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Orientador: Gilberto de Nucci Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Os efeitos vasculares da endotelina-1 (ET-1) , da sarafotoxina 6b (S6b) e o IRL-1620 foram investigados em leito arterial hepático isolado de cão antes e durante a infusão de inibidores da ciclo-oxigenase e da óxido nítrico sintetase (indometacina e L-NAME, respectivamente). Administrações de noradrenalina (NA) foram usadas como agente vasoconstritor controle em nossos experimentos. Após a retirada cirúrgica do órgão, a veia cava (porções abdominal e supra-diafragmática), veia porta e artéria hepática foram canuladas. O órgão foi perfundido através da artéria hepática e da veia porta com solução nutritiva de .Krebs oxigenada e aqueci da a 37oC. Injeções em bolus de ET-1 (0.4-400 pmol), S6b (0.4-400 pmol), IRL-1620 (40-1200 pmol) e NA (5-500 nmol) foram feitas através da artéria hepática e as respostas da prepa~ação foram registradas em polígrafo. A administrações de ET -1 e S6b nduziram uma resposta vasoconstritora dependente da dose e de longa duração, acompanhadas de liberação significativa de prostaciclina (PGI2). A infusão de indometacina (5,6 J.!M) neste sistema tendeu a aumentar, porém não significativamente, as respostas vasculares induzidas por estes agonistas. A subseqüente infusão de L-NAME (10 J.!M), potenciou a resposta vasoconstritora induzida tanto pela ET-1 quando pela S6b (P

Orientadora: Profa. Maria Fernanda de Paula Werner Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 19/12/2020 Inclui referências Resumo: A úlcera gástrica é um problema de saúde pública mundial, caracterizada por extensas lesões na mucosa do estômago e/ou esôfago que podem se estender por todas as camadas do órgão, causando sérias complicações como sangramentos e perfurações que requerem hospitalização do paciente e intervenção cirúrgica. Como principais causas da úlcera gástrica temos o uso de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), que diminuem a produção de muco-bicarbonato gastroprotetor, e a infecção pela bactéria Helicobacter pylori. Além da erradicação da H. pylori, o tratamento convencional visa a inibição da produção de ácido clorídrico pelo uso dos inibidores da bomba de prótons (e.g. omeprazol), ou de antagonistas de receptores H2 da histamina (e.g. ranitidina). Contudo, estudos demonstram que a inibição da secreção ácida gástrica está associada ao aumento do risco de desenvolvimento de diversas doenças como osteoporose, infecções intestinais e até doença renal crônica. Além da secreção ácida gástrica, a ulcerogênese é um processo complexo que também envolve o fluxo sanguíneo. Os sistemas endotelinérgico e da via do óxido nítrico modulam a microcirculação bem como a inflamação e o estresse oxidativo na mucosa gástrica. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito gastroprotetor e cicatrizante de drogas vasoativas, mais especificamente da bosentana e da sildenafila, em modelos de úlcera gástrica aguda e crônica. A administração oral de bosentana (antagonista dual de receptores ETA e ETB) e da sildenafila (inibidor da fosfodiesterase 5), isoladas ou em associação foram investigadas no modelo de úlcera aguda induzida por isquemia-reperfusão. O efeito cicatrizante da monoterapia com a bosentana foi investigada no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético. Por fim, o modelo de ligadura do piloro foi utilizado para investigar o efeito da bosentana na secreção ácida gástrica. Na úlcera aguda por IR, o pré-tratamento com bosentana, sildenafila ou a associação de baixas doses de ambos reduziram a área ulcerada, impediram a depleção de muco e das defesas antioxidantes no tecido gástrico. Complementarmente, esse pré-tratamento reduziu a infiltração de neutrófilos, importante marcador de inflamação tecidual. No modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético foi constatado um aumento na expressão de receptores ETA e ETB na área ulcerada dos animais do grupo veículo comparado com animais naïve. O tratamento com a bosentana por cinco dias acelerou a cicatrização das úlceras crônicas, aumentou o conteúdo de mucina e a proliferação de células epiteliais da mucosa gástrica, reduziu a infiltração de neutrófilos e os níveis de citocinas inflamatórias, como fator de necrose tumoral-alfa e interleucina 1 beta. Os parâmetros plasmáticos da função renal e hepática não foram alterados pelo tratamento subcrônico com a bosentana. A partir dos resultados do modelo agudo, conclui-se que o pré-tratamento com bosentana e sildenafila ou a associação de baixas doses dos fármacos exibe efeito gastroprotetor, e no modelo de úlcera crônica, o pós-tratamento com bosentana induziu a cicatrização de úlceras crônicas, sem modificar a secreção ácida gástrica. Nossos resultados reforçam a tendência mundial do reposicionamento de fármacos (uso off label), e de maneira especial este estudo demonstra que outras vias podem ser exploradas como adjuvantes no tratamento de úlceras gástricas, contornar os possíveis efeitos adversos do tratamento convencional. Abstract: Gastric ulcer is a worldwide public health problem, characterized by extensive lesions in the mucosa of the stomach and / or esophagus that can extend through all layers of the organ, causing serious complications such as bleeding and perforations that require hospitalization and surgical intervention. The main causes of gastric ulcer are the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which decrease the production of gastroprotective mucus-bicarbonate, and infection by the bacterium Helicobacter pylori. In addition to the eradication of H. pylori, conventional treatment aims to inhibit the production of hydrochloric acid by the use of proton pump inhibitors (e.g. omeprazole), or histamine H2 receptor antagonists (e.g. ranitidine). However, studies show that inhibition of gastric acid secretion is associated with an increased risk of developing several diseases such as osteoporosis, intestinal infections and even chronic kidney disease. In addition to gastric acid secretion, ulcerogenesis is a complex process that also involves blood flow. The endothelinergic and nitric oxide pathway systems modulate microcirculation as well as inflammation and oxidative stress in the gastric mucosa. Thus, the objective of this work was to evaluate the gastroprotective and healing effect of vasoactive drugs, more specifically bosentan and sildenafil, in models of acute and chronic gastric ulcers. Oral administration of bosentan (dual antagonist of ETA and ETB receptors) and sildenafil (phosphodiesterase 5 inhibitor), either alone or in combination, were investigated in the ischemia-reperfusion-induced acute ulcer model. The healing effect of bosentan monotherapy was investigated in the acetic acid-induced chronic ulcer model. Finally, the pyloric ligation model was used to investigate the effect of bosentan on gastric acid secretion. In acute IR ulcers, pretreatment with bosentan, sildenafil or the combination of low doses of both reduced the ulcerated area, prevented mucus depletion and antioxidant defenses in gastric tissue. In addition, this pre-treatment reduced the infiltration of neutrophils, an important marker of tissue inflammation. In the acetic acidinduced chronic ulcer model, an increase in the expression of ETA and ETB receptors was found in the ulcerated area of animals in the vehicle group compared with naïve animals. Treatment with bosentan for five days accelerated the healing of chronic ulcers, increased mucin content and proliferation of gastric mucosal epithelial cells, reduced neutrophil infiltration and inflammatory cytokine levels, such as alpha-tumor necrosis factor and interleukin 1 beta. Plasma parameters of renal and liver function were not altered by sub-chronic treatment with bosentan. From the results of the acute model, it is concluded that pretreatment with bosentan and sildenafil or the association of low doses of the drugs exhibits a gastroprotective effect, and in the chronic ulcer model, post-treatment with bosentan induced the healing of ulcers, without changing gastric acid secretion. Our results reinforce the worldwide trend of drug repositioning (off label use), and in a special way this study demonstrates that other routes can be explored as adjuvants in the treatment of gastric ulcers, to circumvent the possible adverse effects of conventional treatment.

Orientador: Prof. Dr. Aleksander R. Zampronio Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 30/07/2020 Inclui referências: p. 52-60 Resumo: É bem estabelecido, em dados de literatura, que os hormônios sexuais podem afetar as respostas inflamatória e imune. Mulheres geralmente demonstram ter maior reatividade imunológica quando comparadas a homens, uma vez que elas apresentam maior número circulante de linfócitos T e imunoglobulinas, são menos suscetíveis a infecções de origem bacteriana e parasitária. Porém, são as que mais sofrem de doenças relacionadas ao sistema imunológico, como doenças autoimunes e dores crônicas. As diferenças sexuais também podem afetar a resposta febril. Alguns estudos já demonstraram a influência dos hormônios sexuais sobre a resposta febril utilizando endotoxina bacteriana, denominado lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-negativas, como modelo de indução de febre em animais de laboratório. Contudo, pouco se sabe a respeito da influência hormonal sobre as respostas febris induzidas por outros padrões associados a patógenos (PAMPs), tais como o zimosan A (Zym) e o ácido poli-inosínico:policitidílico (Poli I:C) que representariam estímulos de origem fúngica e viral, respectivamente. Além disso, alguns estudos já demonstraram, em machos, que existem diferenças nas respostas febris induzidas por esses PAMPs em relação à liberação de citocinas e mediadores centrais. Entre estas diferenças, a endotelina-1 (ET-1) atua como mediador na resposta febril induzida por LPS e Zym, mas não por Poli I:C em machos. O objetivo desse estudo é investigar se os hormônios sexuais afetam a resposta febril induzida por Zym e Poli I:C e o envolvimento de ET-1 como mediador central na resposta febril induzida por LPS, Zym e Poli I:C em ratas Wistar fêmeas. Os resultados revelaram que, semelhantemente ao LPS, a resposta febril induzida por Zym (3 mg/kg, i.p.) e Poli I:C (300 ?g/kg, i.p.) é significativamente maior em fêmeas OVX quando comparadas à fêmeas falso-operadas. A suplementação estrogênica (17??- estradiol, 10 ?g/kg, 5 d, s.c.) em ratas OVX reduziu as respostas febris induzidas por Zym e Poli I:C. Ainda, a administração do antagonista de receptor ETB, BQ788 (3 pmol, 2 ?L), diminuiu a resposta febril induzida por LPS (50 ?g/kg, i.p.) somente em fêmeas com ciclo estral normal, mas não em fêmeas OVX. A injeção de BQ788 também não alterou as respostas febris induzidas por Zym e Poli I:C tanto em fêmeas falso-operadas quanto em OVX. Esses resultados sugerem que os hormônios sexuais, particularmente o estrogênio, reduzem a intensidade da febre induzida por Zym e Poli I:C, igualmente ao que também já foi relatado com a febre induzida por LPS em fêmeas. A ET-1, assim como em machos, participa como mediador na resposta febril por LPS somente em fêmeas falso-operadas, mas não na resposta febril induzida por Zym ou Poli I:C, independentemente da condição hormonal. Esses resultados reforçam a existência da influência dos hormônios sexuais femininos que possivelmente modulam a resposta febril e demonstram que a resposta febril envolve diferentes mediadores dependendo do agente patológico que a esteja causando bem como da condição hormonal do indivíduo em que ela ocorre. Palavras-chave: endotelina-1, estrogênio, diferenças sexuais, resposta imune Abstract: It is well established that sex hormones can affect the immune and inflammatory response. Women generally show greater immunological reactivity when compared to men, as they have a larger number of circulating T lymphocytes and immunoglobulins, are less vulnerable to bacterial and parasitic infections. However, they have a superior prevalence of autoimmune diseases and chronic pain. These sex differences in immune response can also affect the febrile response. Several studies have already demonstrated the influence of sex hormones on the febrile response using bacterial endotoxin, such as lipopolysaccharide (LPS) of gram-negative bacteria, as a model for inducing fever in laboratory animals. However, little is known about the hormonal influence on the febrile response induced by other pathogen-associated molecular patterns (PAMP), such as zymosan A (Zym) and polyinosinic:polycytidylic acid (Poly I:C) that would represent stimuli of fungal and viral origin, respectively. In addition, some studies have been shown, in males, that are differences in the febrile response induced by these PAMPs in relation to the release of cytokines and even central mediators. For instance, endothelin-1 (ET-1), an important central mediator of LPS- and Zym-induced fever, do not participate in the febrile response induced by Poly I:C in males. The purpose of this study was to investigate if female sex hormones affect the febrile response induced by Zym and Poly I:C and the involvement of ET-1 as a mediator on fever induced by these PAMPs in females. The results revealed that, similarly to LPS, the febrile response induced by Zym (3 mg/kg, i.p.) and Poly I:C (300 ?g/kg, i.p.) is significantly higher in ovariectomized (OVX) female rats compared to sham-operated female rats. Estrogen replacement (17??- estradiol, 10 ?g/kg, 5 d, s.c.) in OVX females reduced Zym and Poly I:Cinduced fever. In addition, the administration of the ETB receptor antagonist BQ788 (3 pmol, 2 ?L) reversed the febrile response induced by LPS (50 ?g/kg, i.p.) in cycling females but not in OVX females. BQ788 did not change the febrile response induced by Zym or Poly I:C in both cycling and OVX females. These findings suggest that female sex hormones, and particularly estrogen, reduce the intensity of fever induced by Zym and Poly I:C, similarly as described to LPS. ET-1, as well as in males, participates of the febrile response induced by LPS in cycling females but not by LPS in OVX females, but not in the febrile response induced by Zym or Poly I:C, regardless of hormonal condition. These results reinforce the influence of female sex hormones in modulating the febrile response and show that the febrile response in females can involve different mediators depending on the agent that is causing it. Keywords: endothelin-1, estrogen, sex differences, immune response

Orientador: Prof. Dr. Aleksander Roberto Zampronio Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 29/09/2020 Inclui referências: p. 74-101 Resumo: A síndrome da doença é uma resposta adaptativa que pode ser distinguida por sinais e sintomas característicos, como febre, hiperalgesia generalizada, hipolocomoção, apatia e sono. A endotelina-1 (ET-1) é produzida por estímulos inflamatórios, incluindo lipopolissacarídeo (LPS), e está envolvida na patogênese da inflamação e da dor por meio da ação dos receptores ETA e ETB. A ET-1 também induz febre por ação em receptores ETB no hipotálamo. No entanto, pouco é conhecido sobre a participação da ET-1 produzida no sistema nervoso central (SNC) nos outros fenômenos da síndrome de doença. O presente estudo investigou o papel da ET-1 nas respostas da síndrome da doença, incluindo hiperalgesia, anedonia e hipolocomoção, bem como reavaliou o envolvimento de receptores ETA na resposta febril induzida por LPS em ratos Wistar. A hiperalgesia mecânica foi avaliada com o analgesímetro eletrônico Von Frey e a hiperalgesia térmica com a placa aquecida. A administração intracerebroventricular (i.c.v.) de ET-1 induziu hiperalgesia mecânica e térmica em ratos, que foi reduzida pelo antagonista do receptor ETA BQ123 e exacerbada pelo antagonista do receptor ETB, BQ788. O tratamento dos animais com o inibidor da ciclooxigenase (COX) indometacina não alterou a hiperalgesia induzida por ET-1. A administração intraperitoneal (i.p.) de LPS induziu hiperalgesia mecânica e térmica nos animais. Tanto o BQ123 quanto o BQ788 aboliram essa hiperalgesia mecânica, mas a resposta térmica foi apenas parcialmente bloqueada. Para se avaliar se este comportamento nociceptivo depende da ativação dos receptores de ET-1 no hipotálamo foi feito o tratamento com os antagonistas diretamente nesta região. O bloqueio dos receptores ETA no hipotálamo também aboliu a hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS, e o antagonista do receptor ETB não influenciou essa resposta. Além da hiperalgesia, a administração i.p. de LPS também induziu anedonia, refletida na menor preferência pela sacarose e redução da atividade locomotora no teste do campo aberto. Ambos os antagonistas restauraram a atividade locomotora, mas apenas o BQ788 reverteu a redução da preferência pela sacarose. Concomitantemente a estas respostas, diferentes doses de LPS induziu febre nos animais. A administração do LPS (10 ou 200 ?g/kg, i.p.) produziu febre nos ratos. O pré-tratamento (30 min antes) ou o pós-tratamento (2 h após a administração de LPS) dos animais com o antagonista ETA BQ123 não alterou a resposta febril induzida por baixas doses de LPS corroborando os resultados anteriores. No entanto, o póstratamento dos animais com este antagonista, reduziu a febre induzida por alta dose de LPS. Esses resultados indicam que ET-1 e os receptores ETA e ETB estão envolvidos em várias respostas relacionadas à síndrome da doença, incluindo hiperalgesia mecânica e térmica induzida tanto pela ET-1 quanto pelo LPS. Outros comportamentos ligados à infecção como a anedonia e hipolocomoção além da febre induzidas por LPS também envolvem a participação deste peptídeo. Além disso, os receptores ETA participam da resposta febril induzida por altas doses de LPS, provavelmente em uma fase mais tardia da resposta. Palavras chave: Endotelina-1, endotoxina, hiperalgesia, anedonia, receptores de endotelina. Abstract: The sickness syndrome is an adaptive response that can be distinguished by characteristic signs and symptoms, such as fever, generalized hyperalgesia, hypolocomotion, apathy and sleep. Endothelin-1 (ET-1) is produced by inflammatory stimuli, including lipopolysaccharide (LPS), and is involved in the pathogenesis of inflammation and pain through the action of ETA and ETB receptors. ET-1 also induces fever by action at ETB receptors in the hypothalamus. However, little is known about the participation of ET-1 produced in the central nervous system in other phenomena of the sickness syndrome. The present study investigated the role of ET-1 in the responses of the sickness syndrome, including hyperalgesia, anhedonia and hypolocomotion, as well as re-evaluated the involvement of ETA receptors in the febrile response induced by LPS in Wistar rats. Mechanical hyperalgesia was assessed with the Von Frey electronic analgesiometer and thermal hyperalgesia in the hot plate. Intracerebroventricular (i.c.v.) administration of ET-1 induced mechanical and thermal hyperalgesia in rats, which was reduced by the ETA receptor antagonist BQ123 and exacerbated by the ETB receptor antagonist, BQ788. The treatment of animals with the cyclooxygenase inhibitor (COX) indomethacin did not alter ET-1-induced hyperalgesia. Intraperitoneal (i.p.) administration of LPS induced mechanical and thermal hyperalgesia in animals. Both BQ123 and BQ788 abolished this mechanical hyperalgesia, but the thermal response was only partially blocked. To assess whether this nociceptive behavior depends on the activation of ET-1 receptors in the hypothalamus, treatment with antagonists was carried out directly in this region. Blocking of ETA receptors in the hypothalamus also abolished LPS-induced mechanical hyperalgesia, and the ETB receptor antagonist did not influence this response. In addition to hyperalgesia, i.p. injection of LPS also induced anhedonia, reflected in the lower preference for sucrose and reduced locomotor activity in the open field test. Both antagonists restored locomotor activity, but only BQ788 reversed the reduction in preference for sucrose. Concomitantly with these responses, different doses of LPS induced fever in the animals. Administration of LPS (10 or 200 ?g / kg, i.p.) produced fever in the rats. The pre-treatment (30 min befoere) or the posttreatment (2 h after the injection of LPS) of the animals with the antagonist ETA BQ123 did not alter the febrile response induced by the low dose of LPS corroborating the previous results. However, the post-treatment of the animals with this antagonist, reduced the fever caused by the higher doses of LPS tested. These results indicate that ET-1 and the ETA and ETB receptors are involved in several responses related to the sickness syndrome, including mechanical and thermal hyperalgesia induced by both ET-1 and LPS. Other behaviors linked to infection such as anhedonia and hypolocomotion in addition to fever induced by LPS also involve the participation of this peptide. Moreover, ETA receptors participate in the febrile response induced by high doses of LPS, probably in a later phase of this response. Keywords: Endothelin-1, endotoxin, hyperalgesia, anhedonia, endothelin receptors.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2019. Desde 1970, a cisplatina é um quimioterápico muito utilizado para o tratamento de diversos tipos de tumores sólidos. No entanto, um dos efeitos colaterais mais limitantes deste fármaco é o aparecimento de neuropatias periféricas, que acometem cerca de metade dos pacientes submetidos a tratamento com ele. A patofisiologia deste tipo de dor causada por cisplatina ainda é bem pouco conhecida e de difícil manejo clínico. Por outro lado, alguns trabalhos demonstram o envolvimento do sistema das endotelinas em diversos tipos de neuropatia, mas sua participação na mediação de neuropatias associadas à quimioterapia ainda é desconhecida. O presente estudo teve como objetivo maior verificar se as endotelinas estão implicadas na manutenção da neuropatia induzida por cisplatina em camundongos. Verificou-se que injeções semanais de Cisplatina, na dose de 3 mg/kg (i.p.) por 4 semanas, causavam hiperalgesia mecânica de longa duração tanto na pata posterior quanto na face dos animais tratados. A resposta hiperalgésica mecânica dos animais tratados com cisplatina não foi modificada pelo tratamento neonatal com capsaicina. Drogas de referência para controle de dor e inflamação, tais como morfina, dexametasona, indometacina e celecoxibe reverteram parcialmente a hiperalgesia mecânica na pata e na face dos animais na primeira e na segunda semana após o início do tratamento com cisplatina, mas não foram efetivos na quarta semana. A gabapentina, um dos fármacos de referência para controle de dores neuropáticas, foi efetivo em reverter a hiperalgesia em ambas as regiões e em todos os períodos avaliados. O tratamento com antagonistas peptídicos seletivos para receptores ET A (BQ-123) e ET B (BQ-788) foram efetivos em reverter a hiperalgesia mecânica da face em todos os períodos avaliados, mas o mesmo não aconteceu na pata posterior, cuja hiperalgesia só foi reduzida por estes fármacos na primeira semana após o início do tratamento com cisplatina. Ensaios de RT-PCR quantitativo detectaram aumentos significativos de RNAm para receptores ET A e ET B no gânglio trigeminal dos camundongos após 2 e 4 semanas de tratamento com o quimioterápico. Também foram observados aumentos na expressão protéica de receptores ET B (mas não ET A ) em imunoensaios de Western Blot no gânglio trigeminal, bem como de ambos os receptores em ensaios de imunofluorescência com gânglios de raízes dorsais lombares obtidos de animais após 2 e 4 semanas de tratamento com cisplatina. Este conjunto de resultados implica o sistema das endotelinas na manifestação da hiperalgesia mecânica associada à neuropatia promovida pelo tratamento prolongado com cisplatina em camundongos. O sistema das endotelinas pode vir a constituir um alvo atrativo para manejo terapêutico da neuropatia causada por este quimioterápico. Abstract: Since 1970, cisplatin has been widely used as a chemotherapeutic drug to treat various types of solid tumors. One of the most limiting side effects of this drug is the occurrence of peripheral neuropathy, which affects about half of the patients and is poorly responsive to currently available analgesics. Currently, the pathophysiology of cisplatin-induced neuropathic pain is still incompletely understood, which hampers its effective clinical management. On the other hand, some studies have implicated the endothelin system in various types of neuropathy, but evidence for the participation of endothelins in mediating chemotherapy-associated neuropathies is lacking. Thus, the present study aimed to examine if endothelins are implicated in the maintenance of cisplatin- induced neuropathy in mice. It was found that weekly injections of cisplatin (3 mg/kg per week, i.p.) for 4 weeks caused long-lasting mechanical hyperalgesia in both the hind paw and forehead. Neonatal capsaicin treatment failed to modify the development of mechanical hyperalgesia in response to cisplatin. Acute treatment with the reference analgesic and/or anti-inflammatory drugs morphine, indomethacin, celecoxib and dexamethasone transiently and partially reversed paw and forehead mechanical hyperalgesia when injected at 1 or 2 weeks after initiating cisplatin treatment, but were effective at 4 weeks. In contrast, gabapentin, a reference drug to control neuropathic pain, was effective in reversing hyperalgesia in both regions in all 3 examined periods. Treatment with peptidergic antagonists selective for ET A (BQ-123) and ET B (BQ-788) receptors effectively reversed mechanical hyperalgesia in the forehead at 1, 2 or 4 weeks after starting cisplatin treatment, but hind paw hyperalgesia was only attenuated by these drugs after the first week. Quantitative RT-PCR assays detected significant increases in mRNA for ET A and ET B receptors in trigeminal ganglia collected at 2 and 4 weeks of cisplatin treatment. At 2 and 4 weeks of treatment with cisplatin, an increase in ET B (but not ET A ) receptor protein expression was observed in trigeminal ganglia by Western blot immunoassay of the trigeminal ganglion, as well as of both receptors in lumbar dorsal root ganglia by immunofluorescence assays. Altogether, the results obtained show that prolonged treatment of mice with cisplatin activates the endothelin system to sustain neuropathic mechanical hyperalgesia of the forehead, but not of the hind paw, where endothelins seem to be involved only during the initial, non- neuropathic, sensory changes. The endothelin system could be an attractive target for therapeutic management of chemotherapy-induced craniofacial neuropathy.

A resposta inflamatória pode exacerbar o processo lesivo após desordens neurais agudas como no acidente vascular encefálico. Alternativas de se obter uma diminuição na resposta inflamatória no acidente celular encefálico vem sendo amplamente estudada com o uso de compostos fitoterápicos, nesta hipótese o cipó pucá (Cissus verticillata), uma planta medicinal amazônica popularmente utilizada como anti-inflamatório e anti-hipoglicêmico vem sendo utilizada pela medicina popular no tratamento de doenças agudas inflamatórias. Entretanto, não existem investigações sobre os possíveis efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores do extrato da planta em modelos experimentais de desordens neurais agudas. Neste estudo, investigou-se os efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores do extrato da planta por extração supercrítica em ratos adultos submetidos a lesão aguda induzida por endotelina-1 (ET-1) no córtex motor. Dois grupos experimentais foram delineados: O primeiro com animais do grupo controle com um tempo de sobrevida de vinte e quatro horas e de sete dias (Grupo N= 3 para cada tempo de sobrevida), submetidos a isquemia focal com ET-1, porém injetados apenas solução salina e tween 5% via intraperitoneal (i.p), e o segundo grupo de animais tratados com doses de 100 mg/Kg (i.p) de extrato da planta logo após a cirurgia com os mesmos tempos de sobrevida (Grupo N=5 para cada tempo de sobrevida). Em seguida perfundidos vinte quatro horas e sete dias após a indução da lesão isquêmica. A análise histopatológica geral foi realizada em secções coradas pela violeta de cresila e hematoxilina. Neutrófilos e macrófagos foram identificados por imunoistoquímica com anticorpos específicos (anti-MBS1 e IBA-1, respectivamente), astrócitos marcados com anticorpo anti-GFAP. Realizou-se contagem microglia/macrófagos ativados e corpos neuronais nos grupos experimentais mencionados e avaliou-se a atividade de astrócitos após a lesão. O tratamento com o extrato de Cissus verticillata induziu efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores nos animais tratados, bem como a diminuição da cavitação tecidual, ativação de astrócitos no centro da lesão e diminuição de infiltrado de células inflamatórias polimorfonucleares e/ou microglia/macrófago. The inflammatory response may exacerbate the damaging process after acute neural disorders such as in stroke. Alternatives to obtain a decrease in the inflammatory response in the encephalic cell accident have been widely studied with the use of herbal compounds, in this hypothesis the pucá cucó (Cissus verticillata), an Amazonian medicinal plant popularly used as anti-inflammatory and antihyperglycemic used by folk medicine in the treatment of acute inflammatory diseases. However, there are no investigations into the possible anti-inflammatory and neuroprotective effects of plant extract in experimental models of acute neural disorders. In this study, we investigated the anti-inflammatory and neuroprotective effects of plant extract by supercritical extraction in adult rats submitted to acute injury induced by endothelin-1 (ET-1) in the motor cortex. Two experimental groups were delineated: the first with animals of the control group with a survival time of twenty-four hours and seven days (Group N = 3 for each survival time), submitted to focal ischemia with ET-1, but injected 5% tween intraperitoneal (ip), and the second group of animals treated with doses of 100 mg / kg (ip) of plant extract after surgery with the same survival times (Group N = 5 for each survival time). Then perfused twenty four hours and seven days after induction of ischemic injury. General histopathological analysis was performed in sections stained by cresyl violet and hematoxylin. Neutrophils and macrophages were identified by immunohistochemistry with specific antibodies (anti-MBS1 and IBA-1, respectively), astrocytes labeled with anti-GFAP antibody. Activated microglia/ macrophages and neuronal bodies were counted in the mentioned experimental groups and the astrocyte activity after the lesion was evaluated. Treatment with Cissus verticillata extract induced anti-inflammatory and neuroprotective effects in treated animals, as well as decreased tissue cavitation, astrocyte activation at the center of the lesion and decreased infiltration of polymorphonuclear and/or microglia/ macrophage inflammatory cells. UNIFESSPA - Universidade Federal do Sul e Sudeste do Pará

Fil: Cassinotti, Luis Roberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil: Bianchi, Mariana. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Las endotelinas (ET) son moléculas con importantes funciones en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Sus roles fueron analizados tanto en colon normal como en el patológico, incluyendo además el estudio de los péptidos natriuréticos (NP) ANP y CNP. ET-1 es la principal isoforma en el colon distal, mientras que la ET-2 predomina en el segmento proximal. El principal receptor de endotelinas es ETB, localizado principalmente en los núcleos de células de la mucosa. El receptor ETA exhibe niveles débiles de expresión génica aunque presenta una amplia localización. Los resultados revelaron que tanto las ET como los NP exhiben una distribución que permite postular que estarían involucrados en el mantenimiento de las propiedades mecánicas de las criptas de colon. Para la inducción del cáncer colorrectal murino (CCR), se utilizaron azoximetano y sulfato de sodio dextrano. Las muestras se tomaron en la cuarta, octava, decimosexta y vigésima semana. La progresión tumoral, generada principalmente en el colon distal, se observó mediante técnicas histológicas. Además, se utilizó microscopía de generación de segundo armónico, para analizar la disposición de las fibras de colágeno en la matriz extracelular. En el CRC, el hallazgo más relevante es la remisión temprana de la expresión de ET-2 en el colon distal. Aunque ET-1 no mostró modificaciones relevantes, hubo un aumento en la expresión de ETA y una disminución del receptor de depuración, ETB, que podría potenciar la actividad de ET-1. El CNP mostró aumentos sostenidos en su expresión, lo que sugiere que podría actuar contrarrestando los roles de las ET. Endothelins (ET) are molecules with important roles in physiological and pathophysiological processes. Their roles were analyzed both in normal and pathological colon. The study of the natriuretic peptides (NP) ANP and CNP, their natural antagonists, was included. ET-1 is the major isoform found in the distal colon, while ET-2 predominates in the proximal segment. The main endothelin receptor is ETB, which is mainly located in the nuclei of mucosal cells. The ETA receptor exhibits weak levels of gene expression although depicts a widespread localization. In summary, the results revealed that both ET and NP exhibit a distribution that allows postulating that they would be involved in maintaining the mechanical properties of the colon crypts. For the induction of murine colorectal cancer (CRC), azoxymethane and dextran sodium sulfate were used. Samples were taken at the fourth, eighth, sixteenth and twentieth weeks. The tumor progression, mainly generated in the distal colon, was observed by classical histological techniques. Also, second harmonic generation microscopy, was used to analyze the collagen fibers arrangement in the extracellular matrix. In the induced CRC, the ET profile exhibit differential changes in its expression levels. The most relevant finding is the early ET-2 expression remission in the distal colon. While ET-1 did not exhibit relevant modifications, there was an increase in the ETA expression and a decrease in the clearance receptor, ETB, that could enhance ET-1 activity. CNP showed sustained increases in gene expression in distal colon, suggesting that it could act counteracting the roles of ET family. Universidad Nacional de Entre Ríos Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Orientador: Prof. Dr. Aleksander Roberto Zampronio Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa : Curitiba, 30/11/2018 Inclui referências: p.78-95 Resumo: A sepse representa uma resposta imune desregulada à infecção, com altas taxas de mortalidade e pode progredir para choque séptico. Mostramos anteriormente que o tratamento por via oral com o antagonista do receptor canabinóide CB1, rimonabanto, reduziu as taxas de mortalidade em animais com sepse induzida por ligadura e punção do ceco (CLP). Essa melhora na taxa de sobrevida parece estar relacionada a um aumento nos níveis de arginina vasopressina (AVP) circulantes 12 h após a CLP. O presente estudo investigou os efeitos periféricos do tratamento com rimonabanto na disfunção de órgãos, parâmetros hematológicos e reatividade vascular em ratos Wistar machos com sepse induzida por CLP. Além disso, o presente estudo buscou compreender o efeito do bloqueio central do sistema endocanabinóide e do sistema endotelinérgico durante a sepse. Para este fim, avaliamos o efeito do bloqueio do receptor CB1 na taxa de sobrevida de ratos submetidos à sepse por CLP, o efeito do bloqueio do receptor CB1 e o bloqueio do receptor ETA na temperatura da cauda em ratos com sepse, o efeito da sepse nos níveis de anandamida (AEA) e 2 araquidonilglicerol (2-AG) no hipotálamo, o efeito do antagonista de receptor ETA BQ123, nos níveis de endocanabinóides (eCB) no hipotálamo em ratos sépticos e o efeito do bloqueio do receptor CB1, com AM 251 na variação da temperatura da cauda após a administração de AVP. Os resultados que avaliaram o efeito periférico do bloqueio dos receptores CB1, demonstraram que o tratamento com rimonabanto por via oral (10 mg/kg, 4 h após CLP) aboliu o aumento nos níveis plasmáticos de lactato, lactato desidrogenase (LDH), glicose e creatinina quinase MB (CK-MB) sem alterar os parâmetros hematológicos, como leucopenia e redução da contagem de plaquetas. O tratamento com rimonabanto também não alterou o aumento dos níveis de nitrato/nitrito (NOx) induzido pela sepse, mas reduziu a vasoconstrição induzida pela sepse na artéria da cauda. Ainda, o tratamento com rimonabanto também atenuou a hiperreatividade à AVP sem afetar a hiporresponsividade à fenilefrina em anéis aórticos. O bloqueio, no sistema nervoso central, dos receptores CB1 utilizando os antagonistas de receptor CB1, o rimonabanto e o AM 251 preveniram a mortalidade induzida por CLP em ratos. Além disso, a CLP promoveu uma diminuição na temperatura da cauda dos ratos, e esta diminuição foi abolida após a administração do antagonista de receptor CB1, AM251 e após a administração de antagonista de receptor ETA, BQ123. A sepse aumentou os níveis de AEA no hipotálamo 6 h após a cirurgia, mas não alterou os níveis de 2-AG, e a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de BQ123, aboliu esse aumento. Além disso, a sepse induziu uma hiperresponsividade (vasoconstrição) da artéria caudal à injeção i.v. de AVP 24 h após a cirurgia que foi revertida pelo tratamento i.c.v. com AM 251 4 e 8 h após a CLP. Em conjunto, esses resultados sugerem que o rimonabanto reduz a disfunção de órgãos durante a sepse, e esse efeito pode estar relacionado à sinalização de AVP nos vasos sanguíneos. Este efeito pode ter contribuído para a maior taxa de sobrevida em animais sépticos tratados com agonista inverso/antagonista de receptor CB1. Além disso, é possível sugerir que o bloqueio dos receptores CB1 e ETA no sistema nervoso central (SNC), poderia ser benéfico durante a sepse e poderia representar um novo alvo para o tratamento da sepse. Palavras-chaves: Sepse. Endocanabinóides. Arginina-vasopressina. Endotelina- 1. Abstract: Sepsis is a life-threatening condition with high mortality rates that is caused by dysregulation of the host response to infection. We have previously reported that treatment by oral route with the cannabinoid CB1 receptor antagonist rimonabant reduced mortality rates in animals with sepsis that was induced by cecal ligation and puncture (CLP). This improvement in the survival rate appeared to be related to an increase in arginine vasopressin (AVP) circulating levels 12 h after CLP. The present study investigated the effects of rimonabant on organ dysfunction, hematologic parameters, and vascular reactivity in male Wistar rats with sepsis induced by CLP. In addition, the present study seeks to understand the effect of central blockade of the endocannabinoid system and endothelinergic system during sepsis. To this goal, we evaluated the effect of CB1 receptor blockade on the survival rate of rats submitted to CLP-induced sepsis, the effect of CB1 receptor blockade and ETA receptor blockade on skin temperature in rats with sepsis, the effect of sepsis in the anandamide (AEA) and 2- araquidonilglicerol (2-AG) levels of the hypothalamus and the effect of the administration of BQ123, an ETA receptor antagonist, at the levels of endocannabinoids (eCB) in the hypothalamus in septic rats and the effect of CB1 receptor antagonist, AM 251 on tail temperature variation after AVP administration. Results that evaluated the peripheral effect of CB1 receptor blockade demonstrated that the oral treatment with rimonabant (10 mg/kg, 4 h after CLP) abolished the increase in plasma levels of lactate, lactate dehydrogenase (LDH), glucose and creatinine kinase MB (CKMB) with no alterations in the hematological parameters, such as: leucopenia and reduction in platelet count. Treatment with rimonabant did not alter the increase in nitrate/ nitrite (NOx) levels induced by sepsis, but reduced vasoconstriction in the tail artery. In addition, treatment with rimonabant also attenuated hyperreactivity to AVP without affecting hyporesponsiveness to phenylephrine in aortic rings. The blockade of the CB1 receptors in the central nervous system, using the CB1 receptor antagonists rimonabant and AM 251 prevented CLPinduced mortality in rats. In addition, CLP promoted a decrease in rat skin temperature, and this decrease was abolished following administration of CB1 receptor antagonist, AM251 and following administration of ETA receptor antagonist, BQ123. Sepsis increased the levels of AEA in the hypothalamus 6 h after surgery but did not alter 2-AG levels, and intracerebroventricular (i.c.v) administration of BQ123 abolished this increase. In addition, sepsis induced hyperresponsiveness (vasoconstriction) of the tail artery to the i.v. injection of AVP 24 h after the surgery that was abolished by the i.c.v. treatment with AM 251 4 and 8 h after CLP. Taken together, these results suggest that rimonabant reduces organ dysfunction during sepsis, and this effect may be related to AVP signaling in blood vessels. This effect may have contributed to the higher survival rate in septic animals treated with CB1 receptor antagonist/inverse agonist. In addition, it is possible to suggest that the blockade of CB1 and ETA receptors in the central nervous system could be beneficial during sepsis and could represent a new target for the treatment of sepsis. Keywords: Sepsis. Endocannabinoids. Arginine vasopressin. Endotelin-1.

El objetivo del presente estudio fue cuantificar la contribución del sobrepeso en la magnitud de la lipemia posprandial en sujetos normolipídicos. Se incluyeron 33 adultos normolipídicos en dos grupos (n=20, sobrepeso y (n=13 eutróficos, 66% hombres, edad media 31,2±7,6 años). Se midió la vasodilatación mediada por flujo (VMF), la velocidad de onda de pulso (VOP), el perfil lipídico, el cociente Log TG/c-HDL, la glucosa y presión arterial tras una ingesta estándar con alto contenido de grasa (79% Kcal/grasa). Se calculó, el Z-score de riesgo cardiovascular a partir de la suma de los residuos tipificados (Z) de las variables de riesgo cardiovascular. El estado de lipemia posprandial se midió en ayuno (0 min) y a los (60, 120, 180, y 240 min) posprandiales. El valor basal de la VMF y la VOP fue de 6,9±5,9% y 7.0±0.8 m/s, respectivamente. Se identificó que la lipemia posprandial reducía la WMF en 19,2% a los 60 min (5,9±1,5%) y a los 240 min (3,7±1,2%) (p

Los gliomas de alto grado son los tumores cerebrales primarios másfrecuentes y son altamente agresivos e invasivos. Éstos parecen exhibir unaorganización jerárquica y se ha postulado que su generación ocurre a partir decélulas madre tumorales (CMT), las cuales corresponderían a una subpoblaciónminoritaria capaz de generar y propagar tumores al ser inyectadas en ratonesinmunodeficientes. De esta forma, el aislamiento y la caracterización de célulastumorales derivadas de pacientes con fenotipo de células madre o progenitoraspermite contar con un valioso modelo de estudio para comprender en mayorprofundidad la biología de los gliomas. En el presente trabajo logramos establecer con éxito nueve líneas decélulas madre/progenitoras tumorales (CMPT) a partir de biopsias de gliomas dealto grado. Éstas fueron capaces de generar tumores luego de ser inyectadas enel sistema nervioso central en ratones inmunodeficientes y presentaron lasmismas alteraciones genéticas que se encontraron en los tumores parentales. Además, todas ellas fueron positivas para los marcadores de CMT: Nestina, Vimentina, CD44 y Sox2. Sin embargo, el grado de expresión de CD133 resultóser variable en todas las líneas analizadas. A pesar de las similitudes entre las CMPT y las células madre neurales, esconcebible pensar que pueden existir diferencias en sus respectivos potencialesde diferenciación. Para responder este interrogante hemos sometido a estaslíneas celulares a diversos protocolos de diferenciación basados principalmente enel agregado de BMP4 recombinante humano y en la deprivación de factores decrecimiento. Luego de analizar la expresión de distintos marcadores de diferenciación y de evaluar cambios en la morfología celular, determinamos queestas líneas de CMPT poseen un grado variable de multipotencia, en donde cadauna de ellas presenta un grado de compromiso particular hacia los linajesastroglial y neuronal. Además, pudimos observar que la adición de BMP4recombinante redujo marcadamente la tasa de proliferación de todas las líneascelulares estudiadas. Por último, hemos determinado los niveles de expresión del ARNm de distintos ligandos y receptores involucrados en la señalizacióndependiente de BMPs en seis líneas de CMPT, encontrando en ellas ciertospatrones de expresión característicos. Dado que las CMT probablemente dependan de determinadas señales delmicroambiente tumoral para mantener su identidad, un tratamiento efectivo podríabasarse en el bloqueo de mediadores generados en el nicho perivascular. Por estemotivo y dado el gran potencial de este modelo experimental para el testeo dedrogas, decidimos estudiar los niveles de expresión de los ARNm de loscomponentes del eje endotelinérgico en diferentes líneas de CMPT. Pudimosobservar que todas las líneas celulares analizadas mostraron una expresiónelevada de los transcriptos del receptor ETRB, mientras que el grado de expresiónde los componentes restantes del sistema fue dependiente de cada línea celular. Más aún, en dos de cuatro líneas analizadas, el agregado de endotelinasrecombinantes produjo una disminución significativa de los niveles de apoptosisgenerados en condiciones de deprivación de factores de crecimiento y nutrientes. Dada la variabilidad observada en las respuestas celulares a diferentestratamientos en las distintas líneas de CMPT, este trabajo pone de menifiesto larelevancia de contar con un modelo in vitro basado en cultivos derivados degliomas que permita contribuir al desarrollo de terapias personalizadas. High grade gliomas are the most frequent and malignant primary braintumors in adults and appear to have a hierarchical organization suggestive of astem cell foundation. Glioma stem cells (GSC) have been recently isolated fromtumors of patients and were characterized as a small subset of stem-like tumorcells capable of initiating and sustaining tumor growth when grafted into mice. Thus, isolation and expansion of these putative cancer stem/progenitor cells,harboring tumor-specific phenotypes, constitutes a powerful model to study gliomabiology. Significantly, GSC lines from different tumors exhibit divergent geneexpression signatures and distinct differentiation behavior. In the present study, we successfully established nine gliomastem/progenitor cell (GSPC) lines obtained from malignant gliomas which displaystem cell properties and initiate high-grade gliomas following xenotransplantation. Importantly, all the established cell lines presented the same genomic alterationsas parental tumors. Additionally, they were all positive for the stem cell markers: Nestin, Vimentin, CD44 and Sox2. In contrast, CD133 expression levels widelyvaried among GSPC lines. Despite similarities between GSPC and normal neural stem cells, wehypothesized that there may be differences in their differentiation potentials. Toaddress this issue, first, we exposed these cell lines to several differentiationconditions that principally include BMP4 treatment and growth factors withdrawal. After analyzing the expression of various markers of differentiation and assessingchanges in cell morphology, we determined that these GSPC lines possess avarying degree of multipotency. Moreover, we observed that the addition of recombinant BMP4 markedly reduced the rate of proliferation of all the studied celllines. Finally, we determined the expression levels of different ligands andreceptors involved in BMP-signaling, and found that the GSPC lines showcharacteristic patterns of expression. As many cancer stem cells might depend on a niche to maintain theiridentity, targeting molecules triggered by the perivascular niche could be a strategyto deplete or differentiate them. For this reason and given the potential of thepresent experimental model for drug screening, we studied the expression profileof the endothelin (EDN) axis members in different GSPC lines grown in vitro. Ourfindings revealed that all tested cell lines robustly express ETRB receptor. Nevertheless, the expression levels of the other components of this axis resultedcell line specific. Furthermore, in two from four GSPC lines, the addition ofrecombinant EDNs (1, 2 and 3) reduced apoptotic rates upon qrowth factors andnutrients withdrawal. Given the diversity of the responses displayed by patient-derived CSC lines,the present study highlights the relevance of the in vitro model presented herein forthe development of tailor-made therapies. Fil: Videla Richardson, Guillermo Agustín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Orientador : Prof. Dr. Aleksander Roberto Zampronio Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 30/06/2014 Inclui referências Resumo: Estudos prévios demonstraram que a endotelina-1(ET-1) reduziu a frequência de correntes excitatórias espontâneas em células magnocelulares de ratos através da ativação de receptores ETA. Como se obteve uma redução na frequência de disparo e não na amplitude das correntes, esses dados sugeriram um efeito pré-sináptico. Além disso, o antagonista canabinóide CB1 aboliu esse efeito sugerindo um envolvimento dos endocanabinóides (eCB). Estudos anteriores demonstraram também que durante a sepse ocorre um aumento nos níveis de eCB e ET-1. Deste modo aventamos a hipótese de que durante a sepse severa, a ET-1 por meio da ativação do receptor ETA induz uma liberação de eCB, os quais causariam uma diminuição dos níveis de arginina vasopressina (AVP), e isso poderia contribuir para o aumento da mortalidade nesta condição clínica. A sepse foi induzida em ratos Wistar machos (180-200g) por ligação e punção do ceco (CLP). Uma curva de sobrevida utilizando 1, 3 e 9 furos foi feita com o objetivo de determinar o número de furos necessários para induzir sepse severa. Na curva de sobrevida, os ratos com 1,3 e 9 furos, apresentaram uma taxa de sobrevida de 84%, 26% e 0%, respectivamente. O número de furos escolhido para os experimentos subsequentes foi 3. Nos experimentos subsequentes, os animais foram tratados com antagonista do receptor CB1 rimonabanto (10 mg/kg ou 20 mg/kg, p.o.) 4 h após a CLP ou antagonista de receptor ETA BQ123 (100 pmol i.c.v.), 2h e 4h, 4 e 8 h, e 8 h após a CLP ou com antagonista de receptor ETB BQ 788 (100 pmol, i.c.v.), 4 e 8 h após a CLP e a sobrevida foi analisada por 7 dias. Os animais tratados com Rim (10 mg/kg e 20 mg/kg) apresentaram um aumento na taxa de sobrevida em relação ao grupo CLP/veículo. No tratamento com BQ 123, 2 e 4h ou 8 h após a CLP, os animais não apresentaram um aumento na taxa de sobrevida. Por outro lado, no tratamento com BQ123 4 e 8 h após a CLP, houve um aumento significativo na taxa de sobrevida em relação ao grupo controle (CLP/veículo). Diferentemente, o tratamento dos animais com BQ788, 4 e 8 h após a CLP não modificou a taxa de sobrevida dos animais. Para a medida da temperatura corporal (Tc), 5 dias antes da CLP, registradores de temperatura foram implantados na cavidade peritoneal dos animais. A Tc foi medida em intervalos de 30 min, 2 h antes até 12 h após a CLP. Na avaliação da temperatura, a CLP induziu um aumento da temperatura corporal dos animais e o rimonabanto reduziu este aumento a níveis similares àqueles observados para o grupo falso-operado. Para a avaliação da migração celular, após o tratamento com antagonista de receptor CB1 ou com veículo foi realizada a coleta do exsudato peritoneal dos animais 8 h após a CLP e posteriormente foi feita a contagem global e diferencial de leucócitos. A CLP induziu um aumento significativo na migração de leucócitos, particularmente neutrófilos para a cavidade peritoneal dos animais. O tratamento dos animais com rimonabanto não alterou a migração celular para o peritôneo. Ainda, foi realizada a coleta de sangue dos animais por punção cardíaca 2, 4, 6, 8 e 12 h após a CLP, juntamente com o tratamento dos animais com rimonabanto 4 h após a CLP ou com BQ123 4 e 8 h após a CLP. O número de leucócitos circulantes foi avaliado em todos os tempos, enquanto que os níveis circulantes de interleucina-6 (IL-6) foram avaliados 6 e 8 h após a CLP e os níveis de AVP foram avaliados 6, 8 e 12 h após a CLP. Não foram encontradas diferenças significativas no número de leucócitos circulantes 2 h após a CLP. Na contagem global e diferencial de leucócitos circulantes 4h após a CLP foi observado neutropenia do grupo CLP/veículo em relação ao sham e após 6h foi observado leucopenia decorrente de neutropenia e linfopenia do grupo CLP/veículo. O tratamento com rimonabanto não modificou nenhum destes parâmetros. Em relação à dosagem de IL-6, 6 e 8 h após a CLP houve um aumento nos níveis plasmáticos de IL-6 e o tratamento dos animais com rimonabanto também não modificou este aumento. Na avaliação da dosagem de AVP, após 12 h os grupos CLP/Rim e CLP/BQ123 apresentaram aumento dos níveis de AVP comparado aos grupos CLP/Veículo. Para a análise estatística das curvas de sobrevida foi realizado teste de log rank. Para os testes de migração, leucometria, níveis de AVP e níveis de IL-6 foi realizada ANOVA de uma via seguido pelo teste de Bonferroni, enquanto que para os testes de temperatura foi utilizada ANOVA de duas vias seguido do teste de Bonferroni. Estes dados sugerem que o bloqueio de receptores CB1 e de receptores centrais ETA previne a mortalidade induzida por CLP em ratos. O bloqueio dos receptores CB1, não alterou respostas periféricas como migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal, contagem global e diferencial de leucócitos e níveis de IL-6 mas reduziu a resposta febril e alterou os níveis de AVP no plasma sugerindo uma ação central desse antagonista. Nossos resultados mostram que o bloqueio de receptores centrais ETA e CB1 aumentam os níveis de AVP na fase tardia da sepse induzida por CLP e este efeito está relacionado a um aumento da sobrevida dos animais após a administração desses antagonistas. Palavras-chaves: sepse, endocanabinóides, arginina-vasopressina e endotelina-1. Abstract: Previous studies have shown that endotelin-1 (ET-1) was able to reduce the frequency of spontaneous excitatory currents in magnocellular cells of rats through activation of ETA receptors. As there was a reduction in the firing frequency and not at the amplitude of the currents, the data suggested a presynaptic effect. Further, the CB1 antagonist abolished this inhibitory effect suggesting the involvement of endocannabinoids (eCB). Previous studies also demonstrated that during sepsis there was an increased of ET-1 and eCB levels. Thus we hypothesized that during severe sepsis, ET-1 through the activation of the ETA receptor induces a release of eCB, which would cause a decrease in the levels of arginine vasopressin (AVP), and this could contribute to increased mortality in this condition. Sepsis was induced in Male Wistar rats (180-200g) by cecal ligation and puncture (CLP). A survival curve was performed using 1, 3 and 9 punctures in order to determine the number of punctures needed to induce severe sepsis. In the survival curve, the animals with 1, 3 and 9 punctures presented a survival rate of 84 %, 26 % and 0 %, respectively. The number of punctures chosen for the subsequent experiments was 3. In subsequent experiments, animals were treated with CB1 receptor antagonist rimonabant (Rim, 10 mg/kg or 20 mg/kg, by oral route) 4 h after CLP or receptor antagonist BQ123 ETA (100 pmol icv), 2h and 4h, 4 and 8 h and 8 h after CLP or ETB receptor antagonist BQ 788 (100 pmol, icv), 4 and 8 h after CLP and survival was assessed for 7 days. Animals treated with Rim (10 mg/kg and 20 mg/kg) showed an increase in survival compared to the CLP group / vehicle. In the treatment with BQ 123, 2 and 4 h or 8 h after CLP, the animals did not show an increase in survival. Moreover, in the treatment with BQ123, 4 h and 8 h after CLP, there was a significant increase in survival compared to the control group (CLP/vehicle). In contrast, treatment of animals with BQ788, 4 and 8 h after CLP did not alter the survival rate of the animals. To measure body temperature (Tc), 5 days before CLP, temperature recorders were implanted in the peritoneal cavity of animals. The Tc was measured at intervals of 30 min, 2 h before until 12 h after CLP. In assessing the temperature, CLP induced an increase in body temperature of the animals and Rimonabant reduced this increase to levels similar to those observed in the sham group. For the assessment of cell migration after treatment with CB1 receptor antagonist or with vehicle, collecting the peritoneal exudate of the animals was performed 8 h after CLP and the global leukocyte count and differential was performed. The CLP induced a significant increase in the migration of leukocytes, particularly neutrophils into the peritoneal cavity of the animals. Treatment with rimonabant did not alter the cell migration into the peritoneum. The collection of blood from the animals by cardiac puncture 2, 4, 6, 8 and 12 h after CLP was performed, along with the treatment of animals with rimonabant, 4 h after CLP or BQ123, 4 and 8 h after CLP. The number of circulating leukocytes was assessed at all times while circulating levels of interleukin-6 (IL-6) were evaluated 6 and 8 h after CLP and levels of AVP were evaluated 6, 8 and 12 h after CLP. Treatment with rimonabant did not modify any of these parameters. Regarding IL-6, 6 and 8 h after CLP there was an increase in plasma levels of IL-6 and rimonabant treatment of animals also did not change with this increase. In assessing the dosage of AVP, 12 h after CLP, CLP/Rim and CLP/BQ123 groups showed increased levels of AVP compared with CLP/vehicle group. For statistical analysis of survival curves was performed log rank test. For tests of cell migration, leukocyte count, and measurement of AVP and IL-6 one- way ANOVA followed by Bonferroni test was performed. And for temperature, two-way ANOVA followed by Bonferroni test was used. We have shown in this study that the blockage of CB1 receptors and central ETA receptors prevented the mortality induced by CLP in rats. These data suggest that blockade of central CB1 receptors and ETA receptors prevent CLP-induced mortality in rats. Blockade of CB1 receptors, did not alter peripheral responses such as neutrophil migration into the peritoneal cavity, global and differential leukocyte count and IL-6 but reduced the febrile response and altered levels of AVP in plasma suggesting a central action of this antagonist. Our results show that the blockage of central ETA and CB1 receptors and increase levels of AVP in the late phase of CLP induced sepsis and this effect is related to an increased survival of the animals after administration of these antagonists. Keywords: Sepsis, endocannabinoids, arginine vasopressin and endotelin-1

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014. A dipirona foi introduzida na prática clínica em 1922. Entretanto, apesar dos mais de 90 anos de uso, o seu mecanismo analgésico ainda não foi completamente elucidado. Como já foi demonstrado que a febre induzida por ET-1 é bloqueada pelo tratamento sistêmico com dipirona, neste trabalho avaliamos a capacidade da dipirona e dos seus metabólitos, 4-AA e 4-MAA, de atenuar a nocicepção aguda e hiperalgesia mecânica induzidas pela administração de ET-1. Camundongos receberam uma injeção de ET-1 (10 pmol) na pata traseira direita e, por 30 min, foi cronometrado o tempo gasto lambendo a pata injetada como índice de nocicepção declarada. Em seguida, os animais foram eutanaziados e as patas, coletadas para determinação do edema. Em outro experimento, os animais foram avaliados entre 30 min e 5 h após a injeção de ET-1 através do número de reações de retirada da pata após 10 aplicações do filamento de Von Frey (0,6 g) em intervalos de 30 s, com o objetivo de determinar a hiperalgesia mecânica. O tratamento com a dipirona e seus metabólitos foi feito pelas via sistêmica (i.p., 30 min antes da ET-1), local (s.c. na pata, 20 min antes da ET-1) ou central (i.t.; 15 min antes da ET-1). Foi realizada determinação da atividade da MPO, contagem de células inflamatórias e quantificação dos níveis das citocinas IL-1ß e IL-10 na pele da pata dos animais 15 min ou 4 h após a administração de ET-1. Na nocicepção aguda, todas as substâncias foram efetivas, mas apenas através das vias i.p. e i.t., sendo que a administração de doses semelhantes dos dois metabólitos sugere que a 4-AA é mais efetiva que a 4-MAA. Nenhum tratamento apresentou efeito anti-edematogênico. Na hiperalgesia mecânica o tratamento pelas vias i.p., s.c. e i.t. mostrou efeito anti-hiperalgésico, mas apenas a dipirona e a 4-MAA foram efetivas. A administração de ET-1 não provocou aumento da atividade de MPO ou induziu migração de células inflamatórias para o sítio da administração, mas aumentou os níveis de IL-1ß apenas 4 h após a administração do peptídeo, mostrando sua importância para o estabelecimento da hiperalgesia mecânica, mas não da nocicepção aguda. Os níveis de IL-10, contudo, não foram alterados. O pré-tratamento i.p. com dipirona ou 4-MAA reduziu esses níveis, mas a 4-AA não surtiu efeito. Portanto, o efeito antinociceptivo da dipirona e de seus metabólitos na nocicepção aguda induzida por ET-1 é principalmente central, enquanto que o efeito anti-hiperalgésico é resultante de fatores centrais e locais que envolvem a ação de IL-1ß, provavelmente de células locais e residentes. Abstract : Dipyrone was introduced into the clinical practice in 1922. However, despite of being used for over 90 years, the mechanism of its analgesic action still has not being completely elucidated. As it was already shown ET-1-induced fever is blocked by systemic pre-treatment with dipyrone, in this study we evaluated the ability of dipyrone and its main metabolites, 4-AA, and 4-MAA, to attenuate ET-1-induced acute nociception and mechanical hyperalgesia Mice received an s.c. ET-1 injection (10 pmol) into the right hindpaw and the time spent licking the injected paw was determined throughout a period of 30 min. By the end of the test the animals were euthanized and the paws were collected for oedema determination. In another set of experiments, animals were evaluated from 30 min up to 5 h after ET-1 administration for mechanical hyperalgesia through the number of paw withdrawal after 10 applications of a von Frey filament (0,6 g) in 30 s intervals. Pre-treatment with dipyrone and its metabolites was done through the systemic (i.p., 30 min before ET-1), local (s.c., 20 min before ET-1) or central (i.t., 15 min before ET-1) routes. Inflammatory cells migration was determined through histology with HE colouring and quantification MPO activity. The quantification of the cytokines IL-1ß and IL-10 was also performed. In the acute nociception all the drugs were effective, but only the i.p. and i.t. routes. The administration of similar doses of the metabolites suggests that 4-AA is more effective than 4-MAA. No treatment showed anti-oedematogenic effects. Mechanical hyperalgesia was attenuated through all the treatment routes, but only dipyrone and 4-MAA were effective. ET-1 did not cause increase in MPO activity or induced inflammatory cell migration, but increased IL-1ß levels (only 4 h after ET-1, which shows that this cytokine is important for the establishment of mechanical hyperalgesia). IL-10 levels remained unaffected. The IL-1ß levels were diminished only in animals pre-treated with i.p. dipyrone or 4-MAA. Therefore, the antinociceptive effect of dipyrone and its metabolites in acute nociception induced by ET-1 results mainly from central action, while the anti-hyperalgesic effects appeared from a combination of central and local components, involving IL-1ß liberation, most likely from local and resident cells. Thus, we showed evidences that indicate a new mechanism through which dipyrone may act as an analgesic drug.

Auriculocondylar syndrome (ACS) is a rare craniofacial disorder with mandibular hypoplasia and question-mark ears (QMEs) as major features. QMEs, consisting of a specific defect at the lobe-helix junction, can also occur as an isolated anomaly. Studies in animal models have indicated the essential role of endothelin 1 (EDN1) signaling through the endothelin receptor type A (EDNRA) in patterning the mandibular portion of the first pharyngeal arch. Mutations in the genes coding for phospholipase C, beta 4 (PLCB4) and guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha inhibiting activity polypeptide 3 (GNAI3), predicted to function as signal transducers downstream of EDNRA, have recently been reported in ACS. By whole-exome sequencing (WES), we identified a homozygous substitution in a furin cleavage site of the EDN1 proprotein in ACS-affected siblings born to consanguineous parents. WES of two cases with vertical transmission of isolated QMEs revealed a stop mutation in EDN1 in one family and a missense substitution of a highly conserved residue in the mature EDN1 peptide in the other. Targeted sequencing of EDN1 in an ACS individual with related parents identified a fourth, homozygous mutation falling close to the site of cleavage by endothelin-converting enzyme. The different modes of inheritance suggest that the degree of residual EDN1 activity differs depending on the mutation. These findings provide further support for the hypothesis that ACS and QMEs are uniquely caused by disruption of the EDN1-EDNRA signaling pathway.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 Embora alguns estudos impliquem as endotelinas na patogênese das doenças inflamatórias intestinais (IBDs), as evidências disponíveis sobre a participação destes mediadores na progressão ou na manutenção da resposta inflamatória do cólon ainda são escassas. Neste sentido, o presente estudo tem como objetivo investigar se o tratamento terapêutico com antagonistas seletivos para os receptores ETA ou ETB poderia reverter ou atenuar a progressão de sinais e sintomas da colite experimental induzida por TNBS em camundongos, incluindo a dor visceral associada a esta condição, bem como identificar alguns dos mecanismos de ação envolvidos. Também foi avaliado se o atrasentan (antagonista do receptor ETA) seria capaz de minimizar parâmetros inflamatórios em outro modelo experimental, o de colite causada por sulfato sódico de dextrana (DSS). A instilação de TNBS (1,5 mg por animal) induziu perda de peso corporal, alta mortalidade e danos macro e microscópicos no cólon, associados a acúmulo de neutrófilos, aumentos da atividade da enzima MPO, dos níveis de IL-1?, MIP-2 e KC, da expressão de moléculas de adesão e do RNAm para receptores ETA e ETB no cólon dos animais. O TNBS ainda reduziu os níveis das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-13, e alterou a expressão de RNAm para prepro ET-1 e prepro ET-2 no tecido, além de causar (na dose de 0,5 mg) hiperalgesia mecânica na parede abdominal e pata traseira. O tratamento com atrasentan (10 mg/kg/dia, e.v.), iniciado 24 h após o TNBS, reduziu marcadamente todos esses efeitos do TNBS, exceto as alterações de IL-13 e da expressão de RNAm para prepro ET-1 e prepro ET-2. Em contraste, em todos os ensaios com TNBS em que foi testado, o tratamento semelhante com A192621 (antagonista do receptor ETB) não mostrou qualquer efeito. O atrasentan foi ainda capaz de reduzir diversos parâmetros inflamatórios avaliados no modelo de DSS. Além disso, em leucócitos peritoniais estimulados com LPS in vitro, a produção de MIP-2 e KC por macrófagos e de KC (mas não IL-1 ) por neutrófilos foi bloqueada por um antagonista do receptor ETA. Este conjunto de resultados demonstra que o bloqueio seletivo do receptor ETA mostra-se eficaz em reduzir a inflamação colônica nos modelos de colite induzida por TNBS e DSS, sugerindo que antagonistas deste receptor possam ser úteis no tratamento das doenças inflamatórias intestinais.

A cardiopatia chagásica, desenvolvida após a infecção pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é uma doença inflamatória crônica. Apresenta alterações vasculares significativas, a ponto de conduzir o hospedeiro vertebrado ao óbito. Múltiplos fatores parecem contribuir para os eventos cardiovasculares na doença de Chagas, mas a resposta imune do hospedeiro aparece como essencial tanto em modelo humano quanto experimental. Em particular, a produção de quimiocinas e de outros mediadores inflamatórios têm apresentado grande relevância na alteração da homeostase e contribuído para o recrutamento leucocitário, eventos primordiais para a patogênese da doença de Chagas. Conhecendo-se a precária situação nutricional das populações negligenciadas em áreas endêmicas para a doença de Chagas, e também a relação direta entre fatores nutricionais e a resposta imune do hospedeiro, este trabalho objetivou avaliar a interferência da deficiência protéica na resposta inflamatória cardíaca em modelo experimental da doença de Chagas. Utilizando-se ratos Fisher machos, induzimos uma desnutrição protéica nesses animais, seguida de infecção pelo Trypanosoma cruzi (cepa Y) e avaliamos a síntese da quimiocina Fractalquina/CX3CL1 e do peptídeo endotelina associados à lesão cardíaca durante as fases aguda e crônica da doença de Chagas. Observou-se que a deficiência protéica foi capaz de potencializar a síntese sistêmica de CX3CL1 e de endotelina, tanto na fase aguda quanto crônica da doença de Chagas, porém não foi capaz de controlar o aumento da carga parasitária na circulação sanguínea. Nossos dados mostram, pela primeira vez, a presença da CX3CL1 durante a infecção pelo Trypanosoma cruzi. E ainda, demonstrou a importância do estado nutricional do hospedeiro nas alterações imunes, pertinentes à doença de Chagas, no modelo experimental, sugerindo que a médio ou longo prazo, tais alterações poderiam contribuir para a progressão clínica da doença. Chagas' heart disease developed after Trypanosoma cruzi infection, is a chronic inflammatory disease. It presents significant vascular changes, the point of driving the vertebrate host to death. Multiple factors seem to contribute to cardiovascular events in Chaga's disease, but the host immune response appears to be essential both in human and experimental model. In particular, the production of chemokines and other inflammatory mediators have shown great importance in altering the homeostasis and contributing to leukocyte recruitment, events essential for the pathogenesis of the disease. Knowing the precarious nutritional situation of neglected populations in areas endemic for Chaga’s disease, and also the direct relationship between nutritional factors and host immune response, this study aimed to evaluate the role of protein deficiency in the inflammatory response rate during an experimental model of disease. Using Fisher male rats, we induced proteic malnutrition in these animals, followed by infection with Trypanosoma cruzi (Y strain) and evaluated the synthesis of the chemokine Fractalkine/CX3CL1 and peptide endothelin associated with cardiac injury during the acute and chronic phases of Chaga’s disease. It was observed that protein deficiency was able to enhance the systemic synthesis of CX3CL1 and endothelin in both acute and chronic Chaga’s disease, but was not able to control the increase in parasite load in the bloodstream. Our data show for the first time, the presence of CX3CL1 during infection with Trypanosoma cruzi. Also, we demonstrated the importance of nutritional status in the host immune changes, relevant to Chaga's disease in the experimental model, suggesting that the medium to long term, such changes could contribute to the progression of the disease.

Endothelins (ETs) and sarafotoxins (SRTXs) belong to a family of vasoconstrictor peptides, which regulate pigment migration and/or production in vertebrate pigment cells. The teleost Carassius auratus erythrophoroma cell line, GEM-81, and Mus musculus B16 melanocytes express rhodopsin, as well as the ET receptors, ETB and ETA, respectively. Both cell lines are photoresponsive, and respond to light with a decreased proliferation rate. For B16, the doubling time of cells kept in 14-h light (14L):10-h darkness (10D) was higher compared to 10L:14D, or to DD. The doubling time of cells kept in 10L:14D was also higher compared to DD. Using real-time PCR, we demonstrated that SRTX S6c (12-h treatment, 100 pM and 1 nM; 24-h treatment, 1 nM) and ET-1 (12-h treatment, 10 and 100 pM; 24- and 48-h treatments, 100 pM) increased rhodopsin mRNA levels in GEM-81 and B16 cells, respectively. This modulation involves protein kinase C (PKC) and the mitogen-activated protein kinase cascade in GEM-81 cells, and phospholipase C, Ca(2+), calmodulin, a Ca(2+)/calmodulin-dependent kinase, and PKC in B16 cells. Cells were kept under constant darkness throughout the gene expression experiments. These results show that rhodopsin mRNA levels can be modulated by SRTXs/ETs in vertebrate pigment cells. It is possible that SRTX S6c binding to the ETB receptors in GEM-81 cells, and ET-1 binding to ETA receptors in B16 melanocytes, although activating diverse intracellular signaling mechanisms, mobilize transcription factors such as c-Fos, c-Jun, c-Myc, and neural retina leucine zipper protein. These activated transcription factors may be involved in the positive regulation of rhodopsin mRNA levels in these cell lines.

Rodríguez Puyol, Manuel, tutor, El enzima de conversión de la endotelina-1, ECE-1 es una proteína clave en la regulación de la endotelina por parte de las células endoteliales. El objetivo de la tesis es estudiar su regulación fisiológica o farmacológica y su importancia en el desarrollo de aterosclerosis. Mediante experimentos realizados in Vitro e in vivo, utilizando ratones deficientes en APO E, o células circulante de sangre periférica extraídas de pacientes hipercolesterolémicos, se estudia el efecto sobre su expresión de inhibidores farmacológicos, del óxido nítrico y de las LDL oxidadas. Los resultados muestran una compleja regulación: 1. Los inhibidores de la actividad ECE-1, aumentan la expresión de la proteína, al aumentar los niveles del precursor inactivo, Big endotelina 1, 2. Los donadores de óxido nítrico, inducen una reducción en la cantidad de la enzima, desestabilizando su ARN mensajero. 3. El incremento de LDL oxidadas, observado en la aterosclerosis, produce un incremento en los niveles de ECE-1. Este aumento puede ser, en parte responsable de la hipertensión que se produce en ratones o pacientes hipercolesterolémicos. En conclusión, la compleja regulación de ECE-1 en la que se encuentran implicados metabolitos de la cascada de síntesis de la propia endotelina y otros autacoides endoteliales, apoya la relevancia fisiológica de la enzima en la modulación de la función vascular. Por otro lado, ECE-1 puede ejercer un papel patogénico en la generación de alteraciones estructurales y funcionales de la aterosclerosis y puede constituir una diana terapéutica valiosa en el control de este proceso.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. The nociceptive effects of Endothelin-1 (ET) are well-known. This peptide is synthesized by cleavage of Big ET-1 by Endothelin Converting Enzyme (ECE), however, Big ET-1 can be also cleaved by mast cell-derived chymase to ET-1(1-31), which can be converted to ET-1 by the enzyme neutral endopeptidase-24.11 (NEP). The present study aimed to assess, pharmacologically, the ability of ET-1(1-31) to induce nociception and mechanical hypernociception in the hind paw of mice and compare its effects with those evoked by ET-1 and Big ET-1. The intra-plantar (i.pl) injection of ET-1 (3 to 30 pmol), ET-1(1-31) (30 to 100 pmol) or Big ET-1 (30 to 100 pmol) induced dose-dependent nociception and hypernociception. Local pretreatment of the animals with thiorphan (NEP inhibitor, 300 nmol, i.pl.) or phosphoramidon (NEP and ECE inhibitors, 100 nmol, i.pl.), reduced nociception induced by ET-1(1-31) (10 pmol) or by ET-1(1-31) and Big ET-1 (30 pmol), respectively. On the other hand, pre treatment with chymostatin (chymase inhibitor, 100 nmol) did not alter the nociception induced by ET-1, ET-1 (1-31) or Big ET-1. Mast cell degranulation by i.pl. injection of compound 48/80 (0.05 to 1 ìg) or OVA (0.05 to 1 ìg) also evoked nociception and mechanical hypernociception. The association of Big ET-1 (30 pmol) with sub-effective doses of compound 48/80 (0.1 ìg) or OVA (0.05 ìg) resulted in potentiation of Big-ET-1-induced nociception by 93.5% e 154%, respectively. Pre-treatment with phosphoramidon (100 nmol) or chymostatin (100 nmol) reduced the nociception induced by Big ET-1 associated with compound 48/80 or OVA, while thiorphan was only able to reduce the nociception induced by the association of Big ET-1 plus compound 48/80 at 1000 nmol. Nociception induced by compound 48/80 (1.0 ìg) and OVA (0.3 ìg) was reduced by pretreatment with phosphoramidon or chymostatin or BQ-123 (selective ETBAB receptor antagonist, 10 nmol), while BQ-788 (selective ETBBB receptor antagonist, 10 nmol) and thiorphan (1000 nmol) reduced only nociception induced by OVA and compound 48/80, respectively. The results of the current study suggest that ET-1, formed via an alternative synthesis pathway, which involves formation of the intermediary peptide ET-1(1-31), contributes significantly to nociception induced by the activation of mast cells.

Fatores neurotróficos determinam o desenvolvimento, diferenciação e manutenção de diferentes tipos de neurônios bem como a regeneração de fibras nervosas periféricas, salientando-se o papel do fator de crescimento neural (NGF). Pouco se sabe sobre os mecanismos que controlam a expressão destes fatores. Estudos recentes indicam papel relevante de endotelinas na expressão NGF, mas não há estudos sobre o papel de endotelinas durante a regeneração de fibras nervosas. Neste estudo, analisamos o efeito do bosentan, antagonista de receptores ET-A e ET-B de endotelinas, sobre a expressão de NGF no coração (átrios e ventrículos) e nas glândulas salivares submandibulares de ratos Holtzman jovens submetidos ou não à simpatectomia química por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). O tratamento com bosentan iniciou-se 2 dias antes da simpatectomia sendo mantido até às vésperas do sacrifício. Ratos controles foram tratados com veículos. A inervação simpática foi analisada através de técnica histoquímica para demonstração de catecolaminas baseada em fluorescência induzida por ácido glioxílico. A simpatectomia química gerou desaparecimento completo das terminações nervosas simpáticas no coração e glândulas submandibulares. Três dias após o tratamento com 6-OHDA, as glândulas submandibulares já apresentavam troncos nervosos e poucas terminações nervosas próximas a vasos sanguíneos. No coração o aparecimento de tais sinais de regeneração, ocorreu apenas no 7º dia após a simpatectomia e apenas nos átrios. As glândulas submandibulares, neste período, já apresentavam inervação próxima a animais controles com raras áreas ainda desnervadas. O tratamento com bosentan não alterou o quadro observado nos animais tratados apenas com veículo. Os níveis teciduais de NGF foram obtidos através de ELISA. O tratamento com bosentan impediu o aumento dos níveis atriais de NGF induzido pela simpatectomia, 7 dias após o tratamento com 6-OHDA. Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de NGF dos ventrículos e das glândulas submandibulares nos diferentes grupos. Nossos dados sugerem papel relevante de endotelinas pelo menos durante a fase inicial da regeneração de terminações simpáticas no coração.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. O presente estudo investigou a importância de receptores ETB para endotelinas na modulação da resposta de camundongos à aplicação de estímulos nociceptivos químico e térmico e mecânico não nociceptivo na pata traseira. A administração intraplantar de sarafotoxina S6c, um agonista seletivo de receptores ETB, causou hiperalgesia à formalina e à capsaicina e também causou alodinia mecânica, mas não afetou a reatividade à estimulação térmica. As curvas para estes efeitos da sarafotoxina S6c apresentaram formato de sino, ou seja, doses mais elevadas foram inefetivas em causar hiperalgesia química ou alodinia mecânica. Contudo, estas mesmas doses elevadas de sarafotoxina S6c apresentaram efeito hiperalgésico e alodínico quando administradas junto com naltrexona, um antagonista não seletivo de receptores opióides. Antagonistas seletivos de receptores opióides dos tipos m (CTOP ou naloxonazina) ou k (Nor-BNI), mas não d (naltrindole), também conferiram efeito hiperalgésico à sarafotoxina S6c sobre a segunda fase da resposta nociceptiva à formalina. Os resultados indicam que receptores ETB sensibilizam a pata de camundongos a estímulos nocivos químicos e mecânico não nocivo. Contudo, a intensidade desta influência hiperalgésica e alodínica dos receptores ETB é limitada pelo acoplamento adicional destes a um mecanismo analgésico envolvendo a ativação de um sistema opioidérgico local.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Este estudo avaliou as respostas nociceptivas evocadas por estímulos de diferentes modalidades em ratos submetidos à constrição do nervo infraorbital, um modelo de dor neuropática orofacial, bem como a participação das endotelinas e de seus receptores. A constrição do nervo infraorbital induziu hipernocicepção térmica (ao frio e ao calor) unilateral entre 2 e 12 dias, hipernocicepção mecânica bilateral a partir do 12º dia e potencializou a fase II da resposta à formalina (1%) 12, 20 e 40 dias após a cirurgia. A desnervação neonatal com capsaicina aboliu a hipernocicepção ao frio e ao calor por 6 e 8 dias, respectivamente, e reduziu em 60% a fase II da resposta à formalina. A hipernocicepção térmica foi resistente ao tratamento com AINEs (indometacina, 4 mg/kg e celecoxibe, 10 mg/kg), mas reduzida pelo tratamento com dexametasona (0,5 mg/kg), anticonvulsivantes (carbamazepina, oxcarbazepina e gabapentina, 3 a 30 mg/kg), cloridrato de morfina (2,5 mg/kg) ou de lidocaína (10 mg/kg). A hipernocicepção mecânica só foi modificada por estes dois últimos tratamentos. A injeção de ET-1 (10 pmol) no lábio superior de ratos não operados induziu hipernocicepção mecânica e térmica. Nestes animais, receptores ETA e ETB são expressos no gânglio do trigêmeo, e a expressão dos mesmos é aumentada 15 dias, mas não 4 dias, após a constrição do nervo infraorbital. Em gânglios de animais não operados, receptores ETA foram identificados em fibras A e C, enquanto que receptores ETB foram detectados em fibras C e células da glia. Em gânglios de animais constritos, a presença destas fibras é menos evidente, de modo que a expressão de ambos receptores é menos nítida. No entanto, a expressão de receptores ETA em fibras A, bem como de receptores ETB em células da glia permanece bastante clara. A hipernocicepção térmica foi reduzida por antagonistas de receptores ETA (atrasentan, 10 mg/kg; BQ-123, 3 a 30 nmol), ETB (A-192621, 20 mg/kg; BQ-788, 3 a 30 nmol), ou de ambos (bosentan, 10 mg/kg). Em contraste, a hipernocicepção a estímulos químicos e mecânicos envolveu a ativação de receptores ETA e ETB, respectivamente. Estes resultados sugerem que as endotelinas são importantes mediadores da hipernocicepção orofacial e que receptores ETA e ETB podem constituir alvos terapêuticos potencialmente relevantes para o controle da dor neuropática trigeminal.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia.

Orientador: Jose Geraldo P. Ferraz Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A resistência reduzida da mucosa gástrica hipertensiva portal, perante os agentes lesivos, é observada frequentemente em pacientes portadores de cirrose hepática e hipertensão portal. Trata-se de complicação grave que predispõe ao desenvolvimento de hemorragia digestiva alta ou anemia, secundária à perda crônica sangüínea, resultando na necessidade de frequêntes transfusões sangüíneas. Os fatores que determinam a resistência diminuída da mucosa gástrica hipertensiva portal perante os agentes nocivos incluem uma complexa interação entre vários mediadores continuamente liberados durante o desenvolvimento da circulação hiperdinâmica na hipertensão portal. Os neurônios aferentes primários podem contribuir para esse fenômeno, uma vez que eles foram previamente implicados no desenvolvimento da hiperemia esplâncnica na hipertensão portal. O presente estudo teve como objetivo ivestigar a contribuição da inibição crônica do óxido nítrico, bem como a participação das prostaglandinas e endotelinas, na resistência reduzida da mucosa gástrica à lesão induzida pelo etanol 40% usando modelos experimetais em ratos. Modelos distintos de hipertensão portal (ligadura de ducto biliar comum e estenose calibrada de veia porta) foram realizados em ratos Sprague-Dawley. As lesões gástricas induzidas pelo etanol foram avaliadas utilizando o modelo ex vivo de câmara gástrica. A resposta microcirculatória da mucosa foi avaliada através de fluxometria por laser-Doppler usando o mesmo modelo ex vivo. O papel da inibição prolongada de óxido nítrico foi realizado através da adição de L-NAME à água de beber dos ratos controles e com hipertensão portal antes dos experimentos de câmara gástrica. Similarmente, a função das endotelinas e das prostaglandinas foi avaliada através da utilização de agonistas, antagonistas ou de inibidores. A participação de neurônios aferentes no desenvolvimento da circulação hiperdinâmica da hipertensão portal e sua repercussão sobre a resistência da mucosa gástrica ao etanol foi avaliada através do tratamento neonatal com capsaicina ou do uso de antagonista de taquicininas. A sinalização molecular para produção óxido nítrico, prostaglandinas e endotelinas, bem como o efeito da endotoxemia e o pH intragástrico foi também avaliado. Nossos resultados indicam que a hipertensão portal associada à disfunção hepática reduz a capacidade da mucosa gástrica de se defender contra a aplicação tópica de etanol. Esse fenômeno é influenciado pelo pH intragástrico, bem como pela presença de endotoxemia. Os resultados também indicam que os neurônios aferentes primários participam no desenvolvimento da circulação hiperdinâmica da hipertensão portal, afetando a capacidade de defesa da mucosa gástrica perante os agentes agressores. Nós concluímos que a capacidade de defesa da mucosa gástrica hipertensiva portal, avaliada nos modelos experimentais utilizados, é modulada pelos neurônios aferentes primários, e resulta de uma complexa interação entre o óxido nítrico liberado, prostaglandinas, endotelinas e o sistema nervoso entérico Abstract: The reduced resistance of the portal hypertensive gastric mucosa is frequently observed in patients with liver cirrhosis associated with portal hypertension. It can predispose to upper gastrointestinal hemorrhage as well as anemia secondary to chronic blood loss. It is usually associated with the need of multiple blood transfusions. The mechanisms involved in the reduced resistance of the portal hypertensive gastric mucosa include a complex interaction between several vasoactive mediators continuously released during the development of the hyperdynamic circulation of portal hypertension. Primary afferent neurons may also contribute to this phenomenon, as they have been previously implicated in the development of the splanchnic hyperemia in portal hypertension. The objective of the present study was to investigate the role of chronic inhibition of nitric oxide, as well as prostaglandins and endothelins, in the reduced resistance of the gastric mucosa to ethanol (40%)-induced injury using an experimental rat model. Portal hypertension was induced by bile duct ligation or calibrated portal vein stenosis in male Sprague-Dawley rats. Ethanol-induced gastric damage was assessed using an ex vivo gastric chamber preparation. Gastric blood flow responses were measured using laser Doppler flowmetry using the ex vivo preparation as well. The role of chronic nitric oxide inhibition was achieved by adding L-NAME to drinking water of control and portal hypertensive rats prior to chamber experiments. Similarly, the function of endothelins and prostaglandins was investigated using agonists, antagonists or inhibitors. The participation of primary afferent neurons in both development of hyperkinetic circulation in portal hypertension and its contribution on gastric resistance to ethanol-induced injury were investigated by induction of cirrhosis by bile duct ligation in either capsaicin newborn or takikinin antagonist treated rats. The molecular signaling for generation of nitric oxide, prostaglandins and endothelins was studied using RT-PCR. The gastric prostaglandin synthetic capacity was assessed using ELISA in samples collected at the end of the different experiments. The impact of endotoxemia and intragastric pH on gastric resistance to ethanol-induced injury was also investigated. Our results indicated that induction of liver dysfunction and portal hypertension reduces the gastric resistance to topical application of ethanol. This is influenced by the intragastric pH, as well as by the presence of endotoxemia. This phenomenon is result of a complex interplay between the production and release of nitric oxide, prostaglandins and entothelins. In addition, primary afferent neurons participate in the development of the hyperdynamic circulation of portal hypertension, affecting the ability of the gastric mucosa to defend against injury. We conclude that gastric defence against topical application of ethanol in the presence of experimental portal hypertension is modulated by primary afferent neurons, and result of a complex interplay among the release of nitric oxide, prostaglandins, endothelins and the enteric nervous system Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Nefropatia diabética (ND) é uma importante complicação crônica do diabetes mellitus (DM), sendo responsável por uma proporção importante dos novos casos de diálise. Os principais fatores de risco são a hiperglicemia, hipertensão arterial sistêmica (HAS), a dislipidemia e o tabagismo. Está claro que a ND apresenta também um componente genético, entretanto os genes envolvidos na sua etiologia ainda não estão totalmente identificados. O sistema renina-angiotensina (SRA) tem um importante papel na gênese e progressão da ND. Recentemente, acumulam-se evidências que endotelinas também podem participar na patogênese da ND. As endotelinas são peptídeos com potente ação vasoconstritora e atuam modulando o tono vasomotor, proliferação celular e produção hormonal. Estes peptídeos agem através de dois receptores (ET-A e ET-B) que são expressos nas células endoteliais e no músculo liso vascular. Ativação destes receptores nas células renais levam a uma complexa cascata de alterações resultando em proliferação e hipertrofia das células mesangiais, vasoconstrição das arteríolas aferentes e eferentes e acúmulo da matriz extra-celular. Essas alterações hemodinâmicas renais estão associadas com o aparecimento e progressão da doença renal no DM. Níveis plasmáticos elevados de endotelina-1 (ET-1) têm sido relatados em pacientes com DM, tanto com e sem microalbuminúria, sugerindo que a disfunção endotelial relacionada ao DM poderia aumentar a produção vascular de ET-1, que levaria ao dano glomerular. O uso de drogas antagonistas do receptor da ET-1 em situações de DM experimental tem mostrado propriedades nefroprotetoras, reforçando a importância deste sistema na ND.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. A participação das [endotelinas] na reação inflamatória articular, incluindo a [nocicepção] (NOCI), [hiperalgesia] (HIPER) e sensibilização (SENS) articular induzida pela [carragenina] (CG) foi investigada em articulações de joelho de rato. Foram utilizados os modelos: da incapacitação articular, de [edema] inflamatório (EDEMA) e a reação inflamatória celular, que foi avaliada pela histologia (HISTO) dos cortes articulares. A sensibilização das articulações com carragenina aumentou a nocicepção o edema e a resposta inflamatória celular para uma segundo estímulo com carragenina, 72 h após. A SENS induzida pela carragenina, mas não a NOCI, foi potencializada pelo BQ-788 (antagonista de receptores ETB), enquanto o BQ-123 (antagonista de receptores ETA) foi inefetivo. A sarafotoxina S6c (S6c) marcadamente suprimiu o edema, a resposta inflamatória celular e a nocicepção induzida pela carragenina bem como a sensibilização induzida pela carragenina, endotelina-1 (ET-1) ou sarafotoxina (S6c), e o BQ-788 preveniu estas ações. Portanto a carragenina ativa um mecanismo endotelinérgico operado por receptores ETB que limita a sua ação sensibilizante articular para a nocicepção, edema e eventos inflamatórios celulares evocados para estímulos inflamatórios subseqüentes. A nocicepção induzida pela carragenina pode ser modulada distintamente via receptores ETA e ETB, embora mecanismos endotelinérgicos endógenos não tenham sido recrutados por este algógeno.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. O presente estudo investigou os mecanismos celulares e mediadores envolvidos nas respostas nociceptiva, hiperalgésica e edematogênica, induzidas pela injeção intraplantar (i.pl.) de endotelina-1 (ET-1) em camundongos. O degranulador de mastócitos, composto 48/80, injetado

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. O presente estudo investigou os efeitos nociceptivo, hiperalgésico e edematogênico de [endotelinas] (ETs) injetadas por via intraplantar na pata de camundongos. Além disso, avaliou a contribuição das ETs endógenas para a [nocicepção] (NOCI) e a [hiperalgesia] (HIPER) desencadeadas por ovoalbumina (OVA) em animais sensibilizados ao antígeno. A HIPER foi avaliada como a potencialização da NOCI induzida por capsaicina. A ET-1 causou efeitos nociceptivo, hiperalgésico e edematogênico dependentes de dose. Estas respostas foram bloqueadas por A-127722.5 ou BQ-123 (antagonistas ETA), mas não por BQ-788 (antagonista ETB). Além disso, sarafotoxina S6c (S6c) e IRL 1620 (agonistas ETB) não deflagram nenhum dos efeitos da ET-1. Porém, o BQ-788 revelou um efeito hiperalgésico à ET-3, e a S6c inibiu a HIPER à ET-1 sem alterar suas ações nociceptiva ou edematogênica. Em outros experimentos, a NOCI induzida por OVA em animais sensibilizados foi reduzida por bosentan (antagonista ETA/ETB), BQ-123 ou A-127722.5, e aumentada por A-192621.1 (antagonista ETB). Finalmente, a HIPER à capsaicina induzida por OVA foi bloqueada por bosentan, A-127722.5 ou A-192621.1. Estes resultados demonstram que as ETs contribuem para efeitos pró-nociceptivos (inclusive alérgico) e edematogênico mediados por receptores ETA em camundongos, enquanto os receptores ETB modulam distintamente estas respostas ao peptídeo.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. A Síndrome da Angústia Respiratória Aguda (SARA) é uma insuficiência pulmonar, não-cardiogênica, caracterizada por hipóxia refratária, complacência pulmonar diminuída e ocorrência de infiltrados alveolares difusos. Patologicamente, a SARA apresenta inflamação e elevação da permeabilidade vascular pulmonar, resultado da lesão do epitélio e endotélio pulmonares. A endotelina-1 (ET-1) foi encontrada em níveis elevados no lavado broncoalveolar (BAL) e plasma de ratos, submetidos à lesão pulmonar com ácido olêico (AO), um modelo experimental de SARA ou, no plasma de humanos acometidos de sepse ou SARA. O objetivo do presente estudo foi avaliar, através do emprego de antagonistas de receptores ETA e ETB para ETs, a participação destes peptídeos na mediação da lesão pulmonar induzida por AO em camundongos, avaliando-se os níveis de permeabilidade vascular, celularidade leucocitária e parâmetros histopatológicos. Camundongos receberam 50 mg/kg de azul de Evans (AE, i.v.) e 1 h após, AO (25 - 200 mg/kg em BSA 0,1 %, i.v.) e sacrificados em diversos tempos. Os pulmões foram removidos e processados para detecção do teor de AE tecidual por espectrofotometria, como índice da permeabilidade do leito vascular pulmonar. Outros grupos de animais, que não receberam AE, foram tratados com AO (100 ou 200 mg/kg, i.v.), e o BAL coletado 4 h após, para contagem total e específica de leucócitos. Amostras de pulmão de camundongos tratados com AO (200 mg/kg) foram analisados para a atividade da mieloperoxidade (MPO), através do método de ELISA. Em outra série, os pulmões de camundongos lesionados com AO (100 ou 200 mg/kg) foram removidos, fixados em formalina e corados com hematoxilina-eosina, para avaliação histopatológica. O AO, nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg (i.v.), elevou os níveis intrapulmonares de AE em 150, 610 e 680%, e a massa tecidual seca em 21, 34 e 30 %, respectivamente, relativos ao valor controle correspondente. O pré-tratamento com meloxicam (5 mg/kg, i.p.) ou dexametasona (1 mg/kg, s.c.) reduziu o acúmulo pulmonar de AE em 63 e 76%, respectivamente, em animais que receberam AO (100 mg/kg, i.v.). O pré-tratamento i.v. em animais submetidos à injeção de AO (100 mg/kg, i.v) com bosentan (15 e 30 mg/kg), antagonista misto de receptores ETA/ETB, ou Ro-468443 (3 ou 10 mg/kg) ou A-192621 (10, 15 ou 30 mg/kg), antagonistas seletivos de receptores ETB, reduziu o acúmulo pulmonar de AE em 28 e 72%, ou 30 e 47, ou 34, 43 e 80%, respectivamente. O pré-tratamento com A-127722.5 ou ABT-627 (ambos nas doses 3 ou 5 mg/kg), antagonistas seletivos de receptores ETA, não alteraram significativamente os níveis intrapulmonares de AE. A administração i.v. de ET-1 ou de agonistas seletivos ETB (SX6c, IRL-1620 ou BQ-3020), nas doses de 0,3, 1 ou 3 nmol/kg, não alteraram os níveis intrapulmonares de AE, em animais não submetidos à administração de AO. A administração i.v de AO na dose de 100 mg/kg causou elevação significativa de leucócitos mononucleares no BAL, enquanto que, na dose de 200 mg/kg, elevou tanto os mononucleares quanto os polimorfonucleares. O pré-tratamento com bosentan (30 mg/kg) ou Ro-468443 (10 mg/kg) reduziu significativamente o acúmulo aumentado de polimorfonucleares, mas não de mononucleares induzido por AO (200 mg/kg, i.v) no BAL. Porém, o pré-tratamento com ABT-627 (5 mg/kg) reduziu os níveis de ambos os tipos celulares no BAL. A atividade da MPO em pulmão de camundongos tratados com AO (200 mg/kg) não diferiu do grupo controle. A análise histopatológica (infiltrado leucocitário, hemorragia, congestão vascular e edema intersticial) de pulmões de camundongos, tratados com AO (100 ou 200 mg/kg, i.v.), demonstrou haver lesão tecidual dependente da dose administrada. O infiltrado leucocitário foi inibido após pré-tratamento com bosentan ou antagonistas seletivos de receptores ETA (ABT-627 ou A-127722.5) ou ETB (Ro-468443 ou A-192621). A hemorragia pulmonar foi reduzida pelo pré-tratamento com bosentan, A-192621 e A-127722.5; enquanto que a congestão vascular inibida com A-192621 e, o edema intersticial com Ro-468443. Concluímos que o AO causa aumento da permeabilidade vascular e infiltração leucocitária pulmonar em camundongos, por mecanismos que envolvem mediação endotelinérgica. O aumento da permeabilidade vascular depende da formação de produtos da via da cicloxigenase, e ativação de receptores do tipo ETB (mas não dos ETA). O acúmulo de polimorfonucleares requer mecanismos celulares que podem ser deflagrados tanto por receptores ETA quanto de ETB e, o acúmulo de mononucleares envolve a ativação dos receptores ETA, mas não dos ETB.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas Este estudo procurou avaliar os efeitos da [endotelina-1] (ET-1) na motilidade de diferentes porções do trato biliar extra-hepático isolado de cobaia. Os resultados obtidos revelaram que a ET-1 (0,1 a 100 nM) não causou qualquer resposta contrátil dos ductos hepático e cístico ou da porção proximal do [ducto biliar comum] (DBC), assim como, estas preparações não responderam a colecistocinina-8 (CCK-8; 0,1 a 100 nM), a histamina, ao carbacol (10 nM a 100 µM) ou ao KCL 80 mM. Embora o carbacol e a CCK-8 causaram contrações da porção distal do DBC, a ET-1 não causou qualquer resposta contrátil desta porção. A indometacina (5,6 µM) não alterou a reatividade da porção distal do DBC à CCK-8, mas potencializou as resposta ao carbacol e revelou efeitos contráteis da ET-1. A ET-1, a sarafotoxina S6c(0,1 a 100 nM) e a histamina (10 nM a 100 µM) não induziram qualquer efeito contrátil das porções ampular (EOA) e papilar (EOP) do [esfíncter de Oddi]. Em contraste, o carbacol induziu contrações de ambas as porções do EO e a CCK-8 causou apenas pequenas contrações transitórias. Diferentemente da CCK-8, a incubação das preparações com ET-1 ou sarafotoxina S6c causou inibição da contração induzida pelo carbacol em anéis de EOA, mas não EOP. A indometacina aboliu o efeito inibitório causado pela ET-1 (100 nM) sobre as contrações induzidas pelo carbacol no EOA. O efeito depressor da ET-1 no EOA foi parcialmente bloqueado pelo BQ-123 (antagonista ETA), inalterado pelo BQ-788 (antagonista ETB) e totalmente abolido com a incubação das preparações de EOA com ambos os antagonistas. Tais achados permitem concluir que a ET-1, in vitro, não causa qualquer efeito contrátil em nenhum dos ductos do trato biliar extra-hepático, mas inibe as contrações induzidas pelo carbacol no EOA. A síntese de [prostanóides] inibe um efeito contrátil direto da ET-1 na porção distal do ducto biliar comum e também bloqueia o efeito depressor, mediado por [receptores ETA e ETB,] da ET-1 sobre as contrações induzidas pelo carbacol no EOA de cobaia

A endotelina-1, um peptídeo isolado recentemente, tem sido observada em diferentes tecidos e está envolvida em várias funções reprodutivas. Propusemo-nos a determinar as concentrações da endotelina-1 por radioimunoensaio no plasma de eqüinos e bovinos e no fluido folicular de eqüinos. Foram testados 2 tipos de inibidores de degradação protéica no plasma e fluido folicular. A imunorreatividade média foi de 47,5%, a dose mínima detectável foi de 1 pg/tubo e o coeficiente de variação inter e intra-ensaio foi de 2,36% e 7,26%, respectivamente. O paralelismo entre a curva padrão e as curvas determinadas com diferentes volumes de plasma e fluido folicular valida o radioimunoensaio de endotelina-1 para estas espécies. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro relato de literatura que detecta por radioimunoensaio a endotelina-1 no plasma e fluido folicular de eqüinos e plasma de bovinos. Os resultados do presente trabalho sugerem a utilização do método de radioimunoensaio utilizando-se kits comerciais para a determinação das concentrações da endotelina-1 no plasma de eqüinos e bovinos e fluido folicular de eqüinos, pelo fato de este apresentar alta sensibilidade, precisão e reprodutibilidade, podendo assim ser utilizado no estudo de múltiplas funções da endotelina-1 nestas espécies animais e, em especial, no sistema endócrino-reprodutivo. Endothelin-1, a recently isolated peptide, has been observed in different tissues and is involved in several reproductive functions. The objective of the present study was to determine the concentrations of immunoreactive endothelin-1 in the plasma of horses and cattle and in the follicular fluid of horses using a commercial radioimmunoassay kit. Mean immunoreactivity was 47.5%, the minimum detectable dose was 1 pg/tube and the interassay and intra-assay coefficients of variation were 2.36% and 7.26%, respectively. The parallelism between the standard curves and the curves determined with different volumes of plasma and follicular fluid validates the radioimmunoassay of endothelin-1 for these species. To our knowledge, this is the first report in the literature of detection of endothelin-1 in the plasma and follicular fluid of horses and in the plasma of cattle by radioimmunoassay. The present results suggest the use of the radioimmunoassay method employing commercial kits for the determination of endothelin-1 concentrations in horse and cattle plasma and horse follicular fluid because of its high sensitivity, accuracy and reproducibility, in order to study the multiple functions of endothelin-1 in these animals species, and especially in the endocrine-reproductive system.

Endothelin-1, a recently isolated peptide, has been observed in different tissues and is involved in several reproductive functions. The objective of the present study was to determine the concentrations of immunoreactive endothelin-1 in the plasma of horses and cattle and in the follicular fluid of horses using a commercial radioimmunoassay kit. Mean immunoreactivity was 47.5%, the minimum detectable dose was 1 pg/tube and the interassay and intra-assay coefficients of variation were 2.36% and 7.26%, respectively. The parallelism between the standard curves and the curves determined with different volumes of plasma and follicular fluid validates the radioimmunoassay of endothelin-1 for these species. To our knowledge, this is the first report in the literature of detection of endothelin-1 in the plasma and follicular fluid of horses and in the plasma of cattle by radioimmunoassay. The present results suggest the use of the radioimmunoassay method employing commercial kits for the determination of endothelin-1 concentrations in horse and cattle plasma and horse follicular fluid because of its high sensitivity, accuracy and reproducibility, in order to study the multiple functions of endothelin-1 in these animals species, and especially in the endocrine-reproductive system. A endotelina-1, um peptídeo isolado recentemente, tem sido observada em diferentes tecidos e está envolvida em várias funções reprodutivas. Propusemo-nos a determinar as concentrações da endotelina-1 por radioimunoensaio no plasma de eqüinos e bovinos e no fluido folicular de eqüinos. Foram testados 2 tipos de inibidores de degradação protéica no plasma e fluido folicular. A imunorreatividade média foi de 47,5%, a dose mínima detectável foi de 1 pg/tubo e o coeficiente de variação inter e intra-ensaio foi de 2,36% e 7,26%, respectivamente. O paralelismo entre a curva padrão e as curvas determinadas com diferentes volumes de plasma e fluido folicular valida o radioimunoensaio de endotelina-1 para estas espécies. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro relato de literatura que detecta por radioimunoensaio a endotelina-1 no plasma e fluido folicular de eqüinos e plasma de bovinos. Os resultados do presente trabalho sugerem a utilização do método de radioimunoensaio utilizando-se kits comerciais para a determinação das concentrações da endotelina-1 no plasma de eqüinos e bovinos e fluido folicular de eqüinos, pelo fato de este apresentar alta sensibilidade, precisão e reprodutibilidade, podendo assim ser utilizado no estudo de múltiplas funções da endotelina-1 nestas espécies animais e, em especial, no sistema endócrino-reprodutivo.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas.

La fibrosis intersticial del riñón está asociada a las enfermedades glomerulares crónicas y la nefrotoxicidad farmacológica, esencialmente por cic1osporina A y tacrolimus en pacientes trasplantados, y constituye el factor más importante en el desarrollo de la insuficiencia renal progresiva que acompaña a las enfermedades renales. Aunque el aumento intrarrenal de endotelina I es conocido que provoca isquemia crónica que puede ser importante en el desarrollo de la fibrosis intersticial, otros factores de crecimiento como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-α) y mediadores vasculares como la angiotensina II han sido implicados en el proceso. En este artículo se revisa la histología normal del intersticio renal y el papel que juegan la lesión tubular y de la matriz extracelular en la génesis de la fibrosis intersticial del riñón así como su regulación por mecanismos paracrinos y autocrinos vinculados a las endotelinas y TGF-α., Intersticial renal fibrosis is associated to chronic glomerular diseases and nephrotoxicity caused by drugs, essentially cyclosporin A and Tacrolimus (FK506) in trasplanted patients and it is the most important factor by progressive renal insufficiency. Although increased endothelin (Et) is Known to induce chronic ischemia, and may be important in the genesis of interstitial fibrosis, other mediators of fibrogenesis have been implicated, eg, transforming growth factor beta (TGF-α) and angiotensin Il. In this article we review the normal histology of renal intertitium and the role of tubular lesion and extracellular matrix in the genesis of renal fibrosis. Moreover its regulation by paracrine and autocrine mechanisms linked to endothelins and TGF-α is reviewed.

Orientador: Gilberto de Nucci Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Endotelinas constituem família de mediadores vasoativos, capazes de produzir respostas pressoras potentes e de longa duração em vários territórios vasculares. Por exemplo a endotelina-1 participa no controle da resistência ao fluxo sangüíneo portal, principalmente na presença de cirrose hepática e hipertensão portal. Entretanto, os receptores envolvidos nesse fenômeno não são completamente conhecidos. O objetivo do presente estudo foi caracterizar a população de receptores de endotelina na circulação portal de fígado canino. Respostas vasculares portais à administração de endotelina-1 (agonista misto de receptores ETA/ETB), IRL 1620 (agonista seletivo ETB) e noradrenalina foram avaliadas utilizando preparação de perfusão hepática in vitro. Estas respostas foram investigadas na presença/ausência de antagonistas seletivos de ETA (FR 139317) e ETB (BQ-788). O papel do óxido nítrico e prostaglandinas nesse fenômeno foi avaliado através do uso de inibidores da óxido nítrico sintase e ciclooxigenase (L-NAME e indometacina respectivamente). Administração intraportal de endotelina-1 e IRL1620 resultou em aumento dependente da dose na resistência do fluxo portal, efeito atenuado pelo tratamento com FR 139317 e BQ-788, respectivamente. Inibição da síntese de óxido nítrico e prostaglandinas potencializou a resposta vascular portal induzida pela endotelina-1, sem afetar as respostas ao IRL 1620. Os resultados sugerem a existência de uma população mista de receptores de endotelina na circulação portal de fígado canino. O aumento na resistência ao fluxo portal induzido pela administração de endotelina-1 é mediado por receptores ETA e ETB, sendo o efeito mediado pelos receptores ETA modulado por óxido nítrico e prostaglandinas. A ativação de receptores ETB pode ter papel importante no controle da resistência ao fluxo sangüíneo portal na presença de cirrose hepática e hipertensão portal, condição associada a elevados níveis circulantes de endotelina-1 e de endotelina-3 Abstract: Endothelins constitute a family of vasoactive mediators, capable of producing potent and long-lasting pressor responses in several vascular territories. Endothelin-1 has been implicated in the regulation of resistance to portal blood flow, particularly in the presence of cirrhosis and portal hypertension. However, the receptor subtypes mediating this phenomenon have not been clearly elucidated. In this study we attempted to characterize the endothelin receptor population in the portal circulation. Portal vascular responses to endothelin-1 (ETA/ETB agonist), IRL 1620 (ETB agonist) and noradrenaline were investigated using the isolated, perfused canine liver. The effects of a selective ETA receptor antagonist, FR 139317, and the selective ETB receptor antagonist, BQ -788, on portal vascular responses to the agonists were investigated, in addition, the modulation of these responses by prostaglandins and nitric oxide were also assessed. Endothelin-1 and IRL 1620 produced a dose-dependent increase in portal inflow resistance. This effect was significantly attenuated by treatment with FR 139317 and BQ-788. Blockade of prostaglandin and nitric oxide synthesis with indomethacin and L-NAME, respectively, potentiated the endothelin-1-, but not IRL 1620-induced portal vascular responses. We conclude that there is a mixed population of endothelin receptors in the portal circulation of the canine liver. Endothelin-1-induced portal vasoconstriction is mediated by ETA and ETB receptors. The effects induced via ETA receptors is modulated by prostaglandins and nitric oxide. ETB receptor activation might play an important role in resistance to portal blood flow in disease states such as portal hypertension, a condition associated with increased circulating levels of endothelin-1 and endothelin-3 Mestrado Mestre em Ciências Médicas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, 1994. Os efeitos das endotelinas (ETs) no íleo de cobaia submetido a estimulação elétrica de campo foram avaliados. As ETs causaram depressão transitória das respostas neurogênicas e contração sustentada. O efeito depressor independe da síntese de eicosanoídes ou da ativação de canais de cálcio do tipo "L" e parece ser mediado por receptores ETB, pois a ET-1, ET-3 e sarafotoxina S6c são equipotentes e seus efeitos resistentes ao bloqueio por BQ-123. O efeito contratil das ETs depende em parte de eicosanoídes e é fortemente inibido por nicardipina ou cromacalina. Esse efeito das ETs parece ser mediado por receptores ETA e ETB, pois a ET-1 e mais potente que a ET-3 ou sarafotoxina S6c e p BQ-123 bloqueia os efeitos da ET-1, mas não os da sarafotoxina S6c. Além disso, a ET-1 causa dessensibilização a ET-1 mas não a sarafotoxina S6c. Os receptores envolvidos nos efeitos depressor e contratil das ETs não são acoplados através de proteínas g sensíveis a toxina de Bordetella pertussis.

The rising epidemic of diabetes worldwide is of significant concern. Although the ultimate objective is to prevent the development and find a cure for the disease, prevention and treatment of diabetic complications is very important. Vascular complications in diabetes, or diabetic vasculopathy, include macro- and microvascular dysfunction and represent the principal cause of morbidity and mortality in diabetic patients. Endothelial dysfunction plays a pivotal role in the development and progression of diabetic vasculopathy. Endothelin-1 (ET-1), an endothelial cell-derived peptide, is a potent vasoconstrictor with mitogenic, pro-oxidative and pro-inflammatory properties that are particularly relevant to the pathophysiology of diabetic vasculopathy. Overproduction of ET-1 is reported in patients and animal models of diabetes and the functional effects of ET-1 and its receptors are also greatly altered in diabetic conditions. The current therapeutic approaches in diabetes include glucose lowering, sensitization to insulin, reduction of fatty acids and vasculoprotective therapies. However, whether and how these therapeutic approaches affect the ET-1 system remain poorly understood. Accordingly, in the present review, we will focus on experimental and clinical evidence that indicates a role for ET-1 in diabetic vasculopathy and on the effects of current therapeutic approaches in diabetes on the vascular ET-1 system.