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Orientador: Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) constitui uma doença que afeta todos os cultivares comerciais de citros e é uma ameaça para a citricultura brasileira. A doença é caracterizada pela formação de pústulas, devido à hiperplasia e hipertrofia induzida pela bactéria. A patogenicidade de Xac é dependente do sistema secretório tipo III, que transloca proteínas efetoras pertencentes à família AvrBs3/PthA para dentro da célula hospedeira. Estudos recentes mostram que PthAs funcionam como fatores de transcrição no hospedeiro, transativando genes específicos da planta que irão beneficiar a bactéria ou desencadear uma resposta de defesa. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação de PthAs como ativadores da transcrição, nosso laboratório identificou, através da técnica de duplo-híbrido, várias proteínas de laranja (Citrus sinensis) que interagiram com diferentes PthAs. Entre elas, destacamos uma ciclofilina (CsCyp), que realiza isomerização de resíduos de prolina, uma proteína com domínio tioredoxina (CsTdx), relacionada com interação proteína-proteína e redução de pontes dissulfeto e uma cisteína protease (CsCP), envolvida na resposta de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e funcional de CsCyp. A resolução da estrutura de CsCyp mostrou que CsCyp pertence ao grupo de ciclofilinas divergentes que possuem um loop adicional (KSGKPLH), duas cisteínas invariáveis (C40 e C168) e um glutamato (E83) conservado. Este último interage com resíduos do loop, estabilizando-o. A função destes elementos era desconhecida até o momento e o trabalho visou elucidar sua atuação na regulação da atividade PPIase da proteína. Neste trabalho, verificamos que C40 e C168 formam uma ponte dissulfeto. Dados de modelagem e simulação suportaram a hipótese de que a formação da ponte dissulfeto induz mudanças conformacionais que quebram a interação do E83 com o loop divergente, levando ao fechamento do sítio ativo de CsCyp. O estudo descreveu, portanto um mecanismo de regulação redox, que controla a atividade PPIase da proteína. Adicionalmente, mostrou-se que CsTdx interage com CsCyp através dos resíduos conservados C40 e C168, sendo críticos para tal interação. Foi mostrado também que CsCyp interage com o domínio C-terminal (CTD) da RNA Polimerase II (RNA Pol II), especificamente com a repetição YSPSAP. Surpreendentemente, através da transformação de plantas com construções para silenciamento e superexpressão de CsCyp, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsCyp apresentaram um aumento dos sintomas do cancro cítrico quando infiltradas com Xac, enquanto que plantas com níveis aumentados de CsCyp apresentaram sintomas reduzidos quando infiltradas com Xac, indicando que CsCyp tem papel importante no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. Este trabalho também mostra a expressão e purificação das proteínas CsTdx e CsCP e a comprovação de que CsCP interage com PthAs 2 e 3 através de ensaios de duplo-híbrido Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a disease that affects most species of the genus Citrus and represents a threat to the Brazilian citrus industry. The disease is characterized by the formation of pustules due to hyperplasia and hypertrophy induced by the bacteria. Xac pathogenicity is dependent on a type III secretory system that translocates effector proteins which belongs to AvrBs3/PthA family inside the host cell. Recent studies showed that these proteins work as transcriptional factors that transactivate specific plant genes which will either benefit the bacteria or trigger defense response. To gain insights into PthA mechanism of action as transcription activators, our laboratory identified that PthA targeted the citrus protein complex comprising the thioredoxin CsTdx, ubiquitin-conjugating enzymes CsUev/Ubc13 and cyclophilin CsCyp. Also, we showed previously that the CsCyp binds the citrus thioredoxin CsTdx and the C-terminal domain of RNA Polymerase II (CTD), and that CsCyp complements the function of Cpr1 and Ess1, two yeast prolyl-isomerases that regulate transcription by the isomerization of proline residues of the regulatory C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II. In this work we solved the 3D structure of CsCyp in complex with its inhibitor cyclosporine A (CsA), showing that CsCyp is a divergent cyclophilin that carries the additional loop KSGKPLH, invariable cysteines C40 and C168, and conserved glutamate E83. Despite the suggested roles in ATP and metal binding, the function of these unique structural elements remains unknown. Here we show that the conserved cysteines form a disulfide bond that inactivates the enzyme, whereas E83, which belongs to the catalytic loop and is also critical for enzyme activity, is anchored to the divergent loop to maintain the active site open. In addition, we demonstrate that C40 and C168 are required for the interaction with CsTdx and that CsCyp binds the citrus CTD YSPSAP repeat. Our data support the model where formation of the C40- C168 disulfide bond induces a conformational change that disrupts the interaction of the divergent and catalytic loops, via E83, causing the active site to close. This suggests a new type of allosteric regulation in divergent cyclophilins, involving disulfide bond formation and a loop displacement mechanism. Moreover, we present evidence that PthA2 inhibits the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPIase) activity of CsCyp in a similar fashion as CsA, and that silencing of CsCyp, as well as treatments with CsA, enhance canker lesions in Xac-infected leaves. Given that CsCyp appears to function as a negative regulator of cell growth and that Ess1 negatively regulates transcription elongation in yeast, we propose that PthAs activate host transcription by inhibiting the PPIase activity of CsCyp on the CTD Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. Resumo: O piruvato é considerado o ponto central do metabolismo celular, chave para a geração de energia e blocos biossintéticos. Quando a oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico é necessária, o piruvato citosólico deve ganhar acesso à matriz mitocondrial em um processo que se acredita envolver ativamente duas subunidades carreadoras de piruvato mitocondrial (MPC) organizadas em hetero-oligômeros. Desde 2012, quando as identidades moleculares de mamíferos MPC1 e MPC2 (e MPC3 em leveduras) foram finalmente apresentadas, vários estudos in vitro e in vivo revelaram uma interação inesperada entre duas ou mesmo três subunidades de proteínas que definem diferentes conjuntos funcionais, em um contexto metabólicos específicos; estes têm implicações claras na fisiologia da homeostase e em algumas doenças. No entanto, o mecanismo funcional baseado em estrutura de MPC permanece indefinido, apesar dos intensos esforços empregando ferramentas computacionais e técnicas experimentais de última geração. Nesta tese, a produção recombinante de MPC humano, através de uma estratégia de co-expressão, é incialmente descrita; no entanto, não foi observada formação substancial de complexos e, predominantemente, subunidades individuais foram purificadas. Em contraste com MPC1, que co-purifica com uma chaperona de levedura, demonstramos que os homo-oligômeros MPC2 promovem o transporte eficiente do piruvato em proteolipossomos. Os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas do MPC2 assemelham-se aos demonstrados anteriormente para o MPC na literatura. De maneira distinta, a inibição química do transporte é observada apenas para um derivado de tiazolidinediona. O papel de transporte autônomo para MPC2 é validado em células, quando a expressão ectópica de MPC2 humano em levedura sem MPC endógeno estimulou o crescimento e aumentou o consumo de oxigênio celular. A detecção de várias espécies oligoméricas de MPC2 em isolados mitocondriais, proteínas purificadas e bicamadas lipídicas artificiais sugerem complexos funcionais de alta ordem (> 2 subunidades). Mudanças significativas no conteúdo da estrutura secundária de MPC2, conforme sondado por dicroísmo circular de radiação sincrotron, suportam ainda mais a interação entre a proteína e os ligantes. A cristalografia de raios X foi prejudicada pela incapacidade de se obter cristais adequados tanto, por difusão de vapor, quanto em fase cúbica lipídica, apesar da obtenção de condições iniciais promissoras. Por fim, a análise por crio-microscopia eletrônica de MPC2 reconstituído em nanodiscos de copolímeros sintéticos permitiu a proposição de uma montagem estequiométrica para o complexo. Coletivamente, nossos resultados fornecem bases para o papel independente do MPC2 na homeostase e doenças relacionadas ao metabolismo desregulado do piruvato e representam uma rota promissora para a determinação de um modelo atômico de alta resolução para MPC2 humano. Abstract: Pyruvate is considered the central hub in the cellular metabolism, key for the generation of both energy and biosynthetic blocks. When the oxidation of pyruvate by the citric acid cycle is required, cytosolic pyruvate must gain access to the mitochondrial matrix in a process thought to actively involve two mitochondrial pyruvate carrier (MPC) subunits assembled into heterotypic oligomers. Since 2012, when molecular identities of mammalian MPC1 and MPC2 (and MPC3 in yeast) were presented, range of in vitro and in vivo studies has since revealed an unexpected interplay between two or even three protein subunits that define different functional assemblies on a metabolic context-specific basis; these have clear implications on the physiology of homeostasis and diseases. However, the structure-based functional mechanism of MPC remains elusive, despite intensive efforts by different research groups that employ state-of-the-art computational tools and experimental techniques. In this thesis, the recombinant production of human MPC through a co-expression strategy is first described; nevertheless, substantial complex formation was not observed, and predominantly individual subunits were purified. In contrast to MPC1, which co-purifies with a host chaperone, we demonstrated that MPC2 homo-oligomers promote efficient pyruvate transport into proteoliposomes. The derived functional requirements and kinetic features of MPC2 resemble those previously demonstrated for MPC in the literature. Distinctly, chemical inhibition of transport is observed only for a thiazolidinedione derivative. The autonomous transport role for MPC2 is validated in cells when the ectopic expression of human MPC2 in yeast lacking endogenous MPC stimulated growth and increased oxygen consumption. Multiple oligomeric species of MPC2 across mitochondrial isolates, purified protein and artificial lipid bilayers suggest functional high-order complexes. Significant changes in the secondary structure content of MPC2, as probed by synchrotron radiation circular dichroism, further supports the interaction between the protein and ligands. X-ray crystallography was hampered by the inability to grow suitable crystals by vapor diffusion and in lipidic cubic phase, despite the successful obtention of promising hit conditions. Lastly, cryo-electron microscopy analysis of MPC2 reconstituted into synthetic copolymer nanodiscs allowed for the proposition of a stoichiometric assembly. Collectively, our results provide the initial framework for the independent role of MPC2 in homeostasis and diseases related to dysregulated pyruvate metabolism and may represent a promising route for the determination of a high-resolution atomic model for human MPC2. Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES 001 FAPESP 2015/02734-7; 2019/02261-2

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A manutenção da proteostase é realizada por um sistema de controle de qualidade de proteínas, composto pelas chaperonas moleculares e pelo proteossoma. Entre essas chaperonas, Hsp90 é essencial para a proliferação celular, participando de processos como o enovelamento de proteínas-cliente e a regulação de proteínas envolvidas em sinalização celular. A atividade da Hsp90 é modulada pelas co-chaperonas, que influenciam no ciclo de ATPase e garantem especificidade. Um conjunto de co-chaperonas da Hsp90 possuem um ou mais domínios TPR (tetratricopeptide repeat), os quais interagem com o motivo MEEVD no C-terminal da Hsp90. Entre as interatoras de Hsp90, neste trabalho foram caracterizadas estrutural e funcionalmente a SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), que participa da translocação de proteínas ancoradas em membranas, e o complexo R2TP (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), o qual está envolvido na montagem e estabilização de complexos que participam de vários processos biológicos essenciais para a célula e interage com a Hsp90 através da subunidade Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – ambos de Aedes aegypti. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas com alto grau de pureza. Foram avaliados a estrutura secundária, estabilidade térmica e os parâmetros hidrodinâmicos das proteínas. Hsp90, SGT e Rvb1/Rvb2 foram também analisadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Finalmente, foram realizados experimentos de caracterização funcional e de interação entre as proteínas. A Hsp90 de Aedes aegypti apresentou atividade ATPásica com eficiência catalítica de 5,51 x 10-4 min-1 µM-1, condizente com suas ortólogas. Além disso, manteve um estado conformacional aberto durante todo o ciclo de ATPase, semelhante à Hsp90 humana e diferindo das Hsp90 de E. coli e levedura. Ainda, mostramos pela primeira vez que Hsp90 tem sua expressão aumentada em células de Aedes albopictus expostas a choque térmico, condizente com uma proteína requerida em situações de estresse. A SGT de Aedes aegypti mostrou ser uma proteína dimérica, não esférica e semelhante à SGT humana, mas diferente das SGTs de Leishmania braziliensis e de levedura. Interessantemente, demonstramos que mesmo na ausência da região C-terminal, a SGT de Aedes aegypti mantém uma estrutura globular, diferentemente do sugerido para a SGT humana. Finalmente, para as proteínas componentes do complexo R2TP, observamos que as Rvbs compõem um heterododecâmero; RPAP3 mostrou-se majoritariamente monomérica, e Pih1D1 mostrou equilíbrio concentração-dependente entre monômero e dímero. Interessantemente, Pih1D1 apresentou-se estável, diferindo de suas ortólogas. Ainda, avançamos na reconstituição do complexo R2TP in vitro. A caracterização dessas proteínas (Hsp90, SGT e complexo R2TP) de Aedes aegypti é importante pois pode contribuir para o entendimento do sistema de controle de qualidade de proteínas neste organismo, vetor de doenças tão importantes no contexto nacional Abstract: Proteostasis is maintained by the protein quality control system, constituted by molecular chaperones and the proteasome. Among these chaperones, Hsp90 is essential for cell growth, having a role in protein folding and regulation of signaling proteins. Hsp90’s activity is modulated by its co-chaperones, which influences its ATPase cycle and gives specificity. A group of Hsp90’s co-chaperone involves TPR-containing proteins, that interact with the MEEVD motif localized in the C-terminus of Hsp90. In this work, Hsp90’s interactors were structurally and functionally characterized: SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), that participates of the translocation of tail-anchored proteins, and R2TP complex (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), which is involved in the assembly and stabilization of complexes associated with several essential processes and interacts with Hsp90 via Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – both from Aedes aegypti. Proteins were expressed in E. coli and purified with high purity and their secondary structure, thermal stability and hydrodynamic parameters were determined. Hsp90, SGT and Rvb1/Rvb2 were also studied by small angle X-ray scattering. Finally, functional and interaction experiments were conducted. Aedes aegypti Hsp90 showed low ATPase activity, which is in good agreement with that of its orthologues. Furthermore, it maintained an open conformational state during the entire ATPase cycle, similar to human Hsp90 but different from E. coli and yeast Hsp90. Moreover, it was observed an increase in Hsp90 expression upon heat-treatment, which is in good agreement with a protein that is required for this type of stress. Aedes aegypti SGT was a dimer with a non-spherical shape and similar to the human SGT, but different from Leishmania braziliensis and yeast SGTs. Surprisingly, even deleted from its C-terminus, SGT maintained its globular structure, which is different from the suggested for human SGT. Finally, Rvbs were shown as a heterododecamer, RPAP3 was mainly a monomer and Pih1D1 was in a concentration-dependent equilibrium among monomer and dimer. Unexpectedly, Pih1D1 was found to be stable, different from its orthologues. Additionally, we showed evidence of the in vitro assemble of the Aedes aegypti R2TP complex. The characterization of these proteins (Hsp90, SGT and R2TP) is important because it may contribute to the comprehension of the protein quality control system in Aedes aegypti, which is a vector of many diseases Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2014/25967-4 CAPES 88887.137523/2017-00

Orientador: Mário Tyago Murakami Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Peroxirredoxinas (Prxs) 2-Cys da subfamília Prx1 são peroxidases, com duas cisteínas catalíticas, que regulam os níveis intracelulares de H2O2, além de estarem envolvidas na sinalização celular e de assumirem atividade chaperona em certas condições. Todas as suas funções são reguladas por mudanças na estrutura quaternária induzidas por múltiplos fatores, tais como estado redox, modificações pós-traducionais e pH. Entretanto, as bases moleculares que regulam esses fenômenos ainda não são totalmente compreendidas. As Prxs mitocondriais (Prx1m) de Leishmania, por exemplo, exibem a dupla função de peroxidases e chaperonas moleculares, porém somente a última é crucial para a sobrevivência do parasita no hospedeiro humano. Estudos recentes in vitro mostraram que, quando decamérica e reduzida, Prx1m de Leishmania infantum constitui uma chaperona ativa, enquanto dímeros oxidados são inativos. Neste trabalho foram resolvidas as estruturas cristalográficas da Prx1m de Leishmania braziliensis (LbPrx1m) nas formas dimérica e decamérica, mostrando que alterações conformacionais na região I do loop catalítico estão associadas ao processo de decamerização. Pela primeira vez, foram obtidos dados estruturais de um membro da subfamília Prx1 em dois estados oligoméricos, induzidos por mudanças de pH. Com base nesses dados, desvendamos o mecanismo molecular pelo qual o pH modula a conversão entre dímeros e decâmeros, o qual parece ser fisiologicamente relevante e altamente conservado na subfamília Prx1. Além disso, foi demonstrado que os cátions divalentes Ca2+ e Mg2+ - os quais desempenham papéis importantes no metabolismo na mitocôndria - ativam a função chaperona de Prx1m e estimulam a atividade peroxidase, através de um mecanismo de estabilização de decâmeros inédito e exclusivo de Prxs mitocondriais de Leishmania. Utilizando um mutante dimérico constitutivo de LbPrx1m, cuja oligomerização não é influenciada pelo pH, cátions divalentes ou estado redox, demonstramos que a formação de decâmeros é um pré-requisito não somente para a função peroxidase, mas também para a função chaperona de Prx1m, sendo necessária para conferir resistência à Leishmania infantum frente ao estresse térmico sofrido durante a transição do inseto para o hospedeiro humano. Em conjunto, nossos resultados mostram que concentrações basais de Ca2+ e Mg2+ encontrados na matriz mitocondrial dão suporte à função dupla de Prx1m em Leishmania, enquanto pequenas quedas de pH e altos níveis de Ca2+ podem aumentar o reservatório mitocondrial de chaperonas de Prx1m. Esses dados implicam que a busca de compostos que previnam a decamerização da Prx1m de Leishmania representa uma boa estratégia para inibir a função chaperona desse atrativo alvo terapêutico Abstract: 2-Cys peroxiredoxins (Prxs) from Prx1 subfamily are Cys-based peroxidases that control intracellular levels of H2O2 besides being involved in cell signaling pathways and assuming chaperone function under specific conditions. The regulation of their functions involves changes in their quaternary structure which are induced by multiple factors, such as redox state, posttranslational modifications and pH. However, there is still a lack of information about the molecular basis for these phenomena. The mitochondrial 2-Cys peroxiredoxin (Prx1m) from Leishmania, for example, exhibits dual peroxidase and chaperone functions, but only the latter is crucial for the parasite survival in the mammalian host. Recent in vitro studies indicated that reduced Leishmania infantum Prx1m forms chaperone-active decamers, whereas the oxidized protein dissociates into chaperone-inactive dimers. Herein, we solved the crystal structures of Leishmania braziliensis Prx1m (LbPrx1m) in both dimeric and decameric forms, showing that conformational changes of the region I from the catalytic loop are associated with the decamerization process. We provided, for the first time to our knowledge, structural data of a Prx1 member in two different oligomeric states induced by pH variations. Based on these data, we unveiled the molecular mechanism of pH modulation in dimers/decamers conversion. This mechanism might be extended to other peroxiredoxins and seems to be physiologically relevant. Moreover, we demonstrated that the divalent cations Ca2+ and Mg2+ - which play key roles in mitochondrial metabolism ¿ activate the chaperone function of oxidized Prx1m and stimulate the catalytic activity via a novel and exclusive mechanism of decamer stabilization of mitochondrial Prxs from Leshmania. Using a dimeric mutant of LbPrx1m unable to decamerize by pH, cation influence, or redox state, we also demonstrated that decamer formation is a pre-requisite not only for the peroxidase function of Prx1m but also for the chaperone activity, being essential to provide to Leishmania infantum resistance against heat stress during the transition from insect to the mammalian hosts. Together, our results showed that basal concentrations of Ca2+ and Mg2+, found in the mitochondrial matrix, support the dual function of Prx1m from Leishmania, whereas small decreases in pH or increased Ca2+ levels regulate the mitochondrial reservoir of chaperone-active Prx1m. Our findings imply that the search for compounds that prevent Leishmania Prx1m decamerization represents a promising strategy to inhibit the crucial chaperone function of this attractive therapeutic target Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2012/24134-3, 2015/05851-4

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos Tese (doutorado) ¿ Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: As chaperonas moleculares constituem uma família de proteínas que auxiliam na formação da estrutura nativa de polipeptídeos clientes e são capazes de prevenir o enovelamento incorreto e a agregação, sendo, portanto, essenciais na manutenção da homeostase proteica. As chaperonas da família `small heat shock proteins¿ (sHsps) são expressas em diversos organismos, como bactérias, fungos, vegetais e animais, principalmente em condições de estresse térmico, contribuindo para termotolerância ao proteger proteínas da agregação. Nas plantas, as sHSPs estão presentes em todos os compartimentos celulares, o que demonstra sua importância para a célula. Devido a grande relevância biotecnológica da cana-de-açúcar caracterizamos estrutural e funcionalmente duas sHSPs desta planta: a SsHSP21.5-mt de mitocôndria e a SsHSP22.3-cp de cloroplasto. Os genes dessas proteínas foram expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes foram isoladas e purificadas, em apenas duas etapas cromatográficas, com alto teor de pureza (>95%) e em um único estado oligomérico. A análise de dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência mostraram que ambas foram purificadas enoveladas, com estrutura secundária predominante do tipo folha-?. A caracterização hidrodinâmica determinou a massa molecular, coeficiente de difusão e o raio de Stokes das proteínas em solução, revelando que ambas formam grandes oligômeros globulares em solução. No entanto, a atividade chaperona não foi equivalente entre elas, pois SsHSP22.3-cp foi mais eficiente em proteger todos os substratos modelos testados (malato desidrogenase, citrato sintase, insulina, lisozima e extrato de E. coli) quando comparada com a SsHSP21.5-mt. Estes resultados mostram que as duas sHSP estudadas neste trabalho são estruturalmente semelhantes, mas diferem na atividade chaperona testada, provavelmente devido à baixa similaridade no domínios N-terminal, responsável pela função das sHSP. Estes resultados corroboram a importância da grande diversidade de genes de chaperonas desta família em plantas para manter a homeostase proteica Abstract: Molecular chaperones belong to a family of proteins that are essential to maintain homeostasis since they are able to assist the formation of native structure of polypeptides and also to prevent incorrect folding and aggregation. The chaperones of the family `small heat shock proteins¿ (sHSPs) are expressed in several organisms such as bacteria, fungi, plants and animals, significantly under conditions of thermal stress, contributing to thermotolerance while protecting from aggregation. In plants, sHSPs are present in all cellular compartments, highlighting its importance. Due to the biotechnological relevance of sugarcane, we took to characterize structurally and functionally two os its sHSPs: the SsHSP21.5-mt from mitochondria and the SsHSP22.3-cp from chloroplast. The genes of these proteins were expressed in Escherichia coli and the recombinant proteins were isolated and purified, by two chromatographic steps, with high purity (> 95%) and in a single oligomeric state. Circular dichroism and fluorescence spectroscopy analyses showed that both proteins were folded, presenting predominantly ?-sheet secondary structure. The hydrodynamic characterization determined the molecular weight, the diffusion coefficient and the Stokes radius of the proteins in solution, revealing that both chaperones form similar large oligomers in solution with spherical shapes. However, the chaperone activity was not equivalent, since SsHSP22.3-cp was most effective in protecting all substrate models (malate dehydrogenase, citrate synthase, insulin, lysozyme and extract of E. coli) when compared to SsHSP21. 5-mt. These results showed that the two sHSPs were structurally similar, but had distinct chaperone activity, probably due to the low identity among the N-terminal domains, which are known to be involved with substrate affinity. These results confirm the importance of having great diversity of sHSP chaperones in plants for homeostasis maintenance Doutorado Química Orgânica Doutora em Ciências FAPESP 2011 / 05115-5

Orientadores: Ljubica Tasic, Marco Aurelio Zezzi Arruda Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: A expressão protéica da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) foi avaliada aplicando técnicas de espectrometria de massas (MS) na tentativa de identificar a presença de 40 proteínas classificadas como possíveis chaperonas de secreção dos Sistemas Secretórios do Tipo III e IV. Embora o processo de virulência da Xac ainda não seja bem elucidado, acredita-se que as proteínas alvo desempenhem papel importante em caminhos secretórios. Estas proteínas participam no encaminhamento dos fatores de virulência para a secreção, proporcionando-lhes estrutura específica e compatível aos caminhos secretórios, previnem sua aglomeração e interações inapropriadas. Para alcançar os objetivos, a Xac foi cultivada em três condições distintas: meio de cultura LB, considerado como controle, e meios enriquecidos com extratos provenientes de folhas e cascas de laranja, que mimetizam a presença da planta hospedeira por conterem nutrientes específicos. A separação das proteínas da Xac foi realizada por eletroforese em uma e duas dimensões, que permitiu verificar a presença das proteínas alvo na região de 8-23 kDa com pI na faixa 4-7. Após lise tríptica, as análises de espectrometria de massas (MS) foram realizadas utilizando-se exclusivamente as técnicas de ionização suave MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) e ESI (Electro Spray Ionization). Foram identificadas 12 proteínas da Xac até então consideradas hipotéticas, sendo uma delas, potencial chaperona secretória dessa bactéria. Aplicando técnica de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) foi avaliado o consumo preferencial da Xac em relação aos extratos de casca e folha de laranja, como, também, a produção de metabólitos. O estudo de metalômica qualitativa possibilitou a identificação de espécies metálicas ligadas às proteínas da Xac por ICP-MS em frações obtidas por cromatografia líquida Abstract: The proteome of the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) was studied with the aim to identify 40 hypothetical proteins and possible secretion chaperones from the Type III and Type IV Secretion Systems. It is believed that the target proteins can interact in a conserved manner with virulence factors providing them specific and appropriate structures to travel through the secretion pathways, prevent their improper interactions and agregation. For this purpose, Xac was cultived in three distinct conditions: rich medium (LB), used as the control condition, and in media enriched with orange¿s leaves and peels extracts, which simulate the presence of the host plant cell by containing specific nutrients. After protein separation by electrophoresis (1D and 2D), and detection of proteins in the region of 8-23 kDa and pI range from 4-7, characteristic of the target proteins, tryptic lysis was executed. Mass Spectrometry (MS) analyses applying soft ionization sources, MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) or ESI (Electro Spray Ionization), enabled the identification of 12 proteins, one of them possible secretion chaperone, that were considered hypothetical. Gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) was used as a tool for monitoring the consumption of specific nutrients present in the extracts by Xac and the production of its metabolites. Also, ICP-MS was applied in a qualitative Xac's metalomics that enabled the discrimination of important metallic species in protein fractions obtained by HPLC Mestrado Química Orgânica Mestre em Química

Orientadores: Celso Eduardo Benedetti, Thelma Aguiar Pertinhez Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dentro do programa Smolbnet (Structural Molecular Biology Network) da Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), a orf (open reading frame) XAC1516 da bactéria causadora do cancro cítrico, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), foi selecionada para estudos de estrutura e função. XAC1516 codifica uma lipoproteína de membrana externa semelhante a membros da família OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) de pequenas lipoproteínas, amplamente distribuída entre as Proteobacteria 'beta¿ e 'gama¿. Apesar de se conhecer o papel de muitas lipoproteínas, nenhum membro OmlA/SmpA tem estrutura 3D (tridimensional) determinada e pouco se sabe sobre esta família do ponto de vista funcional, sendo sugerido um possível papel na manutenção da integridade do envelope celular. Curiosamente, no genoma de diversas bactérias o gene omlA apresenta localização adjacente ao gene fur (ferric uptake regulator), que codifica o principal regulador transcricional dos níveis intracelulares de ferro em bactérias Gram-negativas. O curto espaço intergênico entre omlA e fur sugere que os seus promotores são sobrepostos e que suas funções e/ou regulação podem estar associadas. Este trabalho procurou investigar a função da proteína OmlA de Xac, primordialmente através da determinação da sua estrutura 3D e análise das suas propriedades dinâmicas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Também se buscou estudar a possibilidade de associação regulatória e/ou funcional entre omlA e fur, e o envolvimento do lócus no metabolismo de ferro ou na resposta ao estresse celular. Nós observamos que durante a infecção em folhas de citrus OmlA tem sua expressão aumentada em Xac e que neste processo os genes omlA e fur são co-ativados, sugerindo seu envolvimento na interação planta-patógeno. No entanto, o lócus não foi ativado em condições associadas ao metabolismo de ferro e à regulação por Fur observada em outros organismos. Ensaios de mono-híbrido foram realizados para tentar detectar possíveis fatores de ligação ao promotor do lócus omlA e fornecer informações sobre a sua regulação, mas sem sucesso. Pela primeira vez, as propriedades conformacionais e dinâmicas foram determinadas por RMN para um membro da família OmlA, e a estrutura 3D da proteína OmlA de Xac não revelou sua associação direta com processos de captação de ferro. A proteína possui extremidades desenvoveladas e uma porção central estruturada intercalada por loops flexíveis e composta de três fitas 'beta¿ e duas pequenas 'alfa¿ hélices que se empacotam num arquitetura do tipo bicamada 'alfa¿/¿beta¿. Curiosamente, este enovelamento se assemelha aos domínios da proteína BLIP (ß-lactamase inhibitory protein), um inibidor de 'beta¿-lactamase envolvido em interações proteína-proteína. Testes in vivo de co-expressão das proteínas OmlA e 'beta¿-lactamase não indicaram que OmlA possua atividade de inibição da 'beta¿-lactamase, e que portanto é provável que se associe a outra(s) proteína(s). Possíveis parceiros de interação não foram detectados através de experimentos de pull-down e coimunoprecipitação. Apesar disso, os resultados sugerem que a proteína OmlA pode estar envolvida em algum tipo de interação proteína-proteína associada à infecção na planta e sua co-ativação com fur deve fazer parte de uma resposta global relacionada à ativação de mecanismos de importância para sobrevivência de Xac durante a colonização na planta Abstract: The XAC1516 gene from the citrus canker pathogen, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), was selected for structural and functional studies in the context of the Fapesp Smolbnet program. XAC1516 codes for an outer membrane lipoprotein similar to members of the OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) family of small lipoproteins widely distributed across the 'beta¿ and 'gama¿ Proteobacteria. Although the role of numerous bacterial lipoproteins is known, the tridimensional (3D) structure of OmlA/SmpA members has never been reported and little is known about its biological function. However, it has been proposed a role of OmlA in the stability of the cellular envelope. Curiously, the omlA gene is located adjacently to the fur (ferric uptake regulator) gene, which codes for the most important transcriptional regulator of iron intracellular levels in Gram-negative bacteria. The tight intergenic spacement between omlA and fur suggests that they have superimposed promoters and that their function or regulation may be associated. In this work, we have investigated the function of the OmlA protein from Xac essentially through its 3D structure determination and dynamic analysis by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We also investigated the possibility of a functional association between omlA and fur and the involvement of this locus in iron metabolism or cellular stress response. We found that in Xac OmlA expression is enhanced during citrus infection and that in this process omlA and fur are co-activated, thus suggesting their involvement in plantpathogen interaction. The locus, though, was not actived upon conditions associated to iron metabolism or Fur regulation already observed in other organisms. One-hybrid assay were performed in order to detect possible transcriptional factors implicated in omlA/fur expression or repression, but without success. Conformational and dynamical properties of OmlA were determined by NMR. The protein has unfolded N and C termini and a structurally well defined core interconnected by flexible loops and composed by three 'beta¿-strands and two small 'alfa¿-helices, which pack against each other forming a two-layer 'alfa¿/¿beta¿ scaffold. Curiously, this fold ressembles the domains of BLIP ('beta¿-lactamase inhibitory protein), a 'beta¿-lactamase inhibitor involved in protein-protein interaction. OmlA and 'beta¿-lactamase co-expression in vivo experiments did not indicate that OmlA has a 'beta¿-lactamase inhibitory activity. It is possible then that OmlA associates with another protein or proteins, but interacting partners were not detected through pulldown and coimmunoprecipitation assays. Nonetheless, the results suggests that OmlA may be implicated in some sort of protein-protein interaction associated to plant infection and its coactivation with fur may take part of a global response related to activation of important mechanisms for Xac surviving during its colonization in plant Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A mioglobina é uma hemeproteína que tem a função de transportar e armazenar o oxigênio. Suas estruturas primária e secundária são compostas por 153 aminoácidos e oito a-hélices (nomeadas de A-H), respectivamente. Esta proteína tem sido usada como um bom modelo para estudos de estrutura, função, ligação de heme, estabilidade e enovelamento de proteínas. Em condições ligeiramente ácidas (pH em torno de 4), a apomioglobina se desenovela passando por uma forma intermediária que possui propriedades físicas entre o estado nativo (pH 7) e o estado desenovelado (pH 2). Este intermediário apresenta as hélices A, G e H protegidas como demonstrado por experimentos de troca de deutério. No presente trabalho, foram realizados estudos com mutantes de deleção e de permutações circulares de hélices da mioglobina com a finalidade de aumentar o conhecimento sobre como a estrutura terciária de uma proteína é construída. Três classes de mutantes foram criadas: 1) deleção de hélices: 1.1) um mutante de deleção da hélice H (Mb1-123) e 1.2) um mutante de deleção das hélices G e H (Mb1-99); 2) permutações circulares: 2.1) um mutante de permutação da hélice A da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb-B_GHA) e 2.2) um mutante de permutação das hélices A e B da extremidade N-terminal para a C-terminal (Mb- C_GHAB) e 3) permutação com deleção: um mutante de deleção da hélice G com permutação da hélice H da extremidade C-terminal para N-terminal (Mb-HAB_F). As proteínas mutantes foram purificadas diretamente na forma apo, embora estes mutantes possuam capacidade de se ligar ao grupo heme, com exceção do mutante Mb1-123. Estes mutantes possuem valores mais baixos de elipticidade molar e tendência maior à agregação do que a proteína selvagem. Quando na forma holo, os dois mutantes circularmente permutados são compactos e têm estrutura e função semelhantes à holoMbWT. Este resultado difere do resultado observado para as variantes de deleção (Mb1-99 e Mb-HAB_F) que não apresentaram restabelecimento da estrutura e nem supressão da tendência à agregação. Nossos resultados indicam que, embora a mioglobina possua um núcleo de ligação do grupo heme, as hélices A, B, G e H são necessárias para a correta arquitetura da proteína. Apesar da menor estabilidade dos mutantes de permutação circulares em relação à proteína selvagem, as extremidades N- e Cterminais da mioglobina são necessárias para que a proteína alcance uma estrutura estável e funcional semelhante à selvagem. As permuteínas estruturaram a forma intermediária mesmo em pH ao redor de 7, mostrando novamente que as extremidades N- e C- terminais de mioglobina são necessárias para que elas se estruturem como a selvagem. Acreditamos que um núcleo, que se mostrou insensível ao novelamento em meio ácido, foi formado nestes mutantes. Como estes mutantes diferem quanto à posição da hélice B, eles permitiram inferir sobre a participação da hélice B no intermediário de ApoMbWT. Duas formas de intermediários estão provavelmente presentes na via de enovelamento da mioglobina e suas maiores diferenças parecem estar na quantidade de estrutura formada pela hélice B. Nossos resultados estão de acordo com o modelo seqüencial de enovelamento para mioglobina, no qual a hélice B é incorporada após a formação do domínio AGH Abstract: Myoglobin functions as a protein for transporting and storing oxygen and is a soluble, globular heme-binding protein, comprising 153 amino acids arranged in eight helical segments (named A to H). This protein has been used as a good model to study structure, function, heme binding, stability, and folding pathway. Under mild acid conditions (pH 4), apomyoglobin unfolds through an intermediate form with physical properties intermediate between the native (neutral pH) and the unfolded (pH 2.0) states. This intermediate has helices A, G and H protected from hydrogen exchange. Here we present studies of deleted and circularly permuted mutations of helical blocks of myoglobin to add to our understanding of how protein topology is built. Three classes of mutants were constructed: 1) helix deletion: 1.1) a mutant deleted of H helix, Mb1-123, and 1.2) a mutant deleted of G and H helices, Mb1-99; 2) circularly permutation: 2.1) Mb-B_GHA where B-helix is N-terminal and A helix is C-terminal, and 2.2) Mb-C_GHAB where C-helix is N-terminal and B helix is Cterminal; 3) permutation/deletion: a deleted circularly permutation where H-helix is N-terminal, the G helix is deleted, and the F helix is C-terminal, Mb-HAB_F. The mutants were purified in the apo form, where although they have the ability to bind heme with an exception to Mb1-123, they have lower ellipticity and a larger tend ency to aggregate than the wild-type. When in the holo form, the two circularly permuted mutants are compact and have native-like function and conformation, different form the myoglobin variants of deletion (i.e. Mb1-99 and Mb- HAB_F), where the heme binding does not seem to be native-like and do not suppresses their tendency to aggregate. Our results indicate that although myoglobin has a core that is able to bind heme, the A, G, H and B helices are needed for the correct structural architecture of the protein. And, since the circularly permutations are less stable than the wild-type, the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. The apopermuteins resembled the intermediate form even at physiological pH, showing again that the N- and C-termini of myoglobin need to be native-like for the optimum structure-function relationship of this protein. We believe that a nucleus, mostly independent of acid unfolding, was formed by these mutants and, since these permutants differ in the position of the B helix, they gave insights about the participation of the B helix in the intermediate. Two forms of intermediates are likely to be present in the folding pathway of apomyoglobin and their major difference seems to be in the amount of structure in the B helix. Our results agreed with a model of sequencial folding for apomyoglobin where the B helix is added later in the AGH nucleus Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular