Search

The wood-decaying white-rot fungi have the profound ability to completely degrade lignocelluloses and all wood components. These fungi and their enzymes have evolved to modify the various lignocellulose feedstocks in nature, and thereby, they are important organisms for bioconversions as well as in fundamental research on fungal biology. The enzymes have many potential applications in biotechnology and industrial purposes including bioenergy production. Evolutionary background of the fungal species and their organelles thus requires deeper understanding to aid in elucidating the relationship of the species to their lifestyles. This PhD study concentrated on the white-rot fungal species Phlebia radiata, Finnish isolate number 79 (FBCC0043). The phylogenetic studies confirmed positioning of P. radiata species in the systematic class Agaricomycetes of Basidiomycota, and in the phlebioid clade of the order Polyporales. The sequenced and annotated mitochondrial genome of P. radiata was discovered to have features that indicate evolutionary pressure and structural diversity in fungal mitogenomes, not being as stable and compact entities than was previously believed. In this study, P. radiata together with species like Phlebia acerina and Phlebia brevispora was demonstrated to form a Phlebia sensu stricto group which consists of efficient producers of lignin-modifying enzymes. The results pinpointed that there is a species-level connection of fungal molecular systematics to the efficiency in the production of wood-decaying enzymes and activities. Norway spruce (Picea abies) is a common tree species in the boreal forests providing an important source of biomass for forest-based industry. Therefore, P. radiata was cultivated on Norway spruce wood under conditions mimicking natural solid-wood colonization, up to six weeks of growth, and the dynamics of fungal enzyme production and gene expression was studied. The lignin-modifying class-II peroxidases (LiPs and various MnPs) w, Valkolahoa tuottavat sienet hajottavat tehokkaasti lignoselluloosaa ja puuaineksen biopolymeerejä, kuten selluloosaa, hemiselluloosaa ja ligniiniä. Valkolahottavat sienet ovat evoluution myötä kehittyneet tuottamaan erilaisia entsyymejä, jotka kykenevät muokkaamaan ja pilkkomaan monimutkaisia raaka-aineita. Tämän vuoksi valkolahottajat ovat kiinnostavia tutkimuskohteita niin teollisesti kuin perustutkimuksenkin näkökulmasta. Sienten tuottamia entsyymejä voidaan hyödyntää bioteknisissä ja teollisissa sovelluksissa, kuten biopolttoaineiden ja uusien biomateriaalien tuotannossa. Puunlahottajien ja niiden mitokondrioiden pitkän evoluutiohistorian selvittäminen on tärkeää, jotta sienilajien ja niiden elintapojen välisiä suhteita voidaan ymmärtää. Tässä väitöskirjatutkimuksessa oli keskeisessä roolissa Suomesta eristetty rusorypykän (Phlebia radiata) sienikanta 79 (FBCC0043). Fylogeneettinen monigeenitarkastelu vahvisti rusorypykän ja lajin muiden edustajien kuuluvan kantasienten Agaricomycetes-luokan Polyporales-lahkoon, ja siinä edelleen niin kutsuttuun phlebioid-sukuryhmään. Rusorypykän mitokondrion genomin sekvensointi osoitti, että tumallisten eliöiden mitogenomit eivät ole niin vakaita ja yhteneviä yksikköjä kuin aikaisemmin on uskottu. Sienten mitogenomit ovat monimuotoisia ja jatkuvan evolutiivisen paineen alla. Laajempi Phlebia-suvun lajien ja isolaattien fylogeneettinen tutkimus osoitti, että rusorypykkä muodostaa yhdessä lajien Phlebia acerina ja P. brevispora kanssa Phlebia sensu stricto -ryhmän, jonka jäsenet tuottavat tehokkaasti ligniiniä hajottavia hapetus-pelkistysentsyymeitä. Tässä tutkimuksessa huomattiin myös, että molekyylisystematiikan perusteella arvioidut lajien väliset geneettiset suhteet ovat yhteydessä puuta sisältävällä alustalla tuotettaviin entsyymiaktiivisuuksiin ja lajien entsyymiprofiileihin. Kuusi (metsäkuusi, Picea abies) on yksi pohjoisen havumetsävyöhykkeen tärkeimmistä raaka-aineista. Tästä syystä rusorypykän isolaattia 79 kasvatettii

Basidiomycete white rot fungi are wood-rotting species and their impact to the global carbon cycle is significant. White rot fungi are capable of degrading all the polymeric cell wall components of the plant biomass from polysaccharides, cellulose, hemicelluloses and pectin, to the aromatic heteropolymer lignin. This is due to their ability to produce diverse set of extracellular enzymes that degrade or modify the plant cell wall concomitantly releasing carbon. Research on plant-biomass-degrading fungi has concentrated on isolation and characterization of enzymes especially from the ascomycete fungi for biotechnological applications, such as bioenergy, food processing and waste treatment. More recently genomic studies have opened the reservoir of the plant-biomass-degrading potential of basidiomycete fungi including wood-rotting, litter-decomposing, plant-pathogenic and ectomycorrhizal species. Dichomitus squalens is a white-rot fungus, which colonises softwood and is able to efficiently degrade lignin and cellulose. Previously, intensive studies on white rot fungi have been focused on lignin degradation by oxidative enzymes. The aim of this study was to analyse the potential of the plant-cell-wall-modifying enzymes of D. squalens. Plant biomass degradation by D. squalens was studied at different levels from gene expression to enzyme production. The focus was to dissect the overall degradation of plant biomass polymers, especially cellulose degrading enzymes of D. squalens. The cellulose degradation by D. squalens was studied at the transcript level during growth on spruce wood sticks and in microcrystalline cellulose-containing liquid medium. Selected cellulases and oxidoreductases, which putatively act on cellulose were expressed simultaneously on spruce, the natural substrate of the fungus, and microcrystalline cellulose in time- and substrate-dependent manner. To clarify the adaptation of D. squalens to different plant biomass, the transcriptome and secretome of, Valkolahosienet ovat puuta lahottavia kantasieniä, joilla on huomattava merkitys maapallon hiilen kierrossa. Ne hajottavat tehokkaasti kasvisoluseinää, joka koostuu pääosin hiilihydraattipolymeereistä eli selluloosasta, hemiselluloosista ja pektiinistä sekä aromaattisesta ligniinipolymeeristä. Tuottamiensa solunulkoisten entsyymien avulla valkolahosienet muokkaavat ja hajottavat näitä yhdisteitä ja siten vapauttavat hiiltä. Kasvibiomassaa hajottavilla entsyymeillä on lukuisia sovelluskohteita esimerkiksi polttoaine-, elintarvike- ja jätteenkäsittelyteollisuudessa. Tähänastinen tutkimus on kohdistunut lähinnä kotelosienten tuottamien entsyymien eristämiseen ja karakterisointiin sekä niiden bioteknologiseen hyödyntämiseen. Viimeisen kymmenen vuoden aikana genomitieto on osoittanut, että myös puuta lahottavien valkolahosienten sekä muiden kasvibiomassaa muokkaavien kantasienten lignoselluloosaa hajottavien entsyymien kirjo on laaja. Onkin todennäköistä, että näillä entsyymeillä on teollisesti kiinnostavia uusia katalyyttisiä ominaisuuksia. Valkolahosienten tutkimuksen pääkohteena ovat perinteisesti olleet ligniiniä hapettavat entsyymit. Tässä työssä täydennettiin kokonaiskuvaa valkolahosienten kasvibiomassan entsymaattisesta hajotuksesta selvittämällä myös kasvisoluseinän hiilihydraattipolymeerien, erityisesti selluloosan, hajotusta. Työn malliorganismiksi valittiin Dichomitus squalens -salokääpä, joka on havupuulla kasvava ja tehokkaasti selluloosaa ja ligniiniä hajottava valkolahosieni. Salokäävän selluloosan hajotuskykyä selvitettiin seuraamalla valikoitujen, solunulkoisia entsyymejä koodaavien geenien ilmentymistä sienen kasvaessa luonnollisella kasvualustallaan, kuusella, ja mikrokiteisellä selluloosalla. Tutkimuksessa havaittiin, että sieni ilmensi kasvunsa aikana yhtäaikaisesti geenejä, jotka koodaavat sellulaaseja ja hiilihydraattipolymeerejä hapetus-pelkistysreaktioilla hajottavia entsyymejä. Lisäksi sienen kasvun vaihe ja kasvualustan hiilen lähde vaikuttivat

All positive-strand RNA viruses replicate their RNA genomes in close association with cellular membranes. A great variety of cellular membranes are utilized by different viruses and those membranes are extensively modified to support viral replication and to protect the viral RNA from host cell defense mechanisms. Alphaviruses, including Semliki Forest virus (SFV), are positive-strand RNA viruses replicating their RNA on membranes derived from endosomal and lysosomal compartments. SFV induces small invaginations called spherules on plasma membrane and on endosomal membranes. Viral replication complex assembly, spherule formation and initiation of replication are carefully orchestrated events and are guided by specific sequence elements within the genomic RNA as well as by important enzymatic activities of nonstructural proteins (nsPs). The aim of this research was to study in detail how alphavirus replication complexes are assembled and to define the minimum requirements for spherule formation by using a plasmid-derived transreplication system mimicking SFV replication. The role of the genomic RNA in replication was deciphered by using RNA templates, which were either modified or differed in length. Use of RNA templates differing in length clearly showed that they define the spherule diameter suggesting that the template has a significant role in spherule formation. By modifying or deleting specific sequences from the template it was shown that highly conserved RNA elements are important for SFV replication and do not tolerate modifications without compromising replication. Study with the nsPs of SFV showed that the enzymatic activities essential for virus replication are also needed for spherule formation and that enzymes like helicase, protease and polymerase are absolutely essential for replication. Membrane association of the replication complex is also required to establish virus replication in the cells. The work with mutated nonstructural proteins and modifie, Positiivijuosteiset RNA-virukset hyödyntävät isäntäsolun kalvorakenteita kopioidessaan perintöainestaan. Eri virukset käyttävät solun eri kalvorakenteita apuna kopioitumisessa ja samalla muokkaavat niitä lajilleen tyypillisellä tavalla. Muunnellut isäntäsolun kalvorakenteet sekä tukevat viruksen kopioitumistapahtumaa että suojaavat virusta solun puolustusreaktioilta. Alfavirukset, kuten Semliki Forest virus (SFV), lukeutuvat positiivijuosteisiin RNA-viruksiin, ja ne hyödyntävät kopioitumisessaan mm. isäntäsolun endo- ja lysosomaalisia kalvorakenteita. Kopioituessaan SFV muodostaa isäntäsolussa sekä solukalvolle että endosomien kalvoille pieniä pussimaisia kalvokuroumia, joita kutsutaan sferuleiksi. Replikaatiokompleksin kokoaminen, sferulin muodostuminen sekä kopioitumisen käynnistyminen ovat hienovaraisesti säädeltyjä tapahtumia, joihin osallistuvat sekä viruksen RNA:n tietyt konservoituneet alueet, että viruksen replikaatioproteiinit. Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli tutkia yksityiskohtaisesti alfavirusten replikaatiokompleksin muodostumisen vaiheita sekä selvittää, mitkä ovat kopioitumisen vähimmäisvaatimukset. Tutkimuksessa käytettiin SFV:n kopioitumista jäljittelevää trans-replikaatiosysteemiä, jossa tarvittavat viruksen replikaatioproteiinit ja RNA-perintöainesta muistuttava RNA-mallijuoste tuotetaan erillisistä plasmideista. RNA-perintöaineksen roolia tutkittiin käyttämällä muunneltuja RNA-mallijuosteita. Käyttämällä eripituisia RNA-mallijuosteita havaitsimme, että juosteen pituus määrittää syntyvän kalvokurouman halkaisijan. Tutkimustulos viittaa siihen, että perintöaineksella on merkittävä rooli viruksen replikaatiokompleksin muodostumisessa. Perintöaineksen sisäiset, konservoituneet alueet osoittautuivat myös erittäin tärkeiksi viruksen kopioitumiselle. Tutkittaessa viruksen replikaatioproteiineja sekä niiden tärkeitä entsymaattisia toimintoja kävi ilmi, että viruksen kopioitumisen kannalta välttämättömät entsyymaattiset aktiivisuudet ovat välttämättöm

Milk proteins, sodium caseinate (CN) and whey protein isolate (WPI) are used in food industries as emulsifiers. The stability of an O/W emulsion is dependent on the electrostatic and steric repulsion provided by the interfacial proteins against droplet aggregation or lipid oxidation. Therefore, modifications of the surface charge or the interfacial conformation of protein emulsifiers are expected to enhance their emulsifying properties and emulsion stability. In this present work, sodium caseinate and whey protein isolate were modified by different chemical and enzymatic approaches. The modified proteins were characterized using multiple techniques, and the effect of these modifications on emulsifying properties of proteins and emulsion stability was investigated. Succinylation converts the positively charged amino groups into negatively charged carboxyl groups, lowering the isoelectric point (pI) of protein. The ethylene diamine (EDA) modification worked in the opposite way, leading to an increased pI. The extent of these two modifications was studied using SDS-PAGE and MALDI-TOF mass spectrometry. The pI of succinylated and EDA modified milk proteins was studied using zeta-potential measurement. As a result, the succinylation to full extent altered the pI of CN from 4.2 to 2.7, and the EDA modification shifted the pI of CN and WPI from 4.2 to 9.4 and from 4.9 to 9.5 respectively. The pH stability of emulsion made with the modified milk proteins was monitored by following the increase of particle size during storage. The results suggested that succinylation and EDA modification could enhance the emulsion stability at pH 4 7 by increasing the electrostatic repulsion between droplets. Regarding the enzymatic modification of milk proteins, the laccase and transglutaminase (Tgase) catalyzed cross-linking were applied on WPI and CN respectively. In order to improve the reactivity of WPI towards the laccase, a vanillic acid modification was carried out to incorporate add, Maitoproteiinivalmisteita, kuten natriumkaseinaattia (CN) ja heraproteiinia (WPI) käytetään elintarviketeollisuudessa emulgaattoreina. Öljy-vesiemulsioiden säilyvyyteen vaikuttavat sekä fysikaaliset tekijät, kuten öljypisaroiden yhdistyminen ja pintaannousu, että kemialliset tekijät kuten rasvan hapettuminen vesiympäristössä. Öljyn ja veden rajapintaa stabiloivat proteiinit vaikuttavat näihin molempiin: sähköiset vuorovaikutukset sekä steeriset tekijät säätelevät öljypisaroiden välistä kontaktia ja aineensiirtoa rajapinnan läpi. Proteiiniemulgaattoreiden konformaation tai varauksen muokkaaminen muuttaa niiden emulgointiominaisuuksia ja voi siten oletettavasti parantaa emulsion säilyvyyttä halutuissa olosuhteissa. Tässä työssä käytettiin useita eri menetelmiä, joilla tutkittiin natriumkaseinaatin ja heraproteiinin entsymaattisen ja kemiallisen muokkauksen vaikutusta niiden emulgaattoriominaisuuksiin. Proteiinien sukkinylaatio eli meripihkahapon liittäminen muuttaa positiivisesti varatut aminoryhmät negatiivisesti varautuneiksi karboksyyliryhmiksi, jolloin proteiinin isoelektrinen piste (pI) alenee. Muokkaaminen etyleenidiamiinilla (EDA) vaikuttaa vastakkaisella tavalla, jolloin pI kohoaa. Proteiinin muokkautuminen osoitettiin käyttäen geelielektroforeesia (SDS-PAGE) ja massaspektrometriaa (MALDI-TOF). Muokattujen maitoproteiinien isoelektriset pisteet (nettovaraus nolla) määritettiin käyttäen zetapotentiaalimittausta, jossa proteiinin nettovaraus määritetään pH:n funktiona. Kaikkien aminoryhmien sukkinyloituminen alensi natriumkaseinaatin isoelektrisen pisteen 4,2:sta 2,7:ään. EDAlla muokkaaminen puolestaan nosti natriumkaseinaatin ja heraproteiinin isoelektrisen pisteen 4,9:stä 9,5:een. Muokatuilla proteiineilla stabiloitujen emulsioiden säilytyksen aikana tapahtuvia muutoksia seurattiin emulsioiden pisarakokoa mittaamalla. Tulosten mukaan sukkinylaatio ja EDA-käsittely voivat lisätä emulsion pysyvyyttä pH-alueella 4-7, mikä johtuu pisaroiden välisen sähköisen hylki

Salmonella is one of the most commonly reported foodborne pathogens and enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) is one of the most dangerous. They both spread by zoonotic and person-to-person transmission routes. Most Salmonella infections are characterized by mild-to-moderate self-limited diarrhea but also serious disease resulting in death has been reported.Bloody diarrhea is a common symptom of human EHEC infection and the infection may lead to severe post-infection disease such as hemolytic uremic syndrome (HUS), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) and even death. The purpose of this thesis was to investigate the diversity of Salmonella and EHEC strains isolated from domestically acquired infections using several pheno- and genotyping methods for surveillance and outbreak investigation purposes as well as evaluate certain epidemiological typing methods in Finland. All Salmonella and EHEC isolates of domestic origin during 2007-2014 in Finland were studied. Serotyping, phage typing, antimicrobial susceptibility testing, phenotype microarray, pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) were applied as epidemiological typing tools for Salmonella isolates. EHEC isolates were analyzed using serotyping, phage typing, antimicrobial susceptibility testing, virulence gene detection (stx1, stx2, eae, hlyA and saa) and PFGE. During the study period, the number of domestically acquired Salmonella infections has decreased about one fifth compared to the previous decade whereas the number of domestic EHEC infections have increased about one third.Th e incidence of Salmonella infections was highest in 2012 (7.5/100,000 population) and lowest in 2014 (5.4/100,000 population). The incidence of EHEC infections was highest in 2013 (0.33/100,000 population) and lowest in 2008 (0.07/100,000 population). 15% of all Salmonella strains and 70% of all EHEC strains were considered domestically acquired. A total of 131 diff, Salmonella on yksi yleisimmistä elintarvikevälitteisistä bakteeripatogeeneistä, enterohemorraaginen Escherichia coli (EHEC) yksi vaarallisimmista. Molemmat bakteerit ovat eläimen ja ihmisen välityksellä leviäviä ja tarttuvat myös henkilöstä toiseen. Useimmat salmonellojen aiheuttamat infektiot ovat lieviä, itsestään parantuvia suolistoinfektioita, mutta myös vakavia, kuolemaan johtavia tartuntoja todetaan. Veriripuli on yleinen oire erityisesti pikkulasten EHEC-infektiossa. Infektio saattaa johtaa myös vakaviin jälkitauteihin kuten hemolyyttisureemiseen oireyhtymään (HUS), tromboottiseen trombosytopeeniseen purppuraan (TTP) ja jopa kuolemaan. Tässä työssä tutkittiin salmonella- ja EHEC-kantojen ominaisuuksia useilla ilmiasuun (fenotyyppi) ja perimään (genotyyppi) perustuvilla menetelmillä. Lisäksi selvitettiin tiettyjen genotyypitysmenetelmien soveltuvuutta epidemiologiseen seurantaan ja tartuntalähteiden jäljittämiseen. Erityisesti oltiin kiinnostuneita niistä salmonella- ja EHEC-kannoista, joiden tartunta oli saatu Suomessa. Tutkimus käsitti kaikki kotimaiset vuosina 2007-2014 eristetyt salmonella- ja EHEC-kannat. Salmonella-kantojen epidemiologiseen tyypittämiseen käytettiin neljää fenotyypitysmenetelmää, serotyypitystä, faagityypitystä, mikrobilääkeherkkyysmääritystä ja mikroarray testiä sekä kahta genotyypitysmenetelmää, pulssikenttägeelielektroforeesiä (PFGE) ja multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) testiä. EHEC-kantojen tyypitykseen käytettiin O:H-serotyypitystä, faagityypitystä, mikrobilääkeherkkyysmääritystä, virulenssigeenien määritystä (stx1, stx2, eae, hlyA and saa) ja PFGE -menetelmää. Tutkimusaikavälillä kotimaassa saatujen salmonellainfektioiden määrä laski noin viidenneksen verrattuna edelliseen vuosikymmeneen kun taas EHEC tartuntojen lukumäärä nousi noin kolmanneksen. Kotimaisten salmonellatartuntojen ilmaantuvuus oli korkeimmillaan vuonna 2012 (7.5/100 000 asukasta) ja alimmillaan vuonna 2014 (5.4/100 000 asukasta). Kotimaisten

Nitrogen is an indispensable element for plants and animals to be able to synthesise essential biological compounds such as amino acids and nucleotides. Although there is plenty of nitrogen in the form of nitrogen gas (N2) in the Earth s atmosphere, it is not readily available to plants but needs to be converted (fixed) into ammonia before it can be utilised. Nitrogen-fixing bacteria living freely in the soil or in symbiotic association with legume plants, fix N2 into ammonia used by the plants. This is known as biological nitrogen fixation (BNF). In contrast to industrial nitrogen fixation, an energy-demanding process using high temperature and pressure to produce chemical fertilizers, BNF makes use of solar energy alone to complete the same reaction. However, the requirements on compatibility of plants and nitrogen-fixing micro-organism, the rate of conversion and the ability of the micro-organisms to survive in stressful environments are limiting factors of this system. The current demand for more sustainable food production makes BNF an attractive alternative. However, optimization of existing BNF systems as well as development of new highly productive ones is necessary, to be able to replace the use of chemical fertilisers. In order to develop new alternatives, we need to gain more knowledge on the requirements set by both plants and micro-organisms for successful and efficient nitrogen fixation to occur. In this thesis, the nitrogen-fixing legume host Galega (goat s rue) and its symbiotic microbial partner Neorhizobium galegae were used as a model system to investigate the features defining good symbiotic nitrogen fixation. Studies of genetic diversity within the host plant showed that there are genetic traits making a distinction between the two species G. orientalis and G. officinalis, both at a whole-genome level and at the level of specific symbiosis-related genes. Genome sequencing of ten strains of N. galegae provided a useful dataset for studying i) the, Växter och djur är beroende av kväve för att kunna syntetisera nödvändiga biologiska föreningar så som aminosyror och nukleotider. Även om det finns ett överflöd av kvävgas i atmosfären, kan växter inte använda sig av kvävgasen som sådan, utan den måste först omvandlas (fixeras) till ammoniak. Kvävefixerande bakterier har en naturlig förmåga att fixera kvävgas till fördel för växterna. Det här fenomenet kallas biologisk kvävefixering. Bakterierna kan antingen vara frilevande eller leva i symbios med baljväxter. I motsats till industriell kvävefixering, en energikrävande process som är beroende av hög temperatur och högt tryck för att binda kväve i kvävegödsel, utnyttjar biologisk kvävefixering enbart solenergi för samma reaktion. Biologisk kvävefixering begränsas å andra sidan av krav på kompatibilitet mellan värdväxter och kvävefixerande mikroorganismer, effektiviteten av kvävefixeringen samt mikroorganismernas förmåga att överleva under krävande förhållanden. Den rådande efterfrågan på mer hållbara sätt att producera mat för jordens befolkning gör biologisk kvävefixering ett attraktivt alternativ. För att kunna ersätta använding av industriellt kvävegödsel krävs ändå att existerande biologiska kvävefixeringssystem optimeras och att nya högproduktiva system utvecklas. Detta å sin sida förutsätter förbättrad kunskap om de krav som både växter och mikroorganismer ställer för att en lyckad, effektiv kvävefixering ska vara möjlig. I denna avhandling användes som modellsystem växt bakterie paret Galega (getärt) och Neorhizobium galegae, som ingår kvävefixerande symbios med varandra, för att studera särdrag som är kännetecknande för en lyckad symbiotisk kvävefixering. Studier av den genetiska diversiteten inom värdväxten visade att genetiska drag skiljer de två arterna G. orientalis och G. officinalis åt, både då hela genomet beaktas och på ett plan av specifika symbiosrelaterade gener. Genomsekvensering av tio stammar av N. galegae tillhandahöll ett användbart dataset f

Phosphorus (P) intake in Western countries exceeds the nutritional recommendations 2- to 3-fold, and the increased use of food additive phosphates (FAPs) in the food industry has augmented total P (TP) intake; an estimated 10-50% of TP intake comes from additives. However, in food composition databases, the amounts of FAPs may have not been taken into account. Difficulties in measuring true P intake occur also because bioavailability of P differs between foodstuffs; inorganic P from additives is absorbed better in the intestine than natural, organic P. The harmfulness of high P intake to kidney patients has been known for years, and dietary P restriction is used in the treatment of the disease to avoid vascular calcification, which occurs due to calcium-phosphate deposition in the vascular vessel wall. However, recently, concerns have been raised about the role of elevated serum phosphate concentrations in cardiovascular health in the general population, but data on dietary P is scarce. This thesis aims to offer new insights into the potential health risks related to high dietary P intake in Finland by providing knowledge on the bioavailability of P in foodstuffs, and on the association of high dietary P intake with cardiovascular disease risk factors in the general population. In Study I, a new method was developed for analysis of in vitro digestible P (DP), indicating bioavailable and absorbable P. DP and TP contents of certain differently processed cereals were analyzed. The calculated uncertainty of the new analysis method had little effect on the DP contents in the samples. Soured cereals contained more DP than unsoured cereals, and the long processing time increased the amounts of DP. In Study II, the DP contents of selected plant-based foodstuffs with or without FAPs were determined by the analysis method developed in Study I. The analyzed plant-based products contained varying amounts of P, but most P was not digestible, except in FAP-containing foodstuffs (, Fosforin saanti on länsimaissa kaksin-kolminkertaista suhteessa ravitsemussuosituksiin. Fosforin kokonaissaantia on kasvattanut fosforilisäaineiden käyttö elintarviketeollisuudessa ja on arvioitu, että jopa 10-50 prosenttia fosforin saannista on peräisin lisäaineista. Elintarvikekoostumustietokannoissa lisäaineiden osuutta fosforipitoisuuksissa ei välttämättä kuitenkaan ole otettu huomioon. Fosforin todellisen saannin arviointia vaikeuttaa myös fosforin hyväksikäytettävyyden vaihtelevuus eri fosforilähteiden välillä; lisäaineperäinen fosfori imeytyy elimistöön paremmin kuin elintarvikkeen luontainen fosfori. Munuaistautipotilailla runsaan fosforin saannin haitallisuus on ollut tiedossa jo pitkään, ja fosforirajoitteista ruokavaliota käytetään osana heidän hoitoaan, jotta mm. verisuonten kalkkeutumiselta voitaisiin välttyä. Viime vuosina on saatu tutkimustuloksia seerumin kohonneen fosfaattipitoisuuden haittavaikutuksista sydän- ja verisuonitautien riskiin ja verisuonten kalkkeutumiseen myös terveellä väestöllä, mutta ravinnon fosforin osalta tutkimustietoa on niukasti. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena on valottaa runsaan fosforin saannin mahdollisia terveysriskejä Suomessa tuottamalla tietoa elintarvikkeiden fosforin hyväksikäytettävyydestä ja runsaan fosforin saannin yhteyksistä sydän- ja verisuonitautien riskitekijöihin väestötasolla. Väitöskirjan ensimmäisessä ja toisessa osatyössä määritettiin liukoisen, ns. elimistöön imeytyvän ja hyväksikäytettävissä olevan fosforin sekä kokonaisfosforin pitoisuuksia eri tavoin prosessoiduista viljatuotteista sekä tavanomaisista ja lisäainefosforia sisältävistä kasviperäisistä elintarvikkeista. Käytetty liukoisen fosforin analyysimenetelmä jäljitteli ruoansulatuskanavassa ruoalle tapahtuvaa käsittelyä, ja se kehitettiin ensimmäisen osatyön puitteissa. Tulosten perusteella hapatetuissa viljatuotteissa liukoisen fosforin määrä oli suurempi kuin hapattamattomissa, ja pitkä kypsennysaika lisäsi liukoisen fosforin pitoisuuksia. Mu

The known natural habitats of Deinococcus geothermalis are geothermal springs and deep ocean subsurfaces. The bacterium has also found its way to manmade environments, including paper machines and drinking water distribution systems, from which it is very difficult to remove due to its resistance towards industrial washing procedures, dehydration and even high doses of ionizing radiation. D. geothermalis attaches tightly on industrial, even microbially repellent, surfaces initiating slime accumulation. We show that the adhesion of D. geothermalis is mediated by outercellular appendages identified as glycosylated type IV pili. D. geothermalis is the first taxon member of the ancient phylum Deinococcus-Thermus, where glycosylated pili are reported. We propose that D. geothermalis is an obligate microaerobic bacterium. Proteomic analysis showed that D. geothermalis, when cultivated aerobically in nutrient limiting medium prevailing in nature, suffered from oxidative stress. Cells did not grow or respire, unless divalent manganese was supplied. As a novel finding, we reported that the cells secreted succinic acid to the medium, possibly as an end product of metabolic pathways directed to battle oxidative stress. The data suggests that D. geothermalis can grow in aerobic habitats, such as the splash areas of paper machines, when divalent manganese is available. Generation of biofilms may be a physiological response of D. geothermalis to escape atmospheric oxygen. Under aerobic conditions D. geothermalis was intolerant to sodium ions beyond 90 mM. Sodium may have inhibitory effect on V-type ATPases, which D. geothermalis uses as its sole mechanism of oxidative phosphorylation. The findings in this thesis offer novel antifouling strategies in processes where D. geothermalis is harmful: (1) destroying the pili by antifouling treatments; (2) promoting dispersal of D. geothermalis from the biofilm by environment-compatible procedures, such as providing process waters with man, Deinococcus geothermalis bakteerin luontaisia kasvuympäristöjä ovat kuumat lähteet ja valtameren syvänteet, mutta tämä bakteeri on löytänyt tiensä myös ihmisen tuottamiin ympäristöihin, kuten paperikoneille ja talousveden jakelujärjestelmiin. Bakteeri sietää hyvin tuotantolaitteiden puhdistukseen käytettyjä keinoja, kuten happohuuhteluja ja desinfioivia kemikaaleja, kuivatusta ja jopa ionisoivaa sädetystä. D. geothermalis tarttuu tiukasti teollisiin, jopa antimikrobiaaliseksi suunniteltuihin pintoihin. Osoitimme, että bakteerin tarttumaeliminä toimivat tyypin IV pilukset sekä solun pinnalla olevat sokerijohdannaiset. D. geothermalis on ikivanhan pääluokan, Deinococcus-Thermus, ensimmäinen laji, josta löydettiin piluksia. Ehdotamme, että D. geothermalis on mikroaerobinen bakteeri. Proteomiikka-analyysi paljasti, että matalaravinteisessa ympäristössä D. geothermalis kärsi happistressistä. Solujen kasvu ja hengitys pysähtyivät, ellei kasvualustaan lisätty mangaania. Solut erittivät ympäristöönsä meripihkahappoa, jota mahdollisesti syntyi jätteenä prosesseista, joilla solut suojautuivat taistelussa happistressiä vastaan. Tulokset indikoivat, että D. geothermalis tulee toimeen hapellisessa ympäristössä, kuten paperikoneiden roiskealueilla, vain jos mangaani-ioneja on saatavilla. Biofilmien tuotto voi D. geothermalis-bakteerille olla keino suojautua ilmakehän hapelta. Hapellisissa oloissa D. geothermalis sieti huonosti natriumsuoloja. Syynä saattoi olla energiakriisi seurauksena siitä, että natriumionit inhiboivat D. geothermaliksen hapelliseen ATP tuottoon käyttämää entsyymiä, V-ATPaasia. Tämän väitöskirjan tulokset avaavat uusia mahdollisuuksia torjua D. geothermalis prosesseissa, joissa siitä on haittaa: (1) antifouling toimenpiteet, joilla tuhotaan tarttumapilukset; (2) D. geothermaliksen biofilmien tuhoaminen ympäristöystävällisillä tavoilla, kuten lisäämällä prosessivesiin mangaania tai natriumia, tai (3) alentamalla prosessiympäristön happipitoisuus tasolle, jossa

Nitrogen is one of the major essential nutrients for plant growth along with phosphorus and potassium. Some specialized bacterial and archaeal species are able to fix atmospheric N2 into NH3, and that is subsequently converted into plant usable form of nitrogen, NH4+ or NO3-. The biological nitrogen fixation (BNF) process that occurs by the symbiotic interaction of leguminous plants and certain bacterial species (commonly known as rhizobia) is the main source of biological nitrogen input into the soil and therefore plays an important role in maintaining the sustainability of ecosystem services. Due to the fixed N they get from symbiosis, legume species grow better than other plants in nutrient poor, degraded soils. Thereby leguminous trees and shrubs restore degraded farmland and soil fertility by increasing the content of nitrogen and organic carbon in the soil. The versatile leguminous trees and shrubs, such as Erythrina brucei, Crotalaria spp., and Indigofera spp., can be used as forage for cattle and applied as intercrops or fallow crops in low-input agriculture. The usefulness of these legumes can be boosted by inoculating them with effective symbiotic nitrogen-fixing rhizobia. The yield of food legumes such as common bean and soybean can also partly be increased through the use of efficient rhizobial inoculants. Thus, detailed information about the indigenous rhizobia nodulating local food and woody legumes is essential for selecting good inoculant strains. Therefore, this thesis deals with diversity and phylogeny of 143 bacterial isolates obtained from root nodules of E. brucei, Crotalaria spp., Indigofera spp., common bean and soybean growing in different sites in Ethiopia. Taxonomy of the root nodule bacteria was studied using multilocus sequence analyses (MLSA) of the core genes 16S rRNA, recA, rpoB, and glnII. Phylogeny of nodulation (nodA, nodC, nodK/Y) and nitrogen-fixation (nifH) genes of the rhizobia were also studied. The whole genome based AFLP fing, Typpi on fosforin ja kaliumin ohella kasvien kasvulle välttämätön ravinne. Etiopiassa ja muissa Saharan eteläpuolisissa maissa maaperän köyhtyminen on yleinen ilmiö. Typen ja muiden kasviravinteiden puute pienentää viljelykasvien ohella myös palkokasvien, kuten tarhapavun ja soijapavun satoja. Vaikka maan viljavuutta voitaisiin parantaa keinolannoitteilla, etiopialaisilla pienviljelijöillä ei aina ole varaa hankkia niitä. Tämän ekosysteemipalvelun, symbioottisen biologisen typensidonnan hyödyntäminen on edullinen ja ekologisesti kestävä keino parantaa maan viljavuutta. Palkokasvit sitovat symbioosissa juurinystyrän typpibakteereiden (ritsobit) kanssa ilmakehän typpeä kasveille ja muille eliöille käyttökelpoiseen muotoon. Typpeä sitovat palkokasvit parantavat viljelymaan rakennetta ja viljavuutta edistämällä typen ja hiilen sitoutumista maahan. Monia trooppisia palkokasvipuita ja pensaita, kuten etiopialaista Erytrhina brucei -puuta sekä Crotalaria ja Indigofera -pensaita, voidaan käyttää proteiinipitoisena karjanrehuna ja hyödyntää maan parantamisessa kasvattamalla niitä viljelykasvien lomassa (intercropping) ja kesantopelloilla. Tämän väitöskirjan tarkoituksena oli selvittää, mitkä etiopialaiselle maaperälle ominaiset ritsobilajit kykenevät muodostamaan typpeä sitovia nystyröitä paikallisiin puuvartisiin palkokasveihin (Erytrhina brucei, Crotalira spp. ja Indigofera spp.) sekä tarhapapuun (Phaseolus vulgaris) että soijapapuun (Glycine max). Tutkimusta varten eristettiin 143 bakteerikantaa Etiopian keski-, etelä- ja itäosissa kasvaneiden palkokasvien juurinystyröistä. Bakteereiden geneettistä monimuotoisuutta, systematiikkaa (taksonomia) ja kehityshistoriaa (fylogenia) tutkittiin analysoimalla niiden DNA-sormenjälkiä sekä symbioottisten ja bakteerisolun ylläpitogeenien sekvenssejä. Rhizobium phaseoli, R. etli, R. leguminosarum sekä tieteelle uusi Rhizobium-laji osoittautuivat Etiopiassa kasvavien tarhapapujen tyypillisimmiksi symbionteiksi. Puuvartisten palkokasvien

Sepsis is defined as a documented infection with systemic inflammatory response syndrome (SIRS). When pathogens have been detected by blood culturing method, the condition is classified as a bloodstream infection (BSI). The frequency of severe sepsis is approximately 90.4 cases per 100 000 population in Europe and circa 751 000 cases annually in United States. Sepsis is associated with high mortality rates ranging up to 50 % in most severe cases. The presence of immunocompromising conditions, chronic diseases, prosthetic devices such as intravenous lines or urinary catheters and higher age are factors which typically increase the infection risk. Currently, common causative bacteria such as Staphylococcus aureus, other staphylococci, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae are detected using blood culturing method. It is time-consuming, especially in case of fastidious and slow growing bacteria and thus initial empirical therapy typically contains broad-spectrum antimicrobial(s). Rapid methods for sepsis/BSI diagnostics are needed to improve patient outcomes, decrease length of stay in hospital and related costs. When causative pathogens are identified earlier, also appropriate antimicrobials can be administered earlier. The aim of this study was to develop a polymerase chain reaction (PCR) and microarray-based assay for the detection of main causative pathogens and methicillin resistance marker from patients with suspected sepsis/BSI. The assay, which utilized the Prove-it TubeArray platform, was first developed for detection of 12 bacterial species, coagulase negative Staphylococcus group and methicillin resistance marker. The performance of this assay was evaluated with blood culture samples. The bacterial panel was further improved for the detection of over 50 causative pathogens in sepsis/BSI. This optimized assay was clinically validated with over 3300 blood culture samples collected from HUSLAB, Finland and UCLH, United Kingdom. The developed assay, named P, Sepsis tarkoittaa vakavaa yleisinfektiota ja tulehdusreaktio-oireyhtymää, johon liitetään usein veriviljelypositiivisuus. Yleisyys Euroopassa on 90.4 tapausta 100 000 ihmistä kohden ja Yhdysvalloissa noin 751 000 tapausta vuosittain. Sepsikseen liitetään korkea kuolleisuus, jopa 50 %. Heikentynyt immuunipuolustus, krooniset sairaudet sekä korkea ikä saattavat lisätä sairastumisriskiä. Yleisimpiä aiheuttajabakteereita ovat muun muassa Staphylococcus aureus ja muut stafylokokit, Escherichia coli ja Klebsiella pneumoniae. Resistentit ja multi-resistentit bakteerikannat ovat yleensä hoidollisesti vaikeimpia, koska tehokkaan mikrobilääkehoidon kohdistaminen saattaa olla vaikeaa. Tällä hetkellä sepsis osoitetaan veriviljelydiagnostiikan avulla, jolloin mikrobi pyritään tunnistamaan potilaan verestä. Viljely on hidas menetelmä vaativissa kasvuolosuhteissa kasvavien mikrobien kohdalla, siksi potilaan empiirinen ensihoito koostuu yleensä laajakirjoisesta mikrobilääkkeestä tai lääkeyhdistelmistä. Nopeutetun diagnostiikan avulla mikrobi(t) pystyttäisiin tunnistamaan nopeammin ja näin ollen kohdistettu lääkehoito aloittamaan aikaisemmin. Tämän työn tavoitteena oli kehittää PCR-monistus- ja mikrosirutekniikkaan perustuva testi sepsiksen aiheuttajamikrobien tunnistamiseen. Ensin kehitettiin tunnistus 12 bakteerilajille, koagulaasinegatiiviselle stafylokki-ryhmälle sekä metisilliiniresistenssi-geenimarkkerille positiivisesta veriviljelynäytteestä. Testialustaksi optimoitiin Prove-it TubeArray -mikrosiru, jolla pystyi analysoimaan 1-24 näytettä kerrallaan. Testin toimivuus arvioitiin kerätyillä veriviljelynäytteillä. Seuraavassa vaiheessa mikrobipaneeli laajennettiin kattamaan yli 50 sepsiksen aiheuttajamikrobia. Tämän parannetun testiversion toimivuus arvioitiin yli 3300 veriviljelynäytteen avulla, jotka oli kerätty HUSLAB:ssa Suomessa ja UCHL:ssä Isossa-Britaniassa. PCR- ja mikrosirutesti nimettiin Prove-it Sepsis -testiksi, jolle määritettiin 94.7 %:n herkkyys ja 98.8 %:n tarkku

Two types of antigen-presenting cells (APCs), macrophages and dendritic cells (DCs), function at the interface of innate and adaptive immunity. Through recognition of conserved microbial patterns, they are able to detect the invading pathogens. This leads to activation of signal transduction pathways that in turn induce gene expression of various molecules required for immune responses and eventually pathogen clearance. Cytokines are among the genes induced upon detection of microbes. They play an important role in regulating host immune responses during microbial infection. Chemotactic cytokines, chemokines, are involved in migratory events of immune cells. Cytokines also promote the differentiation of distinct T cell responses. Because of the multiple roles of cytokines in the immune system, the cytokine network needs to be tightly regulated. In this work, the induction of innate immune responses was studied using human primary macrophages or DCs as cell models. Salmonella enterica serovar Typhimurium served as a model for an intracellular bacterium, whereas Sendai virus was used in virus experiments. The starting point of this study was that DCs of mouse origin had recently been characterized as host cells for Salmonella. However, only little was known about the immune responses initiated in Salmonella-infected human DCs. Thus, cellular responses of macrophages and DCs, in particular the pattern of cytokine production, to Salmonella infection were compared. Salmonella-induced macrophages and DCs were found to produce multiple cytokines including interferon (IFN) -gamma, which is conventionally produced by T and natural killer (NK) cells. Both macrophages and DCs also promoted the intracellular survival of the bacterium. Phenotypic maturation of DCs as characterized by upregulation of costimulatory and human leukocyte antigen (HLA) molecules, and production of CCL19 chemokine, were also detected upon infection with Salmonella. Another focus of this PhD work was to, Kehomme immuunijärjestelmä on jakautunut synnynnäiseen ja hankittuun immuniteettiin, jotka yhdessä vastaavat mikrobi-infektioiden torjunnasta. Luonnollinen ja hankittu immuniteetti ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa antigeeniä esittelevien solujen kuten makrofagien ja dendriittisolujen välityksellä. Makrofagit ja dendriittisolut tunnistavat evoluutiossa säilyneitä mikrobirakenteita, jotka toimivat varoitussignaalina puolustusjärjestelmien aktivoitumiselle. Eräs tärkeä ryhmä proteiineja, joiden tuotanto käynnistyy solunsisäisten signaalinvälitysreittien toimesta, ovat sytokiinit. Monet sytokiineistä ohjaavat T-soluvasteiden erilaistumista, kemokiinien päätehtävänä on puolestaan säädellä valkosolujen liikennettä kudoksissa. Lukuisten tehtäviensä vuoksi on tärkeää, että sytokiinijärjestelmä on tiukan säätelyn alainen. Tässä työssä tutkittiin synnynnäisen immuniteetin aktivoitumista ihmisen makrofageissa ja dendriittisoluissa. Mikrobi-infektion mallintamisessa käytettiin Salmonella enterica sevorar Typhimurium -bakteeria sekä Sendai-virusta. Työ aloitettiin, koska haluttiin selvittää toimivatko ihmisen dendriittisolut Salmonella-bakteerin isäntäsoluna, ja miten erityisesti sytokiinituotanto aktivoituu infektion aikana. Vertailukohtana käytettiin makrofageja, joiden toiminnasta Salmonella-infektiossa tiedettiin jo paljon ennen tätä tutkimusta. Salmonella sai aikaan makrofageissa ja dendriittisoluissa useiden sytokiinien tuotannon mukaan lukien interferoni (IFN)- gamman, jota yleensä tuottavat luonnolliset tappajasolut ja T solut. Salmonella pystyi selviytymään paitsi makrofagien myös dendriittisolujen sisällä. Lisäksi CCL19-kemokiinin erittyminen ja tiettyjen antigeeniesittelyssä tarvittavien molekyylien ilmentyminen solun pinnalla kuvastivat dendriittisolujen kypsymistä Salmonella-infektion aikana. Tutkimuksessa tarkasteltiin myös tarkemmin miten sytokiinigeenien ilmentyminen on säädelty transkriptiotasolla. CCL19- ja tyypin III IFN -geenien promoottorialueilta lö

Growth is a fundamental aspect of life cycle of all organisms. Body size varies highly in most animal groups, such as mammals. Moreover, growth of a multicellular organism is not uniform enlargement of size, but different body parts and organs grow to their characteristic sizes at different times. Currently very little is known about the molecular mechanisms governing this organ-specific growth. The genome sequencing projects have provided complete genomic DNA sequences of several species over the past decade. The amount of genomic sequence information, including sequence variants within species, is constantly increasing. Based on the universal genetic code, we can make sense of this sequence information as far as it codes proteins. However, less is known about the molecular mechanisms that control expression of genes, and about the variations in gene expression that underlie many pathological states in humans. This is caused in part by lack of information about the second genetic code that consists of the binding specificities of transcription factors and the combinatorial code by which transcription factor binding sites are assembled to form tissue-specific and/or ligand-regulated enhancer elements. This thesis presents a high-throughput assay for identification of transcription factor binding specificities, which were then used to measure the DNA binding profiles of transcription factors involved in growth control. We developed ‘enhancer element locator’, a computational tool, which can be used to predict functional enhancer elements. A genome-wide prediction of human and mouse enhancer elements generated a large database of enhancer elements. This database can be used to identify target genes of signaling pathways, and to predict activated transcription factors based on changes in gene expression. Predictions validated in transgenic mouse embryos revealed the presence of multiple tissue-specific enhancers in mouse c- and N-Myc genes, which has implications to or, Kasvu on olennainen osa kaikkien eliöiden elinkaarta. Eläinten koko vaihtelee lajien välillä huomattavasti useimmissa eläinryhmissä, kuten esimerkiksi nisäkkäissä. Hedelmöittyneen munasolun kehittyessä monisoluiseksi yksilöksi kasvavat elimet oikeaan kokoonsa. Monisoluisten eliöiden kasvaessa niiden koko ei suurene tasaisesti, vaan eri ruumiinosat ja elimet kasvavat lajityypillisen kokoisiksi kehityksen eri vaiheissa. Tällä hetkellä tiedetään hyvin vähän molekyylitason mekanismeista, jotka säätelevät elinkohtaista kasvua. Viimeisen kymmenen vuoden aikana on sekvensoitu useiden lajien genomit. Genominlaajuisen sekvenssitiedon määrä kasvaa jatkuvasti, ja se sisältää tietoa myös lajien sisäisistä sekvenssivariaatioista. Universaalin geneettisen koodin perusteella pystymme lukemaan ja ymmärtämään saatavilla olevaa DNA-sekvenssitietoa niiltä osin kuin se koodaa proteiineja. Huomattavasti vähemmän tiedetään mekanismeista, jotka säätelevät geenien luentaa DNA:sta ja säätelyn variaatioista, jotka ihmisellä aiheuttavat sairauksia. Ylipäänsä tiedämme vähän niin kutsutusta ”toisesta geneettisestä koodista”. ”Toinen geneettinen koodi” koostuu transkriptiotekijöiden tunnistesekvensseistä ja yhdistelmäkoodista, jonka mukaan transkriptiotekijöiden sitoutumispaikat muodostavat geenien luentaa sääteleviä tehostajajaksoja. Väitöskirjan tuloksissa kuvataan ensin tehoseulontamenetelmä transkriptiotekijöiden sitoutumisspesifisyyden mittaamiseen. Tätä menetelmää käyttäen määritettiin DNA- sitoutumisprofiilit useille kasvun säätelyssä keskeisille transkriptiotekijöille. Kehitimme myös tietokoneohjelman nimeltä EEL tehostajajaksojen etsimiseen genomisesta DNA-sekvenssistä. Teimme genominlaajuisen ennusteen hiiren ja ihmisen tehostajajaksoista. Löysimme c-Myc ja N-Myc –geenien alueelta useita tehostajajaksoja, jotka ohjaavat geenien ilmenemisen tiettyyn kudokseen. Tulokset auttavat selittämään elinkohtaista kasvunsäätelyä ja onkogeenien kasvainspesifisyyttä. Lisäksi määritimme, että ihmisen

Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and its family members neurturin (NRTN), artemin (ARTN) and persephin (PSPN) are growth factors, which are involved in the development, differentiation and maintenance of many neuron types. In addition, they function outside of the nervous system, e.g. in the development of kidney, testis and liver. GDNF family ligand (GFL) signalling happens through a tetrameric receptor complex, which includes two glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored GDNF family receptor (GFRα) molecules and two RET (rearranged during transfection) receptor tyrosine kinases. Each of the ligands binds preferentially one of the four GFRα receptors: GDNF binds to GFRα1, NRTN to GFRα2, ARTN to GFRα3 and PSPN to GFRα4. The signal is then delivered by RET, which cannot bind the GFLs on its own, but can bind the GFL-GFRα complex. Under normal cellular conditions, RET is only phosphorylated on the cell surface after ligand binding. At least the GDNF-GFRα1 complex is believed to recruit RET to lipid rafts, where downstream signalling occurs. In general, GFRαs consist of three cysteine-rich domains, but all GFRα4s except for chicken GFRα4 lack domain 1 (D1). We characterised the biochemical and cell biological properties of mouse PSPN receptor GFRα4 and showed that it has a significantly weaker capacity than GFRα1 to recruit RET to the lipid rafts. In spite of that, it can phosphorylate RET in the presence of PSPN and contribute to neuronal differentiation and survival. Therefore, the recruitment of RET to the lipid rafts does not seem to be crucial for the biological activity of all GFRα receptors. Secondly, we demonstrated that GFRα1 D1 stabilises the GDNF-GFRα1 complex and thus affects the phosphorylation of RET and contributes to the biological activity. This may be important in physiological conditions, where the concentration of the ligand or the soluble GFRα1 receptor is low. Our results also suggest a role for D1 in heparin binding and, conse, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), neurturiini, artemiini ja persefiini ovat GDNF-perheen kasvutekijöitä, jotka osallistuvat useiden hermosolutyyppien kehitykseen, erilaistumiseen ja ylläpitoon. Lisäksi ne vaikuttavat hermoston ulkopuolella mm. munuaisen, testiksen ja maksan kehitykseen. Erityisesti GDNF-kasvutekijä on herättänyt paljon tieteellistä mielenkiintoa, sillä GDNF:n on osoitettu edistävän keskiaivojen dopaminergisten hermosolujen elossa pysymistä. Esimerkiksi Parkinsonin taudin oireiden uskotaan johtuvan juuri näiden hermosolujen tuhoutumisesta. GDNF-perheen kasvutekijät välittävät viestinsä soluille reseptorikompleksin avustamana: kaksi GFRα (GDNF family ligand receptor α) molekyyliä ja kaksi RET (rearranged during transfection) molekyyliä muodostavat solun pinnalla kompleksin kahden pysyvästi yhteen liittyneen GDNF-perheen kasvutekijän kanssa. Solukalvon lävistävä RET välittää signaalin solun sisälle, jossa signaali jatkaa kulkuaan. Kaikilla GDNF-perheen kasvutekijöillä on oma GFRα-reseptorinsa, johon ne pääasiassa sitoutuvat: GDNF sitoutuu GFRα1:een, neurturiini GFRα2:een, artemiini GFRα3:een ja persefiini GFRα4:ään. Ainakin GFRα1-molekyylin, RET:n ja GDNF:n muodostaman kompleksin uskotaan syntyvän solukalvon erikoistuneissa osissa, ns. lipidilautoilla. GFRα-molekyylit koostuvat yleensä kolmesta osasta, joita kutsutaan domeeneiksi. GFRα4 tekee kuitenkin poikkeuksen: useimpien eläinlajien GFRα4:stä ensimmäinen domeeni puuttuu kokonaan. Työssämme karakterisoimme hiiren GFRα4-molekyylin ominaisuuksia ja osoitimme, että GFRα4:n, persefiinin ja RET:n kompleksi ei muodostu lipidilautoilla. Tästä huolimatta persefiini ja GFRα4 pystyvät yhdessä RET:n kanssa edistämään hermosolujen erilaistumista ja elossa pysymistä. Näyttää siis siltä, että kompleksin muodostuminen lipidilautoilla ei ole välttämätöntä kompleksin biologisen aktiivisuuden kannalta. Tutkimme myös GFRα1-molekyylin ensimmäisen domeenin merkitystä molekyylin toiminnalle ja osoitimme

Forkhead box class O (FoxO) transcription factors are members of the forkhead box transcription factor superfamily, with orthologues in various species such as human, worm and fly. FoxO proteins are key regulators of growth, metabolism, stress resistance and, consequently, life span. FoxOs integrate signals from different pathways, e.g. the growth controlling Insulin-TOR signaling pathway and the stress induced JNK and Hippo signaling pathways. FoxO proteins have evolved to guide the cellular response to varying energy and stress conditions by inducing the expression of genes involved in the regulation of growth and metabolism. This work has aimed to deepen the understanding of how FoxO executes its biological functions. A particular emphasis has been laid to its role in growth control. Specifically, evidence is presented indicating that FoxO restricts tissue growth in a situation when TOR signaling is high. This finding can have implications in a human condition called Tuberous sclerosis, manifested by multiple benign tumors. Further, it is shown that FoxO directly binds to the promoter and regulates the expression of a Drosophila Adenylate cyclase gene, ac76e, which in turn modulates the fly s development and growth systemically. These results strengthen FoxOs position among central size regulators as it is able to operate at the level of individual cells as well as in the whole organism. Finally, an attempt to reveal the regulatory network upstream of FoxO has been carried out. Several putative FoxO activity regulators were identified in an RNAi screen of Drosophila kinases and phosphatases. The results underscore that FoxO is regulated through an elaborate network, ensuring the correct execution of key cellular processes in metabolism and response to stress. Overall, the evidence provided in this study strengthens our view of FoxO as a key integrator of growth and stress signals., Forkhead box class O (FoxO) geenienluennan säätelijä on konservoitunut proteiini, jonka toiminta liittyy mm. energia-aineenvaihduntaan, kasvun säätelyyn sekä solun suojeluun stressin aiheuttamilta vaurioilta. FoxO-proteiinit muodostavat perheen, jonka jäseniä esiintyy lähes kaikissa monisoluisissa. Näihin kuuluvat mm. ihminen, sukkulamato ja banaanikärpänen. FoxO-proteiinin tärkeimpänä tunnettuna tehtävänä voidaan pitää sen osallistumista aineenvaihdunnan ja kasvun mukauttamiseen ravinnon saatavuuteen. Sen säätelijöinä toimivat mm. ravinnetasoon reagoiva insuliini/TOR signalointiverkosto sekä solustressin aktivoimat JNK- ja Hippo-signaalinvälitysreitit. Kasvulle suotuisissa olosuhteissa FoxO-proteiinin aktiivisuus estetään insuliinisignaloinnin välityksellä. Kun ravinteita on vähän tai kun solun stressitaso kasvaa, esim. lisääntyneiden happiradikaalien seurauksena, FoxO siirtyy solulimasta tumaan, jossa se säätelee useiden eri geenien luentaa. Tällaisiin lukeutuvat mm. glukoosin uudismuodostuksessa oleellisten entsyymien pepck- ja g6pase-geenit, sekä solun jakautumisen negatiivisina säätelijöinä toimivat p27kip1- ja p21cip1-geenit. FoxO toimii sekä koko elimistön, että yksittäisen solun tasolla. Esimerkiksi maksassa FoxO-proteiinin tehtävänä on säädellä veren sokeritasoa, glukoosin uudismuodostuksen kautta. Energiaa kuluttavissa ja varastoivissa kudoksissa, kuten lihaksissa ja rasvakudoksessa, FoxO hidastaa kasvua ja aktivoi energiavaraston käyttöönottoa. Näiden prosessien säätely on elimistön aineenvaihdunnan tasapainon kannalta oleellista. Häiriöt FoxO-proteiinin säätelyssä onkin yhdistetty aineenvaihdunnan sairauksiin kuten insuliiniresistenssiin ja syövän syntyyn. Tässä työssä on tutkittu FoxO-proteiinin aktiivisuuden säätelyä sekä toimintaa, erityisesti kasvun säätelyn mekanismeja joissa FoxO on osallisena. Tutkimus on jaettu osajulkaisuihin, joiden tuloksena (1) on identifioitu uusia FoxO-proteiinin aktiivisuuden säätelijöitä (mm. PKC-, GSK-3β- ja POLO-kinaasi

Angiosperms represent a huge diversity in floral structures. Thus, they provide an attractive target for comparative developmental genetics studies. Research on flower development has focused on few main model plants, and studies on these species have revealed the importance of transcription factors, such as MADS-box and TCP genes, for regulating the floral form. The MADS-box genes determine floral organ identities, whereas the TCP genes are known to regulate flower shape and the number of floral organs. In this study, I have concentrated on these two gene families and their role in regulating flower development in Gerbera hybrida, a species belonging to the large sunflower family (Asteraceae). The Gerbera inflorescence is comprised of hundreds of tightly clustered flowers that differ in their size, shape and function according to their position in the inflorescence. The presence of distinct flower types tells Gerbera apart from the common model species that bear only single kinds of flowers in their inflorescences. The marginally located ray flowers have large bilaterally symmetrical petals and non-functional stamens. The centrally located disc flowers are smaller, have less pronounced bilateral symmetry and carry functional stamens. Early stages of flower development were studied in Gerbera to understand the differentiation of flower types better. After morphological analysis, we compared gene expression between ray and disc flowers to reveal transcriptional differences in flower types. Interestingly, MADS-box genes showed differential expression, suggesting that they might take part in defining flower types by forming flower-type-specific regulatory complexes. Functional analysis of a CYCLOIDEA-like TCP gene GhCYC2 provided evidence that TCP transcription factors are involved in flower type differentiation in Gerbera. The expression of GhCYC2 is ray-flower-specific at early stages of development and activated only later in disc flowers. Overexpression of GhCYC2 i, Kukkien kehitysbiologinen tutkimus pyrkii selvittämään mitkä säätelytekijät ohjaavat kukkaelinten kehitystä sekä kukan muodon ja koon määräytymistä. Vertailemalla geenien toimintaa ja säätelyverkostoja eri kasvilajien välillä saadaan arvokasta tietoa kukkien rakenteen kehityksestä sekä evoluution toimintamekanismeista. Tämän työn tutkimuskohteena on ollut auringonkukkien heimoon kuuluva Gerbera hybrida, jonka kukinnon rakenne on monimutkaisempi kuin perinteisesti kukan kehitysbiologian tutkimuksessa käytetyillä mallikasveilla, kuten lituruoholla ja leijonankidalla. Gerberan kukinto koostuu sadoista yksittäisistä kukista, jotka ovat erilaistuneet sekä rakenteeltaan että toiminnaltaan. Kukinnon reunoilla olevissa laitakukissa on näyttävät terälehdet jotka houkuttelevat pölyttäjiä kukinnon keskustaan. Kukinnon keskellä olevat kehräkukat ovat pienempiä ja vain niissä on toiminnalliset heteet. Tutkimuksen tavoitteena on ollut löytää tekijöitä, jotka säätelevät Gerberan kukkatyyppien erilaistumista ja kehitystä. Vaikka auringonkukkien heimo on yksi suurimmista kasviheimoista, heimolle tyypillisen kukintorakenteen, mykerön, kehityksen säätelystä on vain vähän aiempaa tietoa. Työssä keskityttiin kahteen geeniperheeseen, MADS-box ja TCP-geeneihin, joiden tiedetään olevan tärkeitä kasvien kehityksen säätelytekijöitä. MADS-box geenit säätelevät muun muassa kukkaelinten identiteettiä kun taas TCP-geenit ohjaavat yleisemmin kasvien muodon kehitystä kuten haaroittumista ja kukkien symmetrian kehitystä. Gerberan kukkatyyppien välisten rakenteellisten erojen havaittiin muodostuvan jo hyvin varhaisessa mykerönkehityksen vaiheessa. Geenien ilmentymisen vertailu mikrosirukokeella laita- ja kehräkukkien välillä osoitti, että useat MADS-box geeniperheen jäsenet ilmentyvät eri tavalla eri kukkatyypeissä. Tulokset viittaavat siihen, että MADS proteiinit vaikuttavat kukkatyyppien erilaistumiseen muodostamalla erilaisia proteiinikomplekseja eri kukkatyypeissä. TCP säätelytekijöillä havaitti

Neurotrophic factors play essential role in the development and functioning of the nervous system and other organs. Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) family ligands (GFLs) are of particular interest because they promote the survival of dopaminergic neurons in vitro, in Parkinson s disease animal models and in patients. GDNF is also a potent survival factor for the central motoneurons and thus is considered as a potential lead for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis. The survival promoting receptor complex for GFLs consists of a ligand-specific co-receptor, GFRα and a signal transducing module, receptor tyrosine kinase RET. At least GDNF and persephin, a GFL, have established functions outside central nervous system. GDNF is crucial for enteric nervous system and kidney development as well as for spermatogenesis. Persephin controls calcitonin secretion. Communication between cells often occurs in the extracellular matrix (ECM), a meshwork, which is secreted and deposited by the cells and is mainly composed of fibrillar proteins and polymerized sugars. We evaluated the relationship between GFLs and extracellular matrix components and demonstrated that three GFLs - GDNF, neurturin and artemin bind heparan sulfates with nanomolar affinities. The fourth member of the family - persephin binds these polysaccharides thousand times less tightly. GDNF, neurturin and artemin also bind with high affinity to heparan sulfate proteoglycan (HSPG) isolated from the nervous system, syndecan-3. GDNF signals through HSPGs, evoking Src family kinase activation. This signaling induces cell spreading, hippocampal neurite outgrowth in vitro and cellular migration. Specifically, GDNF signaling through syndecan-3 is important for embryonic cortical neuron migration. Syndecan-3-deficient mice, similarly to mice lacking GDNF, have less GABAergic neurons in their cortex, as compared to the wild-type mice. This fact provides indirect evidence that GDNF interaction wit, GDNF reseptorit: veteraanit ja noviisit Hermokasvutekijöillä on välttämätön rooli hermoston ja muiden elinten kehityksessä ja toiminnassa. Gliasoluperäinen hermokasvutekijä (GDNF)-perheen ligandit (GFL:t) ovat erityisen kiinnostavia sillä ne edistävät dopamiinia välittäjäaineenaan käyttävien neuronien eloonjäämistä soluviljelmissä, Parkinsonin taudin eläinmalleissa ja potilaissa. GDNF edistää myös tehokkaasti keskushermoston liikehermosolujen eloonjäämistä ja siksi sitä pidetään lupaavana proteiinina amyotrofisen lateraaliskleroosin hoitoon. Eloonjäämistä edistävä GFL:ien reseptorikompleksi koostuu GFRα-apureseptorista, joka määrää spesifisyyden ligandille, ja RET reseptori tyrosiinikinaasista, joka välittää signaalin soluun. Tässä työssä raportoimme GDNF:n ja sen apureseptorin muodostaman kompleksin rakenteen. Kuvaamme myös vaihtoehtoisen reseptorin GDNF:lle, syndekaani-3 proteoglykaanin. Nämä tulokset saattavat olla hyödyllisiä suunniteltaessa GDNF:n toimintaa jäljitteleviä aineita neurologisten sairauksien hoitoon.

Absolute and relative rate techniques were used to study the reactivity of Cl atoms with cyclohexanone in 6 Torr of argon or 800–950 Torr of N 2 at 295 ± 2 K. The absolute rate experiments gave k (Cl + cyclohexanone) = (1.88 ± 0.38) × 10 −10 , whereas the relative rate experiments gave k (Cl + cyclohexanone) = (1.66 ± 0.26) × 10 −10 cm 3 molecule −1 s −1 . Cyclohexanone has a broad UV absorption band with a maximum cross section of (4.0 ± 0.3) × 10 −20 cm 2 molecule −1 near 285 nm. The results are discussed with respect to the literature data. © 2008 Wiley Periodicals, Inc. Int J Chem Kinet 40: 223–229, 2008

Eukaryotic cells are characterized by having a subset of internal membrane compartments, each one with a specifi c identity, structure and function. Proteins destined to be targeted to the exterior of the cell need to enter and progress through the secretory pathway. Transport of secretory proteins from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi takes place by the selective packaging of proteins into COPII-coated vesicles at the ER membrane. Taking advantage of the extensive genetic tools available for S. cerevisiae we found that Hsp150, a yeast secretory glycoprotein, selectively exited the ER in the absence of any of the three Sec24p family members. Sec24p has been thought to be an essential component of the COPII coat and thus indispensable for exocytic membrane traffic. Next we analyzed the ability of Hsp150 to be secreted in mutants, where post-Golgi transport is temperature sensitive. We found that Hsp150 could be selectively secreted under conditions where the exocyst component Sec15p is defective. Analysis of the secretory vesicles revealed that Hsp150 was packaged into a subset of known secretory vesicles as well as in a novel pool of secretory vesicles at the level of the Golgi. Secretion of Hsp150 in the absence of Sec15p function was dependent of Mso1p, a protein capable of interacting with vesicles intended to fuse with the plasma membrane, with the SNARE machinery and with Sec1p. This work demonstrated that Hsp150 is capable of using alternative secretory pathways in ER-to-Golgi and Golgi-to-plasma membrane traffi c. The sorting signals, used at both stages of the secretory pathway, for secretion of Hsp150 were different, revealing the highly dynamic nature and spatial organization of the secretory pathway. Foreign proteins usually misfold in the yeast ER. We used Hsp150 as a carrier to assist folding and transport of heterologous proteins though the secretory pathway to the culture medium in both S. cerevisiae and P. pastoris. Using this technique we, Ei saatavilla

Kidney transplantation (Tx) is the treatment of choice for end stage renal disease. Immunosuppressive medications are given to prevent an immunological rejection of the transplant. However, immunosuppressive drugs increase e.g. the risk of infection, cancer or nephrotoxicity. A major genetic contributors to immunological acceptance of the graft are human leukocyte antigen (HLA) genes. Also other non-HLA gene polymorphisms may predict the future risk of complications before Tx, possibly enabling individualised immunotherapy. Graft function after Tx is monitored using non-specific clinical symptoms and laboratory markers. The definitive diagnosis of graft rejection however relies on a biopsy of the graft. In the acute rejection (AR) diagnostics there is a need for an alternative to biopsy that would be an easily repeatable and simple method for regular use. Frequent surveillance of acute or subclinical rejection (SCR) may improve long-term function. In this thesis, associations between cytokine and thrombosis associated candidate genes and the outcome of kidney Tx were studied. Cytotoxic and co-stimulatory T lymphocyte molecule gene expression biomarkers for the diagnosis of the AR and the SCR were also investigated. We found that polymorphisms in the cytokine genes tumor necrosis factor and interleukin 10 (IL10) of the recipients were associated with AR. In addition, certain IL10 gene polymorphisms of the donors were associated with the incidence of cytomegalovirus infection and occurrence of later infection in a subpopulation of recipients. Further, polymorphisms in genes related to the risk of thrombosis and those of certain cytokines were not associated with the occurrence of thrombosis, infarction, AR or graft survival. In the study of biomarkers for AR, whole blood samples were prospectively collected from adult kidney Tx patients. With real-time quantitative PCR (RT-QPCR) gene expression quantities of CD154 and ICOS differentiated the patients with AR from thos, Terminaalisen munuaissairauden paras hoitomuoto on munuaissiirto. Immuunivastetta heikentävää lääkitystä (immunosuppressiivit) annetaan estämään siirteen immunologinen hyljintä. Toisaalta immunosuppressiivit ovat haitallisia munuaisille ja lisäävät infektioiden ja syövän vaaraa. Tärkeimmät siirteen immunologiseen hyväksyntään vaikuttavat geenit ovat ihmisen valkosoluantigeeneja koodaavat geenit (HLA). Muut HLA:n ulkopuolisten geenien eri muodot voivat ennustaa ennen siirtoa hoidon sivuvaikutuksia ehkä mahdollistaen yksilöllisen immunosuppressiivisen lääkityksen. Siirron jälkeen siirteen toimintaa seurataan yleisluontoisten sairauden oireiden ja laboratoriokokeiden avulla. Siirteen hyljintä määritetään ottamalla neulakoepala siirteestä. Äkillisen hyljinnän määritykseen tarvitaan koepalan oton sijaan helposti toistettava ja yksinkertainen menetelmä säännölliseen seurantaan, mikä voi parantaa siirteen pitkäaikaistoimintaa. Väitöskirjassa tutkittiin sytokiinigeeneistä ja laskimotukokseen liittyvistä geeneistä eri geenimuotoja ja näiden vaikutusta munuaissiirteen ennusteeseen. Hyljinnän määrityksen avuksi tutkittiin myös soluille myrkyllisiä ja soluja ärsyttäviä T-imusolumolekyyligeenien ilmentymisbiomerkkejä. Sytokiinigeenien TNF ja IL10 tietyt muodot siirteen saajissa vaikuttivat hyljintäriskiin pienessä aineistossa. Lisäksi IL10 geenin tietyt muodot siirteen luovuttajissa vaikuttivat sytomegaloviruksen lisääntymiseen tietyissä siirteen saajissa. Toisaalta emme löytäneet laskimotukokselle, infarktille, hyljintään sairastuvuudelle tai siirteen elinikää lyhentäville altistavia sytokiini- tai tukosgeenimuotoja. Hyljinnän biomerkkejä tutkittaessa reaaliaikaisella kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla CD154- ja ICOS-geenien ilmentyminen oli erilaista hyljintäpotilaiden ja normaalien potilaiden välillä muttei muiden hyljinnänkaltaisia oireita ilmentäneiden potilaiden ja hyljintäpotilaiden välillä. Tutkittaessa kliinisesti oireettomien mutta koepalan perusteella hylji

In the present thesis, questions of spectral tuning, the relation of spectral and thermal properties of visual pigments, and evolutionary adaptation to different light environments were addressed using a group of small crustaceans of the genus Mysis as a model. The study was based on microspectrophotometric measurements of visual pigment absorbance spectra, electrophysiological measurements of spectral sensitivities of dark-adapted eyes, and sequencing of the opsin gene retrieved through PCR. The spectral properties were related to the spectral transmission of the respective light environments, as well as to the phylogentic histories of the species. The photoactivation energy (Ea) was estimated from temperature effects on spectral sensitivity in the long-wavelength range, and calculations were made for optimal quantum catch and optimal signal-to-noise ratio in the different light environments. The opsin amino acid sequences of spectrally characterized individuals were compared to find candidate residues for spectral tuning. The general purpose was to clarify to what extent and on what time scale adaptive evolution has driven the functional properties of (mysid) visual pigments towards optimal performance in different light environments. An ultimate goal was to find the molecular mechanisms underlying the spectral tuning and to understand the balance between evolutionary adaptation and molecular constraints. The totally consistent segregation of absorption maxima (λmax) into (shorter-wavelength) marine and (longer-wavelength) freshwater populations suggests that truly adaptive evolution is involved in tuning the visual pigment for optimal performance, driven by selection for high absolute visual sensitivity. On the other hand, the similarity in λmax and opsin sequence between several populations of freshwater M. relicta in spectrally different lakes highlights the limits to adaptation set by evolutionary history and time. A strong inverse correlation between Ea and λ, Kaikki näköaistin käytettävissä oleva informaatio on peräisin fotoreseptorisoluista, joiden tehtävänä on aistia valoa. Fotoreseptorin näköpigmenttimolekyyli, rodopsiini, koostuu transmembraanireseptoriosasta (opsiini), sekä siihen sitoutuneesta valoherkästä A-vitamiinialdehydistä (kromofori). Eläimen näkö on suoraan riippuvainen näköpigmenttimolekyylien absorptiospektristä, eli siitä, mitä valon eri aallonpituuksia ne pystyvät absorboimaan. Jokaisella pigmentillä on tietty absorptiomaksimi, missä fotonin absorptiotodennäköisyys on korkein. Näköpigmenttimolekyylin pitäisikin pystyä absorboimaan mahdollisimman hyvin juuri sitä valon aallonpituusaluetta, jota eläimen ympäristössä on tarjolla. Samalla sen tulisi olla mahdollisimman stabiili, jotta kohinaa, eli (termistä) sisäistä satunnaisaktivoitumista, muodostuisi vähän ja signaali/kohina-suhde olisi mahdollisimman korkea. Väitöskirjassa tarkasteltiin näköpigmentin spektraaliherkkyyttä ja termisiä ominaisuuksia, niiden riippuvuutta toisistaan, sekä näköpigmentin sopeutumista eri valoympäristöihin. Tutkimuksessa mallina oli Mysis halkoisjalkais-äyriäisiä sekä murto- että sisävesistöistä, joissa nämä eläimet ovat sopeutuneet eri valoympäristöihin. Mysis-äyriäisiin kuuluu useita geneettisesti määriteltyjä lajeja, joiden syntyhistoria tunnetaan melko hyvin (mm jääkauden erottamat lajit). Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää millä aikavälillä evolutiivinen sopeutuminen on optimoinut näköaistin toimintaa ja mitkä ovat ne selektiiviset paineet, jotka muokkaavat näköaistia. Väitöskirjatyössä selvitettiin myös molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät näköpigmentin toiminnallisia ominaisuuksia. Meri- ja makeavesi populaatioiden absorptiospektrit erosivat toisistaan kaikissa tutkituissa lajeissa. Tulokset osoittavat, että noin 9000 vuodessa evolutiivinen adaptaatio on muokannut valoaistin toimintaa valoympäristöön sopivaksi, jossa selektiivinen paine on ollut valoherkkyyden optimoinnissa. Laskennalliset arviot termisten ja

PATHOGENIC MECHANISMS OF PLOSL Polycystic lipomembranous osteodysplasia with sclerosing leukoencephalopathy (PLOSL), also known as Nasu-Hakola disease, is a recessively inherited disease of brain and bone. PLOSL manifests as early-onset progressive dementia and bone fractures. Mutations in the TYROBP (DAP12) and TREM2 genes have been identified as the primary cause of PLOSL. DAP12 and TREM2 encode important signalling molecules in cells of the innate immune system. The mechanism by which loss-of-function of the DAP12/TREM2 signalling complex leads to PLOSL is currently unknown. The aim of this thesis work was to gain insight into the pathogenic mechanisms behind PLOSL. To first identify the central nervous system (CNS) cell types that express both Dap12 and Trem2, the expression patterns of Dap12 and Trem2 in mouse CNS were analyzed. Dap12 and Trem2 expression was seen from embryonic stage to adulthood and microglial cells and oligodendrocytes were identified as the major Dap12/Trem2 producing cells of the CNS. To subsequently identify the pathways and biological processes associated with DAP12/TREM2 mediated signalling in human cells, genome wide transcript analysis of in vitro differentiated dendritic cells (DCs) of PLOSL patients representing functional knockouts of either DAP12 or TREM2 was performed. Both DAP12 and TREM2 deficient cells differentiated into DCs and responded to pathogenic stimuli. However, the DCs showed morphological differences compared to control cells due to defects in the actin filaments. Transcript profiles of the patient DCs showed differential expression of genes involved in immune response and for genes earlier associated with other disorders of the CNS as well as genes involved in the remodeling of bone, linking the findings with the tissue phenotype of PLOSL patients. To analyze the effect of Dap12 deficiency in the CNS, genome wide expression analysis of Dap12 deficient mouse brain and Dap12 deficient microglia as well as functional, PLOSL:N TAUTIMEKANISMIT Polykystinen lipomembranoottinen osteodysplasia ja sklerosoiva leukoenkefalopatia (PLOSL) on autosomissa peittyvästi periytyvä luuston ja aivojen sairaus. PLOSL:sta käytetään myös nimeä Nasu-Hakolan tauti. PLOSL aiheuttaa luuston heikkenemistä ja varhaisella iällä alkavan dementian. Mutaatiot TYROBP (DAP12) ja TREM2 geeneissä johtavat PLOSL:n. DAP12 ja TREM2 proteiinit ovat tärkeitä elimistön puolustusjärjestelmän solujen normaalille toiminnalle. Mekanismi, jolla DAP12/TREM2 puute johtaa PLOSL:n, on kuitenkin selvittämättä. Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää PLOSL:n tautimekanismeja. Aluksi selvitettiin missä ja milloin DAP12 ja TREM2 geenejä ilmennetään keskushermostossa. Molempia ilmennettiin samoilla aivoalueilla sikiökaudelta lähtien aina aikuisuuteen saakka. Havaittiin myös, että DAP12:ta ja TREM2:ta ilmennetään keskushermostossa erityisesti mikroglia- ja oligodendrosyytti-soluissa. Seuraavaksi haluttiin selvittää mihin aineenvaihduntareitteihin ja solun toimintoihin DAP12:n ja TREM2:n puutos vaikuttaa ihmisen soluissa. Tätä varten tarkasteltiin ihmisen kaikkien geenien ilmentymistä yhtäaikaisesti potilaiden dendriittisoluissa, joissa DAP12 ja TREM2 geenit eivät toimi. Eroja nähtiin sekä immuunipuolustukseen liittyvien geenien että keskushermostosairauksiin ja luun muodostukseen liittyvien geenien ilmentymisessä potilaiden ja kontrollien välillä. Solujen rakenteessa nähtiin lisäksi muutoksia. Lopuksi tarkasteltiin DAP12:n puutoksen seurauksia keskushermostossa analysoimalla kaikkien geenien ilmentymistä sekä aivokudoksessa että mikroglia-soluissa. Mikroglia-soluilla tehtiin myös toiminnallisia kokeita. Tässä väitöskirjatyössä tunnistettiin PLOSL:n kannalta tärkeät solutyypit keskushermostossa ja havaittiin että DAP12:n puute johtaa näiden solujen vialliseen toimintaan, mikä puolestaan vaikuttaa koko keskushermoston toimintaan. DAP12:n ja TREM2:n puute johtaa lisäksi solujen rakenteen ja geenien ilmentymisen muutoksiin

Autoimmune diseases are a major health problem. Usually autoimmune disorders are multifactorial and their pathogenesis involves a combination of predisposing variations in the genome and other factors such as environmental triggers. APECED (autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy) is a rare, recessively inherited, autoimmune disease caused by mutations in a single gene. Patients with APECED suffer from several organ-specific autoimmune disorders, often affecting the endocrine glands. The defective gene, AIRE, codes for a transcriptional regulator. The AIRE (autoimmune regulator) protein controls the expression of hundreds of genes, representing a substantial subset of tissue-specific antigens which are presented to developing T cells in the thymus and has proven to be a key molecule in the establishment of immunological tolerance. However, the molecular mechanisms by which AIRE mediates its functions are still largely obscure. The aim of this thesis has been to elucidate the functions of AIRE by studying the molecular interactions it is involved in by utilizing different cultured cell models. A potential molecular mechanism for exceptional, dominant, inheritance of APECED in one family, carrying a glycine 228 to tryptophan (G228W) mutation, was described in this thesis. It was shown that the AIRE polypeptide with G228W mutation has a dominant negative effect by binding the wild type AIRE and inhibiting its transactivation capacity in vitro. The data also emphasizes the importance of homomultimerization of AIRE in vivo. Furthermore, two novel protein families interacting with AIRE were identified. The importin alpha molecules regulate the nuclear import of AIRE by binding to the nuclear localization signal of AIRE, delineated as a classical monopartite signal sequence. The interaction of AIRE with PIAS E3 SUMO ligases, indicates a link to the sumoylation pathway, which plays an important role in the regulation of nuclear architecture. It was sh, Autoimmuunisairaudet, kuten diabetes, ovat huomattava kansanterveydellinen ongelma. Yleensä autoimmuunisairaus syntyy usean perinnöllisen ja ympäristöstä johtuvan tekijän summana. APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy) on peittyvästi periytyvä harvinainen autoimmuunisairaus. Siinä yksi virheellinen geeni riittää taudin puhkeamiseen. Potilailla esiintyy useita eri elimiin kohdistuvia autoimmuunisairauksia, jotka ovat seurausta kudostuhosta mm. hormonirauhasissa. APECED-taudissa virheellinen geeni, AIRE (autoimmune regulator), koodaa kateenkorvassa toimivaa geenien ilmentymisen säätelijäproteiinia. AIREn säätelemät kohdegeenit ohjaavat kehittyviä puolustussoluja, T-soluja, erottamaan kehon omat rakenteet vieraista. AIRE on näin ollen osoittautunut hyvin tärkeäksi ns. immunologisen toleranssin synnylle. AIREn toiminnan mekanismeista tiedetään kuitenkin vielä varsin vähän. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on pyritty valaisemaan AIRE-proteiinin toimintaa tutkimalla erilaisissa solumalleissa AIREn vuorovaikutuksia itsensä ja muiden molekyylien kanssa. Väitöskirjassa kuvattiin mahdollinen mekanismi APECEDin poikkeukselliselle, yhdessä perheessä havaitulle, vallitsevalle periytymiselle. Kyseisen perheen jäsenillä esiintyvä viallinen AIRE-proteiinin muoto kykenee sitomaan tervettä AIRE-proteiinia ja estämään sen toiminnan. Tutkimuksessa kuvattiin lisäksi kaksi uutta proteiiniperhettä, joiden kanssa AIRE on vuorovaikutuksessa. Importiini alfa -proteiini säätelee AIREn tumakuljetusta sitoutuen sen yksiosaiseen klassiseen tumakuljetussignaaliin. AIREn vuorovaikutus E3 SUMO ligaaseina toimivien PIAS-proteiinien kanssa viittaa AIREn ja sumoylaation yhteyteen. Sumoylaatio on yksi keskeisiä tuman toiminnallisen järjestyksen säätelijöitä. Tutkimuksessa osoitettiin, että AIREa itseään ei sumoyloida, mutta AIRE tehostaa SUMO1- ja PIAS1-proteiinien sijoittumista pistemäisiin tumarakenteisiin. Kahdella mallipromoottorilla saadut tutkimustulokset tukevat ai

Hydrophobins are small surface active proteins that are produced by filamentous fungi. The surface activity of hydrophobin proteins leads to the formation of a film at the air-water interface and adsorption to surfaces. The formation of these hydrophobin films and coatings is important in many stages of fungal development. Furthermore, these properties make hydrophobins interesting for potential use in technical applications. The surfactant-like properties of hydrophobins from Trichoderma reesei were studied at the air-water interface, at solid surfaces, and in solution. The hydrophobin HFBI was observed to spontaneously form a cohesive film on a water drop. The film was imaged using atomic force microscopy from both sides, revealing a monomolecular film with a defined molecular structure. The use of hydrophobins as surface immobilization carriers for enzymes was studied using fusion proteins of HFBI or HFBII and an enzyme. Furthermore, sitespecifically modified variants of HFBI were shown to retain their ability to selfassemble at interfaces and to be able to bind a second layer of proteins by biomolecular recognition. In order to understand the function of hydrophobins at interfaces, an understanding of their overall behavior and self-assembly is needed. HFBI and HFBII were shown to associate in solution into dimers and tetramers in a concentration-dependent manner. The association dynamics and protein-protein interactions of HFBI and HFBII were studied using Förster resonance energy transfer and size exclusion chromatography. It was shown that the surface activity of HFBI is not directly dependent on the formation of multimers in solution., Hydrofobiinit ovat rihmasienten tuottamia pieniä pinta-aktiivisia proteiineja. Pinta-aktiivisina molekyyleinä hydrofobiiniproteiinit muodostavat kalvon ilman ja veden rajapinnalle sekä kiinnittyvät kiinteille pinnoille. Näiden kalvojen ja pinnoitteiden muodostuminen on tärkeää monissa rihmasienen yksilönkehityksen vaiheissa. Lisäksi nämä ominaisuudet tekevät hydrofobiineista kiinnostavia molekyylejä teknisiin sovelluksiin. Trichoderma reesei -homeen tuottamien HFBI- ja HFBII-hydrofobiinien pintaaktiivisuusominaisuuksia tutkittiin ilman ja veden rajapinnalla, kiinteillä pinnoilla sekä liuoksessa. HFBI-hydrofobiinin havaittiin muodostavan yhtenäisen kalvon vesipisaran pinnalle. Kalvon molemmat puolet kuvattiin atomivoimamikroskoopilla ja osoitettiin, että kalvo on muodostunut yhdestä hydrofobiinimolekyylikerroksesta, jolla on hyvin järjestäytynyt molekyylitason rakenne. Entsyymien kiinnittämistä pinnoille hydrofobiinien avulla tutkittiin käyttäen HFBI:n tai HFBII:n ja mallientsyymin fuusioproteiineja. Lisäksi osoitettiin, että kohdennetusti muokattu HFBI-muunnos säilyttää kykynsä itsejärjestäytyä rajapinnoilla ja kykenee sitomaan hydrofobiini-kalvon päälle toisen proteiinikerroksen käyttäen biomolekulaarista tunnistusta. Ymmärtääksemme paremmin hydrofobiinien pinta-aktiivisuusominaisuuksia on tarpeen tuntea hydrofobiinien yleisiä ominaisuuksia ja itsejärjestäytymistä. HFBI sekä HFBII yhdistyvät vesiliuoksessa dimeereiksi ja tetrameereiksi, ja reaktio on riippuvainen proteiinien pitoisuudesta. Liuos-multimeerien muodostumisen dynamiikan ja proteiinien välisten vuorovaikutusten tutkimiseen käytettiin Försterresonanssienergiansiirtomenetelmää sekä geelisuodatuskromatografiaa. Tutkimuksessa osoitettiin, että HFBI:n pinta-aktiivisuus ei ole suoraan riippuvainen liuosmultimeerien muodostumisesta.

Terminal oxidases are the final proteins of the respiratory chain in eukaryotes and some bacteria. They catalyze most of the biological oxygen consumption on Earth done by aerobic organisms. During the catalytic reaction terminal oxidases reduce dioxygen to water and use the energy released in this process to maintain the electrochemical proton gradient by functioning as a redox-driven proton pump. This membrane gradient of protons is extremely important for cells as it is used for many cellular processes, such as transportation of substrates and ATP synthesis. Even though the structures of several terminal oxidases are known, they are not sufficient in themselves to explain the molecular mechanism of proton pumping. In this work we have applied a complex approach using a variety of different techniques to address the properties and the mechanism of proton translocation by the terminal oxidases. The combination of direct measurements of pH changes during catalytic turnover, time-resolved potentiometric electrometry and optical spectroscopy, made it possible to obtain valuable information about various aspects of oxidase functioning. We compared oxygen binding properties of terminal oxidases from the distinct heme-copper (CcO) and cytochrome bd families and found that cytochrome bd has a high affinity for oxygen, which is 3 orders of magnitude higher than that of CcO. Interestingly, the difference between CcO and cytochrome bd is not only in higher affinity of the latter to oxygen, but also in the way that each of these enzymes traps oxygen during catalysis. CcO traps oxygen kinetically - the molecule of bound dioxygen is rapidly reduced before it can dissociate. Alternatively, cytochrome bd employs an alternative mechanism of oxygen trapping - part of the redox energy is invested into tight oxygen binding, and the price paid for this is the lack of proton pumping. A single cycle of oxygen reduction to water is characterized by translocation of four protons across th, Terminaaliset oksidaasit ovat eukaryoottien ja joidenkin bakteerien hengitysketjujen viimeisiä proteiineja. Ne katalysoivat suurinta osaa aerobisten organismien biologisesta hapenkulutuksesta maapallolla. Katalyyttisen reaktion aikana terminaaliset oksidaasit pelkistävät molekulaarisen hapen vedeksi ja käyttävät prosessissa vapautuneen energian ylläpitääkseen elektrokemiallista protonigradienttia toimimalla protonipumppuina. Tämä protonien muodostama membraanigradientti on äärimmäisen tärkeä soluille, koska sitä käytetään hyväksi monissa solun toiminnoissa kuten substraattien kuljetuksessa ja ATP synteesissä. Vaikka useiden terminaalisten oksidaasien rakenteet tunnetaan, ne eivät itsessään riitä selittämään protonin pumppauksen molekulaarista mekanismia. Tässä työssä olemme käyttäneet monitahoista lähestymistapaa käyttäen erilaisia tekniikoita tutkiaksemme terminaalisten oksidaasien ominaisuuksia ja protonin pumppauksen mekanismia. Katalyyttisen reaktion aikana tapahtuvien pH:n muutosten mittaaminen sekä aikaerotteisen potentiometrisen elektrometrian ja optisen spektroskopian yhdistelmä mahdollisti arvokkaan tiedon keräämisen oksidaasien toiminnan eri osa-alueista. Me kykenimme vertailemaan terminaalisten oksidaasien hapensitomisominaisuuksia hemi-kuparioksidaasi ja bd-oksidaasi entsyymiperheiden välillä ja havaitsimme, että kyseiset proteiinit käyttävät erilaisia mekanismeja hapen sitomisessa. Hemi-kupari oksidaasit sitovat hapen kineettisesti - sitoutunut happimolekyyli pelkistetään nopeasti ennen kuin se ehtii irrota aktiivisesta keskuksesta, kun taas bd-oksidaasi käyttää hapetus-pelkistus energiaa hapen tiukkaan sitomiseen, ja on siten kykenemätön pumppaamaan protoneja. Yhden happimolekyylin pelkistäminen vedeksi mahdollistaa neljän protonin pumppaamisen kalvon yli. Tuloksemme mahdollistavat katalyyttisen kierron eri vaiheiden ja yksittäisten protoninpumppaus tapahtumien yhteen sovittamisen. Jokainen katalyyttisen kierron protonin pumppaus reaktio ei ole vain yk

The cells of multicellular organisms have differentiated to carry out specific functions that are often accompanied by distinct cell morphology. The actin cytoskeleton is one of the key regulators of cell shape subsequently controlling multiple cellular events including cell migration, cell division, endo- and exocytosis. A large set of actin regulating proteins has evolved to achieve and tightly coordinate this wide range of functions. Some actin regulator proteins have so-called house keeping roles and are essential for all eukaryotic cells, but some have evolved to meet the requirements of more specialized cell-types found in higher organisms enabling complex functions of differentiated organs, such as liver, kidney and brain. Often processes mediated by the actin cytoskeleton, like formation of cellular protrusions during cell migration, are intimately linked to plasma membrane remodeling. Thus, a close cooperation between these two cellular compartments is necessary, yet not much is known about the underlying molecular mechanisms. This study focused on a vertebrate-specific protein called missing-in-metastasis (MIM), which was originally characterized as a metastasis suppressor of bladder cancer. We demonstrated that MIM regulates the dynamics of actin cytoskeleton via its WH2 domain, and is expressed in a cell-type specific manner. Interestingly, further examination showed that the IM-domain of MIM displays a novel membrane tubulation activity, which induces formation of filopodia in cells. Following studies demonstrated that this membrane deformation activity is crucial for cell protrusions driven by MIM. In mammals, there are five members of IM-domain protein family. Functions and expression patterns of these family members have remained poorly characterized. To understand the physiological functions of MIM, we generated MIM knockout mice. MIM-deficient mice display no apparent developmental defects, but instead suffer from progressive renal disease and incr, Monisoluisten eliöiden monimutkaiset fysiologiset toiminnot ovat mahdollisia pitkälle erilaistuneiden solujen ansiosta. Erilaistuneet solut omaksuvat niille tyypillisen morfologian. Aktiinitukiranka on yksi solun muodon pääsäätelijöistä, ja se onkin välttämätön useille solun perustoiminnoille, kuten jakautumiselle, liikkumiselle sekä endo- ja eksosytoosille. Muutokset aktiinitukirangassa ovat keskeisessä osassa myös solujen erilaistumisessa, niin esimerkiksi hermosoluiksi tai maksasoluiksi kuin syöpäsoluiksikin. Aktiinitukirangan toimintaa säädellään erittäin tarkasti lukuisten eri proteiinien avulla. Osa aktiinia säätelevistä proteiineista on kaikille soluille välttämättömiä, kun taas toiset ovat kehittyneet nimenomaan tiettyjen erilaistuneiden solujen tarpeisiin. Usein aktiinitukirangasta riippuvaiset soluprosessit, kuten ulokkeiden muodostus solun liikkuessa, ovat sidoksissa muutoksiin solukalvolla. Solujen täytyykin pystyä tarkasti koordinoimaan aktiinitukirangan ja solukalvon muutoksia, mutta molekyylimekanismit, joilla tämä saavutetaan, ovat hyvin huonosti tunnettuja. Tämän väitöskirjatutkimuksen kohteena on hiljattain löydetty proteiini, MIM (Missing-In-Metastasis), joka alun perin löydettiin virtsarakonsyöpäsolujen aggressiivisuutta vähentävänä tekijänä. Tässä työssä osoitamme, että MIM on solutyyppi-spesifinen proteiini, joka säätelee aktiinitukirankaa WH2-domeeninsa avulla. MIM-proteiinissa on myös IM-domeeni, jonka havaitsimme kaartavan solukalvoa ulospäin. Tämä ennen havaitsematon mekanismi johtaa soluissa filopodioiden, solujen liikkumisessa oleellisten ulokkeiden, muodostumiseen. MIM käyttää hyväkseen näitä kahta domeenia kytkien siten toisiinsa solutukirangan ja solukalvon molekyylitason muutokset. Ymmärtääksemme proteiinin biologista merkitystä paremmin, teimme MIM-poistogeenisen hiirimallin. Havaitsimme, että MIM ei ole välttämätön nisäkkäiden kehitykselle, mutta poistogeeniset hiiret sairastuvat vakavaan munuaistautiin ja altistuvat kasvainten, eri

The pathogenesis of inflammatory rheumatic diseases, including rheumatoid arthritis (RA) and spondyloarthropathies (SpAs) such as reactive arthritis (ReA), is incompletely understood. ReA is a sterile joint inflammation, which may follow a distal infection caused by Gram-negative bacteria that have lipopolysaccharide (LPS) in their outer membrane. The functions of innate immunity that may affect the pathogenesis, prognosis and treatment of these diseases were studied in this thesis. When compared with healthy controls, whole blood monocytes of healthy subjects with previous ReA showed enhanced capacity to produce TNF, an essential proinflammatory cytokine, in response to adherent conditions (mimicking vascular endothelium made adherent by inflammatory signals) and non-specific protein kinase C stimulation. Also, blood neutrophils of these subjects showed high levels of CD11b, an important adhesion molecule, in response to adherence or LPS. Thus, high responsiveness of monocytes and neutrophils when encountering inflammatory stimuli may play a role in the pathogenesis of ReA. The results also suggested that the known risk allele for SpAs, HLA-B27, may be an additive contributor to the observed differences. The promoter polymorphisms TNF 308A and CD14 (gene for an LPS receptor component) 159T were found not to increase the risk of acute arthritis. However, all female patients who developed chronic SpA had 159T and none of them had 308A, possibly reflecting an interplay between hormonal and inflammatory signals in the development of chronic SpA. Among subjects with early RA, those having the polymorphic TLR4 +896G allele (causing the Asp299Gly change in TLR4, another component of LPS receptor) required a combination of disease-modifying antirheumatic drugs to achieve remission. It is known that rapid treatment response is essential in order to maintain the patients work ability. Hence, +896G might be a candidate marker for identifying the patients who need combination, Luonnollinen immuunijärjestelmä käsittää kehon epäspesifiset vieraan materiaalin torjuntakeinot, jotka käynnistyvät nopeasti ennen spesifisen opitun immuniteetin aktivaatiota. Yksi tärkeimmistä luonnollisen immuniteetin toiminnoista on veren syöjäsolujen tarttuminen (adheesio) tulehduksen esiintuomiin molekyyleihin verisuonten seinämissä ja siirtyminen kudokseen hävittämään tulehduksen aiheuttajaa. Luonnollisen immuniteetin solujen keskeisiä reseptoreja ovat adheesiomolekyyli CD11b/CD18 sekä CD14/TLR4/MD-2, joka sitoo Gram-negatiivisten bakteerien LPS-rakennetta käynnistäen solussa mm. tulehdusvälittäjäaine TNF:n tuotannon. Tulehduksellisten reumasairauksien kuten reaktiivisen artriitin (ReA:n) ja nivelreuman (RA:n) patogeneesi tunnetaan puutteellisesti. ReA on spondyloartropatia (SpA) -tautiryhmään kuuluva niveltulehdus, jota edeltää nivelen ulkopuolinen, tyypillisesti Gram-negatiivisen bakteerin aiheuttama infektio. Tutkimuksessa havaittiin, että ReA:n sairastaneiden koehenkilöiden veren syöjäsolujen reaktio adheesioon (TNF-tuotannon käynnistyminen ja CD11b-tason nousu) tai LPS:ään (CD11b-tason nousu) oli voimakkaampi kuin ReA:a sairastamattomien. Täten syöjäsolujen reaktiivisuus voi liittyä ReA:n patogeneesiin. Luonnollisen immuniteetin geenien säätelyalueiden polymorfismit kuten CD14 -159C/T ja TNF -308G/A voivat vaikuttaa geenien luennan aktiivisuuteen ja tulehdusvasteeseen. Tutkimuksessa kaikilla naispotilailla, joilla SpA kroonistui, oli -159T eikä heistä kellään ollut -308A:ta, mikä voi kertoa hormoni- ja tulehdussignaalien yhteisvaikutuksesta SpA:ssa. Keskeistä RA-potilaan työkyvyn säilyttämiseksi on saada nopeasti hyvä hoitovaste. Tulosten perusteella TLR4 +896A/G -polymorfismi voi olla hyödyllinen hoitostrategian suunnittelussa: potilaat, joilla oli G-alleeli, eivät saavuttaneet remissiota yhdellä antireumaattisella lääkkeellä vaan tarvitsivat lääkeyhdistelmää. VEGF on kasvutekijä, joka lisää sekä verisuonten läpäisevyyttä että niiden kasvua, jota tapahtu

The present study analyses the traffic of Hsp150 fusion proteins through the endoplasmic reticulum (ER) of yeast cells, from their post-translational translocation and folding to their exit from the ER via a selective COPI-independent pathway. The reporter proteins used in the present work are: Hsp150p, an O-glycosylated natural secretory protein of Saccharomyces cerevisiae, as well as fusion proteins consisting of a fragment of Hsp150 that facilitates in the yeast ER proper folding of heterologous proteins fused to it. It is thought that newly synthesized polypeptides are kept in an unfolded form by cytosolic chaperones to facilitate the post-translational translocation across the ER membrane. However, beta-lactamase, fused to the Hsp150 fragment, folds in the cytosol into bioactive conformation. Irreversible binding of benzylpenicillin locked beta-lactamase into a globular conformation, and prevented the translocation of the fusion protein. This indicates that under normal conditions the beta-lactamase portion unfolds for translocation. Cytosolic machinery must be responsible for the unfolding. The unfolding is a prerequisite for translocation through the Sec61 channel into the lumen of the ER, where the polypeptide is again folded into a bioactive and secretion-competent conformation. Lhs1p is a member of the Hsp70 family, which functions in the conformational repair of misfolded proteins in the yeast ER. It contains Hsp70 motifs, thus it has been thought to be an ATPase, like other Hsp70 members. In order to understand its activity, authentic Lhs1p and its recombinant forms expressed in E. coli, were purified. However, no ATPase activity of Lhs1p could be detected. Nor could physical interaction between Lhs1p and activators of the ER Hsp70 chaperone Kar2p, such as the J-domain proteins Sec63p, Scj1p, and Jem1p and the nucleotide exchange factor Sil1p, be demonstrated. The domain structure of Lhs1p was modelled, and found to consist of an ATPase-like domain, a do

Air/surface exchange of mercury was investigated over background soils at five sites in the Tahquamenon River watershed in the Michigan Upper Peninsula in the summer of 1998. Measurements of Hg fluxes were performed during middayperiods using the ORNL Teflon dynamic flux chamber. Mean Hg emission fluxes were 1.4??0.3???2.4??1.0 ng m -2 hr -1 for three shaded forest sites and 7.6??1.7 ng m -2 hr -1 for an open field site. Hg dry deposition was observed at a heavily shaded forest site overwet soils (mean =???0.3??0.2 ng m -2 hr -1). Theoverall mean Hg flux was 1.4??1.4 ng m -2 hr -1 for the four shaded forest sites. The Hg fluxes observed at these sites are similar to those found at other northern background sites. Significant, rapid response of Hg emission to solar radiation was observed over these background soils. Artificial irrigation over these soils induced immediate andmeasurable increases in Hg emission. Soil temperature was found to be less influential to Hg air/surface exchange over these heavily shaded forest background soils than we have seen elsewhere.

Calculations of the daily solar radiation incident at the tops of the atmospheres of Mars and the outer planets and its variability with latitude and season are presented in a series of figures and tables similar to those for Earth in The Smithsonian Meteorological Tables. The changes in the latitudinal and seasonal distributions of daily surface insolation during the great Martian dust storm of 1971 (when Martian atmospheric optical depth increased from about [tau] = 0.1 to 2.0 were significant and dramatically illustrate the effect of atmospheric aerosols on surface insolation; i.e., the mean annual daily insolation at the poles decreased by more than a factor of 100 as [tau] increased from 0.1 to 2.0.

Molecular motors are proteins that convert chemical energy into mechanical work. The viral packaging ATPase P4 is a hexameric molecular motor that translocates RNA into preformed viral capsids. P4 belongs to the ubiquitous class of hexameric helicases. Although its structure is known, the mechanism of RNA translocation remains elusive. Here we present a detailed kinetic study of nucleotide binding, hydrolysis, and product release by P4. We propose a stochastic-sequential cooperative model to describe the coordination of ATP hydrolysis within the hexamer. In this model the apparent cooperativity is a result of hydrolysis stimulation by ATP and RNA binding to neighboring subunits rather than cooperative nucleotide binding. Simultaneous interaction of neighboring subunits with RNA makes the otherwise random hydrolysis sequential and processive. Further, we use hydrogen/deuterium exchange detected by high resolution mass spectrometry to visualize P4 conformational dynamics during the catalytic cycle. Concerted changes of exchange kinetics reveal a cooperative unit that dynamically links ATP binding sites and the central RNA binding channel. The cooperative unit is compatible with the structure-based model in which translocation is effected by conformational changes of a limited protein region. Deuterium labeling also discloses the transition state associated with RNA loading which proceeds via opening of the hexameric ring. Hydrogen/deuterium exchange is further used to delineate the interactions of the P4 hexamer with the viral procapsid. P4 associates with the procapsid via its C-terminal face. The interactions stabilize subunit interfaces within the hexamer. The conformation of the virus-bound hexamer is more stable than the hexamer in solution, which is prone to spontaneous ring openings. We propose that the stabilization within the viral capsid increases the packaging processivity and confers selectivity during RNA loading. Finally, we use single molecule technique

Viral genomes are encapsidated within protective protein shells. This encapsidation can be achieved either by a co-condensation reaction of the nucleic acid and coat proteins, or by first forming empty viral particles which are subsequently packaged with nucleic acid, the latter mechanism being typical for many dsDNA bacteriophages. Bacteriophage PRD1 is an icosahedral, non-tailed dsDNA virus that has an internal lipid membrane, the hallmark of the Tectiviridae family. Although PRD1 has been known to assemble empty particles into which the genome is subsequently packaged, the mechanism for this has been unknown, and there has been no evidence for a separate packaging vertex, similar to the portal structures used for packaging in the tailed bacteriophages and herpesviruses. In this study, a unique DNA packaging vertex was identified for PRD1, containing the packaging ATPase P9, packaging factor P6 and two small membrane proteins, P20 and P22, extending the packaging vertex to the internal membrane. Lack of small membrane protein P20 was shown to totally abolish packaging, making it an essential part of the PRD1 packaging mechanism. The minor capsid proteins P6 was shown to be an important packaging factor, its absence leading to greatly reduced packaging efficiency. An in vitro DNA packaging mechanism consisting of recombinant packaging ATPase P9, empty procapsids and mutant PRD1 DNA with a LacZ-insert was developed for the analysis of PRD1 packaging, the first such system ever for a virus containing an internal membrane. A new tectiviral sequence, a linear plasmid called pBClin15, was identified in Bacillus cereus, providing material for sequence analysis of the tectiviruses. Analysis of PRD1 P9 and other putative tectiviral ATPase sequences revealed several conserved sequence motifs, among them a new tectiviral packaging ATPase motif. Mutagenesis studies on PRD1 P9 were used to confirm the significance of the motifs. P9-type putative ATPase sequences carrying a si, Virukset muodostuvat perimäaineksesta, DNA:sta tai RNA:sta, ja sitä ympäröivästä proteiinikuoresta. Viruksen perimän pakkaaminen proteiinikuoren sisään on tärkeä osa viruksen elinkiertoa solussa, ja kuori varjelee perimäainesta ympäristön rasituksilta viruksen ollessa solun ulkopuolella. Virus voi rakentua joko siten, että kuoriproteiinimolekyylit sitoutuvat perimään, ja perimä ja kuoriproteiinit tiivistyvät valmiiksi virukseksi, tai rakentamalla pallomainen, tyhjä proteiinikuori ensin, minkä jälkeen perimä pakataan kuoren sisään. Bakteriofagi eli bakteerivirus PRD1 on muodoltaan ikosaedri (12-kulmio), mutta poikkeuksellisen PRD1:stä tekee sen proteiinikuoren alla oleva rasvakalvo. Vaikka PRD1:stä on tiedetty, että virus rakentuu tyhjien kuorien eli prokapsidien kautta, tarkkaa mekanismia PRD1:n tai minkään sisäkalvollisen viruksen DNA:n pakkaukselle ei ole aikaisemmin tunnettu. Tässä väitöskirjatyössä on tunnistettu useita PRD1:n pakkauksessa toimivia virusproteiineja sekä havaittu niiden sijaitsevan yhdessä kulmassa, erillään kuoren muissa kulmissa sijaitsevista isäntäsolun tunnistukseen tarvittavista proteiineista. Työssä on tutkittu PRD1:n eri pakkausproteiinien toimintaa, ja mm. kehitetty PRD1:lle ns. in vitro -pakkausmenetelmä, jossa DNA:ta voidaan pakata tyhjiin prokapsideihin koeputkessa, ilman eläviä soluja. Virukset voivat lysogenisoitua, eli vaipua lepotilaan, jossa uusia viruksia ei tuoteta eikä isäntäsolu tuhoudu. Joskus tässä tilassa olevan viruksen perimään voi osua haitallinen mutaatio, joka estää virusta aktivoitumasta. Työssä tunnistettiin bioinformatiikan keinoin PRD1:n ja sen sukulaisen Bam35-viruksen kaltaiseksi eräs Bacillus cereus -bakteerin perimästä löytynyt osa, pBCLin15. pBClin15:n arvellaan olevan joko lepotilassa oleva virus tai mutaatioita kerännyt viruksen jäänne. Työssä havaittiin myös Bam35:n voivan lysogenisoitua. PRD1:n kuoriproteiinin rakenteen on aiemmin todettu olevan hyvin samankaltainen mm. ihmisen adenoviruksen kuoriproteiini

Plasma phospholipid transfer protein (PLTP) plays a crucial role in high-density lipoprotein (HDL) metabolism and reverse cholesterol transport (RCT). It mediates the generation of pre-beta-HDL particles, enhances the cholesterol efflux from peripheral cells to pre-beta-HDL, and metabolically maintains the plasma HDL levels by facilitating the transfer of post-lipolytic surface remnants of triglyceride-rich lipoproteins to HDL. In addition to the antiatherogenic properties, recent findings indicate that PLTP has also proatherogenic characteristics, and that these opposite characteristics of PLTP are dependent on the site of PLTP expression and action. In human plasma, PLTP exists in a high-activity (HA-PLTP) and a low-activity form (LA-PLTP), which are associated with macromolecular complexes of different size and composition. The aims of this thesis were to isolate the two PLTP forms from human plasma, to characterize the molecular complexes in which the HA- and LA-PLTP reside, and to study the interactions of the PLTP forms with apolipoproteins (apo) and the ability of apolipoproteins to regulate PLTP activity. In addition, we aimed to study the distribution of the two PLTP forms in a Finnish population sample as well as to find possible regulatory factors for PLTP by investigating the influence of lipid and glucose metabolism on the balance between the HA- and LA-PLTP. For these purposes, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) capable of determining the serum total PLTP concentration and quantitating the two PLTP forms separately was developed. In this thesis, it was demonstrated that the HA-PLTP isolated from human plasma copurified with apoE, whereas the LA-PLTP formed a complex with apoA-I. The separation of these two PLTP forms was carried out by a dextran sulfate (DxSO4)-CaCl2 precipitation of plasma samples before the mass determination. A similar immunoreactivity of the two PLTP forms in the ELISA could be reached after a partial sample denaturation, Plasman fosfolipidin siirtäjäproteiinilla (PLTP) on tärkeä merkitys high-density -lipoproteiinien (HDL) aineenvaihdunnassa ja kolesterolin takaisinkuljetusjärjestelmässä. PLTP kykenee muodostamaan pre-beta-HDL partikkeleita, lisäämään kolesterolin ulosvirtausta soluista näille partikkeleille, sekä ylläpitämään plasman HDL-tasoja kuljettamalla lipolyysin yhteydessä muodostuvia triglyseridi-pitoisten partikkeleiden fosfolipidijäämiä HDL-partikkeleille. Ateroskleroosin kehittymiseltä suojaavien ominaisuuksien lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet, että PLTP:lla on myös ateroskleroosia edistäviä ominaisuuksia, ja että nämä vastakkaiset ominaisuudet ovat riippuvaisia PLTP:n ilmentymis- ja toimintaympäristöstä elimistössä. Ihmisen verenkierrossa PLTP esiintyy aktiivisessa (high-activity, HA-PLTP) ja matala-aktiivisessa muodossa (low-activity, LA-PLTP), jotka molemmat ovat liittyneinä kooltaan ja koostumukseltaan toisistaan eroaviin makromolekulaarisiin rakenteisiin. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli eristää nämä kaksi PLTP-muotoa ihmisen verenkierrosta, karakterisoida molekyylirakenteet, joihin HA- ja LA-PLTP ovat liittyneinä, sekä tutkia PLTP-muotojen vuorovaikutusta apolipoproteiinien (apo) kanssa ja näiden kykyä säädellä PLTP:n aktiivisuutta. Lisäksi tavoitteena oli tutkia PLTP-muotojen esiintymistä suomalaisessa näyteaineistossa, sekä löytää mahdollisia PLTP:n säätelytekijöitä tutkimalla sekä lipidi- että glukoosiaineenvaihdunnan vaikutusta HA- ja LA-PLTP:n väliseen tasapainoon. Tähän tarkoitukseen kehitettiin entsyymi-immunokemiallinen menetelmä (ELISA) PLTP:n kokonaispitoisuuden ja kahden eri PLTP-muodon pitoisuuksien määrittämiseksi. Tässä väitöskirjatyössä osoitettiin, että ihmisen verenkierrosta eristetty HA-PLTP -molekyylikompleksi sisältää myös apoE:tä, kun taas LA-PLTP muodostaa kompleksin apoA-I:n kanssa. Nämä kaksi PLTP-muotoa erotettiin toisistaan saostamalla plasmanäytteet dekstraanisulfaatti (DxSO4)-CaCl2:lla ennen pitoisuuksien määrittämistä. PLTP:n e

Transposable elements, transposons, are discrete DNA segments that are able to move or copy themselves from one locus to another within or between their host genome(s) without a requirement for DNA homology. They are abundant residents in virtually all the genomes studied, for instance, the genomic portion of TEs is approximately 3% in Saccharomyces cerevisiae, 45% in humans, and apparently more than 70% in some plant genomes such as maize and barley. Transposons plays essential role in genome evolution, in lateral transfer of antibiotic resistance genes among bacteria and in life cycle of certain viruses such as HIV-1 and bacteriophage Mu. Despite the diversity of transposable elements they all use a fundamentally similar mechanism called transpositional DNA recombination (transposition) for the movement within and between the genomes of their host organisms. The DNA breakage and joining reactions that underlie their transposition are chemically similar in virtually all known transposition systems. The similarity of the reactions is also reflected in the structure and function of the catalyzing enzymes, transposases and integrases. The transposition reactions take place within the context of a transposition machinery, which can be particularly complex, as in the case of the VLP (virus like particle) machinery of retroelements, which in vivo contains RNA or cDNA and a number of element encoded structural and catalytic proteins. Yet, the minimal core machinery required for transposition comprises a multimer of transposase or integrase proteins and their binding sites at the element DNA ends only. Although the chemistry of DNA transposition is fairly well characterized, the components and function of the transposition machinery have been investigated in detail for only a small group of elements. This work focuses on the identification, characterization, and functional studies of the molecular components of the transposition machineries of BARE-1, Hin-Mu and Mu. For BA, Kaikkien eliöiden perimä koostuu geeneistä jotka ohjeistavat elintärkeitä toimintoja, sekä ns. toistuvista DNA-jaksoista joiden osuus perimästä vaihtelee, ollen bakteereilla n. 3%, ihmisellä 45% ja joillain kasveilla jopa yli 70%. Näitä toistojaksoja pidettiin aikoinaan turhana "roska DNA:na" koska niiden toiminnasta ei ollut tietoa. Liikkuvat geneettiset elementit, "hyppivät geenit" eli transposonit ovat osa tätä toistuvaa DNA:ta. Tänä päivänä tiedetään että näillä elementeillä on tärkeä merkitys perimän evoluutiossa, ja jopa geenien synnyssä. Esimerkiksi nisäkkäiden immuunipuolustuksen vasta-ainegeenien uudelleenjärjestelymekanismin ajatellaan kehittyneen transposonisysteemistä. Bakteereilla antibioottien vastustuskykyä koodaavat geenit siirtyvät usein solusta toiseen transposonien välityksellä. Myös eräät virukset kuten HIV-1 ja bakteerivirus Mu toimivat kuten transposonit. Huolimatta transposonien monimuotoisuudesta ne kaikki käyttävät hyvin samanlaista liikkumismekanismia, transpositiota. Transposonit kokoavat transpositiokoneiston jossa yksinkertaisimmillaan transposaasi proteiinit ovat sitoutuneet transposoni DNA:n päihin muodostaen DNA-proteiinikompleksin (ydinkoneiston). Tässä kompleksissa transposaasi katalysoi kemialliset reaktiot, DNA:n katkaisun ja uudelleen liittämisen, ja tämän koneiston avulla transposoni liikkuu paikasta toiseen. Se kuinka nämä koneistot kootaan ja kuinka ne molekyylitasolla toimivat määrittää monia ominaisuuksia transposonin elinkierrossa. Tässä työssä tutkittiin kolmen transposonin transpositiokoneistoja, tunnistettiin niiden molekulaariset (proteiini ja DNA) komponentit, sekä tutkittiin niiden ominaispiirteitä ja toiminnallisuutta. Ensimmäisessä osassa tutkimme ohran retrotransposonia, BARE-1:a, jonka elämänkiertoon oletettavasti kuuluu RNA välivaihe ja viruksen kaltaiset partikkelit (VLP:t), jotka muistuttavat rakenteeltaan ja toiminnaltaan viruksia ja toimivat retrotransposonin transpositiokoneistona. Etsimme ohran solu-uutteis