skelettmuskel. Die beschriebenen Ergebnisse waren im humanen und murinen Studienkollektiv vergleichbar. Die Ergebnisse können ein Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen der UPR im septischen SM sein und einen Beitrag zur Pathogenese der CIM leisten.

Das Endoplasmatische Retikulum (ER) übernimmt wichtige Funktionen in der Prozessierung neu synthetisierter Proteine sowie bei der Lipidbiosynthese und Calciumspeicherung. ER-Stress führt zur Aktivierung der Unfolded protein response (UPR), über PERK (Protein Kinase RNA-like Endoplasmic Reticulum Kinase), ATF6 (activating transcription factor 6) und IRE1 (inositol-requiring enzyme 1). Die UPR resultiert in einem Translationsstop sowie in transkriptionellen Kompensationsmechanismen, die entweder zum Überleben der Zelle oder zum Zelltod führen. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass die zusätzliche Depletion von PDI (protein disulfide isomerase family A member 1) in ERp57- (protein disulfide isomerase family A member 3) Knockdown (KD) Zellen keine stärkere Toxizität bei der Behandlung von kolorektalen Karzinomzellen bringt. Die p53-abhängige Apoptoseinduktion und der additive Effekt von ERp57-KD und Bestrahlung wurden durch zusätzlichen PDI-KD verringert. Nichtsdestotrotz zeigte sich eine starke Einschränkung der Proliferation auch durch Doppel-KD-von ERp57 und PDI. Es konnte nachgewiesen werden, dass PDI nach ERp57-KD vermehrt oxidiert vorlag und so eine proapoptotische PERK-Aktivierung triggern konnte. Die zusätzliche Depletion von PDI führte zur Inaktivität von PERK und zu einer geringeren Apoptoserate sowie normaler Zellzyklusprogression. Auch unter globalem ER-Stress spielte PDI eine entscheidende Rolle in der PERK-Aktivierung: Fehlte PDI, entfiel die protektive PERK-Aktivierung und die Zellen zeigten sich vulnerabler gegenüber ER-Stress induzierenden Reagenzien. Diese Ergebnisse zeigen, dass ERp57 als Reduktase für PDI in Zellen agiert und eine Akkumulation von oxidiertem PDI eine essenzielle Rolle in der Aktivierung des ER-Stress-Sensors PERK spielt. Eine Inhibition von PDI ist daher ein rationaler Ansatz zur Verminderung der PERK-Aktivität. Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2018

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende neurodegenerative Krankheiten, deren Ursache die Umfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrP\(^{C}\)) in eine abnormal gefaltete Form (PrP\(^{Sc}\)) ist. PrP\(^{C}\) kann Dimere ausbilden, welche mit einer protektiven Funktion assoziiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die neurotoxische Mutation (A113V, A115V, A118V) keinen Einfluss auf die Homo- und Heterodimerisierung mit PrP hat. Die Umwandlung von PrP\(^{C}\) zu PrP\(^{Sc}\) wird jedoch durch die Ausbildung von Dimeren verhindert. Der Transport sekretorischer Proteine, wie beispielsweise von PrP, in das Endoplasmatische Retikulum erfolgt in Eukaryoten durch das Sec61-Translokon. In Prokaryoten ermöglicht der homologe Translokationskanal (SecY), den Transport sekretorischer Proteine in den periplasmatischen Raum. Wir konnten zeigen, dass die beeinträchtigte Sec-Translokation intrinsisch unstrukturierter Proteine ein konserviertes evolutionäres Merkmal zwischen Säugerzellen, Hefe und \(\textit {E.coli}\) ist.

Durch einen Prozess, der als sekundäre Endosymbiose bezeichnet wird, wurde eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen. Dies führte zur Entstehung der komplexen Plastiden von Cryptophyten, Haptophyten, Heterokontophyten und Apicomplexa. Das Genom dieser ehemaligen Rotalge wurde im Laufe der Evolution dramatisch reduziert und zum größten Teil in den Wirtskern transferiert. Dies führte dazu, dass die meisten plastidären Proteine nun im Zellkern des Wirtes kodiert sind und aus dem Cytosol in die Plastide importiert werden müssen. Es mussten entsprechende Translokationsmechanismen entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht neue Komponenten der dritten Plastidenmembran zu identifizieren, welche auf die äußere Chloroplastenmembran primärer Plastiden zurückgeht. Diese Membran unterscheidet sich von anderen plastidären Membranen durch die Präsenz von β-barrel Proteinen, die für die äußeren Membranen von Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten charakteristisch sind. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen wurden putative plastidäre β-barrel Proteine vorhergesagt und als Fusionsproteine in P. tricornutum lokalisiert. Es wurden von 23 Proteinen, vier in der Plasmamembran, vier im Cytosol, fünf im ER, fünf außerhalb der Plastide und fünf in der Plastide lokalisiert. Es konnte kein Protein in der dritten Plastidenmembran identifiziert werden. Die Vorhersagealgorithmen sind nicht dafür geeignet eukaryote Proteome auf β-barrel Proteine hin zu analysieren. Des Weiteren lag ein anderes Problem in der Beschaffenheit der Genmodelle, welche die Basis der Vorhersage bildeten. In einem zweiten Projekt wurde die Subkompartimentierung des ERs in P. tricornutum untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass das ER in ein hostER, die Kernhülle (NE) und das cER eingeteilt werden kann, wurde untersucht, ob sich hER und cER in ihrer Funktion unterscheiden. Basierend auf der Annahme, dass hER und cER durch den Tag-Nacht-Zyklus der Photosynthese unterschiedlichen physiologischen Bedingungen ausgesetzt sind, wurde gefolgert, dass einige Funktionen wie zum Beispiel die Proteinqualitätskontrolle und -faltung auf das hER beschränkt sein könnten. Daher wurden Faktoren der UPR in P. tricornutum untersucht. Überraschenderweise konnten IRE1 und PERK in Heterokontophyten und Haptophyten identifiziert werden. Lokalisationsstudien der UPR-Faktoren zeigten, dass diese hauptsächlich auf das hER und den NE beschränkt sind, wohingegen hDer1-2 als Beispiel für Proteindegradation im gesamten ER und Transporterproteine wie Tpt1 hauptsächlich im cER vorhanden sind. Die Abwesenheit der UPR im cER lässt sich durch die Physiologie begründen. Außerdem wirft die Präsenz von PERK und IRE1 in Protisten ein neues Licht auf die Sichtweise der Evolution der UPR. So ist eine alternative Entstehungsgeschichte der UPR denkbar., In a process termed secondary endosymbiosis a red alga was established as an endosymbiont. This led to the evolution of the complex plastids found in cryptophytes, haptophytes, heterokontophytes and apicomplexans. The genome of this former red alga was drastically reduced and mostly transferred into the host nucleus. Thus, most plastidal proteins are now encoded in the host nucleus and have to be imported from the cytosol into the plastid. Appropriate transport mechanisms had to be evolved. The aim of this work was the identification of new components of the third plastid membrane. It evolved from the outer chloroplast envelope of primary plastids. This membrane is distinct from other plastidal membranes due to the fact that it presumably contains β-barrel proteins which are characteristic of outer membranes of gram-negative bacteria, mitochondria and chloroplasts. With different algorithms putative plastidal β-barrel proteins were predicted and localized as fusion proteins in P. tricornutum. Out of 23 proteins, four were localized to the plasma membrane. Four other proteins were localized to the cytosol. Five proteins were localized to the ER. Additionally five proteins were localized to various compartments outside the plastid and five proteins were localized to the plastid. There were no new proteins of the third plastidal membrane identified. The used prediction algorithms are not suited to analyze a eukaryotic genome for β-barrel proteins. Moreover, the quality of the predicted gene models of the database complicated the analysis. In the second part of this work the subcompartmentalization of the ER of P. tricornutum was analyzed. Based on the classification of the ER into a hostER, nuclear envelope and cER the functions of these two subcompartments were tested. Based on the assumption that hER and cER are exposed to different physiological conditions during night and day, functions as protein quality control and protein folding might be restricted to the hER. Therefore, factors of the UPR were studied. Surprisingly, IRE1 and PERK were identified in heterokontophytes and haptophytes. Localization studies of these UPR factors showed that these are indeed mainly found in the hER and only in minor concentrations in the nuclear envelope and cER. hDer1-2 which takes part in protein degradation shows an equal distribution over the complete ER, while transporter proteins like Tpt1 are mainly found in the cER and nuclear envelope. The absence of the UPR factors in the cER can be explained by different physiological conditions during night and day inside of these two subcompartments. Additionally, the presence of PERK and IRE1 in protists sheds a new light on the evolution of the UPR. An alternative evolutionary history is conceivable.

Durch einen Prozess, der als sekundäre Endosymbiose bezeichnet wird, wurde eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen. Dies führte zur Entstehung der komplexen Plastiden von Cryptophyten, Haptophyten, Heterokontophyten und Apicomplexa. Das Genom dieser ehemaligen Rotalge wurde im Laufe der Evolution dramatisch reduziert und zum größten Teil in den Wirtskern transferiert. Dies führte dazu, dass die meisten plastidären Proteine nun im Zellkern des Wirtes kodiert sind und aus dem Cytosol in die Plastide importiert werden müssen. Es mussten entsprechende Translokationsmechanismen entwickelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht neue Komponenten der dritten Plastidenmembran zu identifizieren, welche auf die äußere Chloroplastenmembran primärer Plastiden zurückgeht. Diese Membran unterscheidet sich von anderen plastidären Membranen durch die Präsenz von β-barrel Proteinen, die für die äußeren Membranen von Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten charakteristisch sind. Mit Hilfe verschiedener Algorithmen wurden putative plastidäre β-barrel Proteine vorhergesagt und als Fusionsproteine in P. tricornutum lokalisiert. Es wurden von 23 Proteinen, vier in der Plasmamembran, vier im Cytosol, fünf im ER, fünf außerhalb der Plastide und fünf in der Plastide lokalisiert. Es konnte kein Protein in der dritten Plastidenmembran identifiziert werden. Die Vorhersagealgorithmen sind nicht dafür geeignet eukaryote Proteome auf β-barrel Proteine hin zu analysieren. Des Weiteren lag ein anderes Problem in der Beschaffenheit der Genmodelle, welche die Basis der Vorhersage bildeten. In einem zweiten Projekt wurde die Subkompartimentierung des ERs in P. tricornutum untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass das ER in ein hostER, die Kernhülle (NE) und das cER eingeteilt werden kann, wurde untersucht, ob sich hER und cER in ihrer Funktion unterscheiden. Basierend auf der Annahme, dass hER und cER durch den Tag-Nacht-Zyklus der Photosynthese unterschiedlichen physiologischen Bedingungen ausgesetzt sind, wurde gefolgert, dass einige Funktionen wie zum Beispiel die Proteinqualitätskontrolle und -faltung auf das hER beschränkt sein könnten. Daher wurden Faktoren der UPR in P. tricornutum untersucht. Überraschenderweise konnten IRE1 und PERK in Heterokontophyten und Haptophyten identifiziert werden. Lokalisationsstudien der UPR-Faktoren zeigten, dass diese hauptsächlich auf das hER und den NE beschränkt sind, wohingegen hDer1-2 als Beispiel für Proteindegradation im gesamten ER und Transporterproteine wie Tpt1 hauptsächlich im cER vorhanden sind. Die Abwesenheit der UPR im cER lässt sich durch die Physiologie begründen. Außerdem wirft die Präsenz von PERK und IRE1 in Protisten ein neues Licht auf die Sichtweise der Evolution der UPR. So ist eine alternative Entstehungsgeschichte der UPR denkbar.

Sec61p is the channel-forming subunit of the heterotrimeric Sec61 complex that mediates co-translational protein import into the endoplasmic reticulum (ER). In yeast, proteins can also be post-translationally translocated by the hetero-heptameric Sec complex, composed of the Sec61 and Sec63 complexes. Sec61 is also a candidate for the dislocation channel for misfolded proteins from the ER to the cytosol during ER-associated degradation (ERAD). The structure of Sec61p is highly conserved, but the roles of its N-terminal acetylation and N-terminal amphipathic helix were unknown so far. To investigate the function of the Sec61p N-terminus, I deleted its amphipathic helix, or both the helix and N-acetylation site, and characterized these two mutants together with a sec61 mutant carrying a mutation of the N-terminal acetylation site previously shown to result in temperature-sensitivity and an ERAD defect. Mutation of the N-acetylation site on its own had no effect on protein import into the ER in intact cells. Yeast expressing sec61 without the N-terminal helix displayed severe growth and post-translational ER import defects. Nevertheless, the formation of Sec complexes was not affected. Instead, removal of the N-terminal helix compromised the integrity of heterotrimeric Sec61 complexes. My data show that the Sec61p N-terminal helix is required for post-translational protein import into the ER and Sec61 complex stability, whereas Sec61p N-terminal acetylation plays a role in ERAD. Der heterotrimere Sec61-Proteinkomplex vermittelt die Translokation sekretorischer Proteine ins Endoplasmatische Reticulum (ER) und ist ein putativer Transportkanal fehlgefalteter Proteine aus dem ER ins Cytosol während der ER-assoziierten Proteindegradation (ERAD). Die Untereinheit Sec61p bildet den Kanal und vermittelt den cotranslationalen Proteinimport in das ER. Proteine können in Hefen auch posttranslational durch den heteroheptameren Sec-Komplex, bestehend aus dem Sec61- und dem Sec63‑Komplex, transloziert werden. Die Sec61p-Struktur ist hochkonserviert, aber die Funktion der N-Acetylierung und der N-terminalen amphipatischen Helix waren bisher nicht bekannt. Daher deletierte ich die Helix mit und ohne die Acetylierungsstelle und charakterisierte beide Mutanten zusammen mit einer kürzlich entdeckten sec61 Mutante, die in der N-terminalen Acetylierungsstelle mutiert ist, temperatursensitiv ist und ERAD-Defekte aufweist. Die Mutation der Acetylierungsstelle hatte keinen Effekt auf den Proteinimport ins ER intakter Zellen. Hefen, die sec61 ohne die N-terminale Helix exprimieren, zeigen einen starken Wachstums- und posttranslationalen ER-Importdefekt. Die Ausbildung des Sec-Komplexes war nicht betroffen, obwohl die Integrität des heterotrimeren Sec61-Komplexes beeinflusst war. Meine Daten belegen, dass die N-terminale Helix für den posttranslationalen Import ins ER und die Sec61-Komplexstabilität notwendig ist, wohingegen die N-Acetylierung eine Rolle in der ERAD spielt.

Eine der beeindruckendsten Umwelten, die von Bakterien besiedelt werden ist die extreme Kälte. Nur wenig ist bekannt über die Anpassung von kältesensitiven, zellbiologischen Prozessen. In dieser Arbeit, präsentiere ich eine genomweite Analyse von psychrophilen, mesophilen und thermophilen Bakterien zur Identifikation struktureller Änderungen von klassischen Signalpeptiden, Tat-Signalpeptiden, Lipoproteinsignalpeptiden und Transmembrandomänen zur Anpassung an die Kälte. Der größte Unterschied ist, dass psychrophile Signalpeptide und Transmembrandomänen höhere Anteile an Ile beinhalten verglichen mit mesophilen. Sec61p ist ein mehrfach transmembranes Protein, dass einen Kanal in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) bildet. Es ist die Pore, die für den Import löslicher Vorläuferproteine und für die Insertion von Transmembrandomänen verantwortlich ist. Außerdem ist Sec61p von S. cerevisiae ein Kandidat für den Exportkanal in einem Prozess, der als ERAD bezeichnet wird. In dieser Arbeit untersuchte ich den N-Terminus und etablierte die sec61S2Y-Mutante, die defekt für die N-Acetylierung, posttranslationale Translokation und ERAD ist. Ich untersuchte die Mutante sec61Y345H in Hefe, deren Homolog in Mäusen Diabetes auslöst und identifizierte in einem neuen Screen eine vitale sec61-Mutante ohne Loop 7. Eine vollständige Deletion von Loop 7 führt zu starken Defekten im posttranslationalen Proteinimport von löslichen Proteinen ins ER und in ERAD von löslichen Substraten. One of the most impressive environments bacteria settled in is the extreme cold. Little is known about adaptation of cold-sensitive cell biological processes. In this thesis, I present a genome-wide analysis of several psychrophilic, mesophilic and thermophilic bacteria to identify structural changes in classic signal peptides, Tat signal peptides, lipoprotein signal peptides and transmembrane domains to the cold. The most striking difference was that psychrophile signal peptides and transmembrane domains contained higher percentages of Ile compared to mesophiles. Sec61p is a multiple transmembrane protein that forms a channel in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). The pore is responsible for the import of soluble precursor proteins and for the insertion of membrane proteins. Furthermore, Sec61p of S. cerevisiae is a candidate for the export channel in a process named ERAD. In this thesis, I examined the role of the N-terminus and established the sec61S2Y mutant, defective for N-acetylation, posttranslational translocation and ERAD. I analyzed the sec61Y345H mutant, whose homolog in Mice causes diabetes and I identified a vital sec61 mutant lacking loop 7 in a new screen. A complete deletion of Loop 7 results in strong defects for its posttranslational protein import of soluble proteins in the ER and in the ERAD of soluble substrates.

Das Killertoxin K28 ist ein viral codiertes A/B-Toxin der Hefe Saccharomyces cerevisiae, das nach endozytotischer Aufnahme und retrogradem Transport zum ER gelangt. Nach Retrotranslokation äußert sich der letale Effekt in Abhängigkeit zur applizierten Konzentration entweder in einem G1/S-Zellzyklusarrest oder der Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die ER-Zytosol-Dislokation des Dimers durch das Chaperon BiP sowie die Isomerase-Aktivität der Protein-Disulfidisomerase und eine ausgeglichene Ca2+-Konzentration katalysiert wird. Die Überwindung der ER-Membran wird vermutlich durch Sec61p vermittelt und findet unabhängig von ERAD-Komponenten, UPR sowie Autophagozytose oder der Synthese von „lipid droplets“ (LD) statt. Die Expression der α Untereinheit führt ebenfalls zu einem G1/S-Arrest der Zielzelle. Auch hier werden Kar2p sowie eine intakte Ca2+-Homöostase zur effizienten Retrotranslokation in das Zytosol benötigt. Sec61p sowie Der1p des ERAD-L-Pathways bilden wahrscheinlich die potentielle Dislokationspore, wobei der ER-Export auch mit der LD-Synthese in Zusammenhang gebracht werden kann. Die gängigen zellulären Degradations-Prozesse wie ERAD, HiP und Autophagie tragen jedoch ausschließlich zum Abbau des Toxins bei. Die Wirkung der K28α-Untereinheit auf höhere Eukaryonten resultiert in der Induktion der Apoptose. UPS scheint im Säuger den ER-Export von K28α zu unterstützen, da die Substitution interner Lysinreste mit einer Reduktion der Toxizität einhergeht. The killer toxin K28 is a viral encoded A/B toxin of the yeast Saccharomyces cerevisiae which is taken up by endocytosis and is transported retrogradely to the ER. After retrotranslocation the lethal effect culminates either in a G1/S cell cycle arrest or in apoptosis depending on the toxin concentration. In this work it was shown that ER-cytosol dislocation of the α/β dimer is catalyzed by the chaperone BiP and the isomerase activity of protein disulfide isomerase Pdi1p and requires balanced intracellular Ca2+ levels. Passing the ER-membrane is assumed to be mediated by Sec61p and is independent of ERAD components, UPR, autophagy or the synthesis of "lipid droplets" (LDs). The expression of the plasmid-driven K28α-subunit also leads to a G1/S-arrest of the target cell. Kar2p and an intact Ca2+ homeostasis are also required for efficient retrotranslocation into the cytosol. As part of the ERAD-L pathway, Sec61p and Der1p are likely to form the potential dislocation pore whereupon ER export of K28α can also be associated with LD-synthesis. However, all major cellular degradation processes such as ERAD, HiP and autophagy contribute exclusively to the degradation of the toxin. The effect of K28α expression in higher eukaryotes results in the induction of apoptosis. In this case, the UPS seems to support ER export of K28α since the substitution of internal lysine residues is accompanied by a reduction of toxicity.

Fehlgefaltete sekretorische Proteine werden aus dem Lumen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) in das Cytoplasma transloziert, wo sie von dem Ubiquitin-Proteasom-System degradiert werden (ER-assoziierte Degradation, ERAD). Wie genau die Proteine aus dem ER transportiert werden, ist noch nicht geklärt. Verschiedene Studien, die eine einzige „leaky“ sec63-Mutante verwendeten, lassen vermuten, dass Sec63p beim Proteinexport beteiligt sein könnte. Um diesen Sachverhalt genauer zu erforschen, habe ich einen Screen verwendet, bei dem willkürliche Punktmutationen in das SEC63-Gen eingefügt wurden. Ich habe die Mutanten auf Akkumulation des ERAD-Substrats CPY* getestet, welche auf einen Defekt bei dessen Degradation hindeutet. Ich habe sechs Mutanten isoliert, wovon nur sec63-402 eine deutliche Akkumulation von CPY* aufwies. Diese Mutante trägt eine Mutation in dem Interaktionsbereich mit dem Chaperon Kar2p, der sogenannten J-Domäne. Mutanten mit Punktmutationen in der Transmembran-, Brl- oder sauren Domäne wiesen keine Degradationsdefekte auf. Durch Untersuchung von anderen ERAD-Substraten zeigte sich, dass sich der Degradationsdefekt in sec63-mutierten Hefezellen auf lösliche Proteine beschränkt. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass Sec63p durch seine Interaktion mit Kar2p an der Degradation von löslichen ERAD-Substraten beteiligt ist. Misfolded secretory proteins are translocated from the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) to the cytoplasm for degradation by the ubiquitin-proteasome system (ER-associated degradation, ERAD). How exactly this export from the ER is accomplished is still not understood. Several studies using a single leaky sec63 mutant suggested that Sec63p might be involved in protein export. To examine this issue further, I used a screen in which random point mutations were inserted into the SEC63 gene. I tested the mutants for accumulation of the ERAD substrate CPY*. Accumulation of CPY* in cells indicates a degradation defect. I isolated six sec63 mutants of which only sec63-402 showed a strong accumulation of CPY*. This mutant carries a mutation in the interaction area with the chaperone Kar2p, the so called J-domain. Mutants with point mutations in the transmembrane, the Brl or the acidic domain caused no detectable ERAD defect for CPY*. The examination of other ERAD substrates showed that sec63-402 affected only degradation of soluble substrates. This demonstrates that in yeast the interaction of Sec63p with Kar2p is important for the specific degradation of soluble ERAD substrates.

Verf.: Kevin Gesson Mit dt. Zsfassung Wien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2009

Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Aspekte zur Faltung und Assemblierung oligomerer Proteine bearbeitet. Zum einen wurden die Expression und die Sekretion des mono-klonalen Antikörpers MAK33 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae analysiert. Die in das Kulturmedium abge-gebe-nen Antikörperketten (wenige µg/l) waren z.T. fragmentiert und formten keine aktiven Antikörper. Innerhalb der Zelle wurden die Ketten im ER und im Cytosol - in löslicher und unlöslicher Form -, sowie in den Vakuolen nachgewiesen. Auch die Koexpression von murinem BiP und Hefe-Hac1 führte zu keiner Erhöhung der Sekretionsrate der Antikörperketten. Insgesamt lassen diese Beobachtungen auf eine Überlastung des Hefesystems bzw. auf eine fehlerhafte Faltung der Antikörperketten innerhalb der Hefezelle schließen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit Untersuchungen zur Stabilität und Struktur der Prolyl-4-Hydroxylase unter nativen und re-duzieren-den Bedingungen. Desweiteren wurde die Rekonstitution des Prolyl-4-Hydroxylase-Tetramers aus den isolierten Unter-einheiten analysiert. Two aspects of folding and assembly of oligomeric proteins were investigated in this thesis. First, expression and secretion of the monoclonal antibody MAK33 in the yeast Saccharo-myces cerevisiae were analyzed. Small amounts of antibody chains (in the range of µg/l) were secreted into the culture medium. These chains were partially fragmented and did not assemble to active antibodies. Inside the cell, antibody chains were detected in the ER and in the cytosol - in soluble and insoluble form - and in vaculoes. Coexpression of murine BiP and yeast Hac1 did not result in an increase of secretion. These results suggest overloading of the cell system as well as incomplete and erroneous folding of the antibody chains in the cell. In the second part of the thesis, stability and structure of prolyl-4-hydroxylase were analyzed under native and reducing conditions. Additionally, reconstitution experiments of the tetramer of prolyl-4-hydroxylase from the isolated subunits were performed.

• Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor., • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive.

Neben ihrer Bedeutung in der Medizin sind Antikörper ideale Modellproteine für grundlegende Studien zur Strukturbildung und Faltung von sekretorischen Proteinen. In dieser Arbeit wurden E. coli knockout-Mutanten bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, aktive Fab Fragmente eines monoklonalen Antikörpers im Cytoplasma zu produzieren. Des weiteren wurden die Faltung dieses Fab Fragments in vitro und der Einfluß von Faltungshelfern auf den Faltungsprozeß detaillierter untersucht. Dabei wurde insbesonders die Kooperation zwischen dem ER residenten Hsp70 Homologen BiP und der Proteindisulfidisomerase PDI analysiert. Die Ergebnisse dieser Faltungsstudien sowie die Aufklärung des ATPase Zyklus von BiP erlauben Einblicke in die Faltung von sekretorischen Proteinen im ER und die Funktionsweise und Regulation molekularer Chaperone. Beside their importance in medicine, antibodies are ideal model proteins for basic studies in structure formation and folding of secretory proteins. In this thesis, E. coli knock out strains were compared concerning their ability to produce active Fab fragments of a monoclonal antibody in the cytoplasm. Further, the in vitro folding of this Fab fragment and the influence of folding helpers on the folding process were investigated in detail. In this context, the cooperation between the ER resident Hsp70 homologue BiP and the protein disulfide isomerase (PDI) was analyzed. The results of this folding studies as well as the dissection of the ATPase cycle of BiP allow us deeper insights in the folding of secretory proteins in the ER and the function and regulation of molecular chaperones.

Im ersten Teilprojekt der vorliegenden Dissertation wurde das Calpastatin, der endogene Inhibitor der Calpaine, mittels NMR-Spektroskopie strukturell charakterisiert. Das Calpastatin umfasst eine aminoterminale Domäne mit unbekannter Funktion und vier inhibitorisch aktive Domänen. Sowohl das rekombinante Volllängenprotein als auch isolierte inhibitorische Domänen zeigten volle Aktivität. Die rekombianten Proteine wiesen ungewöhnliche physikochemische Eigenschaften auf. Eine strukturelle Charakterisierung der ersten inhibitorischen Domäne mittels NMR-Spektroskopie ergab, dass das Protein in Lösung unter physiologischen Bedingungen unstrukturiert vorliegt. Aufgrund der experimentellen Daten und einer Analyse der Primärstruktur konnte das Calpastatin in die Familie der unter physiologischen Bedingungen ungefalteten Proteine eingeordnet werden. Im zweiten Teilprojekt wurde ein ATP-abhängiger Peptidtransport in der Hefe S. cerevisiae untersucht. Die Transportaktivität konnte durch subzelluläre Fraktionierungen im Endoplasmatischen Retikulum der Hefe lokalisiert werden. Die Volumenabhängigkeit des Transports an mikrosomalen Vesikeln und der Einsatz semi-intakter Hefezellen sprechen dafür, dass es sich bei der beobachteten Aktivität um einen Import von Peptiden handelt. Weitere Experimente zeigten, dass die Transportrate von der Reaktionstemperatur und der Peptidkonzentration abhängig ist. Eine Beteiligung der Hefeproteine Mdl1p und Mdl2p am Transport konnte anhand von Deletionsmutanten ausgeschlossen werden. Ferner konnten beide Proteine anhand von subzellulären Fraktionierungen in mitochondrialen Membranen nachgewiesen werden. The structural characterisation of calpastatin, the endogenous inhibitor of calpaine, by NMR spectroscopy was the first subproject of this thesis. Calpastatin comprises an aminoterminal domain of unknown function and four inhibitory active domains. Both the full length protein and the isolated inhibitory domains showed full activity. The recombinant proteins possessed exceptional physico-chemical properties. NMR studdies of the first inhibitory domain of calpastatin revealed an unstructured conformation in solution. Based on the experimental data and the analysis of the primary structure calpastatin was shown to be a member of the family of natively unfolded proteins. An ATP-dependent peptide translocation in the yeast S. cerevisiae was subject of the second subproject. The transport activity was localized to the endoplasmic reticulum of yeast by subcellular fractionation. The transport was shown to be dependent on the volume of microsomal vesicles and was also detected in semi-intact yeast cells. Both results argue for an peptide import into the lumen of the endoplasmic reticulum. Further experiments regarding the transport rate showed a dependency on the reaction temperature and peptide concentration. Mutant yeast strains indicated the yeast proteins Mdl1p and Mdl2p to be not involved in the transport process. Both proteins were localized to mitochondrial membranes by subcellular fractionation.

The clearance of apoptotic cells is a fine-tuned process based on a complex interaction between apoptotic cells and phagocytes. For their quick and efficient removal apoptotic cells expose so called “eat-me” signals on their surfaces. The best known “eat-me” signal is phosphatidylserine (PS). Various phagocyte receptors (v3 integrin, 2-GPI receptor, Mer) bind to PS via their corresponding bridging molecules (MFG-E8, 2-GPI, gas6) initiating the process of phagocytosis. Most apoptotic cells are phagocytosed instantaneously in a silent fashion. However, some dying cells escape early PS dependent clearance and enter late stages of apoptosis characterised by cell shrinkage and plasma membrane loss due to extensive blebbing. Apoptosing cells are known to remain their membrane integrity for a long time. Hence, it is unclear how apoptotic cells compensate for this massive loss of plasma membranes. To avoid progression to secondary necrosis and autoimmunity a second line of signals which support clearance of late apoptotic cells has to emerge on the cells surfaces. Several non-PS specific bridging molecules including CRP, C1q, SP-A and SP-D as well as MBL and other lectins are known to bind late apoptotic cells. However, their targets on the apoptotic surface are unknown. The aim of this work was to analyse alterations in the glycocalyx and the composition of plasma membranes of cells undergoing apoptosis to identify potential “eat me” signals especially of late apoptotic cells. Changes in the surface glycosylation of cells undergoing apoptosis were monitored in various phases of cell death, since several lectin ligands specifically opsonising late apoptotic cells predict massive altered surface glycosylation. When we analysed the binding to apoptosing cells of 23 fluorescence labelled lectins, those known to bind mannose, N-acetylglucosamine, and fucose displayed the highest activity. This carbohydrate pattern usually comprises terminal sugar moieties of incompletely processed (immature) glycoproteins. The accessibility of these sugar structures was restricted to late apoptotic cells after shrinkage. By contrast, sialic acids, terminal sugar residues of completely processed (mature) glycoproteins, got lost on the membranes of apoptosing cells. This loss was already observed before cell shrinkage. Therefore, we hypothesized that during apoptosis intracellular membranes derived from the endoplasmic reticulum (ER) or the Golgi complex containing immature glycoproteins are translocated to the cells’ surfaces to substitute loss of plasma membrane. We screened the plasma membranes of apoptotic cells for proteins that in viable cells are sequestered in the ER to prove this hypothesis. The chaperone calnexin, a dysfunctional immunoglobulin µ heavy chain (µHC), and the KDEL receptor, all ER resident proteins that are not exposed on viable cells, were detected on the surfaces of shrunken late apoptotic cells. Surface exposure of GM1, a ganglioside that is enriched in lipid rafts on the cell surface and intracellularly in the ER, respectively, was observed to substantially fade in early apoptosis. Later in apoptosis GM1 reappeared on the surfaces of shrunken cells. We could show that GM1 derived from the intracellular ER stores gets access to the cell surface. Interestingly, when the apoptotic blebbing process was abrogated using the ROCK-inhibitor Y-27632 neither augmentation of immature glycostructures, nor exposure of ER derived proteins or lipids on the surfaces of apoptotic cells was to be detected. Finally, the apoptosis related ER to plasma membrane trafficking was monitored performing live-cell imaging with KDEL receptor-GFP transgenic HeLa cells. It was recorded that during apoptosis plasma membrane blebbed from the cell surface and were directly replenished by surface incorporation of ER membranes. In late apoptosis, the genuine plasma membrane was almost completely lost from the cell surface and ER membranes now formed the outer envelope of the cells. In vivo clearance of apoptotic cells is normally accomplished before the cells enter late stages of apoptosis. We suggest that the translocation of ER membranes to the cell surface is a strategy of apoptotic cells to maintain the ion selectivity of the plasma membrane and to prevent leakage as long as possible if the early PS dependent clearance has failed. Additionally, the movement of internal membranes to the cell surface may represent an energy-saving way of apoptotic cells for the concomitant exposure of a multitude of preformed late “eat-me” signals normally sequestered inside the cell. Die Clearance apoptotischer Zellen ist ein fein abgestimmter Prozess, der auf komplexen Interaktionen zwischen Phagozyten und sterbenden Zellen basiert. Um von Phagozyten erkannt und beseitigt zu werden, exponieren apoptotische Zellen so genannte „Eat-me“ Signale. Das am besten bekannte „Eat-me“ Signal ist Phosphatidylserin (PS). Verschiedene Phagozyten-Rezeptoren (v3 Integrin, 2-GPI-Rezeptor, Mer) binden an PS über das jeweils dazugehörige Brückenmolekül (MFG-E8, 2-GPI, gas6) und initiieren den Phagozytoseprozess. Entkommen apoptotische Zellen dieser frühen Clearance treten sie in späte Phasen der Apoptose ein, charakterisiert durch das Schrumpfen der Zellen und den Verlust von Plasmamembran aufgrund des umfangreichen Abschnürens von Blebs (von Plasmamembran umschlossene Vesikel). Es ist bekannt, dass apoptierende Zellen die Ionenselektivität ihrer Plasmamembran für eine lange Zeit aufrechterhalten. Demzufolge müssen sie diesen massiven Verlust an Plasmamembran ausgleichen. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen sind allerdings unbekannt. Um sekundäre Nekrose und Autoimmunität zu vermeiden muss zudem eine zweite Reihe an Signalen auf den Zelloberflächen erscheinen, welche die Clearance der spät apoptotischen Zellen unterstützen. Verschiedene nicht PS spezifische Brückenmoleküle, wie zum Beispiel CRP, C1q, SP-A und SP-D sowie MBL und andere Lektine sind bekannt an spät apoptotische Zellen zu binden. Ihre spezifischen Epitope auf der apoptotische Oberfläche sind allerdings nicht bekannt. Ziel dieser Promotionsarbeit war es Veränderungen in der Glykokalyx und in der Zusammensetzung der Plasmamembran von apoptotischen Zellen zu analysieren, um potentielle „Eat-me“ Signale besonders von spät apoptotischen Zellen zu identifizieren. Da verschiedene Lektine besonders spät apoptotische Zellen opsonisieren und deshalb massive Änderungen des Glykosilierungsmusters auf den Zelloberflächen voraussagen, wurde die Oberflächenglykosilierung in verschiedenen Phasen des Zelltods untersucht. Es wurde gezeigt, dass Mannose-, N-Acetylglucosamin- und Fucose-Reste, die in nicht vollständig prozessierten (unreifen) Glykoproteinen als terminale Zucker vorliegen, auf den Oberflächen spät apoptotischer, geschrumpfter Zellen zugänglich werden. Im Gegensatz dazu gingen Sialinsäuren, die terminalen Zuckerreste von vollständig prozessierten (reifen) Glykoproteinen, auf den Oberflächen früh apoptotischer, nicht geschrumpfter Zellen verloren. Aufgrund dieser Beobachtungen wurde die Hypothese aufgestellt, dass während der Apoptose intrazelluläre Membranen und die darin enthaltenen unreifen Glykoproteine aus dem Endoplasmatischen Reticulum (ER) an die Zelloberfläche verlagert werden, um verloren gegangene Plasmamembran zu ersetzen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden die Plasmamembranen apoptotischer Zellen nach Proteinen untersucht, die in vitalen Zellen im ER zurückgehalten werden. Das Chaperon Calnexin, eine dysfunktionale schwere Immunglobulin-Kette und der KDEL Rezeptor sind Proteine, die in der ER-Membran verankert sind und nicht auf vitalen Zellen exponiert werden, aber auf den Oberflächen von geschrumpften, spät apoptotischen Zellen nachgewiesen werden konnten. Die Oberflächenexpression von GM1, einem Ganglioside, dass an der Zelloberfläche in Lipid Rafts und intrazellulär im ER angereichert vorkommt, wurde in frühen Phasen der Apoptose zunächst merklich weniger, nahm aber auf spät apoptotischen, geschrumpften Zellen wieder zu. Es konnte gezeigt werden, dass intrazelluläres GM1 aus dem ER auf den Zelloberflächen zugänglich wird. Wenn das apoptotische Abschnüren von Blebs von der Zelloberfläche mit Hilfe des ROCK- Inhibitors Y-27632 unterbunden wurde, waren auf der Oberfläche der spät apoptotischen Zellen interessanterweise weder unreife Glykostrukturen, noch aus dem ER stammende Proteine und GM1 zu detektieren. Mittels Live-Cell-Imaging von apoptierenden KDEL Rezeptor-GFP transgene HeLa-Zellen konnte schließlich gezeigt werden wie sich im Verlauf der Apoptose Plasmamembran von der Zelloberfläche abschnürt und direkt durch Einlagerung von ER-Membran in die Oberfläche ergänzt wird. In der späten Apoptose war die ursprüngliche Plasmamembran fast vollständig auf der Zelloberfläche verschwunden und ER-Membran formte jetzt die äußere Hülle der Zelle. In vivo werden apoptotische Zellen normalerweise erkannt und phagozytiert noch bevor sie späte Phasen der Apoptose erreichen. Die Verlagerung von ER-Membranen an die Zelloberfläche ermöglicht es den apoptotischen Zellen die Ionenselektivität ihrer Plasmamembran aufrecht zuhalten und so lang wie möglich ein Auslaufen zu verhindern, wenn die frühe Clearance über Erkennung von PS fehlgeschlagen ist. Zusätzlich stellt sie einen energiesparenden Weg dar, um gleichzeitig eine Vielzahl vorgeformter, später „Eat-me“ Signale an den Oberflächen zu exponieren, die im vitalen Zustand im Inneren der Zellen verborgen sind.

Die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) ist Teil des Qualitätskontrollsystems am ER, um der Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER entgegenzuwirken. Hierbei werden ERAD-Substrate mit Hilfe von E3-Ligasen wie z.B. HRD1 ubiquityliert und anschließend durch den p97-Ufd1-Npl4 Komplex aus der ER-Membran extrahiert. Im Zytosol werden diese extrahierten Proteine vom 26S Proteasom abgebaut. Für die Retrotranslokation von ERAD- Substraten werden zudem die Membranproteine Derlin-1 und VIMP benötigt, welche mit p97 assoziieren und einen Proteinkomplex bilden. HERP ist ein ER-lokalisiertes Protein, dessen Synthese durch den UPR (unfolded protein response) als Antwort auf die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER induziert wird. Dies deutet auf eine Rolle von HERP im ERAD hin. Interessanterweise besitzt HERP eine sogenannte UBL-Domäne. Für andere Proteine mit UBL-Domäne konnte eine Interaktion dieser Domäne mit dem Proteasom nachgewiesen werden. Daher kann angenommen werden, dass HERP ebenfalls mit dem Proteasom interagiert und dies zur ER- Membran rekrutiert, wo es für den Abbau von ERAD-Substraten benötigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von HERP innerhalb des UPR zu ermitteln. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass HERP essentiell für den Abbau des ERAD-Modell- Substrates CD3-delta ist. Somit hat HERP tatsächlich eine Rolle im ERAD. Außerdem wird eine direkte Interaktion von HERP mit der E3-Ligase HRD1 nachgewiesen. Es wird zudem gezeigt, dass HERP und HRD1 einen Proteinkomplex mit p97, Derlin-1 und eventuell auch mit VIMP bilden. Dieser ERAD Komplex ist folglich sowohl für die Ubiquitylierung als auch die Retrotranslokation von ERAD-Substraten verantwortlich und garantiert somit die effiziente Prozessierung von Proteinen aus dem ER. Zudem wird gezeigt, dass die UBL-Domäne von HERP im Gegensatz zu anderen UBL- Domänen nicht mit dem Proteasom interagiert. Somit kann nicht mehr davon ausgegangen werden, dass Proteasombindung eine Gemeinsamkeit aller Proteine mit UBL-Domäne ist. Dagegen wird eine Interaktion der UBL-Domäne von HERP mit dem deubiquitylierenden Enzym USP7 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass auch Deubiquitylierung eine wichtige Rolle im ERAD-Prozess spielt. ER-associated protein degradation (ERAD) is part of the ER quality control system dealing with the accumulation of misfolded proteins in the ER. This process requires polyubiquitylation of ERAD substrates involving E3 ligases, such as HRD1, and their subsequent extraction from the ER membrane by the p97-Ufd1-Npl4 complex. Retrotranslocation of substrates into the cytosol for degradation by the 26S proteasome also involves the membrane proteins Derlin-1 and VIMP, which are associated with p97 to form a protein complex. The ER-resident protein HERP was shown to be upregulated by the unfolded protein response pathway (UPR) upon the accumulation of misfolded proteins in the ER. It was therefore considered to function in ERAD. Interestingly, HERP contains a UBL domain. In other proteins this domain facilitates an interaction with the proteasome, suggesting that HERP might recruit the proteasome to the ER membrane for efficient ERAD. The aim of this study was to investigate the function of HERP within the UPR. The findings presented here demonstrate that HERP is essential for the degradation of a model ERAD substrate. Thus, HERP indeed has a role in ERAD. Moreover, the data show that HERP directly interacts with the E3 ligase HRD1 and the two proteins form a common protein complex with p97, Derlin-1 and possibly also with VIMP. This suggests that both ubiquitylation and retrotranslocation of ER proteins are performed by one protein complex, enabling an efficient processing of ERAD substrates. This study also demonstrates that the UBL domain of HERP does not share the proteasome binding property of other UBL domains, suggesting that proteasome binding cannot be considered a general feature of all UBL domains. Instead, the HERP UBL domain is able to interact with the deubiquitylating enzyme USP7. Therefore, deubiquitylation might also be an important aspect in the proteasome-dependent degradation of misfolded ER proteins.

Der Transport in das endoplasmatische Retikulum (ER) ist der erste Schritt in der Biogenese sekretorischer Proteine. Im Säuger erfolgt der Transport hauptsächlich cotranslational, was eine enge Kooperation zwischen Ribosom, Translokon an der ER-Membran und luminalen Proteinen erfordert. Die Hauptkomponente des Translokons ist der Sec61-Komplex, der die Translokationspore bildet. Weitere Komponenten, Sec62p und Sec63p, wurden identifiziert. Diese Proteine (a) kommen in äquimolaren Konzentrationen mit Sec61a (Untereinheit des Sec61-Komplexes) vor (b) interagieren miteinander und mit dem Sec61-Komplex und (c) seine Ho-mologe in der Hefe sind für den posttranslationalen Transport und Sec63p auch für den cotranslationalen Transport essentiell. Dies deutet darauf hin, dass Sec62p und Sec63p des Säugers am cotranslationalen Transport beteiligt sind. Eine Sequenzanalyse von Sec62p zeigt die Anwesenheit eines im Hefeprotein nicht konservierten basischen Peptidmotives, das charakteristisch für ribosominteragierende Proteine ist. In der vorliegenden Arbeit wurden Fragmente des Säuger-Sec62p in E. coli synthetisiert und es wurde durch klassische Ribosomenbindungs- und Fraktionierungstudien gezeigt, dass Sec62p durch seine N-terminale cytosolische Domäne direkt mit Ribosomen interagiert. Hierbei handelt es sich um eine bei physiologischer Salzkonzentration stabile elektrostatische Interaktion, wofür das basische Motiv wichtig ist. Mittels Kompetitionsanalysen für die Bindung an Ribosomen wurde gezeigt, dass die Bindungsstelle von Sec62p mit dem Bereich des Ribosoms, das für die Interaktion mit dem Translokon verantworlich ist, überlappt, und dass diese Bindungsstelle auch von dem Hsp40-Chaperon Mtj1p/ERj1p verwendet wird. Die funktionelle Bedeutung der Sec62p-Ribosom-Interaktion wurde in einem zellfreien in vitro-Translationssystem untersucht. Sec62p wirkt inhibitorisch auf die Proteinsynthese von sekretorischen und nicht-sekretorischen Proteinen. Hierbei handelt es sich um eine Hemmung der Initiation der Translation. Die Interaktion von Sec62p am ribosomalen Tunnelausgang bewirkt Veränderungen in der Translationsfaktorenbindungstelle des Ribosoms, was auf einen allosterischen Wirkungsmechanismus für die Induktion der Translationshemmung hindeutet. Der Einfluss von Sec62p auf die Proteinsynthese bei Translokationsvorgängen wird diskutiert und anhand der Analogien mit Mtj1p wird eine Regulation von Sec62p über seine Interaktion mit Sec63p vorgeschlagen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten unterstützen ein Modell, bei dem Sec62p durch die Interaktion mit Ribosomen und wahrscheinlich auch durch Interaktion mit Sec63p einen Informationsaustausch zwischen dem Cytosol und dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums vermittelt. Das luminale Hsp70-Chaperon BiP ist an mehreren Stadien des cotranslationalen Proteintransports beteiligt. Für späte Schritte der Translokation wurde beobachtet, dass BiP durch seine Interaktion mit dem zu transportierenden Substrat die Translokationseffizienz erhöht. Es wurde vorgeschlagen, dass in Analogie zum Hefe-System BiP die naszierende Kette während ihrer Translokati-on bindet und dadurch die Unidirektionalität des Transports zum Lumen gewährleistet. Bei der cotranslationalen Translokation in Vesikeln, die keine luminalen Proteine enthalten, können bereits luminal modifizierte Translokationssubstrate zurück ins Cytosol gelangen. Daher besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion von BiP mit dem Substrat tatsächlich erst nach dem vollständigen Transport des Substrats erfolgt, um dieses im ER-Lumen zu halten. In der vorliegenden Arbeit wurde der cotranslationale Transport in einem in vitro-System mit Proteoliposomen rekonstituiert, wobei das Protein Avidin als artifizielles luminales Protein anstelle von BiP und biotinylierte Substrate eingesetzt wurden. Die gewonnenen Daten zeigen, dass die Bindung des Substrats, die zur Erhöhung der Transporteffizienz führt, sowohl während als auch nach seiner Translokation erfolgt. Dies bestätigt die bisher vermutete Funktion von BiP, die Unidirektionalität des cotranslationalen Transports zu sichern, und zeigt darüber hinaus eine erweiterte Funktion von BiP bei der Retention von bereits translozierten Substraten im Lumen des ER. Diese Erkenntnise bringen neue Aspekte im Zusammenhang mit der Termination der Translokation, die in einem Modell dargestellt werden. The transport into the endoplasmic reticulum (ER) is the first step in the biogenesis of secretory proteins. In mammalian cells this transport occurs mainly cotranslationally and requires a tight cooperation between the ribosome, the translocon at the ER-membrane, and luminal proteins. The Sec61-complex that builds the translocation pore is the main component of the translocon. Further components, namely Sec62p and Sec63p, have been identified. These proteins a) are present in equimolar concentrations with the Sec61a subunit of the Sec61-complex, b) interact with each other and with the Sec61-complex and c) in yeast are essential for the posttranslational transport (Sec63p for the cotranslational transport as well). This suggests that mammalian Sec62p and Sec63p are involved in cotranslational protein transport. The sequence analysis of Sec62p reveals the presence of a basic peptide motif which is not conserved in the yeast homolog and that is characteristic of ribosome interacting proteins. In the present work, fragments of the mammalian Sec62p were synthesized in E. coli and analyzed in classical ribosome binding assays. It was shown that Sec62p interacts directly with ribosomes through its N-terminal domain. This interaction is an electrostatic and at physiological salt concentrations stable one, for which the basic motif in Sec62p is important. Through competition analysis for the binding to ribosomes it was shown, that the binding site of Sec62p at the ribosome is overlapping with the binding site of the translocon and of the Hsp40-chaperone Mtj1p/ERj1p. The functional significance of the Sec62p-ribosome interaction was analyzed in a cell-free in vitro-translation system. Sec62p inhibits the protein synthesis of secretory and non-secretory proteins. To do this, Sec62p acts at the level of translation initiation. The interaction of Sec62p with the ribosomal tunnel causes changes in the ribosomal binding site for the translation factors. This points to an allosteric mechanism by which Sec62p induces the inhibition of translation. The influence of Sec62p on protein synthesis is discussed and in analogy to Mtj1p a regulation of Sec62p through its interaction with Sec63p is proposed. The data that have been obtained in this work support a model in which Sec62p mediates an information exchange between the cytosol and the lumen of the endoplasmic reticulum through its interaction with ribosomes and probably Sec63p. The luminal Hsp70-chaperone BiP participates in several stages of cotranslational protein transport. For late steps of translocation it was shown, that BiP increases the translocation efficiency through its interaction with the transport-substrate. It was suggested that, in analogy to the yeast system, BiP binds to the nascent chain during its translocation and determines the unidirectionality of the transport into the lumen. However, studying the cotranslational translocation into vesicles lacking luminal proteins, it was shown, that luminally modified transport-substrates can get back into the cytosol. Thus, there is the possibility that BiP actually interacts with the substrate not during but after its transport to retain it in the ER-lumen. In the present work the cotranslational transport was reconstituted in an in vitro-system with proteoliposomes where biotinylated substrates and the protein avidin, as an artificial luminal protein instead of BiP, were used. The results of this analysis show that the binding of the transport-substrates leads to an increase in transport-efficiency and occurs both during and after translocation of the substrates. This confirms the so far assumed function of BiP in ensuring the unidirectionality of the transport and, additionally, gives evidence of a more extensive function of BiP in the retention of already translocated substrates in the lumen of the endoplasmic reticulum.

In der vorliegenden Arbeit wurde MIDA1 als cytosolisches Homolog des ER-Hsp40 ERj1p charakterisiert. Eine Hsp70/Hsp40-typische Interaktion von MIDA1 mit Hsc70 konnte nachgewiesen werden, bei der die ATPase-Aktivität von Hsc70 stimuliert wurde. Weiter konnte gezeigt werden, dass MIDA1 an Ribosomen binden kann, was zu einer Reduktion der Translationseffizienz führte. In Analogie zu ERj1p befindet sich die Bindungsstelle von MIDA1 am Ribosom möglicherweise in unmittelbarer Nachbarschaft zum Ribosomenausgangskanal. Daher ist es denkbar, dass Hsc70 durch MIDA1 zum Ribosom rekrutiert wird, um dort mit der naszierenden Kette, sobald diese den Ribosomen-ausgangskanal verlässt, zu interagieren. Darüber hinaus wurde das Hsp40/Hsp70-Chaperonnetzwerk des ER des Pankreas weiter charakterisiert: Grp170, ein Hsp70-verwandtes Protein im ER, konnte aus Hundepankreas-Mikrosomen isoliert werden. Mit Gelfiltrationen konnte die Bildung eines Komplexes aus Grp170 und BiP nachgewiesen werden, der bei Anwesenheit von ATP dissoziiert. Weiter konnte gezeigt werden, dass der Nukleotidaustausch von BiP durch Grp170 stimuliert wird. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von BiP und einem J-Protein wurde auch eine Stimulation der Grp170-ATPase beobachtet, ohne dass es dabei offenbar zu einer Bindung des J-Proteins an Grp170 kommt. Das bereits als Nukleotidaustauschfaktor bekannte Protein BAP wurde rekombinant in E. coli synthetisiert und seine Nukleotidaustausch-Aktivität bestätigt. Anschließend konnte die durch BAP bewirkte zusätzliche Stimulation des durch ERj1p oder ERj2p aktivierten ATPase-Zyklus von BiP bestimmt und mit dem Effekt von Grp170 verglichen werden. Das Hsp40-Homolog ERj4p konnte ebenfalls in E. coli synthetisiert und seine Funktionalität durch die Interaktion mit BiP einschließlich einer Stimulation von dessen ATPase-Aktivität gezeigt werden. Die Affinität von ERj4p sowie der J-Domäne von ERj5p zu BiP wurden im Biacore-System bestimmt. Somit konnte das Hsp40/Hsp70-Chaperonnetzwerk des ER eines definierten Zelltyps erstmals vollständig quantitativ charakterisiert werden. The cytosolic Hsp40-homologue MIDA1 and the Hsp70/Hsp40-chaperone network of the endoplasmic reticulum in pancreatic cells has been characterized. A typical Hsp70/Hsp40-interaction of MIDA1 with Hsc70 was demonstrated, at which the ATPaseactivity of Hsc70 was stimulated. Further more, an association of MIDA1 to ribosomes has been shown, leading to a reduction in transcriptional efficiency. The binding site at the ribosome is possibly located in close proximity to the ribosomal exit site. Therefore one can speculate, that the function of MIDA1 is to recrute Hsc70 to the ribosome where it can bind to the nascent chain leaving the exit tunnel. Grp170 is a Hsp70-related protein in the lumen of the ER. It has been demonstrated, that Grp170 forms a complex together with the other lumenal Hsp70 BiP in the absence but not in the presence of ATP. Grp170 accelerates the nucleotide exchange of BiP and in countermove a J-activated BiP stimulates the ATPase activity of Grp170. Besides Grp170, there is another lumenal protein, namely BAP, that shows a nucleotide exchange activity. The additional stimulation by BAP of the ERj1 and ERj2 stimulated BiP ATPase turnover has been determined. Further, the affinity of ERj4 and the J-domain of ERj5 for the binding to BiP has been detemined by surface plasmon resonance spectroscopy and compared with affinities of other J-proteins.

The endoplasmic reticulum (ER) is an intracellular membranous system of all eukaryotic cells where most of the secretory proteins acquire their native tertiary structure. The ER contains a highly active quality control system. Malfolded proteins are selectively recognized in the ER and transported back to the cytoplasm, where they are finally degraded by the 26S proteasome in an ubiquitin dependent manner. The latter process is known as ER associated degradation (ERAD). Failure of this process leads to formation of protein aggregates and results in impaired cell function. To understand how ERAD related components cooperatively participate in ER degradation and to get a better insight if Sec61p is really the pore-forming unit of the protein retrotranslocon, Blue Native Electrophoresis (BN) and co-immunoprecipitation techniques were applied in this study. To determine the composition of the retrotranslocon and to obtain new information on the entire process involved in ERAD, a series of CPY* fusion protein substrates with special structural characteristics were constructed and investigated. Using Blue Native electrophoresis, a stable Der3-Hrd3p complex was detected. The finding of the Der3-Hrd3p complex together with soluble malfolded substrates as CPY* or CPY*GFP and membrane substrates as CT* or CTG*, indicated that Der3-Hrd3p complex acts as a part of a retrotranslocation machinery. The AAA ATPase Cdc48p was also found in this Der3-Hrd3p complex when using Blue Native electrophoresis, indicating the existence of a Cdc48-Der3-Hrd3p complex. The finding of the interaction between Cdc48 and the Der3-Hrd3p complex by co-immunoprecipitation experiments confirmed this complex composition. Blue Native electrophoresis showed two stable Sec61-Sec62-Sec63p complexes (430kDa and 480kDa), the composition of which did not undergo changes in any of the ERAD mutants, indicating that these might constitute the protein import complex. Further insights into the retrotranslocation process was intended to reach with the help of new ERAD substrate CPY*GAr215, a CPY* derivative containing a long Glycine-Alanine repeat sequence. Previous work by Thomas Bohnacker (Diplomarbeit, Universität Stuttgart, 2004) has indicated that full length CPY*GAr215-HA3 is only "processed". A partial degradation product appeared, displaying a loss of the C-terminal part of the protein. Full length and the intermediates of CPY*GAr215-HA3 were shown here to be glycosylated and located in ER vesicles. It was observed here that there is a slight growth reduction in temperature sensitive Sec61-2 cells overexpressing CPY*GAr215 at 35°C. Sec61p was found to interact with Cdc48p and both, full length and intermediates of CPY*GAr215 by co-immunoprecipitation experiments. Remarkably, Blue Native electrophoresis also indicated the existence of a Sec61-Cdc48-CPY*GAr215 complex in wild type cells. All together, this work suggests the existence of a Sec61-Cdc48-Der3/Hrd3-CPY*GAr215 complex which might form a dynamic retrotranslocon in ER degradation. With the help of biochemical methods, the results in this study show the existence and dynamic changes of Cdc48-Der3-Hrd3-substrate protein complexes. This might constitute at least in part the scaffold of the retrotranslocon. Sec61p, as a pore-forming protein, might be involved in the retrotranslocation process. Cdc48 protein complex might act as a linker between the pore and ubiquitination system, and the proteasome, handing over the ubiquitinated substrates from cytosolic face of the ER to 26S proteasome for final degradation., Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist ein intrazelluläres Membransystem in eukaryontischen Zellen, in das der Großteil der sekretorischen Proteine importiert wird. Diese Proteine erhalten dort ihre natürliche tertiäre Struktur. Das ER hat ein sehr aktives Qualitätskontrollsystem. Falschgefaltete Proteine werden selektiv im ER erkannt und vom ER Lumen oder der ER Membran zurück ins Zytoplasma transportiert, wo sie dann schließlich vom 26S Proteasom in einem ubiquitinabhängigem Prozess abgebaut werden. Dieser Prozess ist bekannt als ER assoziierte Degradation (ERAD). Fehler in diesem Prozess führen zu Proteinagregation, was schließlich zu einer Beeinträchtigung der Zellfunktionen führt. Eine Fehlfunktion der ER assoziierten Degradation hat mehrere medizinisch wichtige Auswirkungen in menschlichen Zellen. Um zu verstehen, wie ERAD beziehende Komponenten miteinander bei der ER Degradation mitwirken, und um einen besseren Einblick zu bekommen, ob Sec61p wirklich eine porenbildende Einheit des Proteinretrotranslokons ist, wurden Blue Native Elektrophorese (BN) und Coimmunoprezipitationstechniken in dieser Studie angewendet. Um die Zusammensetzung des Retrotranslocons zu bestimmen, als auch um neue Informationen über den gesamten Prozess der im ERAD abläuft zu erhalten, wurden eine Reihe von CPY* Fusionsproteinsubstraten mit speziellen strukturellen Charakteristika konstruiert. Durch den Einsatz von Blue Native Elektrophorese wurde ein stabiler Der3-Hrd3p Komplex detektiert. Die Entdeckung des Der3-Hrd3p Komplexes zusammen mit löslichen falschgefalteten Substraten wie CPY* oder CPY*GFP und Membransubstrate wie CT* oder CTG*, deuten darauf hin dass der Der3-Hrd3p Komplex als ein Teil der Retrotranslokationsmaschinerie dient. Die AAA ATPase Cdc48p wurde in diesem Der3-Hrd3p Komplex durch Blue Native Elektrophorese gefunden, was auf die Existenz eines CDC48-Der3-Hrd3p Komplexes hindeutet. Die Entdeckung einer Interaktion zwischen Cdc48 und des Der3-Hrd3p Komplexes durch Coimmunoprezipitationsexperimenten bestätigte diese Komplex Zusammensetzung. Blue Native Elektrophorese zeigte zwei stabile Sec61-Sec62-Sec63p Komplexe (430kDa und 480kDa), eine Zusammensetzung die keiner Veränderung in irgendeiner der ERAD Mutanten unterlag, was darauf hindeutet dass diese den Proteinimportkomplex bilden. Weitere Einblicke in den Retrotranslokationsprozess wollte man mittels des neuen ERAD Substrates CPY*GAr215, einem CPY* Derivat mit einer langen Glycine-Alanine Wiederholungssequenz, erreichen. Bei frühere Arbeit von Thomas Bohnacker (Diplomarbeit, Universität Stuttgart, 2004) zeigte, dass das gesamte CPY*GAr215-HA3 nur "prozessiert" wird. Ein Zwischenabbauprodukt tauchte auf, was einen Verlust des C-terminalen Teiles des Proteins anzeigt. Das gesamte Protein und auch die Intermediate vom CPY*GAr215-HA3 stellten sich als glycosiliert und in ER Vesikeln lokalisiert heraus. Es zeigte sich durch Coimmunoprezipitationen, dass Sec61p mit Cdc48p interagiert, sowie auch mit dem gesamten Protein und auch den Intermediaten von CPY*GAr215-HA3. Bemerkenswerterweise deutete sich auch durch Blue Native Elektrophorese die Existenz eines Sec61-Cdc48-CPY*GAr215 Komplexes in Wildtypzellen an. Zusammengefasst deutet diese Arbeit auf Existenz eines Sec61-Cdc48-Der3/Hrd3-CPY*GAr215 Komplexes hin, welcher wohl einen dynamisches Retrotranslokon für die ER Degradation bilden kann. Mit der Hilfe von biochemischen Methoden, zeigen die Ergebnisse dieser Studie die Existenz und die dynamischen Veränderungen des Cdc48-Der3-Hrd3-Substrat Protein Komplexes. Dies könnte zu mindest in Teilen das Gerüst des Retrotranslokons darstellen. Sec61p, konnte als ein Porenbildendes Proteien an dem Retrotranslokationsprozess beteiligt sein. Der Cdc48 Proteinkomplex könnte als ein Linker zwischen der Pore, dem Ubiquitinierungssystem und dem Proteasom fungieren, indem es die ubiquitinierten Substrate von der zytosolischen Seite des ERs zum 26S Proteasom zur endgültigen Degradation überreicht.

Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP.

Die Transportproteine AtER-ANT1 und OsER-ANT1 sind Vertreter der MCF (mitochondrial carrier family) und werden phylogenetisch in die Gruppe der klassischen mitochondrialen ADP/ATP-Transporter (AACs) eingegliedert. Unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtER-ANT1 und OsER-ANT1 um spezifische ADP/ATP-Transporter handelt. Der Transport dieser Substrate verläuft in Form eines Gegentausches, entsprechend den klassischen mitochondrialen AACs. Sowohl AtER-ANT1 als auch OsER-ANT1 sind hochgradig insensitiv gegen die Hemmstoffe BKA und CAT der klassischen mitochondrialen AACs. Dagegen konnte für diese Transportproteine NEM (N-ethylmaleimid) als spezifischer Hemmstoff identifiziert werden, der interessanterweise auch eine inhibierende Wirkung auf den Nukleotidtransport ber die ER-Membran besitzt. Der Transport der klassischen mitochondrialen AACs wird dagegen nicht beeinflusst. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von AtER-ANT1 mittels GFP-Fusion ergaben, dass dieses Protein in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert ist. Weiter wurde eine Methode etabliert, die Lokalisierung des AtER-ANT1 in planta zu untersuchen. Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation in Abhängigkeit der An- bzw. Abwesenheit von Mg2+ konnte die Lokalisierung des AtER-ANT1 im ER bestätigt werden. Weiter konnte mit diesem Gradienten auch eine Kolokalisierung des AtER-ANT1 mit dem ER-spezifischen Marker-Protein Calretikulin gezeigt werden. Eine Analyse der gewebespezifischen Expression offenbarte eine starke Expression des AtERANT1 in Geweben, die eine hohe ER-Aktivität aufweisen, u.a. die Wurzelspitze, die Leitgefäße, die Samen und die Pollengewebe. Desweiteren wurde die physiologische Rolle des AtER-ANT1 anhand von zwei unabhängigen Knockout-Linien bezüglich dieses Gens umfassend untersucht. Es konnte dabei gezeigt werden, dass der dramatisch im Wachstum retardierte Phänotyp der Knockout-Pflanzen unter ambienten Wachstumsbedingungen mit einer enormen Veränderung des gesamten Stoffwechsels einhergeht. Detaillierte Metabolit-Analysen zeigten außerdem, dass die Deletion des AtER-ANT1 Gens besonders starke pleiotrope Effekte auf den Photorespirationsstoffwechsel hat. Diese Beobachtungen wurden durch Analysen der Knockout-Pflanzen unter hoch CO2-Bedingungen bestätigt. Die hoch CO2-Bedingungen bewirkten sowohl eine Verbesserung des gesamten Stoffwechsels als auch der morphologischen phänotypischen Erscheinung der Knockout-Pflanzen. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Redundanz verschiedener AACIsoformen in Arabidopsis thaliana, die auf biochemischer Ebene sehr ähnliche Eigenschaften besitzen. Knockout-Analysen zeigten, dass AtAAC1 für den pflanzlichen Stoffwechsel essentiell ist, da das Ausschalten eine Letalität der Pflanzen hervorruft. Für AtAAC2 und AtAAC3 kann dahingegen eine physiologische Bedeutung in späten Entwicklungsstadien der Pflanze angenommen werden. Neben der Charakterisierung pflanzlicher Transportproteine wurde zudem ein mitosomaler Adeninnukleotid-Transporter aus dem Protisten Entamoeba histolytica biochemisch unter Verwendung des heterologen E. coli-Expressionssystems charakterisiert. Die Analysen ergaben, dass es sich bei diesem Adeninnukleotid-Transporter um ein zu den klassischen mitochondrialen AACs alternatives Transportprotein handelt, das sich sowohl im Substratspektrum als auch in Inhibitorstudien von bereits charakterisierten mitochondrialen und hydrogenosomalen ATP/ADP-Transportern unterscheidet. Mitosomen benötigen Energie u.a. zur Bildung von Fe-S-Clustern. Da diese Organellform im Gegensatz zu Mitochondrien und Hydrogenosomen nicht zu einer ATP-Synthese fähig sind, indizieren die ermittelten Daten eine physiologische Funktion dieses Proteins in der Versorgung der Mitosomen mit ATP.

Toxoplasma gondii is an obligatorily intracellular living, parasitical protozoon of great medical importance particularly in two cases: On the one hand with first infection during a pregnancy, which can harm the Foetus. On the other hand as opportunistic pathogen in immunocompromised patients (e.g. AIDS). Here a reactivation of continuous stages could lead to death. A starting point for the fight against the parasites represents a special metabolic pathway, the glycosylphosphatidylinositol (GPI) biosynthesis. GPIs consist of a conserved hydrophilic glycan structure, which can be modified by side chains, and a hydrophobic inositol-phospholipid. Like numerous other parasitic protozoa the T. gondii major surface proteins are anchored by GPIs in the cell surface - a blocking of the GPI biosynthesis leads to killing the parasites. In order to fight only the parasites with therapeutic efforts and not to affect the GPI biosynthesis that is likewise taking place in the host cells however, detailed knowledge of this metabolic pathway is necessary. A system of permeabilized Tachyzoites of T. gondii was developed and the distribution of GPI anchor precursors and further GPI biosynthetic intermediates over the membrane of the endoplasmic reticulum (ER) was examined for the first time. The cell membrane is effectively permeabilized by hypotonic treatment, which remains ER with this treatment intact. This system was used, in order to label GPIs with different radioactive precursor molecules (sugar nucleotides). The GPI intermediates formed by permeabilized Toxoplasma were characterized on the basis of specific enzymatic treatments and chemical hydrolyses and compared with already well-known data. It was stated that the hydrophilic components of the GPI intermediates match with the described structures. In addition it could be proven in this work that before starting the mannosylation steps an acylation from GlcN-PI to GlcN-(acyl)-PI at the inositol takes place. Following radioactive labelling of the glycolipids the enzyme PI-PLC, which cleaves between hydrophilic and hydrophobic portion of the GPIs, was used to examine orientation of the GPI biosynthesis intermediates in the ER membrane. It could be shown that both early, and higher glycosylated intermediates and even GPI anchor precursors to the predominant part exhibit a cytoplasmic orientation in the ER membrane. In connection with transient acylation of the inositol ring a repeated change of the different intermediates over the ER membrane ("flip-flop") seems possible. For the first time it could be shown here that such large GPI anchor precursors with an additional hydrophilic side chain, consisting of N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, cross a lipid bilayer membrane., Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazellulär lebendes, parasitisches Protozoon mit großer medizinischer Bedeutung vor allem in zwei Fällen: Zum einen bei Erstinfektion während einer Schwangerschaft, hier kann es zur Schädigung des Fötus kommen, zum anderen als opportunistischer Krankheitserreger bei immunsupprimierten Patienten (z. B. AIDS), hier kann eine Reaktivierung von Dauerstadien zum Tod führen. Einen Ansatzpunkt zur Bekämpfung der Parasiten stellt ein spezieller Stoffwechselweg dar, die Glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) Biosynthese. GPIs bestehen aus einer konservierten hydrophilen Glycan-Grundstruktur, die durch Seitenketten modifiziert werden kann, und einem hydrophoben Inositol-Phospholipid. Wie bei einer Vielzahl anderer parasitärer Protozoen sind auch bei T. gondii die Hauptoberflächenproteine durch GPIs in der Zelloberfläche verankert, eine Blockierung der GPI-Biosynthese führt zum Absterben der Parasiten. Um bei therapeutischen Ansätzen jedoch nur die Parasiten zu bekämpfen und die in den Wirtszellen ebenfalls stattfindende GPI-Biosynthese nicht zu beeinflussen, sind detaillierte Kenntnisse über diesen Stoffwechselweg nötig. Es wurde ein System aus permeabilisierten Tachyzoiten von T. gondii entwickelt und erstmals die Verteilung von GPI-Ankervorläufern und weiterer GPI-Biosyntheseintermediate über die Membran des endoplasmatischen Reticulums (ER) untersucht. Durch hypotone Behandlung wird die Zellmembran effektiv permeabilisiert, das ER bleibt bei dieser Behandlung intakt. Dieses System wurde genutzt, um GPIs mit verschiedenen radioaktiven Vorläufermolekülen (Zuckernukleotiden) zu markieren. Die von permeabilisierten Toxoplasmen gebildeten GPI-Intermediate wurden anhand spezifischer enzymatischer Behandlungen und chemischer Hydrolysen charakterisiert und mit bereits bekannten Daten verglichen. Dabei wurde festgestellt, daß die hydrophilen Komponenten der GPI-Intermediate mit den beschriebenen Strukturen übereinstimmen. Außerdem konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß vor Einsetzen der Mannosylierungs-Schritte eine Acylierung am Inositol von GlcN-PI zu GlcN-(acyl)-PI erfolgt. Anschließend an die radioaktive Markierung der Glycolipide wurde mit Hilfe des Enzyms PI-PLC, das zwischen hydrophilem und hydrophobem Anteil der GPIs spaltet, die Orientierung der GPI-Biosyntheseintermediate in der ER-Membran untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl frühe, als auch höher glycosylierte Intermediate und sogar GPI-Ankervorläufer zum überwiegenden Teil eine cytoplasmatische Orientierung in der ER-Membran aufweisen. Im Zusammenhang mit transienter Acylierung des Inositolringes scheint ein mehrfacher Wechsel der verschiedenen Intermediate über die ER-Membran ("flip-flop") möglich. Erstmals konnte hier gezeigt werden, daß derart große GPI-Ankervorläufer mit einer zusätzlichen hydrophilen Seitenkette, bestehend aus N-Acetyl-Galactosamina1-4Glucose, eine Lipid-Doppelmembran überqueren.

Sekretorische Proteine und Proteine der Kompartimente des sekretorischen Transportweges müssen die Membran des Endoplasmatischen Retikulums überqueren, um an ihren Wirkungsort zu gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurden frühe Schritte des kotranslationalen Transports von Proteinen durch die ER-Membran untersucht. Signalsequenzen leiten diese Proteine als ribosomengebundene Intermediate an die ER-Membran. Die Ribosomen binden dort an den Sec61p-Komplex, der als Ribosomenrezeptor wirkt und gleichzeitig den proteinleitenden Kanal in der Membran bildet. Die Assoziation von Ribosomen mit dem Sec61p-Komplex verläuft in zwei Phasen. Die initiale Bindung ist sensitiv gegenüber hohen Salzkonzentrationen. Die Ribosomenbindung wird salzresistent, wenn die naszierende Kette in den Kanal inseriert und der Sec61p-Komplex die Signalsequenz erkennt. Sowohl Ribosomen ohne naszierende Kette als auch Ribosomen, die Proteine ohne Signalsequenzen synthetisieren, sind nur zur initialen salz-sensitiven Bindung an den Sec61p-Komplex fähig. Signalsequenzen interagieren im Cytosol mit SRP (engl.: Signal Recognition Particle). In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Signalsequenzen außerdem von Calmodulin gebunden werden. SRP und Calmodulin scheinen für die Interaktion mit Signalsequenzen einen ähnlichen Mechanismus zu benutzen, der wiederum mit der Signalsequenzerkennung durch den Sec61p-Komplex verwandt ist. Alle Ribosomen, unabhängig davon ob und welches Protein sie translatieren, können mit dem Sec61p-Komplex interagieren und daher um Bindungsplätze an der ER-Membran kompetitieren. Wenn SRP an die Signalsequenz einer naszierenden Kette gebunden ist, erhalten diese Ribosomen jedoch einen Vorteil in der Kompetition. Nur sie können Ribosomen ohne naszierende Kette oder Ribosomen, die ein cytosolisches Protein translatieren, vom Sec61p-Komplex verdrängen und sich selbst dann einen Translokationsort sichern, wenn alle Bindingsplätze an der Membran besetzt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden dreidimensionale Strukturen von Komplexen aus Ribosom und proteinleitendem Translokationskanal vorgestellt, die der ersten und zweiten Phase der Ribosomenbindung entsprechen. Überraschenderweise unterscheiden sich diese beiden Stadien strukturell nicht. In beiden Fällen existieren definierte Verbindungen zwischen Ribosom und Kanal, die eine Lücke von etwa 20 Angström zwischen dem Ribosom und der Membranoberfläche überbrücken. Die Lücke stellt eine Verbindung zum Cytosol her, die eventuell dazu dient, naszierende Ketten ins Cytosol zu entlassen, wenn diese nicht ins Lumen des ER transportiert werden sollen. Weiterhin zeigen wir, daß der Kanal in nativen Membranen größer ist als der Kanal, der nur aus gereinigtem Sec61p-Komplex besteht. Dieser größere Kanal besitzt eine zusätzliche lumenale Domäne, die von der Oligosaccharyltransferase oder vom TRAP-Komplex gebildet wird. The first step in the secretory pathway is the translocation of proteins across the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). In this thesis project, early stages of cotranslational protein translocation in mammalian cells were studied. Proteins following the secretory pathway are targeted to the ER as ribosome-nascent chain complexes by their N-terminal hydrophobic signal sequences. The nascent chain is translocated across the ER membrane through a hydrophilic channel formed by the Sec61p complex, which also functions as the ribosome receptor. The initial binding of ribosomes to the ER membrane is salt-sensitive. After insertion of the nascent chain into the translocation channel and signal sequence recognition by the Sec61p complex, the ribosome is bound in a salt-resistant manner. The membrane binding of ribosomes lacking nascent chains and of ribosomes carrying nascent chains without signal sequences is always salt-sensitive. It is known that in the cytosol, the signal sequence binds to the signal recognition particle (SRP). Here we show that another cytosolic factor, the small regulatory protein calmodulin, can interact with signal sequences. Our data suggest that both SRP and calmodulin use a similar mechanism for substrate binding and recognition. In fact, this mechanism may be related to signal sequence recognition by the Sec61p complex. Previously the question has been raised of how efficient targeting of ribosome-nascent chain complexes (RNCs) carrying a signal sequence is possible when all ribosomes, regardless of the presence or nature of a nascent chain, can bind to the Sec61p complex. We demonstrate that all ribosomes compete for common binding sites at the ER membrane and that SRP functions as a positive effector to give RNCs carrying a signal sequence an advantage over other ribosomes. RNCs with a signal sequence and bound SRP can displace ribosomes without a nascent chain and ribosomes synthesizing cytosolic proteins from the membrane and can therefore secure a translocation site even when all ribosome binding sites at the ER membrane are occupied. A structural analysis by single particle cryo electron microscopy revealed that ribosome-translocation channel complexes do not differ in the salt-sensitive or the salt-resistant stage of ribosome binding to the ER membrane. Furthermore our data show that the ribosome is linked to the translocation channel by a discrete number of connections. Even in the presence of a translocating nascent chain the ribosome-membrane junction is not completely sealed towards the cytosol. Instead, a sizable gap exists between the ribosome and the surface of the membrane that may allow nascent polypeptide chains to enter the cytosol when their translocation across the ER membrane is prevented. We also show that translocation channels derived from native microsomes are larger than channels derived from purified Sec61p complex. These larger channels contain a wider central pore and an additional lumenal domain, which is formed by the oligosaccharyl transferase or by the TRAP complex.

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae können Proteine entweder co- oder posttranslational durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden. Sie besitzen eine Signalsequenz, die sie zu einem hydrophilen Kanal in der Membran bringt, durch den der Transport erfolgt. Die zentrale Komponente des Translokationsapparates in der Membran ist der aus den Untereinheiten Sec61p, Sbh1p und Sss1p bestehende Sec61p-Komplex. Beim Proteintransport wirkt der Sec61p-Komplex zusammen mit anderen Faktoren: Im cotranslationalen Transport geht er eine feste Bindung mit Ribosomen ein; der posttranslationale Transport erfordert die Assoziation mit dem tetrameren Sec62/63p-Komplex unter Bildung des sogenannten Sec-Komplexes. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur des Sec61p-Komplexes durch Elektronenmikroskopie analysiert. Er liegt in Detergenzlösung in ringförmigen Strukturen mit einem Durchmesser von ~82Å und einer zentralen Pore von ~21Å vor. Jeder Ring besteht aus drei oder vier heterotrimeren Sec61p-Komplexen. Die oligomeren Ringstrukturen des Sec61p-Komplexes entsprechen vermutlich proteinleitenden Kanälen der Membran des Endoplasmatischen Retikulum. In Membranen wird ihre Bildung durch die Bindung von Ribosomen oder die Interaktion mit dem Sec62/63p-Komplex induziert. Eine dreidimensionale Struktur, die durch Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten wurde, zeigt, daß das Ribosom so an den Sec61p-Komplex bindet, daß der Tunnel im Ribosom, durch den die naszierende Polypeptidkette das Ribosom verläßt, genau in die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers mündet. Es existiert also ein kontinuierlicher Kanal, der sich vom Peptidyltransferase-Zentrum im Ribosom durch die zentrale Pore des Sec61p-Oligomers erstreckt, durch den naszierende Polypeptidketten cotranslational direkt in das Lumen des Endoplasmatischen Retikulum transportiert werden könnten. In dieser Arbeit wurde ein dem Sec61p-Komplex verwandter heterotrimerer Komplex in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum identifiziert, der aus den Untereinheiten Ssh1p, Sbh2p und Sss1p besteht. Sss1p ist beiden trimeren Komplexen gemein; Ssh1p und Sbh2p sind homolog zu Sec61p bzw. Sbh1p. Durch Deletion von Ssh1p und Sbh2p wurde gezeigt, daß der Ssh1p-Komplex wie der Sec61p-Komplex am Transport von Proteinen in das Endoplasmatische Retikulum beteiligt ist. Der Ssh1p-Komplex ist mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert und bildet in Detergenzlösung oligomere Ringstrukturen, aber interagiert nicht mit dem Sec62/63p-Komplex. Wir postulieren daher, daß der Ssh1p-Komplex ausschließlich den cotranslationalen Transport von Proteinen vermittelt. Beim posttranslationalen Transport interagiert das vollständig synthetisierte Modellsubstrat Prepro-Alphafaktor mit vielen cytosolischen Proteinen. Die cytosolischen Chaperone Hsp70 und TRiC konnten als Interaktionspartner identifiziert werden. Bei der Bindung des Prepro-Alphafaktors an die Membran werden die cytosolischen Proteine freigesetzt. Wir verwendeten einen Photoquervernetzungsansatz, um zu untersuchen, wie die Signalsequenz des Prepro-Alphafaktors im Bindungsschritt durch den Sec-Komplex erkannt wird. Die Signalsequenz-bindungsstelle wird hauptsächlich von Sec61p gebildet und befindet sich an der Grenzfläche zur Lipiddoppelschicht. Die gebundene Signalsequenz ist in einer helikalen Struktur fixiert und wird auf gegenüberliegenden Seiten von den Transmembrandomänen 2 und 7 des Sec61p umgeben. Sec62p und Sec71p, zwei Untereinheiten des Sec62/63p-Komplexes, flankieren gemeinsam eine Seite der Signalsequenzhelix, befinden sich aber in größerer Entfernung zur Signalsequenz als Sec61p. Es wird ein Modell vorgeschlagen, das beschreibt, wie die Bindung der Signalsequenz den Translokationskanal für den Transport öffnen könnte. Protein transport across the membrane of the endoplasmic reticulum occurs either co- or posttranslationally in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In both cases, polypeptides are directed to a translocation apparatus in the membrane by virtue of their signal sequences and then transported across the lipid bilayer through a protein-conducting channel. The major component of the protein translocation apparatus in the membrane is the heterotrimeric Sec61p complex consisting of the subunits Sec61p, Sbh1p and Sss1p. During translocation the Sec61p complex associates with other factors: In the cotranslational mode it interacts with ribosomes, whereas in the posttranslational mode it associates with the tetrameric Sec63/62p complex to form the so-called Sec complex. Here, we have analyzed the structure of the Sec61p complex by electron microscopy. In detergent this complex forms ring-like structures with a diameter of about 82Å and a central pore of about 21Å. Each ring contains 3 or 4 heterotrimeric Sec61p complexes. In membranes the formation of ring structures of the Sec61p complex is induced by its association with ribosomes or the Sec62/63p complex. We propose that the ring-like Sec61p oligomers represent protein-conducting channels of the endoplasmic reticulum membrane. A 3-dimensional structure of the ribosome-Sec61p complex obtained by electron-cryo-microscopy and single particle reconstruction showed, that the central pore of the Sec61p oligomer aligns precisely with the exit of a tunnel traversing the large ribosomal subunit that forms the passageway for the nascent chain. Thus, in cotranslational translocation a continuous channel extending from the ribosome through the Sec61p oligomer could guide the nascent chain directly into the lumen of the endoplasmic reticulum. Furthermore, we have discovered a trimeric protein complex in the yeast endoplasmic reticulum membrane that is structurally related to the Sec61p complex. This so-called Ssh1p complex consists of Ssh1p, a distant relative of Sec61p, of Sbh2p, a homolog of the Sbh1p subunit of the Sec61p complex, and of Sss1p, a component common to both trimeric complexes. In contrast to Sec61p, Ssh1p is not essential for cell viability, but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential for cell viability, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperature and accumulate precursors of secretory proteins in the cytosol. Like the Sec61p complex, the Ssh1p complex forms ring-like structures in detergent and interacts with membrane-bound ribosomes, but it does not associate with the Sec62/63p complex. We therefore postulate that the Ssh1p complex functions exclusively in the cotranslational pathway of protein translocation. In the posttranslational transport process the newly synthesized translocation substrate prepro-a-factor associates with a large number of cytosolic proteins including the chaperones Hsp70 and TRiC. Upon binding of prepro-a-factor to the Sec complex all cytosolic proteins are released. Using a photo-crosslinking approach and a unique mapping technique we have investigated, how the signal sequence of prepro-a-factor is recognized by the Sec complex during the binding step. The signal sequence contacts primarily the multispanning membrane protein Sec61p. The bound signal sequence adopts a helical structure that interacts on opposite sides with transmembrane domains 2 and 7 of Sec61p, respectively. Sec62p and Sec71p, two subunits of the Sec62/63p complex, contact one side of the signal sequence, but are further away than Sec61p. Our data show, that the signal sequence binding site is located at the interface of the protein channel and the lipid bilayer. We suggest that binding of the signal sequence could open the channel for polypeptide transport.

Der Eintritt löslicher oder membranständiger Proteine in den Sekretionsweg beginnt mit dem Transport der Proteine durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Translokationspore wird durch den heterotrimeren Sec61-Komplex gebildet. Homologe Membranproteine der alpha- und gamma-Untereinheit dieses Komplexes sind bislang in allen daraufhin untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gefunden worden. Es handelt sich somit um einen entwicklungsgeschichtlich hoch konservierten Mechanismus des Proteintransports durch Membranen. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben uns mittlerweile ein komplexes Bild des Translokationsgeschehens vermittelt. Die vorliegende Arbeit beleuchtet einen völlig neuen Aspekt der Proteintranslokation: Es zeigt sich, daß Gene, die für Komponenten des Sec61-Komplexes kodieren, in sehr unterschiedlichen eukaryotischen Organismen unabhängig voneinander dupliziert wurden und sich im folgenden nebeneinander weiterentwickelten. Die Untersuchung dieser sog. paralogen Gene und ihrer Genprodukte zum einen in Säugerzellen und zum anderen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Gegenstand der Arbeit. In Säugerzellen finden sich zwei sehr ähnliche SEC61a-Gene (knapp 80% Identität auf Nukleinsäureebene, etwa 94% auf Aminosäureebene), deren Expression in verschiedenen Organen und Embryonalstadien der Maus analysiert wurde. In allen bislang getesteten Geweben wurden beide Gene exprimiert. Deutliche Unterschiede zeigten sich allerdings in der Stärke der Expression: Während die Expressionshöhe des bereits bekannten SEC61a-I-Gens relativ konstant war, variierte die des paralogen SEC61a-II-Gens zwischen den einzelnen Organen. Der selektive Vorteil zweier paraloger SEC61a-Gene für den Säugerorganismus liegt somit möglicherweise in der unterschiedlichen Regulierbarkeit ihrer Expression. In Saccharomyces cerevisiae finden sich paraloge Proteine und dafür kodierende Gene sowohl für die alpha-Untereinheit Sec61p als auch für die beta-Untereinheit Sbh1p des heterotrimeren Sec61p-Komplexes. Der Grad der Identität liegt mit 32% zwischen Sec61p und Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) allerdings erheblich niedriger als in Säugerzellen. Sbh1p und Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) sind zu etwa 50% identisch. Für die gamma-Untereinheit Sss1p wurde kein paraloges Protein gefunden. Es konnte gezeigt werden, daß die beiden, hier neu beschriebenen Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen, heterotrimeren Komplex, den Ssh1p-Komplex, bilden, der ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert ist und eine Funktion beim Proteintransport durch diese Membran hat. Im Gegensatz zu SEC61 ist SSH1 nicht essentiell, wenn auch das Ssh1p für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Die Deletion des SBH2-Gens zeigt keinen Phänotyp, was allerdings für die des SBH1-Gens ebenfalls gilt. Erst das Fehlen beider Proteine führt zu einem temperatur-abhängigen Wachstumsphänotyp und zu Defekten in der Translokation. Der entscheidende Unterschied zwischen dem Sec61p- und dem Ssh1p-Komplex scheint darin zu bestehen, daß der Sec61p-Komplex modulartig einsetzbar ist: als trimerer Komplex bei der kotranslationalen Translokation und im heptameren Sec-Komplex beim posttranslationalen Proteintransport. Demgegenüber deuten die Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes darauf hin, daß dieser nicht mit dem tetrameren Sec62p-Sec63p-Komplex zum heptameren Sec-Komplex assoziieren kann. Vielmehr läßt er sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen nachweisen, was auf eine ausschließliche Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der kotranslationalen Translokation schließen läßt., Soluble or membrane proteins entering the secretory pathway are first translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The proteins move through a channel formed by the heterotrimeric Sec61-complex. Homologues of the alpha- and gamma-subunit of this complex have been found in a wide variety of procaryotic and eucaryotic organisms indicating an evolutionary highly conserved mechanism for translocating proteins across membranes. Several recent investigations contributed to a complex understanding of this process. The work presented here sheds light on a completely new aspect of protein translocation across the ER-membrane: Interestingly genes coding for components of the Sec61-complex are found to have been duplicated independently in diverse eucaryotic organisms giving rise to so called paralogous genes (= intraspecies homologues) co-evolving after duplication. These paralogous genes and their gene products in mammalian cells as well as in the yeast Saccharomyces cerevisiae have been analyzed in detail. Mammalian cells possess two very similar SEC61a-genes (about 80% identity on nucleic acid level, about 94% on protein level). Their expression has been analyzed for several murine organs and embryonic stages. All tissues tested so far showed expression of both genes though the level of expression differed significantly: whereas expression of the already known SEC61a-I-gene seemed to be more or less constant across different tested organs, expression levels of the paralogous SEC61a-II-gene were not. Consequently the ability to differentially regulate the expression of the two paralogous SEC61a-genes may be of selective advantage for the mammalian organism. In the yeast Saccharomyces cerevisiae paralogous proteins of the alpha-subunit Sec61p as well as for the beta-subunit Sbh1p of the heterotrimeric Sec61p-complex can be found. The paralogous alpha-subunits Sec61p and Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) are less well conserved (32% identity) than the mammalian paralogues. Sbh1p and Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) are 50% identical. No paralogous protein was found for the gamma-subunit Sss1p. Instead, it could be shown that the new proteins Ssh1p and Sbh2p together with Sss1p are found in a heterotrimeric complex, the Ssh1p-complex, which like the Sec61p-complex localizes to the ER-membrane and has a function in translocating proteins across this membrane. In contrast to Sec61p Ssh1p is not essential for cell viability but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperatures and show translocation defekts in vivo as well as in vitro. The most intriguing difference between the Sec61p-and the Ssh1p-complex might be that the Sec61p-complex has a role in both co- and post-translational translocation pathways, as a separate entity and as part of the heptameris Sec-complex, respectively. However, there was no evidence for the Ssh1p-complex being part of an heptameric complex together with the tetrameric Sec62p-Sec63p-complex, but association of the trimeric Ssh1p-complex with membrane-bound ribosomes could be shown, making it likely that the Ssh1p-complex functions exclusively in the co-translational pathway of protein transport.

BAP29 and BAP31 are ubiquitously expressed integral membrane proteins of the ER. In B-lymphocytes, they transiently bind to the TM domains of mIgD and mIgM, both of which are BCR subunits. BAP29 and BAP31 are discussed to play a role in controlling ER export of certain TM proteins by an unknown mechanism. In particular, BAPs are considered candidates to mediate ER retention of mIg molecules in the absence of the BCR subunits Ig-alpha and Ig-beta. Evaluation of database sequence information led to the identification of BAP family members from animals, plants and fungi. BAP proteins are likely expressed in all eukaryotes and possess a characteristic composition of structural elements and sequence motifs. Similarities in protein sequence and locus architecture suggest that mammalian BAP29 and BAP31 are paralogs that arose from a duplicated ancestral gene. To investigate the role of BAP proteins in the ER, mouse ES cells deficient for either BAP29, BAP31 or both were generated by a sequential gene targeting approach. Targeted disruption of the BAP31 locus was achieved using a novel type of targeting vector that combines conditional targeting with promoter trapping. BAP-deficient cells exhibit normal growth and morphology of secretory pathway membrane systems. ER retention of mIgs and their cell surface transport after BCR assembly was examined in wild-type and BAP-deficient ES cells transfected with GFP-mIg fusion proteins. BAP-deficient cells retain these fusion proteins in the ER and do not transport them to the cell surface unless Ig-alpha and Ig-beta are co-expressed. Thus, ER retention of mIgs and BCR assembly is not compromised in the absence of BAP29 and BAP31. The present study proposes a function of BAP proteins in ER quality control rather than export control. BAP29 and BAP31 may selectively recognize and remove misfolded TM domains to prevent spontaneous protein aggregation and loss of sorting control.