Search

Orientador: Prof. Dr. Bonald C. Figueiredo Coorientadora: Professora Helena H. L. Borba Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva. Defesa : Curitiba, 18/11/2020 Inclui referências: p. 77-92 Abstract: The adrenocortical tumor (ACT) incidence is 18 to 20 times more frequent in children from the state of Paraná and Santa Catarina than in children from other countries. The reason is the high frequency of the germline TP53 R337H variant in Paraná. It is also a serious problem the frequency of other types of cancer among adults. The present work began after documenting the cure for R337H-carrier newborns who developed malignant ACT in a new cohort (Paraná cohort 2012), where well-trained parents receiving only remote support were able to identify early signs and symptoms of ACT. Based on these previous reports, the objectives of this project were: (1) to estimate, using published data, the pediatric population at greater risk of developing ACT in Paraná and Santa Catarina, the only two states with complete mapping of all regional health for R337H mutation; (2) to evaluate the proportion of pediatric ACT cases with and without the R337H mutation in Paraná and Santa Catarina; (3) to determine the costs of chemotherapy and mitotane for the public health system of Paraná (2007-2018, SESA/DATASUS) and the indirect costs considering the number of deaths and surgeries impacting the quality of life of patients between those diagnosed at stage 1 and those at more advanced stages of ACT (2+3+4); (4) evaluate the proportion of stages (2+3+4) admitted to Hospital Pequeno Príncipe in the last ten years (2011-2019); and (5) reassess the applicability of a new version of a Bill for a mandatory neonatal R337H test in Paraná and Santa Catarina. The methodology includes (1) a review of the R337H mutation frequency in the population and in the ACTs of Paraná and Santa Catarina, reviewing ACT cases admitted to the Hospital Pequeno Príncipe (2011-2019), complemented with data from pediatric ACT records in a public database system in the same period. It was also reported that Santa Catarina has a mean R337H frequency of 0.249% among newborns, while in a more complete analysis of the Paraná population the mean frequency was 0.30%. Among the results, it was estimated that 16 children born in Paraná/year carrying the TP53 R337H mutation will develop ACT before reaching 12 years old, while in Santa Catarina it is approximately eight cases per year, while in both states, non-R337H carriers may develop two or three pediatric ACTs (Costa et al., 2019). These results are proportional to the number of births per year and to the frequency of the mutation in each state. The ACT medication (including only chemotherapy and mitotane) for the stages 3 and 4 (85%, 114/134 in 2007-2018) cost in average (on the basis of cost for SUS) 135 times more than stage 1 treatment (requiring only surgery), without considering consultations, periodical exams and overall costs in hospital. In the last 9 years were admitted 13 cases at stages 2, 3 and 4 (72.2%, 13/18) at Hospital Pequeno Príncipe Hospital. The low quality of life with long time of chemotherapy, recurrences and surgeries, higher costs and the time spent out of the school for children in stage 2, 3 and 4, requires changes in the public system. In conclusion, important changes were proposed for a revised Bill, discarding the need for a specialized municipal program without conducting periodic examinations, emphasizing genetic counseling and training of parents and family members of newborns with the R337H mutation, by trained nurses. The test for newborns of ancestors born in both states would be suitable for newborns with at least one case of cancer in the family. Resumo: O tumor de córtex adrenal (TCA) ocorre com uma incidência 18 a 20 vezes maior em crianças do estado do Paraná (PR) e de Santa Catarina (SC) em comparação com outros países. A alta incidência está associada à variante TP53 R337H, também responsável por diversos tipos de câncer em adultos. O presente trabalho teve início quando se comprovou a cura para recém-nascidos portadores da mutação R337H mediante treinamento de seus pais para identificar precocemente os sinais e sintomas do TCA, recebendo apenas orientação a distância. Com base nesse histórico, foram traçados os objetivos deste projeto: (1) estimar, por meio de revisão de dados bibliográficos, a população pediátrica em maior risco de desenvolver TCA no PR e em SC; (2) comparar a proporção de casos de TCA pediátrico/ano com e sem a mutação R337H no PR e em SC; (3) estimar o custo para os hospitais para aquisição de quimioterápicos e mitotano para tratamento dos estádios avançados, tomando por base o número de casos registrados no estado do Paraná (2007-2018, SESA/DATASUS), comparando com o que seria exigido para tratar o estádio 1; (4) identificar a proporção dos casos de TCA (2, 3 e 4) internados no Hospital Pequeno Príncipe (HPP) nos últimos nove anos (2011-2019); (5) propor uma nova versão do Projeto de Lei nº 262/2011 para tornar obrigatório o Teste do Pezinho para a mutação R337H no PR e em SC. Trata-se de pesquisa de caráter descritivo, documental, exploratório e qualitativo. A metodologia empregada inclui (1) revisão de frequência da mutação na população e nos TCAs do PR e SC, (2) revisão de casos de TCA admitidos no HPP de 2011 a 2019, complementados com dados dos registros de TCA pediátrico do sistema público. No mapeamento em SC identificou-se uma frequência da mutação R337H média de 0,249% entre os recém-nascidos, enquanto no PR esta foi de 0,30%. A partir dos resultados obtidos foi estimado que 16 crianças por ano, nascidas no PR e portadoras da mutação TP53 R337H, desenvolverão TCA antes de completarem 12 anos, já em SC seriam oito casos por ano, acrescendo-se mais dois ou três sem a mutação nos dois estados. O tratamento (quimioterapia e mitotano) dos casos de TCA nos estádios 3 e 4 (68,6%) 92/134, de 2007 a 2018, implicou em um gasto estimado anual de R$ 551.568,31 contra R$ 43.377,60 do estádio 1 (cirurgia). Dos 18 pacientes internados no HPP nos últimos nove anos (2011-2019), 13 (72,2%) foram casos 2, 3 e 4. A péssima qualidade de vida com o longo período de quimioterapia, recorrências, cirurgias, o maior custo e o tempo despendido fora das escolas exigem mudanças no sistema público. Concluindo, o estudo revisa o Projeto de Lei, descartando a necessidade de programa municipal especializado e realização de exames periódicos, enfatizando o aconselhamento genético e o treinamento dos pais e familiares de recém-nascidos com a mutação R337H. O teste para recém-nascidos de ancestrais nascidos nos dois estados seria indicado para aqueles com, no mínimo, um caso de câncer na família.

Orientador : Prof. Dr. Roberto Pontarolo Co-orientador : Prof. Dr. Bonald C. Figueiredo Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 06/06/2011 Bibliografia: fls. 101-110 Área de concentração: Análises Clínicas Resumo: Introdução. A incidência do tumor de córtex adrenal (TCA) é marcadamente alta no Estado do Paraná, onde mais de 95% dos pacientes herdaram a mutação germinativa R337H TP53 de um dos pais. O desconhecimento da existência da mutação impede uma ação preventiva contra o TCA avançado, assim como a falta de dados sobre o risco para outros tipos de câncer em crianças e adultos dificulta o planejamento epidemiológico e o aconselhamento genético. O presente trabalho foi proposto com o objetivo de esclarecer estes questionamentos. Métodos: Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Hospital de Clínicas da UFPR, do Hospital Pequeno Príncipe e pela CONEP em 2005 e em 2009 (com novos objetivos). Foram coletadas amostras de sangue periférico para a identificação da mutação R337H TP53 por meio da técnica de PCRRFLP. A confirmação da mutação foi feita por meio do sequenciamento do exon 10 do gene TP53 e pelo achado da mesma mutação em outras pessoas da família. O acompanhamento ambulatorial das crianças com a mutação R337H se baseou nos exames periódicos médicos, em ecografias abdominais e concentrações plasmáticas de hormônios adrenocorticais. Os resultados preliminares de heredogramas das famílias com a mutação R337H revelaram casos de carcinoma de plexo coroide (CPC) com a mutação, o que motivou a pesquisa para esclarecer se há incidência aumentada de CPC no Paraná. Resultados: De dezembro de 2005 a março de 2010, 171.649 RN, de um total de 180.000, participaram do rastreamento da mutação R337H TP53. Foram identificados 461 RN (0,27%) com a mutação. Dezenove casos de TCA foram diagnosticados no grupo de RN (n=13) ou no grupo de parentes abaixo de 15 anos de idade (n=6) durante esta coorte. Além disso, 34 casos de TCA foram revelados (31 crianças e 3 adultos) no histórico sobre câncer das famílias avaliadas (n=343 famílias). Das crianças que participaram do protocolo de vigilância ambulatorial, oito (2,4%) desenvolveram o TCA. Das crianças restantes portadoras da mutação e que não participaram do protocolo de vigilância, nove (2,5%) desenvolveram o TCA. As crianças com diagnóstico de TCA a partir do protocolo de vigilância ambulatorial apresentaram média de tamanho de tumores estatisticamente menor (apenas no estadio I) do que as que não participaram do protocolo (7 casos nos estadios II ou III, incluindo um óbito). Em 63,3% (14/22) dos pacientes com CPC foi identificada a mutação R337H. Ao contrário, dos 100% de LOH identificado em casos de TCA, o mesmo percentual não aconteceu nos casos de CPC. Conclusões. Este estudo demonstra a viabilidade do rastreamento neonatal para a detecção da mutação R337H e tratamento precoce de crianças com TCA, o que sugere que tal procedimento deveria ser incluído no Programa de Triagem Neonatal existente nos Estados brasileiros com uma frequência da mutação semelhante à da população do Paraná (1/371). Esta mutação é responsável por mais de 60% dos casos de CPC, sugerindo uma incidência pelo menos duas vezes maior desta neoplasia no Estado do Paraná do que em outras regiões onde não ocorre a mutação R337H. Abstract: Introduction. The incidence of adrenocortical tumor (ACT) is remarkably high in Parana State (Southern Brazil), where over 95% of patients inherited the germline R337H TP53 mutation from a parent. Lack of knowledge about the mutation prevents a preventive action against advanced ACT. Likewise, lack of data on the risk for other types of cancer in children hamper the epidemiological monitoring and genetic counsling. This study was proposed to clarify these questions. Methods. This study was approved by the Ethics Committee for Research in Humans from the Hospital de Clínicas from UFPR, from the Pequeno Príncipe Hospital, and by CONEP in 2005 and 2009 (with new goals). Peripheral blood samples were collected for DNA analysis of the R337H mutation of the TP53 gene using the PCR-RFLP assay. Confirmation of the mutation was performed by sequencing of the TP53 exon 10 and by the identification of the same mutation in other family members. Outpatient Children with the R337H mutation was based on periodic medical examination, abdominal ultrasound and plasma concentrations of adrenocortical hormones. Preliminary analysis of the pedigrees of the families revealed cases of choroid plexus carcinoma (CPC) with the mutation and encouraged further study to verify whether there is increased incidence of CPC in Paraná state. Results. From December 2005 to March 2010, 171.649 newborns from a total of 180.000 were recruited for the screening of the R337H TP53 mutation. We identified 461 infants (0.27%) with this mutation. Nineteen cases of ACT were diagnosed in the group of newborns (n = 13) or in the group of relatives under 15 years of age (n = 6) in this cohort. In addition, 34 cases of ACT (31 children and 3 adults) were identified through the family history of cancer (n=353 families). Of the newborns who have participated of the surveillance program, eight (2.4%) developed TCA. Of the remaining newborns with the mutation who were not in the surveillance program, nine (2.5%) developed ACT. Children diagnosed with ACT through the surveillance program presented tumors with average size statistically smaller (only stage I) than those who did not attend the surveillance program (7 cases in stages II or III, including one deceased child). In 63.3% (14/22) of the patients with CPC was identified the germline R337H mutation. Unlike the ACT with 100% LOH, a lower percentage of LOH was found in CPC. Conclusions. This study demonstrates the feasibility of the neonatal screening to detect and treat precociously the ACT from children with the R337H mutation, suggesting that the neonatal screening for the R337H mutation should be included in the neonatal screening program in the Brazilian states with a similar frequency of mutation found in Paraná state (1/371). This mutation is responsible for more than 60% of the CPC cases in children, suggesting an incidence at least twice higher in Paraná than in other regions without the mutation R337H.

Orientadora : Profª Drª Almeriane Maria Weffort Santos Co-orientador : Prof. Dr. Bonald Cavalcante de Figueiredo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 25/02/2010 Inclui referências Área de concentração: Análises clínicas Resumo: Tem sido documentado no Paraná que a mutação R337H no gene TP53 é a principal causa do tumor de córtex adrenal (TCA) em crianças. A mutação é herdada de um dos pais, mas confere baixa penetrância (aproximadamente 3 a 4%) aos seus portadores, o que sugere que outros fatores são necessários para o desenvolvimento do tumor. Um dos eventos genéticos mais comumente encontrados em TCA, associado à mutação R337H, é a perda de heterozigose com retenção do alelo mutado. Este é um dos principais mecanismos de inativação de genes supressores de tumor, sendo demonstrado em vários tipos de cânceres. A proteína p53 mutante é altamente instável em condições de pH e temperatura elevados e desencadeia um desequilíbrio genômico, resultando em perda da sua função e no acúmulo de alterações no DNA. A perda de imprinting genômico na região 11p15 é o principal fator que leva a perda de controle da expressão de IGF2 e de outros genes situados nesta região. O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar outras alterações de risco para o desenvolvimento do TCA em crianças portadoras da mutação R337H. Para isso, foram analisados 13 tumores de córtex adrenal (4 adenomas e 9 carcinomas). A idade em que estes tumores foram diagnosticados variou de 1 mês a 9 anos e a proporção entre meninas e meninos foi de 3,3:1,0. As amostras foram analisadas por Hibridização Genômica Comparativa em Microarranjos (aCGH ou SNP-CGH). A alta resolução desta técnica permite a identificação de alterações no número de cópias de DNA em regiões genômicas muito menores do que a permitida pela CGH convencional. Encontramos várias alterações, sendo os ganhos de DNA mais freqüentes que as perdas. A perda do alelo materno de IGF2 em 92% (12/13) das amostras parece ser o principal mecanismo de perda de imprinting que ocorre em 11p15. Um SNP foi encontrado em 6p21 em 92% das amostras, sugerindo uma perda de função do gene HLA-DRB5 que poderia ser responsável pela diminuição na apresentação de antígeno pelo TCA. As alterações encontradas no cromossomo 9 foram bastante frequentes, abrangendo quase toda sua extensão e foram marcadas predominantemente por ganhos genômicos. Estes ganhos em 9q33 confirmam achados anteriores, mas não permitem afirmar conclusivamente sobre a participação de outro gene ou sobre alguma informação nova nos mecanismos relacionados à formação de tumor no córtex adrenal. Abstract: It has been documented in Parana state (southern Brazil) that the mutation R337H in the TP53 gene is the main cause of childhood adrenocortical tumor (ACT). The mutation is inherited from a parent, but it causes low risk (approximately 3-4%) to their carriers, which suggests that other factors are required for tumor development. One of the genetic events most commonly found in ACT associated with the R337H mutation is the loss of heterozygosis with retention of the mutant allele in the tumor. This is one of the main mechanisms of inactivation of tumor suppressor genes, and it has been demonstrated in several types of cancers. The mutant p53 protein is highly unstable under conditions of high pH and temperature and triggers a genomic imbalance, resulting in loss of function, and hence the accumulation of DNA alterations. Loss of genetic imprinting in 11p15 is the main factor that leads to alteration in the expression of IGF2 and other genes located in this region. This study was conducted to identify other genomic changes in children with the germline mutation R337H that may contribute to ACT development. We have analyzed 13 childhood ACT (4 adenomas and 9 carcinomas). The age at which these tumors were diagnosed ranged from 1 month to 9 years and the ratio between girls and boys was 3.3:1.0. The samples were analyzed by comparative genomic hybridization on microarrays (aCGH or SNP-CGH). The high resolution of this technique allows the identification of changes in the DNA in genomic regions much smaller than allowed by conventional CGH. There are a number changes, with gains of DNA more frequently found than losses. We have found loss of the maternal allele of IGF2 in 92% (12/13) of the samples that seems to be the main mechanism of loss of imprinting that occurs in 11p15. One SNP was found in 6p21 in 92% of the samples, suggesting a possible loss of function of the gene HLA-DRB5 that could account for decreased presentation of antigen by the ACT. The abnormalities found in chromosome 9 were quite frequent and extensive, covering almost all parts of this chromosome and were predominantly gain of chromosome. These findings in 9q33 confirm earlier findings, but do not allow any new conclusion about the participation of other genes or about any new information in the mechanism related to tumorigenesis in adrenal cortex.

Orientador: Bonald Cavalcante de Figueiredo Inclui apêndice Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 28/09/2007 Inclui bibliografia Área de concentração: Análises clínicas

Orientador : Hélio Pedrini Co-orientador : Bonald Cavalcante Figueiredo Inclui apendices Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias Exatas, Programa de Pós-Graduaçao em Informática. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia

Orientador : Bonald C. Figueiredo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia Resumo: A incidência de Tumor de Córtex Adrenal (TCA) pediátrico no Estado do Paraná é de 12 a 18 vezes maior do que em qualquer outro lugar do mundo e a principal causa é a mutação no gene TP53 R337H, localizada no cromossomo 17p13.1. Um grande número de famílias podem ser portadoras desta mutação no Paraná. A estimativa preliminar da prevalência desta mutação na população do Paraná era de 1/1500, baseada em um estudo recente (30 famílias/41 crianças com TCA). O conhecimento da prevalência exata desse gene na população é o primeiro passo para esclarecer sua distribuição geográfica e racial, assim como facilitar outros estudos para esclarecer o que pode ou não contribuir para a formação do TCA e outros tipos de câncer. Os objetivos deste estudo são estimar a prevalência desta mutação entre os recém-nascidos (RNs), verificar a distribuição nas diferentes regiões e grupos étnicos do Paraná e investigar a evidência de mutação de novo. Instituições de 235 cidades foram convidadas e aceitaram participar deste estudo, atingindo-se um total de 30098 RNs investigados. A coleta de sangue foi realizada de maneira escalonada entre dezembro/2005 a novembro/2006, até atingir aproximadamente 65% dos nascidosvivos/ mês. O percentual de mães que aceitaram fazer o teste nos seus RNs e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi próximo de 100%. Todos os RNs foram identificados por código de barras e aqueles que apresentaram a mutação no primeiro teste de triagem (testando-se o DNA de três RNs simultaneamente) foram submetidos a uma segunda punção lateral do calcâneo para teste confirmatório (com amostras individuais). As amostras foram analisadas por PCR-RFLP (Reação em Cadeia da Polimerase - Polimorfismo de Fragmentos de DNA obtidos por Enzimas de Restrição), usando-se a enzima HhA I que corta o produto amplificado do TP53 selvagem (reconhecendo a seqüência CGCG ). O alelo com a mutação (contendo a seqüência CACG) é identificado pela presença de uma banda não digerida de 447pb. Após a confirmação da mutação, os pais dos RNs foram questionados em relação à cor da pele e etnia. A mutação foi identificada em 64 RNs (64/30098), gerando uma prevalência média de 2,12/1000. A prevalência foi estimada com maior precisão em 7 regionais de saúde do Estado (1,52 a 3,9/1000), com diferença estatisticamente significativa em algumas delas em relação à prevalência média do Estado. O percentual de distribuição dos grupos raciais na família do RN segregando o alelo TP53 R337H variou de 62,5% (brancos) a 12,5% (morenos), 12,5% (negros) e 12,5% (índios). Entre o grupo de pele branca, a descendência mais freqüente foi de italianos (35,7%), portugueses (14,4%), brasileiros (14,4%), alemães (7,1%), poloneses (7,1%), espanhóis (7,1%), libaneses (7,1%) e franceses (7,1%). Nenhuma descendência japonesa, chinesa ou outra raça oriental foi encontrada. Os resultados obtidos nesse estudo permitiram encontrar uma prevalência da mutação TP53 R337H três vezes maior do que a previamente estimada, o que sugere que a penetrância do TCA é menor que a previamente calculada. Contudo, várias famílias apresentaram histórico de outros tipos de câncer, especialmente câncer de mama, o que deve ser investigado posteriormente. Devido ao número limitado de famílias investigadas, ainda é inviável estimar a prevalência em grupos raciais / étnicos ou a predominância da mutação em várias regiões do Estado. Este é o primeiro estudo que utiliza um teste de DNA para avaliar a relação entre gene e câncer em RNs. Abstract: The incidence of childhood adrenocortical tumor (ACT) in State of Paraná is 12-18 times higher than in northern Brazil or other countries and the main reason is the TP53 R337H mutation located at chromosome 17p13.1. A large number of families were expected to carrier this mutation in Paraná. The preliminary estimation of prevalence for this mutation in the population of Paraná was 1/1500 based on a recent study (30 families/41 children with ACT). Knowledge of the accurate prevalence of this gene in the population is the first step towards clarification of the geographical and racial distribution and adress the question whether it may or not contribute to formation of ACT and other types of cancer. The goals of this study were to estimate the prevalence of this mutation among newborns, verify whether the distribution is homogeneous among different regions and racial groups of Paraná and investigate evidence of de novo mutation. Institutions from 235 cities were invited and have accepted to participate in this study, reaching 30098 tested newborns. The blood samples were collected between December/2005 and November/2006, until reaching 65% of the newborns/month in Paraná state. The percentage of mothers who accepted to do the test was close to 100% and they had to sign the informed consent form (ICF). All newborns were coded and those presenting the mutation in the first screening test (containing a DNA pool of three newborns) were submitted to a second heal-prick blood test (for individual samples). Samples were screened by PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - Restriction Length Polymorphism) analysis, using the restriction enzyme HhA I to cut the wild type amplified product (cutting site CGCG) into two fragments of 193 and 254 bp. The mutated allele (cutting site CACG) is identified by the presence of the undigested band size (447pb). After confirmation of the mutation, the newborn parents were inquired about skin color and etnia of the parental side segregating the mutation. Sixty-four newborns (64/30098) were found with the mutation giving rise to a mean prevalence of 2.12/1000. The prevalence range among the geographical regions of the state, denominated "Health Regionals", was more accurately estimated for 7 of them (1.52 to 3.9/1000) resulting in a statistically significant difference in relation to mean prevalence for the state. The percentage of the racial group in the family of mother or of father segregating the TP53 R337H allele varied from 62.5% (white), to 12.5% (brown), 12.5% (black) and 12.5% (indians). Among the white skin group, the most frequently reported descendants were Italian (35.7%), Portuguese (14.4%), Brazilian (14.4%), German (7.1%), Polish (7.1%), Spanish (7.1%), Libanese (7.1%) and French (7.1%). No descendant of Japanese, Chinese or other oriental were found. The mean prevalence of the TP53 R337H mutation in State of Paraná is three times higher than previously estimated, which suggests that the penetrance for ACT is lower than previously reported. However, family history for other types of cancer were also found, specially breast cancer, which suggest risk for other types of cancer that must be further investigated. Given the limited number of families investigated so far, it is still unable to estimate prevalence of racial group/etnia or the predominance of the mutation in the several regions of the state. This was the first study using a DNA test to study a cancer related gene in newborns.

Inclui apendices Orientador : Bonald Cavalcante de Figueiredo Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2006 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Análises clínicas

Resumo: O neuroblastoma é o segundo tumor sólido extracraniano mais comum em crianças abaixo de cinco anos de idade. Alguns tumores podem sofrer regressão espontânea, sem qualquer tratamento, especialmente em crianças menores de um ano de idade. Entretanto, a maioria das crianças apresenta estádios avançados, rápida progressão tumoral e diminuição da sobrevida. A amplificação do oncogene MYCN e a perda de ambos alelos de 1p36 (provável gene supressor tumoral) são os mais importantes marcadores moleculares relacionados com o pior prognóstico em crianças com neuroblastoma. O objetivo deste estudo foi identificar a amplificação do oncogene MYCN e outras características em 45 crianças (25 meninos e 20 meninas, variando de 1 mês a 13 anos de idade) com neuroblastoma atendidas em três hospitais de Curitiba, entre 1990 e 2000. A amplificação do oncogene MYCN foi verificada através da técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH). A maioria dos pacientes encontrava-se nos estádios 3 e 4 (36/45, 80%) e acima de 1 ano de idade (36/45, 80%) no momento do diagnóstico. A sobrevida observada nos estádios 1, 2, 3, 4, e 4S foi de 100% (2/2), 50% (3/6), 50% (8/16), 10% (2/20) e 0% (n=1), respectivamente. Comparações foram feitas para saber se tumor com amplificação do MYCN associado com outras características estaria relacionado com menor sobrevida. As características avaliadas foram sexo, idade, estadiamento, histopatologia, segundo os critérios da Classificação Internacional de Patologia do Neuroblastoma (INPC), grau de diferenciação neuroblástica (indiferenciado, pouco diferenciado e bem diferenciado), localização do neuroblastoma e resposta ao tratamento. Dezesseis (43%) de 34 tumores com resultados de FISH apresentaram amplificação de MYCN, enquanto as demais 11 amostras de cortes de parafina não puderam ser avaliadas. A sobrevida foi inferior em meninos com MYCN amplificado (8%) do que em meninas com MYCN amplificado (60%) de acordo com o Teste para Diferença entre Proporções (p

Orientador : Bonald Cavalcante Figueiredo Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia Área de concentraçao: Análises clínicas Resumo: A identificação de marcadores tumorais continua sendo um desafio no diagnóstico de neoplasias, e dependendo da sensibilidade e especificidade existirão importantes implicações para a terapêutica e prognóstico. Fosfatase alcalina placentária (hPLAP) e PLAP-símile são marcadores tumorais expressos em neoplasia de ovário, testículo, pulmão, trato gastrointestinal e tumor adrenocortical (TCA). Em condições fisiológicas, PLAP é produzida a partir da 12ª semana de gestação e PLAP-símile é produzida em baixíssimos níveis, em testículo, cérvix, timo, que se elevam em fumantes. As isoformas das fosfatases alcalinas (ALPs) humanas são (1) ALP placentária (hPLAP) e (2) PLAP-símile, termoestáveis e com 98% de homologia entre si; (3) ALP intestinal (IAP) e (4) tecido não específico (TNAP), termolábeis e com 88% e 56% de homologia com relação à PLAP, respectivamente. O objetivo deste estudo foi desenvolver dois imunoensaios para detecção da atividade catalítica (ICA) da hPLAP/PLAP-símile com anticorpos anti-hPLAP produzidos em ovelha. Foi elaborado um imunoensaio provavelmente capaz de reconhecer todas as isoformas de PLAP e PLAP-símile (ICA-PLAP), produzido com anticorpos policlonais purificados em coluna de Sepharose® ligada a hPLAP, e outro com anticorpos policlonais que reconhecem um epítopo de PLAP (ICA-PEP), purificados com coluna de Sepharose® ligada ao peptídeo sintético AA 57-71 da seqüência de hPLAP. As metodologias foram padronizadas e validadas com hPLAP e IAP comerciais, amostras de soro de 93 doadores de sangue (não fumantes e fumantes), soro de gestantes e de uma paciente com carcinoma embrionário de ovário, e tecidos de placenta e TCA. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram 6,5% e 9,9% para o ensaio ICA-PLAP e 3,7% e 9% para o ensaio ICA-PEP. A recuperação variou de 96,1% a 98,4%, e de 97,1% a 103,9% para os ensaios ICA-PLAP e ICA-PEP, respectivamente. Em ambos os ensaios, a sensibilidade foi igual a 0,1 U/l e o valor de corte igual a 0,2 U/l para não fumante e fumante ocasional, enquanto os resultados preliminares sugerem que níveis de PLAP/PLAP-símile acima de 0,4 U/l em fumantes podem eventualmente revelar uma neoplasia. Os ensaios ICA-PLAP e ICA-PEP apresentaram um boa correlação (r=0,94). Reação cruzada foi observada numa concentração de IAP de 50 g/ml (equivalente a 27,5 U/l) no ensaio ICAPLAP, e de 100 g/ml no ICA-PEP (equivalente a 55 U/l e que correspondeu a um resultado de 0,4 U/l, o que seria obtido com apenas 36 ng/ml de PLAP, ou seja, uma concentração cerca de 2800 vezes menor). As atividades de PLAP/PLAP-símile nas amostras de soro da paciente com carcinoma embrionário de ovário diminuiu com a redução do tamanho da massa tumoral no primeiro ciclo de antineoplásicos. Em 77% (17/22) das amostras de tecido de TCA, as atividades de PLAP/PLAP-símile estavam acima do valor de referência obtido para o soro de indivíduos saudáveis (0,2 U/l), porém estes experimentos precisam ser reavaliados em relação ao quadro clínico e comparando-se com a atividade em córtex adrenal normal. Os ensaios ICAPLAP e ICA-PEP e os resultados obtidos com os pacientes, sem incluir a atividade de IAP, permitiram concluir que há alguns tipos de tumores que podem ser precocemente detectados usando soro ou amostras de tecido. Palavras-chave: fosfatase alcalina placentária, marcadores tumorais, imunoensaio catalítico. Abstract: The search for a tumor marker continues to be a challenging issue for cancer diagnosis, and its sensitivity and specificity often have important therapeutic and prognostic implications. PLAP and PLAP-like are tumor markers expressed in malignancies from ovary, testis, lungs, adrenocortical tumors (TCA) and gastrointestinal tract tumors. At phisiological conditions, hPLAP is produced by placenta after the twelth week of pregnancy and PLAP-like by normal thymus, fetal and neonatal testis, and normal endocervix at very low levels, and their levels increase dramatically in smoking individuals. The human alkaline phosphatase (ALP) consisted of a family of four isozymes. Human placental ALP (hPLAP) and PLAP-like, which are stable at 65oC and present 98% homology; intestinal ALP (IAP) and nonspecific tissue ALP (TNAP) or liver/bone/Kidney ALP, which are not active at 65oC and present 88% and 56% homology with PLAP, respectively. The main goal of this study was to develop two enzymatic immunoassays for PLAP/PLAP-like determination using antibodies produced in sheep: one immunoassay capable of recognizing all possible PLAP and PLAP-like proteins using a policlonal antibody (ICA-PLAP) purified in affinity-column (Sepharose® bound to hPLAP) and the second immunoassay (ICA-PEP) designed to recognize a small part of PLAP (AA 57-71). A standard protocol for both assays was stablished and afterwards they were tested with commercial hPLAP and IAP, using serum samples from 93 adult individuals (including smoking and non-smoking ones), sera from pregnant women and a patient with ovary embryonal carcinoma, as well as, tissue samples from placenta and childhood TCA. Intra- and inter-assay coefficients of variation were 6,5% and 9,9% for ICA-PLAP, and 3,7% and 9% for ICA-PEP, respectively. The recovery ranged from 96,1% to 98,4%, and from 97,1% to 103,9% for ICA-PLAP and ICA-PEP, respectively. The working range was from 0.1 U/l to 11 U/l for both assays. PLAP/PLAP-like in serum of non-smoking and apparently normal adult individuals was found up to 0,2 U/l, while smoking individuls seem to present an upper cut-off level of 0,4 U/l. Beyond these values it is recommended to search for neoplastic tissue. Data obtained using the ICA-PLAP assay correlated well to ICA-PEP (r=0.94). Cross-reactivity with IAP was observed at high IAP concentrations, 50 g/ml (or 27,5 U/l) using ICA-PLAP, and higher concentration (100 g/ml, or 55 U/l) for ICA-PEP (exhibiting only 0,4 U/l, in contrast with 36 ng/ml that would be required for PLAP to reach the same result, which is almost 2800 times less concentrated). Identification of PLAP/PLAP-like activity in a girl with ovary embryonal carcinoma that diminished with tumor size after first cycle of chemotherapy indicated that these assays are efficient and important for follow-up. Using these assays, it was found that 77% (17/22) of the tested TCA tissue samples expressed either PLAP or PLAP-like, however, further research is necessary to better quantify and characterize according to clinical conditions of children. The ICA-PLAP and ICA-PEP assays and the results obtained from patients, without including IAP activity, allowed to conclude that there are subsets of tumors that may be precociously detected using either serum or tissue samples. Key words: placental alkaline phosphatase, tumor markers, catalytic immunoassay.

Orientador : Bonald C. de Figueiredo Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2004 Inclui bibliografia e anexos Resumo: Aproximadamente 90% dos tumores adrenocorticais em crianças (TAC) no estado do Paraná apresentam a mutação R337H Tp53 nas células da linhagem germinativa, um fator de supressão tumoral. Os hormônios sexuais, o cortisol e outros hormônios em excesso nos TACs são os responsáveis pelo aparecimento dos sinais e sintomas mais freqüentes: síndrome virilizante e síndrome de Cushing. A grande maioria dos pacientes com TAC é diagnosticada até os três anos de idade, porém os responsáveis pelas crianças relatam que, normalmente, os sintomas começaram a surgir cerca de seis meses a dois anos antes do diagnóstico. Diante dessas observações e de uma série de diferenças entre tumores de crianças e de adultos, formulou-se a hipótese de que o tumor de crianças poderia surgir durante o período embrionário. O presente trabalho tem como objetivo testar essa hipótese por meio da identificação de um marcador embrionário em amostras de TAC. Para tal foi realizada a pesquisa de, fosfatase alcalina placentária (PLAP) e CD30, referidos como possíveis marcadores embrionários na identificação de tumores de testículos e ovários, os quais apresentam função esteroidogênica a exemplo da adrenal. A técnica de imunohistoquímica (IH) foi utilizada para mostrar PLAP e CD30 em cortes embebidos e parafina, e outras duas proteínas, 17 -hidroxilase (17-OHase) e Tp53, foram utilizadas como controles. A fim de confirmar a presença do(s) marcador(es) que apresentar(em) resultado(s) positivo(s) na técnica de IH e o peso molecular esperado nas amostras de TAC, foi utilizada também a técnica de western blotting em amostras congeladas de TAC, empregando como controles positivos, amostra de placenta e PLAP comercial. Os resultados obtidos na IH revelaram que CD30 (apenas 5,1% de positividade nas amostras pesquisadas) não é um marcador específico ou confiável, ao passo que PLAP foi encontrada em 36,2% dos TACs. O percentual baixo de imunopositividade encontrado para 17-OHase e Tp53 em relação ao esperado (aproximadamente 95% e 90%, respectivamente) pode ser justificado por problemas no preparo das amostras do tumor ou na incubação com os anticorpos. Este motivo pode também sugerir que pode haver um percentual maior de TACs de crianças positivos para PLAP na IH. A presença de PLAP foi confirmada no western blotting que revelou também o peso molecular esperado, entre 70 e 75 KDa. Os resultados obtidos para 17-OHase e p53 mostraram as condições do material pesquisado, enquanto os resultados positivos para PLAP são as melhores evidências de que TAC de crianças é de origem embrionária. Entretanto, por ter havido provavelmente baixa sensibilidade para PLAP na IH, o presente trabalho não pode assegurar a existência de TAC negativo para PLAP. Sabe-se que, em algum momento da embriogênese do córtex adrenal, ocorre falha do R337H Tp53 ou de outros mutantes e formação do TAC, cujo crescimento ocorre a diferentes velocidades. Novas pesquisas com PLAP e outros possíveis marcadores em tecidos de TAC e em soro de pacientes possibilitarão um diagnóstico precoce das recidivas, que está freqüentemente associado a um prognóstico mais favorável. Abstract: Approximately 97% of the pediatric adrenocortical tumors (ACT) from Paraná present the germline mutation R337H Tp53. This allele has been considered to be responsible for the increased incidence of ACT in children from this state in southern Brazil. Sex hormones, cortisol and other hormones produced at high levels in ACT are responsible for the most common clinical presentations: virilizing syndrome and Cushing's syndrome. Most of the patients with ACTs are diagnosed in the first three postnatal years, however, parents have reported onset of signs and symptoms six months to two years earlier. Based upon these observations and on a number of differences between children and adults, a hypothesis has been formulated to propose that most cases of pediatric ACTs are developed during the embryonic period. The present work was proposed to test the embryonic origin of ACT through the identification of an embryonic marker in ACT samples. To address this objective, two candidates were selected: placental alkaline phosphatase (PLAP) and CD30, both reported as possible embryonic markers for identification of testis seminoma and ovary cancer, which present steroidogenic tissue as the adrenal córtex. The immunohistochemistry technique (IHC) was used to investigate the presence of PLAP and CD30 in paraffin-embedded sections, while 17 -hydroxilase (17-OHase) and p53, were used as controls. In order to confirm the presence of the marker that show a positive result by IH and its molecular weight, another technique, western blotting was used to investigate frozen samples of ACT, employing as positive controls placental tissue and commercial PLAP. The IHC findings have revealed that CD30 (only 5,1% of the samples were positive) is not a specific or safe marker, while PLAP was found to be positive in 36,2% of the ACTs. The low frequency of positive cases for 17-OHase and p53 in relation to expected frequencies (approximately 95% and 90%, respectively) may be explained by differences in assay conditions such as sample preparation and antibody incubation. This may be also the reason to suggest that frequency of positive results for PLAP in IH may be probably higher. The presence of PLAP was confirmed in the western blotting, which has revealed the expected molecular weight, between 70 and 75 KDa. The obtained results for 17-OHase and p53 have contributed to evaluate the sample conditions, while the PLAP results are the best evidence to date that children's ACT is from embryonic origin. However, due to low IHC sensitivity results for PLAP, this study could not determine, which samples were really negative for PLAP, which would be indicated to test the negative PLAP expression hypothesis in the marjority of adult ACTs. This study proposes that at a certain moment of the adrenocortical development there must be a failure of the remaining R337H Tp53 and/or of other mutants that contribute to develop cancer cells that will form ACT. According to the profile of each ACT, it is expected different growth rates of the tumor, and further studies with PLAP and other candidates will contribute to reach earlier diagnosis of recurrences, which is frequently associated with better prognosis.

Orientador : Bonald Cavalcante Figueiredo Co-orientador : Brás Heleno de Oliveira Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde, Programa de Pós-Graduaçao em Ciencias Farmaceuticas. Defesa: Curitiba, 2004 Inclui bibliografia e anexos

Orientador: Bonald Cavalcante de Figueiredo Co-orientador: Brás Heleno de Oliveira Inclui apendice Inclui bibliografia

Orientador : Bonald C. Figueiredo Co-orientador : Luis de Lacerda Filho Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde Resumo: Síndrome de Insensibilidade Androgênica (AIS) é uma doença causada por mutações no gene do receptor androgênico (AR) ou em coativadores do AR. A apresentação clínica varia desde um fenótipo totalmente masculino até tipicamente feminino com amenorréia primária e pilificação escassa, o último fenótipo é caracterizado como AIS completa (CAIS). OBJETIVOS: O objetivo deste estudo foi identificar a mutação do AR em indivíduos com CAIS e portadores da mesma família e avaliar alguns fatores que ainda são questões de debate: presença de pequena quantidade de pêlos em pacientes com CAIS, época da gonadectomia, método de ampliação vaginal (vaginoplastia cirúrgica ou dilatação mecânica) e comportamento sexual. PACIENTES E MÉTODOS: A partir do caso índice foi realizada análise do heredograma que identificou todos os familiares. As pacientes com CAIS foram diagnosticadas através de dados clínicos e laboratoriais. Seqüenciamento direto de DNA, combinado com ensaio de PCR alelo-específíca, identificou-se a mutação do AR. Análises do comportamento sexual foram realizadas a partir de entrevistas com pacientes adultas. RESULTADOS: Dezenove pacientes com CAIS foram identificadas, incluindo 3 pacientes falecidas e 14 carreadoras, distribuídas em 4 gerações. Inicialmente algumas pacientes com CAIS se apresentavam com amenorréia e pilificação sexual secundária ausente ou escassa. Análises subseqüentes revelaram altos níveis de testosterona e cariótipo 46, XY. Dez das 16 pacientes vivas foram totalmente investigadas, três (3/16) não completaram este estudo e 3 (3/16) se recusaram a qualquer participação e foram consideradas como portadoras de CAIS com base em relatos de seus parentes de primeiro grau. Usando o ensaio de PCR alelo-específico, 13 (13/19) pacientes com CAIS e 11 (11/14) mulheres carreadoras foram positivas para a mutação C576F entre 89 indivíduos testados. Esta mutação substitui guanina por timina no nucleotídeo 2089, localizado no éxon 2. As pacientes com CAIS, apresentavam achados similares, tais como genitália externa feminina, amenorréia, ginecomastia e ausência de pilificação sexual secundária. Três das pacientes adultas examinadas (3/8) exibiam pilificação pubiana escassa (Tanner P2) ao invés de ausência completa de pêlos. A gonadectomia foi realizada após a puberdade em 7 pacientes (7/10), sendo encontrados 3 hamartomas e 2 seminomas. Uma das pacientes com seminoma possuía um hamartoma contra-lateral, e a outra possuía o testículo contra-lateral normal que foi extirpado 20 anos após a retirada do seminoma. As duas crianças aguardam a cirurgia de remoção da gônada, e uma das pacientes adultas está providenciando a sua gonadectomia. Duas pacientes optaram por vaginoplastia e 5, por dilatação vaginal mecânica. O tratamento não cirúrgico obteve sucesso em atingir um tamanho razoavelmente esperado da vagina em 4 de 5 pacientes após um período de 2 a 4 anos. A análise do comportamento sexual demonstrou que todas as pacientes com CAIS são completamente femininas, embora houvesse o estigma de possuir uma doença intersexual. CONCLUSÕES: Neste estudo está o maior número de pacientes com CAIS, já relatado, numa mesma família. (1) A mutação encontrada, C576F, é responsável por todos os casos de CAIS na família estudada; (2) alguns indivíduos apresentam, uma variação fenotípica, pilificação pubiana esparsa, sugerindo que um mecanismo independente de androgênios pode influenciar o crescimento dos pêlos; (3) tumores em gônadas foram observados apenas em pacientes adultas, sugerindo que a gonadectomia pode ser adiada para o período pós-puberal; (4) a dilatação vaginal mecânica foi preferida quando comparada com a vaginoplastia cirúrgica; e (5) o comportamento sexual foi completamente feminino, o que é consistente com a idéia de que a falta completa da ação androgênica induz a feminização de indivíduos XY com CAIS. Abstract: Androgen insensitivity syndrome (AIS) is a disorder whose ongins lie in the androgen receptor (AR) or in coactivators o f AR. Clinical presentation of AIS ranges from a typically male phenotype to a typically female phenotype with primary amenorrhea and lack of pubic and axillary hair; the latter phenotype is categorized as complete AIS (CAIS).OBJECTIVE: The goals of this study were to identify the AR mutation in CAIS individuals and carriers of the same kindred and evaluate some features that are still a matter o f debate: presence o f small amount of pubic hair in CAIS patients, the best age for gonadectomy, vaginal enlargement (based on surgical vaginoplasty or dilation therapy) and sex behavior. SUBJECTS and METHODS: Analysis o f the index cases pedigree allowed identification of all family members. Affected members with CAIS were identified based on clinical and laboratory data. Direct DNA sequencing combined with a rapid and reliable allele-specific PCR assay were employed to identify the underlying mutation in the AR gene of all consenting family members through all generations. Sex behavior analysis was based on interviews with each adult patient or parents o f children. RESULTS: Analysis o f the pedigree revealed 19 affected individuals, including 3 deceased patients and 14 carriers. All patients were phenotypically female and distributed throughout four generations and most o f the adult patients initially presented with amenorrhea and lack o f secondary sexual hair. Subsequent analyses revealed high testosterone levels and a male karyotype. Ten o f the 16 alive patients were fully investigated. 3/16 did not complete this investigation and the remaining 3/16 individuals refused any participation and they were considered as CAIS based on reports from their first-degree relatives. Using an allele-specific PCR method, 13/19 CAIS patients and 11/14 carries women were found positive among 89 tested individuals for a G to T transition at nucleotide 2089, in exon 2 of the AR gene, resulting in CYS 576 PHE. All individuals presented similar findings, such as female external genitalia, female sex behavior, amenorrhea, gynecomastia and absence of facial hair. Three of the patients exhibited sparse (Tanner P2) rather than complete absence o f pubic hair. Three hamartomas and 2 seminomas were found in 7 gonadectomizaded patients. One o f the patients with a seminoma had a contralateral harmatoma while the patient with the second seminoma had a normal testis, which was removed during this investigation, 20 years after the seminoma removal. Two individuals elected to have plastic surgery to enlarge the vaginal cavity and 5 had opted for chronic mechanical vaginal dilation. Dilation therapy was successful in reaching the minimal expected size of vagina in 4 o f 5 cases. Analysis o f sex behavior revealed it to be genuinely feminine in all examined patients, despite stigmatization for having an intersex disorder, sometimes requiring long-term psychological support. CONCLUSIONS: We have presented the highest number o f CAIS individuals in the same kindred found in the literature and the most important features were: (1) the C576F mutation is responsible for all cases o f CAIS; (2) some o f the individuals presented at least one different phenotype, sparse pubic hair, suggesting that, a yet unknown androgen-independent mechanism seems to influence hair growth; (3) tumors in gonads were found only among adult patients and had a frequency that was similar to those of previous studies, suggesting that gonadectomy may be postponed to the end o f puberty; (4) vaginal dilation was the preferable therapy compared to surgical vaginoplasty; and (5) sex behavior was entirely feminine which is consistent with the idea that complete lack o f androgen effect causes feminization o f XY individuals.

Orientador: Bonald C. de Figueiredo Co-orientador: Vânia M. de Alcântara Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde Resumo: O procedimento usual para se confirmar uma suspeita clínica de deficiência do hormônio do crescimento (GHD) é verificar se existe ausência de um pico mínimo de GH (7 ng/ml) nos testes de estímulos farmacológicos com insulina ou clonidina. Além da falta de consenso internacional sobre o valor a ser adotado para o pico mínimo de GH, atualmente variando entre 5 e 10 ng/ml, há também as diferenças existentes entre os diversos imunoensaios empregados, sobretudo em relação à especificidade do anticorpo de captura empregado em cada imunoensaio. Desta forma, foi proposto um ELISA sanduíche com o objetivo de quantificar as isoformas do hGH que possuem o sítio 1 de ligação ao receptor somatogênico. Para este fim, anticorpos policlonais de cavalo anti-hGH recombinante (rhGH) foram produzidos, purificados em coluna de afinidade com rhGH ligado covalentemente à sefarose e, em seguida, divididos em dois grupos através da utilização de uma segunda coluna de afinidade, contendo parte da hélice 4 do hGH ligada à sefarose. Os anticorpos aderidos nesta coluna foram posteriormente eluídos com solução ácida e utilizados como anticorpos de "captura", ao passo que os anticorpos que não ficaram retidos durante a passagem pela segunda coluna foram conjugados à Horseradish Peroxidase (HP) e usados como segundo anticorpo ou de marcação. Anticorpos anti-hélice 4 foram incubados numa placa, 1 }ig/poço, como antígeno, utilizou-se o rhGH em concentrações de 125 a 0,98 ng/ml e o segundo anticorpo, conjugado à HP em diluição de 1:1000. Verificou-se que a faixa de linearidade mais adequada para leitura de amostras desconhecidas esteve entre 1,95 e 31,25 ng/ml de rhGH e que a sensibilidade mínima testada foi de 0,12 ng/ml. O coeficiente de variação intra-ensaio foi de 4,53 e de 6,33 % para os respectivos valores de 8,16 e de 2,37 ng/ml, enquanto o coeficiente de variação interensaio foi de 6,00 e 8,27% para as concentrações de 8,67 e 14,87 ng/ml, respectivamente. As percentagens de recuperação variaram entre 96,02 e 103,82% enquanto a linearidade mostrou-se mais satisfatória para concentrações de hGH acima de 3,37 ng/ml. A especificidade do anticorpo foi avaliada utilizando-se concentrações de até 500 ng/ml do hormônio homólogo, prolactina humana, sem apresentar reação cruzada, afastando resultados de falsa imunorreatividade. Comparando-se o ELISA sanduíche com o IRMA, na quantificação de hGH de 436 amostras de 73 meninos e 36 meninas submetidos aos testes de estímulo com clonidina, verificou-se que as maiores discrepâncias aconteceram com valores abaixo de 2 e acima de 20 ng/ml. Vinte e quatro amostras com determinações diferentes entre estes dois ensaios foram submetidas ao ensaio quimioluminescente e, apesar dos resultados não terem sido semelhantes, houve boa correlação entre o ELISA e o IRMA, cujo coeficiente foi de 0,90 e entre o ELISA e o ICMA foi de 0,93, ao passo que entre o ICMA e o IRMA foi de 0,89. As características deste ELISA sanduíche permitem a sua utilização na determinação de hGH na rotina laboratorial de pacientes com GHD, porém, para que seja aplicado em pesquisas na quantificação de concentrações mais baixas de hGH, seriam necessários estudos adicionais. Abstract: The usual procedure to confirm a suspicious clinical case of growth hormone deficiency (GHD) is to verify whether exist or not a minimal GH peak (7 ng/ml) on pharmacological tests with insulin or clonidine. Lack of an international consensus about the minimal peak of GH, presently ranging from 5 to 10 ng/ml, and all technical differences among available immunoassays, specially related to the capture antibody specificity contribute to divergent results among these assays. Thus, the present study was designed to prepare a sandwich ELISA to quantify all hGH isoforms that present binding site 1 to its receptor. To this end, horse policlonal, anti recombinant hGH (rhGH) were produced and purified in affinity columns prepared with rhGH covalently bound to sepharose. The obtained antibodies were further splitted into two groups through a second affinity column prepared with a synthetic peptide correspondent to a fraction of helix 4 bound to sepharose. The antibodies retained to the second column were afterwards eluted with acidic solution and used as capture antibodies, while those with free passage through the column were conjugated to Horseradish Peroxidase (HP) and used as second or marker antibodies. One microgram of anti-helix 4 antibody was incubated in each well, with rhGH concentrations ranging from 125 to 0.98 ng/ml and second antibody, conjugated to HP, applied in a 1:1000 dilution. The working range was observed between 1.95 and 31.25 ng/ml of rhGH and the minimal tested sensibility was 0.12 ng/ml. The intra-assay variation coefficient was 4.53 and 6.33 % for rhGH values of 8.16 and 2.37 ng/ml, respectively, while the inter-assay variation coefficient was 6.00 and 8.27% for rhGH concentration of 8.67 e 14.87 ng/ml, respectively. Rate of recovery ranged between 96.02 and 103.82%, however, the best linearity (closer to 100%) was noticed for hGH above 3.37 ng/ml. Antibody specificity was evaluated incubating up to 500 ng/ml of the GH homologous hormone, prolactin, without presenting any cross-reactivity, what ruled out false immunoreactivity to hGH. Comparisons between sandwich ELISA and IRMA were made during hGH quantification of 436 samples from 73 boys and 36 girls submitted to provocative tests with clonidine and some discrepancies were found for hGH below 2 and above 20 ng/ml. Twenty four divergent samples between ELISA and IRMA were further analyzed with a immunochemiluminometric assay (ICMA), which exhibited results different from those obtained with ELISA and IRMA. However, the correlation coefficients found between ELISA and IRMA was 0.90, between ELISA and ICMA was 0.93 and between ICMA and IRMA was 0.89. The observed features of the present ELISA allow its use for determination of hGH required by routine analyses of patients with GHD, however for research purposes requiring measurements of low concentrations of hGH further optimization of this assay is necessary.

Orientador: Bonald C. Figueiredo Co-orientador: Nelson Augusto Rosário Filho Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciencias da Saúde Resumo: A diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) pode ocorrer em associação com deficiência de IgA (DIgA), doença celíaca (DC) e outras doenças auto-imunes. A maior prevalência de DIgA entre pacientes com DM-1 tomou-se evidente após introdução dos testes sorológicos de screening para DC, pois a imunoglobulina, que geralmente e detectada contra a proteína do trigo (gliadina) ou constituintes da mucosa intestinal (endomisio), pertence a classe de imunoglobulina A (IgA). O objetivo do presente estudo foi determinar a prevalência de DIgA entre pacientes com DM-1 e suas implicações na avaliação dos testes sorológicos para DC. Um grupo de 149 crianças e adolescentes com DM-1 (media da idade de 12,4 anos) foi selecionado de forma randomizada para determinação de anticorpos IgA anti-endomisio (EMA), realização de biopsia intestinal de acordo com EMA, dosagem de anticorpos IgA antigliadina (AGA) e de IgA sérica por 3 métodos (turbidimetria, imunodifusão radial em placa de baixa concentração e ELISA). Trinta dos 35 pacientes com EMA positivo foram submetidos a biopsia intestinal, 13 tiveram DC confirmada com biopsia (Graus Dl e IV); destes, 9 tinham AGA positivo. Apenas quatro pacientes com EMA positivo tinham sintomas de DC, 3 com DC confirmada, e um não foi submetido a biopsia. A maioria dos pacientes com DM-1 e DC tinha estatura abaixo da estatura alvo em comparação aos pacientes com DM-1 e EMA negativo (p=0,002). EMA teve sensibilidade de 100% e AGA, de 69,2%; a especificidade de AGA foi de 94,1% (a especificidade de EMA não pode ser calculada). A prevalência de DIgA no grupo de DM-1 foi de 5,3% (8/149), 50 vezes maior do que a população brasileira normal, sendo que nenhum paciente se apresentou com infecções recorrentes. Todos os pacientes com DIgA tinham EMA positivo e nenhum teve níveis detectáveis de AGA. Em quatro pacientes com DIgA, o EMA foi positivo, AGA negativo e biopsia intestinal normal, o que sugeriu que EMA foi falso positivo. Apenas 1 (1/13) paciente com DC teve DIgA, ou seja, a prevalência de DIgA em pacientes diabéticos com DC foi de 7,7%. Devido a variabilidade dos resultados dos testes sorológicos (EMA e AGA), foi proposto um protocolo para o diagnostico de DC em pacientes diabéticos. Abstract: Type 1 diabetes mellitus (DM-1) may occur in association with IgA deficiency (IgAD), celiac disease (CD) and other autoimmune diseases. Increased prevalence of IgA deficiency among diabetic patients became more evident after introduction of serologic tests for CD screening. The immunoglobulin that usually is found against a wheat protein (gliadin) or any protein of the small intestine mucosa (endomysium) is from the IgA class. The present study was designed to assess the prevalence of IgAD among DM-1 patients and its implications in the evaluation of serologic tests for CD. One hundred and forty nine DM-1 children (mean age 12.4 years) were randomly selected for IgA anti-endomysial antibody test (EMA), intestinal biopsy (according to EMA), IgA anti-gliadin antibody (AGA) and determination of serum IgA (three methods were used: turbidimetry, radial immunodiffusion and ELISA). Thirty of 35 positive EMA were submitted to duodenal biopsy, 13 with confirmed CD (grade III or IV), 9 with positive AGA. Four were symptomatic for CD, 3 with confirmed CD. In the group with CD, the mean height was statistically below the target height (p=0,002), compared with the group of DM-1 children and negative EMA. The sensitivity of EMA was 100% and AGA, 69,2%; the specificity of AGA was 94,1%, the specificity of EMA was not possible to be calculated. The prevalence of IgAD was 5,3% (8/149), 50 times higher than normal Brazilian population, no patients with recurrent upper respiratory tract, pulmonary, or gastrointestinal infections. All patients with IgAD had positive EMA, no patients with detectable AGA. Four IgAD cases (very low IgA serum levels obtained in an ELISA assay) were positive for EMA, not for AGA, and had normal biopsy, which could suggest false positive EMA. One IgAdeficient patient had confirmed CD, the prevalence of IgAD in CD was 7.7%. Because of the variability in the results of serologic tests (EMA versus AGA), a protocol was proposed to optimize the screening, the diagnosis of CD and to reduce number of cases indicated for intestinal biopsy.